CN101586084B - 一种酵母菌及其在蔬菜腌制废水弱碱化处理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株保藏编号为CGMCC No.3000，能对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的假丝酵母菌G70(Candida thaimueangensis)及利用该菌株对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的方法。假丝酵母菌G70(CGMCC No.3000)是一株盐度耐受能力强，pH生长范围广的菌株，该菌株可在较短的时间内使蔬菜腌制废水的pH由酸性上升至弱碱性并去除废水的部分COD，极大地降低了蔬菜腌制废水的处理成本；其培养方法简单，生长速度快，易沉降，可用于对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理。该菌株在蔬菜腌制废水处理方面具有较好的应用前景。

Description

一种酵母菌及其在蔬菜腌制废水弱碱化处理中的应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株假丝酵母菌G70(Candida thaimueangensis)，保藏编号为CGMCC No.3000。本发明还涉及假丝酵母菌G70(Candida thaimueangensis)在蔬菜腌制废水处理中的用途。

背景技术

腌制蔬菜在我国民众的饮食中有着不可取代的地位，流传久远而广泛。随着工业化的发展，腌制蔬菜产业有了长足的发展，有了像榨菜、东北泡菜这样一批畅销全国的产品；而产业规模的扩大，更是让腌制蔬菜产业成为了一些地方的支柱产业，重庆涪陵区榨菜产业链年产值达20多亿元，浙江余姚市的榨菜产业年产值也在15亿元以上。

但是，蔬菜腌制会产生大量的高盐酸性有机废水，直接排放会造成严重的环境污染；一是导致接纳水系的富营养化，导致水体变黑发臭；二是破坏农田土壤结构，使土壤碱性增导致土质硬化、板块化；三是腌制废水自身会散发出难闻的异味，严重影响周围居民生活环境。

目前，我国蔬菜腌制处理中遇到的问题包括以下几个方面：一，废水含盐量高，传统的活性污泥法处理效果很差，而费用较高的物化处理方法又很难被利润微薄的生产企业接受；二，生产企业数量众多且规模普遍较小，加之分布零散，不利于采用先进技术对废水进行集中的大规模处理。以榨菜为例，只有涪陵地区的少数几家龙头企业实现了对榨菜腌制液的处理和资源回收。

嗜(耐)盐菌的生理特性使其能够适应高盐的生长环境，已有研究结果表明嗜(耐)盐菌在处理高盐污水方面具有很大的优势和潜力。目前，蔬菜腌制废水的处理研究也已经转向了嗜(耐)盐菌的工程利用，并在理论研究和工艺设计上取得了一些重大突破。但是，由于蔬菜腌制废水中含有较多的有机酸，废水偏酸性且pH波动较大，不利于嗜(耐)盐菌的生长，使得微生物处理系统无法稳定、有效地运行。现有普遍通过添加化学药剂来调节蔬菜腌制废水的pH，但这种方法存在以下两个问题：一是成本高，因为蔬菜腌制废水中含有较多的有机酸，酸度大，需要投加大量的药剂才能将废水pH调节至中性；二是产生了额外的污染，化学药剂的大量使用不仅增加了废水中的污染物量，而且会产生大量的污泥，这些污泥如果处理不当会造成二次污染。因此，迫切需要发展一种经济可行的新方法来对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理。

酵母菌因其独特的细胞结构，对外部环境具有较强的适应能力，具有较广的pH生长范围和高有机负荷耐受力；而有些被称为耐盐性酵母或渗透耐性酵母的酵母菌更是能在较高盐浓度的环境中生长。已有的研究发现Kluyveromyces fragilis、Saccharomyces cerevisiae、Candida utilis(Hang Y.D.，Splittstoesser D.F.，Landschoot R.L.(1972)，Appl.Environ.Microbiol.，24(6)：1007-1008)和Rhodotorula rubra(C.T.Shih，Y.D.Hang(1996)，Lebensm.-Wiss.u.-Techno.，29：570-572)不仅可以在泡菜废水中生长，而且可以通过自身的代谢活动将泡菜废水的酸度完全去除掉，同时对COD也有很好的去除效果。

因此，筛选合适的酵母菌，使其能够在对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的同时去除废水的部分COD，将是大幅降低蔬菜腌制废水处理成本的一种有效方式。

发明内容

本发明的一个目的在于克服目前用化学方法调节蔬菜腌制废水pH的缺陷，提供一株既可以对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理又具有较好的COD去除效果的酵母菌。

本发明所提供的对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的酵母菌株是假丝酵母菌G70(Candida thaimueangensis，或简写为C.thaimueangensis)，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3000，保藏日期为2009年4月2日。

假丝酵母菌G70从浙江慈溪某榨菜厂污水排放口泥样中分离得到。富集和分离培养基均为榨菜废水，将榨菜废水过滤、121℃灭菌30min即可，pH4.6，盐度3.5％(以NaCl计)，固体培养基加6％的琼脂；置于培养箱30℃培养。在液体培养基里，假丝酵母菌G70形成沉淀；在固体培养基里，该菌菌落呈米黄色，圆形，表面突起，不湿润，直径约2mm；细胞显微镜下(Olympus，BX40)该菌株呈现运动性，形态为椭圆形居多(3-5μm×2-3μm)，一端芽殖(见图1)。

经生物学特性研究，假丝酵母菌G70具有如下的生理特征：

1)兼性好氧；

2)温度生长范围为15-40℃，最适为25-30℃；

3)pH生长范围为3-10，最适为4-5；

4)盐度生长范围(以NaCl计)为0-10％，最适为0-2％。

对假丝酵母菌G70的26S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，发现与已知假丝酵母菌Candida thaimueangensis NBRC 101967^T的26S rRNA基因序列相似性大于99.2％，假丝酵母菌G70的26S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

假丝酵母菌G70可在液体发酵培养基如麦芽浸出粉培养基和察氏培养基上培养，优选麦芽浸出粉培养基，培养温度15-40℃；培养后可在4℃下短期保藏，若要长期保藏，则使用甘油冷冻管或冷冻干燥管保藏比较合适。上述麦芽浸出粉培养基的组成(w/V)为：干麦芽浸出粉0.3％、干酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％，pH约5.5，溶剂为水，固体培养基加2％琼脂。

本发明的另一个目的是提供一种使用假丝酵母菌G70(C.thaimueangensis)CGMCC No.3000对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的方法，包括以下步骤：

1)将假丝酵母菌G70接种于液体发酵培养基中(优选麦芽浸出粉液体培养基)进行活化培养，优选的培养条件为25-30℃活化培养18-24h；

2)将活化培养好的假丝酵母菌G70按1-10％(v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水中进行扩大培养，优选的培养条件为在25-30℃培养12-24h；

3)将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照1-10％(v/v)的接种量投加到蔬菜腌制废水处理池中，闷曝培养，至废水pH上升到7.0-8.0，污泥沉降比为10-20％，完成污泥培养；

4)根据实际工艺设计以连续进水或间歇进水方式对蔬菜腌制废水进行好氧处理，完成对废水的弱碱化处理。具体工艺参数可根据后续处理对废水pH的要求来设定。

上述方法步骤2)中，可先将活化培养好的假丝酵母菌G70按1-10％(v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水中在25-30℃进行适应性培养12-18h，再将适应性培养好的假丝酵母菌G70按1-10％(v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水进行扩大培养；扩大优选的培养条件为在25-30℃培养12-24h。

扩大培养可根据实际需要进行多次重复，直至液体培养的假丝酵母菌G70满足用量要求。

上述方法步骤3)中，假丝酵母菌G70按照1-10％(v/v)的接种量可一次性投加完成，也可在一定时间内分批投加完成。

上述方法步骤4)中，所述的间歇进水方式具体可采用SBR工艺对步骤3)中的蔬菜腌制废水进行处理，具体工艺参数例如处理周期、出水排水量、各段运行时间、温度等，可根据实际情况进行设定。

为保证假丝酵母菌G70的活性及处理效果，上述方法中蔬菜腌制废水的pH应不小于3.0(优选pH范围为3.0-7.0，更优选为3.5-5.0)，盐浓度以NaCl计应不大于10％。

本发明发现的假丝酵母菌G70CGMCC No.3000是一株盐度耐受能力强，pH生长范围广的菌株，生长代时短，菌体沉降性好；该菌株可利用自身的生长代谢使蔬菜腌制废水的pH在较短时间内由酸性上升至弱碱性，且能有效去除蔬菜腌制废水的部分COD。本发明提供的蔬菜腌制废水弱碱化处理方法工艺简单，成本低廉，快速有效，可应用于蔬菜腌制废水的预处理阶段，对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理。本发明大幅降低了蔬菜腌制废水的处理成本，有望在蔬菜腌制废水处理方面发挥重大作用。

附图说明

图1为假丝酵母菌G70CGMCC No.3000的显微镜照片，放大倍数1000倍；图中黑点为酵母菌。

图2为假丝酵母菌G70CGMCC No.3000生长曲线图，培养温度为30℃。

具体实施方式

实施例1、假丝酵母菌G70的分离筛选

将采自浙江慈溪某榨菜厂污水排放口泥样2g放在50ml经过滤的榨菜废水中，加入玻璃珠振荡打散，取上清液5ml加入到50ml经过滤的榨菜废水中，温度30℃，转速160rpm，摇床富集培养4天。将富集培养菌液用过滤、灭菌后的榨菜废水梯度稀释后涂布榨菜废水培养基平板，30℃静置培养4天；根据菌落形态挑取不同的单菌落接种到过滤、灭菌后的榨菜废水中，温度30℃，转速160rpm，摇床培养48h，筛选可使榨菜废水碱化的菌株；将可使榨菜废水碱化的菌株进行划线培养，得到单克隆，划线仍使用榨菜废水培养基平板。挑取单克隆转接到过滤、灭菌后的榨菜废水中，温度30℃，转速160rpm，摇床培养；待菌液生长至OD₆₀₀为0.3-0.6时，按2％(v/v)的接种量转接至装有300ml过滤除菌榨菜废水的锥形瓶中，温度30℃，转速160rpm，摇床培养48h，每6h取一次样测定菌液pH和COD(菌液6000rpm离心10min后收集上清，用连华科技的5B-3B型COD多元速测仪测定)，筛选得到碱化效果和COD去除效果最好的菌株假丝酵母菌G70(CGMCC No.3000)。

上述榨菜废水pH为4.6，盐度为3.5％(以NaCl计)，固体培养基加6％琼脂；灭菌条件为121℃，0.1MPa，30min。

实施例2、假丝酵母菌G70生长条件

1)生长温度范围：用接种环挑取假丝酵母菌G70到麦芽浸出粉培养基斜面(干麦芽浸出粉0.3％、干酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％，琼脂2％，pH自然(约5.5))，30℃恒温静置培养24-36h，出现乳白色的菌体；用接种环从斜面上挑取生长良好的菌体接种到装有麦芽浸出粉液体培养基(干麦芽浸出粉0.3％、干酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％，pH自然(约5.5))的锥形瓶中，温度30℃，转速160rpm，摇床培养，待菌液生长至OD₆₀₀为0.3-0.6时按2％(v/v)的接种量转接至新鲜的麦芽浸出粉培养基，测定假丝酵母菌G70的生长温度范围。温度梯度为：10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，转速160rpm，摇床培养，用紫外分光光度计测定菌液的OD₆₀₀。结果表明假丝酵母菌G70生长温度范围为15-40℃，最适为25-30℃。

2)生长盐浓度范围(以NaCl计)：分别向配制好的麦芽浸出粉液体培养基中加入不等量的NaCl，配制盐浓度梯度培养基，NaCl浓度梯度(m/v)为：0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％。将生长至对数期的假丝酵母菌G70按2％(v/v)的接种量转接至盐浓度梯度培养基，温度30℃，转速160rpm，摇床培养，用紫外分光光度计测定菌液的OD₆₀₀。结果表明假丝酵母菌G70的生长盐浓度范围(以NaCl计)为0-10％，最适为0-2％。

3)生长pH范围：分别向配制好的麦芽浸出粉液体培养基中加入盐酸或NaOH调节其pH，pH梯度为：2、3、4、5、6、7、8、9、10。将生长至对数期的假丝酵母菌G70按2％(v/v)的接种量转接至pH梯度培养基，温度30℃，转速160rpm，摇床培养，用紫外分光光度计测定菌液的OD₆₀₀。结果表明假丝酵母菌G70的生长pH范围为3-10，最适为4-5。

将活化后的假丝酵母菌G70按2％(v/v)的接种量转接至麦芽浸出粉培养基，温度30℃，转速160rpm，摇床培养，12小时可至对数生长期(见图2)。

实施例3：假丝酵母菌G70的26S rRNA基因的PCR扩增与序列测定

取新鲜菌液1ml，12000rpm离心1min，弃上清；向沉淀中加入100μl GTE溶液(25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖)在旋涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散；再加入650μlGTE溶液，振荡混匀。接着悬液中加入7.5μl的100mg/ml的溶菌酶至终浓度为1mg/ml，混匀，37℃温浴30min；然后再向悬液中加入7.5μl的10mg/ml的蛋白酶K至终浓度为0.1mg/ml，混匀，55℃温浴1h，中间轻缓颠倒离心管数次。温浴结束后向溶液中加入等体积(750μl)的苯酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心5min；将上清移至新的离心管中，然后再用苯酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次；取上清至新的离心管中(约500μl)，加入1/10体积的3M的NaAc(pH5.2)，混匀，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃静置30min沉淀DNA，取出，4℃、12000rpm离心10min；小心弃去上清液，用1ml的70％乙醇洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心5min，弃上清，将沉淀放入55℃烘箱中数分钟除去乙醇；然后用50μl含RNaseA(终浓度50μg/ml)的TE(pH8.0)溶解，37℃温浴30min，除去RNA；即可获得用于PCR的基因组DNA。扩增26S rRNA基因的一对通用引物如下：

正向(NL 1)：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’

反向(NL4)：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’

上述引物根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)26S rRNA基因序列做位置参照点(O′Donnell K.″The Fungal Holomorph：Mitotic，Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics，″1993，225-233，CAB International，Wallingford，UK)。PCR反应体系(50μl)为：10×buffer(Mg²⁺free)5μl，Mg²⁺(25mM)3μl，10μM引物各1μl，dNTP(10mM)0.5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，MiliQ水38μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性60s、52℃退火45s、72℃延伸75s；35个循环后72℃延伸5min。PCR产物纯化与序列测定由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。完成测定的26S rRNA基因部分片断有效长度为538bp，与菌株Candida thaimueangensis NBRC 101967^T的26SrRNA序列相似性大于99.2％，。假丝酵母菌G70CGMCC No.3000的26S rRNA序列如Seq ID No.1所示。

实施例4、假丝酵母菌G70弱碱化处理榨菜废水效果验证

按照实施例2的方法，用麦芽浸出粉体培养基将假丝酵母菌G70培养至对数期，按照10％的接种量(v/v)转接到过滤除菌的榨菜废水中进行适应性培养，温度30℃，转速160rpm，摇床培养18h。将适应性培养好的假丝酵母菌G70按照2％的接种量(v/v)转接到装有300ml过滤除菌榨菜废水中的锥形瓶中，温度30℃，转速160rpm，摇床培养24h；设置两份空白对照，对照1所用样品为过滤除菌后的榨菜废水，对照2所用样品为未过滤除菌的榨菜废水。实验结果表明，摇床培养条件下，假丝酵母菌G70可在24h内使榨菜废水pH上升至7.7左右，COD去除率为25-30％；对照样的pH和COD几乎没变化。

上述榨菜废水pH4.5，盐度3.5％(以NaCl计)。

实施例5、SBR工艺下用假丝酵母菌G70弱碱化处理榨菜废水

按照实施例4的方法，将适应性培养好的假丝酵母菌G70按照2％的接种量(v/v)转接到榨菜废水中进行扩大培养，温度30℃，转速160rpm，摇床培养18h；将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照5％的接种量(v/v)投加到有效容积为4L的自制SBR反应装置中，进行闷曝处理，至废水pH上升到7左右，污泥沉降比为15％，完成污泥培养。污泥培养完成后，启动SBR反应装置，一个处理周期为18h，包括进水0.5h，曝气反应14h，沉淀1h，出水0.5h，闲置2h；每次出水排水量为有效容积的85％(3.6L)，保持污泥沉降比在15％。连续运行两周，出水pH为6.7-7.3，COD去除率为30-35％。

上述榨菜废水pH4.5，盐度3.5％(以NaCl计)，环境温度为23-30℃。

实施例6、SBR工艺下用假丝酵母菌G70弱碱化处理笋干腌制废水

按照实施例5的方法，将扩大培养好的假丝酵母菌G70投加到有效容积为4L的自制SBR反应装置中，对笋干腌制废水进行弱碱化处理，一个处理周期为16h，包括进水0.5h，曝气反应14h，沉淀1h，出水0.5h；每次出水排水量为有效容积的85％(3.6L)，保持污泥沉降比在15％。连续运行两周，出水pH为7-7.5，COD去除率为35-45％。

上述笋干腌制废水pH为5-5.5，盐度2.8％(以NaCl计)，环境28-33℃。

实施例7、连续进水条件下用假丝酵母菌G70弱碱化处理榨菜废水

按照实施例5的方法，将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照1％的接种量(v/v)投加到有效容积为10立方的好氧处理池中，进行闷曝处理，至废水pH上升到7左右，污泥沉降比为15％，完成污泥培养。污泥培养完成后，开始连续进水处理，水力停留时间为16h，污泥龄为14d。连续检测一个月，进水pH为3.5-5，盐度为3-4％(以NaCl计)；出水pH为6.7-8，COD去除率为30-35％；环境温度25-35℃。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种酵母菌及其在蔬菜腌制废水弱碱化处理中的应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>538

<212>DNA

<213>Candida thaimueangensis

<400>Seq ID No.1

GCGGCGAGTG AAGCGGCAAG AGCTCAGATT TGAAATCGTG TTTCGGCACG AGTTGTAGAG    60

TGTAGGCGGG AGTGTCTGCG GCGGGCAGTG TCCAAGTCCC TTGGAACAGG GCGCCACTGA    120

GGGTGAGAGC CCCGTGGGAC GCTGCGCAAA GCTTTGAGAC CCTGCTGACG AGTCGAGTTG    180

TTTGGGAATG CAGCTCCAAG CGGGTGGTAA ATTCCATCTA AGGCTAAATA CTGGCGAGAG    240

ACCGATAGCG AACAAGTACT GTGAAGGAAA GATGAAAAGC ACTTTGAAAA GAGAGTGAAA    300

CAGCACGTGA AATTGTTGAA AGGGAAGGGT ATTGGGCCCG ACATGGGGAG TGCGCACCGT    360

TGCCTCTTGT AGGCGGCGCT CTGGGCGCTC TCTGGGCCAG CATCGGTTCT TGCTGCAGGA    420

GAAGGGGTGC CGGAACGTGG CTCTTCGGAG TGTTACAGCC GGCGCCAGAT GCTGCGTGCG    480

GGGGACCGAG GGCTGCGACT TATGTCTCGG ATGCTGGCAC AACGGCGCAA TACCGCCC      538

Claims (10)

1.一种假丝酵母菌(Candida thaimueangensis)G70，菌种保藏编号为CGMCC No.3000，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的假丝酵母菌(Candidathaimueangensis)G70，其特征在于：所述假丝酵母菌(Candidathaimueangensis)G70的26S rRNA序列如Seq ID NO.1所示。

3.一种使用权利要求1所述的假丝酵母菌(Candidathaimueangensis)G70对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的方法，包括以下步骤：

1)将假丝酵母菌G70接种于液体发酵培养基中进行活化培养；

2)将活化培养好的假丝酵母菌G70按1-10％(v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水中进行扩大培养；

3)将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照1-10％(v/v)的接种量投加到蔬菜腌制废水处理池中，闷曝培养，至废水pH上升到7.0-8.0，污泥沉降比为10-20％，完成污泥培养；

4)根据实际工艺设计以连续进水或间歇进水方式对蔬菜腌制废水进行好氧处理，完成对废水的弱碱化处理。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的液体发酵培养基为麦芽浸出粉液体培养基。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中培养条件为在25-30℃培养18-24h。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中可先将活化培养好的假丝酵母菌G70按1-10％(v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水中在25-30℃进行适应性培养12-18h，再将适应性培养好的假丝酵母菌G70按1-10％(v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水进行扩大培养。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的扩大培养条件为在25-30℃培养12-24h。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，扩大培养可根据实际需要进行多次重复，直至液体培养的假丝酵母菌G70满足用量要求。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中假丝酵母菌G70按照1-10％(v/v)的接种量可一次性投加完成，也可在一定时间内分批投加完成。

10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于：所述方法中蔬菜腌制废水的pH范围为3.0-7.0，盐浓度以NaCl计不大于10％。

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