CN110484583B - 燕窝活性肽及其抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种燕窝活性肽及其制备方法。该燕窝活性肽的制备方法包括对浸泡过的燕窝进行变性，将变性后的燕窝进行粉碎，将粉碎后的燕窝调节pH，然后加入蛋白酶，进行酶解，对酶解产物灭酶，过滤。本发明还提供了该燕窝活性肽在抗肿瘤等中的应用等。

Description

燕窝活性肽及其抗肿瘤应用

技术领域

本发明是中国专利申请第201910406255.0号(燕窝肽及其解聚耦合酶解的制备方法)和第201910409744.1号(燕窝小分子肽及其速溶肽粉)的继续申请，属于蛋白质和生物医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种燕窝活性肽及其制备方法和抗肿瘤应用。

背景技术

胶原蛋白(Collagen)是分布在人和动物体内的一种白色、不透明的蛋白质，存在于结缔组织中，约占体内蛋白质总量的1/3，与器官和机体衰老的功能有着密切的关系。胶原蛋白根据其类型可以分为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原、IV型胶原、Ⅴ型胶原蛋白等。其中Ⅰ型胶原蛋白与皮肤光泽，弹性，无皱等美容养颜特征最密切相关，主要分布于皮肤、肌腱等组织，占全部胶原蛋白含量的80-90％左右，是由2条COL1A1基因编码的α1链和1条COL1A2基因编码的α2链组成的三螺旋结构；Ⅴ型胶原蛋白是韧带的主要组成成分之一，同时也是肌腱的重要结构组成，与柔韧性相关，COL5A1基因编码Ⅴ型胶原蛋白的α1肽链。

MKI67(也称Ki-67)是细胞增殖相关的核蛋白基因，广泛表达于增殖期细胞而不表达于静止期细胞。目前临床研究证实，MKI67阳性肿瘤细胞的分数增高与多种恶性肿瘤的进展和预后相关。MKI67对前列腺癌、脑肿瘤,肾癌，神经细胞癌及乳腺癌等肿瘤的预后评价和癌症的复发有重要的参考价值，且MKI67在胃癌，卵巢癌等肿瘤中表达水平增高，并且与肿瘤患者的生存率关系密切，抑制MKI67基因表达的药用组合物可应用于多种癌症治疗或辅助治疗肿瘤，和/或预防肿瘤发生。

本发明人前期研究的成果——中国专利申请第201910406255.0号和第201910409744.1号，获得了两种解聚耦合酶解方法制备的燕窝活性肽，除了具有小分子肽易吸收等特点，而且药用、保健效果确切，能显著提高免疫力，而本发明人进一步研究发现，该燕窝活性肽具有抗肿瘤活性，而且具有一定的促进胶原蛋白分泌的功效。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的燕窝活性肽，不但其药用、保健效果确切，优于传统技术制备的燕窝产品，而且具有提高胶原蛋白分泌和抑制肿瘤等作用。另外，本发明还提供了该燕窝活性肽的制备方法和在诸如抗肿瘤等方面的应用。

具体而言，在第一方面，本发明提供了燕窝活性肽，其通过包括如下步骤的制备方法制备：

(1)取干净的燕窝，加水浸泡；

(2)对浸泡过的燕窝进行变性；

(3)将变性后的燕窝进行粉碎；

(4)将粉碎后的燕窝调节pH，然后加入蛋白酶，进行酶解；

(5)对酶解产物灭酶，过滤；和

(6)任选对过滤的酶解液进行浓缩、干燥。

优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(1)中，燕窝和水的重量比为1：40-80，优选为1：50-70，如1：60。

也优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(1)中，浸泡的时间为2-6小时，优选为3-5小时，如3小时。

本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(2)中变性的方法可以是物理方法，如加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射和/或超声波处理等，也可以是化学方法，如用强酸、强碱、尿素、重金属盐和/或十二烷基硫酸钠(SDS)等处理等，还可以是上述物理或化学方法中两种或两种以上的组合。在本发明的具体实施方式中，变性是加热变性。

优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(2)中，加热的温度为90-100℃，优选为95-100℃，如100℃。

也优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(2)中，加热的时间为10-60分钟，优选为20-40分钟，如30分钟。

本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(3)中粉碎的方法可以是超微粉碎、胶体磨粉碎、破壁粉碎、球磨机粉碎、均质机均质和/或高压均质机的一种或者几种的组合。在本发明的具体实施方式中，粉碎是均质。

优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(4)中，调节pH为调节pH至6.5-7.5或者调节pH至8.0～9.0。

优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(4)中，蛋白酶为碱性蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。在本发明的具体实施方式中，蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶。在本发明的另一个具体实施方式中，蛋白酶为碱性蛋白酶。

也优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(4)中，酶解的温度为25-60℃，优选为30-55℃，如50℃。

还优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(4)中，酶解的时间为1-6小时，优选为2-5小时，如3小时。

优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(5)中，灭酶的温度为80-100℃，优选为85-98℃，如95℃。

也优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(5)中，灭酶的时间为10-60分钟，优选为20-40分钟，如30分钟。

还优选在本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(5)中，过滤的膜孔径为150-200目，优选为180-200目，如200目。

在本文中，任选表示可以选择，也可以不选择。即，本发明第一方面的燕窝活性肽的制备步骤(6)是可以不被选择进行的，则本发明第一方面的燕窝活性肽存在于溶液中；也可以选择进行该步骤(6)，使得本发明第一方面的燕窝活性肽以固体形式存在。

在第二方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明第一方面的燕窝活性肽和药学上可接受的辅料。在本文中，术语“药学上可接受的辅料”包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与药物活性成分相容。运用药学上可接受的辅料制备药物制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的药物组合物包含本发明第一方面的燕窝活性肽作为活性成分，将该燕窝活性肽和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药形式，例如口服或经过皮肤等的给药形式，最优选是口服。

在第三方面，本发明提供了保健食品组合物，其包括本发明第一方面的燕窝活性肽和保健食品中可接受的辅料。在本文中，术语“保健食品中可接受的辅料”包括食品上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、调味剂、着色剂、增香剂等，它们与保健食品的保健活性成分相容。本发明第一方面的燕窝活性肽可以直接加入食品或者食品原料中，例如可以添加在含有或者不含有甜味剂的汤或羹中。

在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的燕窝活性肽的制备方法，其包括：

(1)取干净的燕窝，加水浸泡；

(2)对浸泡过的燕窝进行变性；

(3)将变性后的燕窝进行粉碎；

(4)将粉碎后的燕窝调节pH，然后加入蛋白酶，进行酶解；

(5)对酶解产物灭酶，过滤；和

(6)任选对过滤的酶解液进行浓缩、干燥。

优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(1)中，燕窝和水的重量比为1：40-80，优选为1：50-70，如1：60。

也优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(1)中，浸泡的时间为2-6小时，优选为3-5小时，如3小时。

优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(2)中，变性是加热变性。

优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(2)中，加热的温度为90-100℃，优选为95-100℃，如100℃。

也优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(2)中，加热的时间为10-60分钟，优选为20-40分钟，如30分钟。

优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(3)中，粉碎是均质。

优选在第四方面的制备方法的步骤(4)中，调节pH为调节pH至6.5-7.5或者调节pH至8.0～9.0。

优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(4)中，蛋白酶为碱性蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。在本发明的具体实施方式中，蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶。在本发明的另一个具体实施方式中，蛋白酶为碱性蛋白酶。

也优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(4)中，酶解的温度为25-60℃，优选为30-55℃，如50℃。

还优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(4)中，酶解的时间为1-6小时，优选为2-5小时，如3小时。

优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(5)中，灭酶的温度为80-100℃，优选为85-98℃，如95℃。

也优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(5)中，灭酶的时间为10-60分钟，优选为20-40分钟，如30分钟。

还优选在本发明第四方面的制备方法的步骤(5)中，过滤的膜孔径为150-200目，优选为180-200目，如200目。

在第五方面，本发明提供了本发明第一方面的燕窝活性肽在制备抗肿瘤的药物中的应用。在本发明的具体实施方式中，本发明第一方面的燕窝活性肽能够抑制MKI67基因的表达。所以相应地，本发明提供了本发明第一方面的燕窝活性肽在制备抑制MKI67基因表达的药物中的应用。

在第六方面，本发明提供了本发明第一方面的燕窝活性肽在制备促进胶原蛋白分泌的药物或保健食品中的应用。在本发明的具体实施方式中，本发明第一方面的燕窝活性肽能够促进COL1A1基因和COL5A1基因的表达。所以相应地，本发明提供了本发明第一方面的燕窝活性肽在制备促进COL1A1基因和/或COL5A1基因表达的药物或保健食品中的应用。

优选在本发明第五方面或第六方面的应用中，药物是本发明第二方面的药物组合物。

也优选在本发明第六方面的应用中，保健食品是本发明第三方面的保健食品组合物。

本发明的有益效果在于：提供了新的燕窝活性肽，其药用、保健效果确切，能显著促进胶原蛋白分泌和抑制肿瘤，效果显著优于传统方法制备的燕窝产品。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1是实施例1所得燕窝活性肽GPC凝胶渗透色谱图。

图2是实施例2所得燕窝活性肽GPC凝胶渗透色谱图。

图3是对比例所得传统燕窝GPC凝胶渗透色谱图。

图4显示了燕窝活性肽和传统方式制备的燕窝肽对成纤维细胞NIH-3T3 COL1A1基因表达的影响。

图5显示了燕窝活性肽和传统方式制备的燕窝对成纤维细胞NIH-3T3 COL5A1基因表达的影响。

图6显示了燕窝活性肽和传统方式制备的燕窝对成纤维细胞NIH-3T3 MKI67基因表达的影响。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

实施例1燕窝活性肽的示例性制备方法1

称取干燥燕窝(马来西亚白燕)10g，清洗干净后置于1000ml烧杯中，加入600ml纯化水，室温浸泡3小时。将浸泡过的燕窝连同水置于圆底烧瓶中，用电热套加热(100℃)变性30分钟，然后冷却至室温。将变性后的燕窝用均质机(MA60型号，可购自OuHor公司)以3000转/秒均质匀浆5分钟。将匀浆后的燕窝pH调节至7.0，然后加入20mg碱性蛋白酶(20万u/g酶活力，可购自南宁庞博生物工程有限公司)和20mg木瓜蛋白酶(80万u/g酶活力，可购自南宁庞博生物工程有限公司)，混匀后分装于500ml锥形瓶中，每瓶200ml，于50℃恒温摇床酶切3小时。将酶解产物加热至95℃，保持30分钟，使酶失活，然后，过200目滤布除杂，得澄清酶解液。最后，将酶解液浓缩，冷冻干燥得到燕窝活性肽粉9.3克。

如图1所示，经GPC凝胶渗透色谱检测，其中，207Da小分子肽含量为32.50％，673Da小分子肽含量为29.09％，1453Da小分子肽含量为9.65％，三者总含量71.23％。

实施例2燕窝活性肽的示例性制备方法2

称取干燥燕窝(马来西亚白燕)10g，清洗干净后置于1000ml烧杯中，加入600ml纯化水，室温浸泡3小时。将浸泡过的燕窝连同水置于圆底烧瓶中，用电热套加热(100℃)变性30分钟，然后冷却至室温。将变性后的燕窝用均质机(MA60型号，可购自OuHor公司)以3000转/秒均质匀浆5分钟。将匀浆后的燕窝pH调节至9.0，然后加入40mg碱性蛋白酶(20万u/g酶活力，可购自南宁庞博生物工程有限公司)，混匀后分装于500ml锥形瓶中，每瓶200ml，于50℃恒温摇床酶切3小时。将酶解产物加热至95℃，保持30分钟，使酶失活，然后，过200目滤布除杂，得澄清酶解液。最后，将酶解液浓缩，冷冻干燥得到燕窝活性肽粉9.4克。

如图2所示，经GPC凝胶渗透色谱检测，其中，188Da小分子肽含量为32.50％，619Da小分子肽含量为29.09％，1324Da小分子肽含量为9.65％，三者总含量71.33％。

对比例燕窝肽的传统制备方法

称取干燥燕窝10g，清洗干净后置于1000ml烧杯中，加入600ml纯化水，室温浸泡3小时，将浸泡过的燕窝连同水置于炖盅隔水(95℃)炖煮30分钟。为了能够进行GPC凝胶渗透色谱检测，将炖煮好的燕窝同样用均质机以3000转/秒均质匀浆5分钟。然后，过200目滤布，显然，大部分燕窝未能透过滤布，将透过滤布的燕窝溶液冷冻干燥，得2.3克干粉。

如图3所示，经检测，过滤后所得的燕窝溶液中分子量在200-2500Da之间的小分子肽的含量为0％。

效果实施例燕窝活性肽对成纤维细胞NIH-3T3分泌细胞外基质的影响

采用根据本发明实施例1制备的燕窝活性肽和对比例制备的燕窝肽，来观察对成纤维细胞NIH-3T3分泌细胞外基质的影响，具体实验如下：

1，实验方法

体外培养小鼠胚胎成纤维细胞株NIH-3T3。当细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至7×10⁴/ml。将细胞悬液接种到12孔细胞培养板中，每孔1ml，放置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养至密度大约在30-40％。

换含有工作浓度待测物的新培养基：

(1)正常组：加入与待测物对应体积的PBS。

(2)燕窝活性肽组：根据本发明实施例1制备的燕窝活性肽，设1μg/ml、50ng/ml两个浓度。

(3)燕窝组：根据本发明对比例制备的传统燕窝，设1μg/ml、50ng/ml两个浓度。

置培养箱中继续培养48h后，弃上清，加入1ml/孔的Trizol，裂解细胞，收样。

按照Reverse transcription PCR kit和Real-time PCR kit(Takara)说明书进行，分别检测COL1A1、COL3A1、COL5A1、MKI67基因的表达变化。

2，实验结果

数据以GAPDH为内参基因；正常组为对照样本。数据处理运算公式如下：

(1)应用内参基因对对照样本和待测样本进行校正

ΔCt(对照样本)＝Ct(目标基因)-Ct(GAPDH)

ΔCt(待测样本)＝Ct(目标基因)-Ct(GAPDH)

(2)对照样本和待测样本的ΔCt进行归一化

ΔΔCt＝ΔCt(待测样本)-ΔCt(对照样本)

(3)基因表达差异计算：RQ＝2^-ΔΔCt

RQ值低于0.5，为有效抑制；RQ值大于2，为有效促进。

COL1A1基因为Ⅰ型胶原蛋白的α1链的编码基因，COL1A1基因表达结果如图4所示：燕窝组与正常组相比，有促进COL1A1基因表达的趋势，但无显著性差异，而本发明的燕窝活性肽能够有效促进COL1A1基因的表达。

COL5A1基因为Ⅴ型胶原蛋白的编码基因，COL5A1基因表达结果如图5所示：与正常组相比，本发明的燕窝活性肽和低剂量的燕窝组都能够有效促进COL5A1基因的表达。

由结果可知，从总体上看，燕窝从基因层面确实有促进胶原蛋白分泌的功效，从而起到美容养颜的功效，而本发明的燕窝活性肽能够显著促进Ⅰ型胶原蛋白的COL1A1基因和Ⅴ型胶原蛋白COL5A1基因的表达，其中，促进Ⅰ型胶原蛋白的COL1A1基因表达的效果明显优于传统制备的燕窝肽。

另一方面，MKI67(也称Ki-67)是一种肿瘤特异性蛋白即肿瘤生物标志物，在多类肿瘤中表达，如乳腺癌，前列腺癌，脑癌，肾癌，神经细胞癌等。降低编码Ki-67基因的表达水平可以作为抑制肿瘤细胞生长或评价肿瘤疗效的一种手段。

MKI67基因表达的结果如图6结果所示：与正常组相比，燕窝组具有抑制该基因表达的趋势，但不具备显著性，而本发明的燕窝活性肽能够显著抑制MKI67基因的表达，表明本发明所述的燕窝活性肽具有抑制肿瘤的活性，可应用于治疗或辅助治疗肿瘤，和/或预防肿瘤发生。

Claims (13)

1.燕窝活性肽，其通过包括如下步骤的制备方法制备：

(1)取干净的燕窝，加水浸泡，其中，燕窝和水的重量比为1：40-80，浸泡的温度为15-30℃，浸泡的时间为2-6小时；

(2)对浸泡过的燕窝进行加热变性，其中，加热的温度为90-100℃，加热的时间为10-60分钟；

(3)将变性后的燕窝进行粉碎；

(4)将粉碎后的燕窝调节pH，然后加入蛋白酶，进行酶解，其中，调节pH为调节pH至6.5-7.5或者调节pH至8.0～9.0，蛋白酶为碱性蛋白酶和/或木瓜蛋白酶，酶解的温度为25-60℃，酶解的时间为1-6小时；

(5)对酶解产物灭酶，过滤，其中，灭酶的温度为80-100℃，灭酶的时间为10-60分钟，过滤的膜孔径为150-200目；和

(6)任选对过滤的酶解液进行浓缩、干燥。

2.权利要求1所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(1)中的燕窝和水的重量比为1：50-70；

步骤(1)中的浸泡的温度为22-26℃；和/或，

步骤(1)中的浸泡的时间为3-5小时。

3.权利要求2所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(1)中的燕窝和水的重量比为1：60；

步骤(1)中的浸泡的温度为室温；和/或，

步骤(1)中的浸泡的时间为3小时。

4.权利要求1所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(2)中的加热的温度为95-100℃；和/或，

步骤(2)中的加热的时间为20-40分钟。

5.权利要求4所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(2)中的加热的温度为100℃；和/或，

步骤(2)中的加热的时间为30分钟。

6.权利要求1所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(4)中的酶解的温度为30-55℃；和/或，

步骤(4)中的酶解的时间为2-5小时。

7.权利要求6所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(4)中的酶解的温度为50℃；和/或，

步骤(4)中的酶解的时间为3小时。

8.权利要求1所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(5)中的灭酶的温度为85-98℃；

步骤(5)中的灭酶的时间为20-40分钟；和/或，

步骤(5)中的过滤的膜孔径为180-200目。

9.权利要求8所述的燕窝活性肽，其中，

步骤(5)中的灭酶的温度为95℃；

步骤(5)中的灭酶的时间为30分钟；和/或，

步骤(5)中的过滤的膜孔径为200目。

10.组合物，其为药物组合物，其中所述药物组合物包括权利要求1-9之任一所述的燕窝活性肽和药学上可接受的辅料。

11.权利要求1-9之任一所述的燕窝活性肽在制备抑制MKI67基因表达的药物中的应用。

12.权利要求1-9之任一所述的燕窝活性肽在制备促进胶原蛋白分泌的药物中的应用。

13.权利要求1-9之任一所述的燕窝活性肽在制备促进COL1A1基因和/或COL5A1基因表达的药物中的应用。

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