CN110470776A - 一种海狗人参丸中非法添加物的筛查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种海狗人参丸中非法添加物的筛查方法。该筛查方法包括如下步骤：向海狗人参丸粉末样品中加入有机溶剂和水，微波辅助萃取，然后加入盐析剂，摇振，离心分相，取其上相吹干，溶解过滤后进行HPLC分析，并与海狗人参丸多维指纹图谱和非法添加物的色谱信息进行对比分析即可。本发明利用微波辅助盐析分相萃取结合多维指纹图谱的方法，用于海狗人参丸中非法添加物的筛查，通过对各组成因素的优化，确定了最佳萃取条件；根据非法添加物的光谱特征，对其色谱行为进行了研究，结合多批次海狗人参丸样品的色谱信息，获得了海狗人参丸的多维指纹图谱特征。本发明的筛查方法可检测16种非法添加物，筛查效率高，具有较佳的准确性和可靠性。

Description

一种海狗人参丸中非法添加物的筛查方法
技术领域
本发明属于检测与分析技术领域，具体涉及一种海狗人参丸中非法添加物的筛查方法。
背景技术
海狗人参丸(FSGP)是一种壮阳类保健品，其有效成分除海狗精粉外，还包括枸杞子、人参、山药、肉桂、淫羊藿和杜仲等多味中药，对性功能障碍有明显效果。目前市场上的海狗人参丸品牌众多，质量参差不齐，存在非法添加化学药物来增强药效的现象，长期服用含有这些非法添加物的保健品，可能会引起血压过低、休克、脑卒中等严重药物不良反应。常见的非法添加物包括5型磷酸二酯酶(PDE-5)抑制剂、雄性激素、α受体拮抗剂以及植物提取物，新型非法添加物还在不断涌现。多样的非法添加物和复杂的样品基质都对海狗人参丸的安全监测增加了困难。近年来，文献报道了多种方法用于补肾壮阳类保健品中非法添加物的检测，对于非法添加剂的验证大都依赖于标准或参考物质，对于未知伪品或不含标准物质的非法添加剂，其他复杂方法需要进一步确认。因此，开发一种高效、可靠且能够摆脱标准物质依赖的筛查方法很有发展前景。
指纹图谱技术因其特异性和代表性的特征，已被广泛应用于食品和药品的质量控制，在非法添加物筛查中的成功应用已有文献报道。HPLC是获取样品高通量信息的有力工具，通过各种分离和检测技术可以区分色谱间的特征差异。依靠色谱分离、光谱性质和样品特性，多样化的分离和歧视性检测可突出非法添加剂的存在。因此，基于在不同色谱条件下多波长检测得到的数据，构建多维指纹，通过指纹轮廓可轻易地识别外来的非法添加剂，大大提高准确性和可靠性，避免假阳性和假阴性结果。
由于中药本身成分复杂，各组分之间的理化性质也存在差异，而目前样品前处理方法滞后，大多采用单一溶剂萃取后测定，局限于有限的一类药效成分或少量成分的萃取，且会引入大量样品基质，干扰非法添加物的筛查。
因此，开发一种具有较高准确性和可靠性的多种非法添加物的筛查方法具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有指纹图谱技术对海狗人参丸中非法添加物的进行筛查局限于有限的一类药效成分或少量成分的萃取，干扰大，准确性和可靠性不佳的缺陷或不足，提供一种海狗人参丸中非法添加物的筛查方法。本发明利用微波辅助萃取—盐析分相萃取结合多维指纹图谱的方法，用于海狗人参丸中非法添加物的筛查，通过对盐析分相萃取各组成因素的优化，确定了最佳萃取条件；根据非法添加物的光谱特征，对其色谱行为进行了研究，结合多批次海狗人参丸样品的色谱信息，获得了海狗人参丸的多维指纹图谱特征。利用微波辅助萃取—盐析分相萃取对海狗人参丸中的非法添加物进行高效萃取，同时排除样品基质的干扰，多检测波长的使用则利于进一步降低基质干扰并突出非法添加物的特征。本发明提供的筛查方法可检测16中非法添加物，筛查效率高，具有较佳的准确性和可靠性。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种海狗人参丸中非法添加物的筛查方法，包括如下步骤：向海狗人参丸粉末样品中加入有机溶剂和水形成混合萃取溶剂体系，微波辅助萃取，然后加入盐析剂，摇振，离心分相，吹干，溶解过滤后进行HPLC分析，并与海狗人参丸多维指纹图谱数据库和非法添加物的色谱信息进行对比分析即可；
所述有机溶剂为丙酸乙酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯或氯仿；所述海狗人参丸粉末样品和有机溶剂的质量体积比不大于1:25mg/mL；所述有机溶剂和水的体积比不大于1:1；所述盐析剂为NaCl、Na2SO4、MgSO4、NH4Cl或硫酸铵；所述有机溶剂和盐析剂的体积质量比为1:1.6～4mL/g。
盐析分相萃取(Salting-out Phase Separating Extraction)是在传统液液萃取基础上发展而来的，该方法具有富集效率高、有机溶剂用量小、易放大等特点，是一种绿色的样品前处理技术，日益受到研究人员的重视。它是将少量的有机溶剂与大体积的水混合后形成均一的一相后加入到样品中进行萃取，萃取完成后加入适量的盐，使样品提取液分相，离心后收集有机相，目标物即转移到有机相中，而大极性物质则留在水相，从而实现除杂的目的，集提取、分离、纯化为一体，因而在食品、环境、生物样品、重金属离子及药品等的分析中得到广泛的应用。利用微波辅助萃取快速、高效、有机溶剂消耗小等优点，将其与盐析分相萃取相结合，将极大提高非法添加物的萃取效率，降低样品基质的干扰，进一步增加非法添加物筛查的准确性和可靠性。
目前，未有将盐析分相萃取与指纹图谱技术相结合对海狗人参丸中非法添加物进行筛查的相关报道。
本发明建立了一种微波辅助盐析分相萃取(Microwave-assisted salting-outphase separation extraction)结合多维指纹图谱的方法，用于海狗人参丸中非法添加物的筛查。通过对盐析分相萃取各组成因素的优化，确定了最佳萃取条件；根据16种非法添加物的光谱特征，对其色谱行为进行了研究，结合多批次海狗人参丸样品的色谱信息，获得了海狗人参丸的多维指纹图谱特征。利用微波辅助盐析分相萃取对海狗人参丸中的非法添加物进行高效萃取，同时排除样品基质的干扰，多检测波长的使用则利于进一步降低基质干扰并突出非法添加物的特征。基于此建立的海狗人参丸多维指纹图谱，可作为标准指纹图谱，根据图谱的差异对未知样品进行准确地筛查。
本发明提供的筛查方法可检测16种非法添加物，筛查效率高，具有较佳的准确性和可靠性。
优选地，所述混合溶剂萃取体系中海狗人参丸粉末样品和混合溶剂的质量体积比为1:50g/mL。
更为优选地，所述有机溶剂为碳酸二甲酯。
经过对比优化，以碳酸二甲酯作为有机溶剂具有环境友好，更佳的除杂效果好，16种非法添加物的回收率达到最高且趋于稳定。
优选地，所述混合溶剂萃取体系中海狗人参丸粉末样品和有机溶剂的质量体积比为1:25g/mL。
在该比值条件下，16种非法添加物的回收率达到最高且趋于稳定。
优选地，所述有机溶剂和水的体积比为1:8。
有机溶剂(有机相)和水相的相比(体积比)不大于1:1时盐析分相体系对大极性组分的除杂效果保持不变。但当有机溶剂和水相的相比(体积比)为1:8时，有机溶剂更多的溶解到水相中，增大了有机溶剂和非法添加物的接触面积，从而增加提取效率。
优选地，所述盐析剂为NaCl、Na2SO4、MgSO4、NH4Cl或硫酸铵中的一种或几种。
更为优选地，所述盐析剂为硫酸铵。
硫酸铵的盐析分相效果较好。
优选地，所述有机溶剂和盐析剂的体积质量比为2.5:8mL/g。
无机盐的用量影响到盐析后有机溶剂的体积，进而影响到回收率。在此比值关系下有机溶剂的析出体积较大，16种非法添加物的回收率最高。
优选地，所述非法添加物为伐地那非类、雄性激素类、育亨宾、α受体拮抗剂、红地那非类、他达拉非类、西地那非类、硫代那非类、他达拉非类和伐地那非类化合物中的一种或几种。
优选地，所述HPLC分析选用的色谱柱为YMC-Triart C18色谱柱；流动相选用流动相A：乙腈，流动相B：磷酸二氢钾水溶液；洗脱条件为：(0～15min,25～35％流动相A；15～25min,35％流动相A；25～45min,35～50％流动相A；45～60min,50％～65％流动相A。
更为优选地，所述色谱柱为YMC-Triart C18色谱柱，250×4.6mm，5μm。
更为优选地，所述HPLC分析的进样量为20μL，流速为1mL/min，
更为优选地，检测方法为DAD检测器记录色谱图，并用Chemstation软件对采集的数据进行处理；FLD检测器中检测信号分别在激发波长280或275nm和发射波长330或470nm下进行监测。
具体地，HPLC分析的条件为：YMC-Triart C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)，20μL样品在35℃下按以下洗脱程序完成分离分析：流动相为乙腈(A)和磷酸二氢钾水溶液(B，pH4.3)(0～15min,25～35％A；15～25min,35％A；25～45min,35～50％A；45～60min,50％～65％A)，流速为1mL/min；检测方法为DAD检测器记录色谱图，并用Chemstation软件对采集的数据进行处理；FLD检测器中检测信号分别在激发波长280或275nm和发射波长330或470nm下进行检测。
优选地，所述海狗人参丸多维指纹图谱数据库的建立及对比分析过程如下：
S1：在220nm的检测波长下利用紫外光谱检测测定多批次海狗人参丸样品的色谱信息，并拟合得到标准指纹图谱R0；HPLC分析结果与标准指纹图谱R0进行比对可对海狗人参丸中是否存在非法添加物作出初步判断；
S2：在230nm的检测波长下利用紫外光谱检测测定多批次海狗人参丸样品的色谱信息，得到海狗人参丸的一级指纹图谱，拟合得到标准指纹图谱R1；通过比较一级指纹图谱的差异，并与非法添加物的色谱定位比较，可初步直观的判定出非法添加物的存在；
S3：分别在246nm、278nm、280nm、284nm、294nm和355nm的检测波长下利用紫外光谱检测测定多批次海狗人参丸样品的色谱信息，得到海狗人参丸的二级指纹图谱，分别拟合得到标准指纹图谱R2、R3、R4、R5、R6和R7；通过比较二级图谱的差异，并与非法添加物的色谱定位比较，可对非法添加物进行进一步的确认；
S4：分别在激发波长280和275nm及发射波长330和470nm下进行监测,利用荧光检测测定多批次海狗人参丸样品的荧光光谱信息，得到海狗人参丸的二级指纹图谱，分别拟合得到标准指纹图谱R8和R9；通过比较二级图谱的差异，并与非法添加物的色谱定位比较，可对非法添加物进行筛查。
更为优选地，S3中在246nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R2用于伐地那非类和雄性激素类的确认；S3中在278nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R3用于育亨宾和α受体拮抗剂的确认；S3中在280nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R4用于红地那非类的确认；S3中284nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R5用于他达拉非类的确认；S3中294nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R6用于西地那非类的确认；S3中355nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R7用于硫代那非类的确认。
更为优选地，S4中激发波长280nm和发射波长330nm下进行检测得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R8用于他达拉非类的确认；S4中激发波长275nm和发射波长470nm下进行检测得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R9用于伐地那非类的确认。
更为优选地，测定的海狗人参丸样品的批次为11批。
优选地，利用相似度评价软件进行拟合。
优选地，S1～S4中利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行拟合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用微波辅助萃取、盐析分相萃取结合多维指纹图谱的方法，用于海狗人参丸中非法添加物的筛查，通过对盐析分相萃取各组成因素的优化，确定了最佳萃取条件；根据非法添加物的光谱特征，对其色谱行为进行了研究，结合多批次海狗人参丸样品的色谱信息，获得了海狗人参丸的多维指纹图谱特征。利用微波辅助萃取和盐析分相萃取对海狗人参丸中的非法添加物进行高效萃取，同时排除样品基质的干扰，多检测波长的使用则利于进一步降低基质干扰并突出非法添加物的特征。本发明提供的筛查方法可检测16中非法添加物，筛查效率高，具有较佳的准确性和可靠性。
附图说明
图1为多相萃取体系对非法添加物萃取效果对比；
图2为各萃取体系样品分析结果对比；
图3为不同碳酸二甲酯体积下16种非法添加物的回收率；
图4为不同用量水除杂效果对比色谱图；
图5为碳酸二甲酯体积变化规律；
图6为碳酸二甲酯体积随盐的加入的变化规律；
图7为盐的加入量对非法添加物回收率的影响；
图8为盐析分相萃取与甲醇提取效果的对比；
图9为11批次海狗人参丸220nm检测波长下指纹图谱；
图10为海狗人参丸230nm检测波长下的一级标准指纹图谱；
图11为海狗人参丸在不同检测波长下的二级标准指纹图谱；
图12为11批次海狗人参丸荧光二级标准指纹图谱；
图13为海狗人参丸中非法添加物筛查流程图；
图14为市售样品HPLC-UV色谱图与标准图谱以及16种常见非法添加物色谱图对比SS(Suspected sample)代表未知样品。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
盐析分相萃取条件优化
实施例1盐析分相萃取条件优化
本实施例提供一种筛选方法，具体如下：
11批次海狗人参丸通过实体商店及网络渠道购买，样品详细信息见表1。准确称取粉碎的样品粉末0.1g于密闭微波提取罐中，分别加入一定量的有机溶剂和水，振摇使其充分互溶，于70℃下提取10min，冷却至室温后加入一定量的无机盐，振摇，待其完全溶解后转移至50mL离心管中，3500rpm/min离心5min后取有机相氮气吹干，适量甲醇溶解后用0.22μm滤膜过滤，进行HPLC分析。
HPLC分析的过程如下：选用的色谱柱为YMC-Triart C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)，20μL样品在35℃下按以下洗脱程序完成分离分析：流动相为乙腈(A)和磷酸二氢钾水溶液(B，pH4.3)(0～15min,25～35％A；15～25min,35％A；25～45min,35～50％A；45～60min,50％～65％A)，流速为1mL/min；检测方法为DAD检测器记录色谱图，并用Chemstation软件对采集的数据进行处理；FLD检测器中检测信号分别在激发波长280或275nm和发射波长330或470nm下进行监测。
本实施例对盐析分相萃取条件进行优化，具体包括(1)萃取剂(即有机溶剂)类型筛选；(2)萃取剂体积筛选；(3)水的体积考察；(4)无机盐及其用量筛选；(5)盐析分相萃取与甲醇和水萃取效果对比。
表1 11批次海狗人参丸的样品信息
(1)萃取剂类型筛选
合适的萃取剂对萃取体系的形成和萃取效率至关重要。一方面，萃取剂不仅能在一定条件下溶于水又能在盐析作用下与水相完全分离，从而除去极性较大的组分；另外，待测组分在萃取剂中的溶解度要远大于在水中的溶解度，同时尽可能少的引入干扰组分。本实施例分别考察了戊醇(amyl alcohol)、丙酸乙酯(ethyl propionate)、碳酸二甲酯(dimethyl carbonate)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、碳酸二乙酯(diethyl carbonate)、乙酸丁酯(butyl acetate)、氯仿(chloroform)共7种加入适量的有机溶剂与水按相比1:1的分相萃取溶剂体系进行筛选。
各体系对16种非法添加物的萃取率结果见图1。
由图1可知，碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯和丙酸乙酯对除育亨宾和酚妥拉明以外的非法添加物都有比较高的萃取率，而碳酸二甲酯、氯仿和戊醇对育亨宾、酚妥拉明有相对较高回收率。7种萃取体系有机相检测图谱对比结果见图2。
从图2中可以看出，采用有机溶剂与水的混合溶剂分相萃取后样品中大极性成分含量大大减少，对非法添加物检测的干扰降低，其中以丙酸乙酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯和氯仿效果最为明显，从试剂的环境友好性、除杂效果及回收率等方面考虑，最终选择碳酸二甲酯-水萃取溶剂萃取体系。
(2)萃取剂体积筛选
为充分萃取产品中的非法添加物，须保证足够的萃取剂体积。在取样量为0.1g的情况下，考察了碳酸二甲酯体积为1mL、1.5mL、2mL、2.5mL和3mL时与水按1:1体积比混合后16种非法添加物的回收率，结果见图3。
由图3可知，当碳酸二甲酯体积达到2.5mL以后，16种非法添加物的回收率达到最高且趋于稳定，故选择2.5mL碳酸二甲酯作为最佳体积。
(3)水的体积考察
分相的目的在于将样品提取液中的大极性组分分流到水相中，而水的用量则影响到除杂效果。由于碳酸二甲酯与水不能任意比互溶，若碳酸二甲酯不能完全分散到水相中，则会严重影响萃取非法添加物的效率。因此，本实验固定了碳酸二甲酯的体积，通过改变水的用量，考察了不同相比的除杂效果，考察结果见图4。由图4中可以看出，相比在1:1以后萃取体系对大极性组分的除杂效果保持不变。
此外，当水相对于碳酸二甲酯的体积比增加时，碳酸二甲酯逐渐溶解到水相中，这将大大增加提取时碳酸二甲酯与非法添加物的接触面积，从而增加提取效率。图5表明当碳酸二甲酯与水的体积比达到1:8的时候，碳酸二甲酯几乎完全溶解到水相中，因此选择体积比为1:8，即加入20mL水。
(4)无机盐用量筛选
本实施例以硫酸铵为例，考察硫酸铵的用量的影响。硫酸铵的用量影响到盐析后碳酸二甲酯的体积，进而影响到回收率。本实验首先对碳酸二甲酯的体积随着硫酸铵的加入量的变化进行考察。
结果见图6。从图中可以看出，随着盐加入量的不断增多，碳酸二甲酯的体积也在增加，且由下相转移至上相。
由图6可知，当硫酸铵加入量在3g以前，碳酸二甲酯的体积变化非常剧烈，随后趋缓，当达到11.25g时，碳酸二甲酯的体积达到最大，为2.35mL，此时绝大部分碳酸二甲酯已经析出。计算加入不同质量硫酸铵时16种非法添加物的回收率，结果见图7。
由图7可明显的看到，随着硫酸铵加入量的增加，16种非法添加物的回收率经历了一个先增加后减少的过程，当加入8g硫酸铵回收率达到最大，故选择加入8g硫酸铵用于析出碳酸二甲酯。
(5)盐析分相萃取与甲醇提取效果对比
采用单一溶剂萃取，能够获取较为全面的样品信息，但缺乏选择性，易引入干扰。海狗人参丸中非法添加物多为弱极性物质，因此样品信息中大极性组分的存在，会为筛查带来不便，而盐析分相萃取的使用则能很好的解决这一问题。
按照常规方法，分别采用单一溶剂甲醇(2.5mL)和本法进行了样品萃取对比试验。
由图8可以看出，水相的存在使大极性组分与非法添加物所在的有机相分离，简化了图谱，降低了样品基质信息的干扰，同时保留了目标物信息不丢失，并且提高了非法添加物的响应，分析时间更短，筛查的效率更高。
实施例2海狗人参丸多级指纹图谱数据库的建立
本实施例提供海狗人参丸多级指纹图谱数据库的建立，具体包括紫外光谱检测和荧光光谱检测。
其中紫外光谱检测的过程如下：DAD检测器记录色谱图，并用Chemstation软件对采集的数据进行处理。
荧光光谱检测的过程如下：FLD检测器中检测信号分别在激发波长280或275nm和发射波长330或470nm下进行检测。
(1)海狗人参丸光谱特征
对海狗人参丸和16种非法添加物的光谱特征进行研究发现，在220nm检测波长下所获得的海狗人参丸样品以及非法添加物的信息最为丰富，可在此波长获得11批次海狗人参丸样品色谱信息，结果见图9。通过相似度评价软件拟合得到标准指纹图谱R0，根据图谱的差异，可对海狗人参丸中是否存在非法添加物作出初步判断。
(2)海狗人参丸的一级指纹图谱
通过与R0进行比对，对存在差异的样品进行非法添加物的筛查。首先根据16种常见非法添加物的光谱图，在保证所有非法添加物都有较高响应的基础上选择230nm作为通用检测波长，对11批次样品进行检测，得到海狗人参丸的一级指纹图谱，见图10(a)，拟合可获得其标准指纹图谱R1，通过比较一级指纹图谱的差异，经过与16种非法添加物的色谱定位比较，见图10(b)，可初步直观的判定出非法添加物的存在。
(3)海狗人参丸的二级指纹图谱
通过检测波长的选择来降低样品基质的干扰，并凸显非法添加物的特征，从而提高检测的灵敏度。对不同类别的非法添加物，分别选择相应的特征波长，其中伐地那非类和雄性激素类：246nm；育亨宾和α受体拮抗剂：278nm；红地那非类：280nm；他达拉非类：284nm；西地那非类：294nm；硫代那非类：355nm，并进行标准指纹图谱R的拟合，依次命名为R2、R3、R4、R5、R6和R7，相似度均大于0.9，满足要求。在一级指纹图谱筛查的基础上，对非法添加物进行进一步的确认，其结果见图11。
相较与紫外检测器，荧光检测器的选择性和灵敏度更高，可极大简化图谱，同时提高筛查的灵敏度和准确性。对于他达拉非类和伐地那非类化合物，可利用荧光检测器获取海狗人参丸的荧光指纹图谱，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》拟合得到的标准指纹图谱为R8和R9，结果见图12。由图中可以看出，荧光指纹图谱样品信息大幅减少，便于非法添加物的筛查。
(4)海狗人参丸的多级指纹图谱筛查流程
对于海狗人参丸待测样品中非法添加物的筛查，大致流程见图13，其一般步骤为：依据上述样品制备方法(盐析分相萃取最佳条件，具体为：准确称取粉碎的样品粉末0.1g于密闭微波提取罐中，分别加入2.5mL碳酸二甲酯和20mL水，振摇使其充分互溶，于70℃下提取10min，冷却至室温后加入8g硫酸铵，振摇，待其完全溶解后转移至50mL离心管中，3500rpm/min离心5min后取碳酸二甲酯相氮气吹干，适量甲醇溶解后用0.22μm滤膜过滤，进行HPLC分析：选用的色谱柱为YMC-Triart C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)，20μL样品在35℃下按以下洗脱程序完成分离分析：流动相为乙腈(A)和磷酸二氢钾水溶液(B，pH4.3)(0～15min,25～35％A；15～25min,35％A；25～45min,35～50％A；45～60min,50％～65％A)，流速为1mL/min；检测方法为DAD检测器记录色谱图，并用Chemstation软件对采集的数据进行处理；FLD检测器中检测信号分别在激发波长280或275nm和发射波长330或470nm下进行监测)，结合紫外和荧光检测手段，首先获得待测样品的多级指纹图谱，拟合得到标准图谱后进行相似度评价，通过图谱的差异对非法添加物进行筛查，见图13。
(5)方法学考察
对实施例2(4)中提供的筛查流程进行方法学考察，具体过程如下。
按照上述样品提取方法，加入不同浓度的16种非法添加物标准品，以样品基质信号的3倍和光谱匹配度达到950时非法添加物的最低浓度作为该非法添加物的鉴定检出限。取16种非法添加物的混合标准溶液，配制一系列不同浓度的溶液进行HPLC-UV和HPLC-RF检测，进样量为20μL，用峰面积A对相应的浓度C作标准曲线，以标准曲线的相关系数R2达到0.999以上时的浓度作为线性范围；对混合标准溶液进行不断稀释，以信号与噪声的比值达到3时的浓度作为检测限。在HPLC-RF的一级和二级以及HPLC-UV方法分别进行了方法学考察，结果见表2。
表2 方法学考察结果
实施例3海狗人参丸多级图谱的应用
利用对实施例2(4)中提供的海狗人参丸多级图谱筛选方法，对市场上在售的5个样品进行了筛查，结果见图14。由图14(a)可以清晰地看出未知样品的HPLC-UV指纹图谱中，除SS3出现了若干未知峰以外，其余四个与R0基本保持一致；图14(b)显示了SS5可能中存在睾丸素，二级指纹图谱(图14(c))进一步确认了它的存在，光谱匹配结果见表3。由表3可看出，睾丸素的光谱匹配度高于950，因此可确认样品5中存在睾丸素。检测结果经过三次平行实验验证，含量计算结果表明睾丸素的含量在20.5μg/g，RSD为5.71％。样品应用实验表明所建立的海狗人参丸多维指纹图谱方法准确、可靠、有效，能够满足非法添加物的检测。
表3 待测样品中非法添加物检测结果
本发明建立了一种微波辅助盐析分相萃取结合多维指纹图谱的方法，用于海狗人参丸中非法添加物的筛查。以非法添加物的回收率和除杂效果为指标，对影响该体系的关键因素进行了考察，确定了最佳萃取条件。根据5型磷酸二酯酶(PDE-5)抑制剂、雄性激素、α受体拮抗剂以及植物提取物等16种非法添加物的光谱特征，结合紫外和荧光两种检测手段，在降低样品基质干扰的同时突出了非法添加物的特征。利用上述样品前处理和检测方法，通过对11批次样品的研究，获得了海狗人参丸的多维指纹图谱特征，对样品中的非法添加物进行分级筛查，在实际应用中取得很好效果，是一种简单、高效的非法添加物筛查方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海狗人参丸中非法添加物的筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：向海狗人参丸粉末样品中加入有机溶剂和水形成混合溶剂萃取体系，微波辅助萃取，然后加入盐析剂，摇振，离心分相，上相吹干，溶解过滤后进行HPLC分析，并与海狗人参丸多维指纹图谱和非法添加物的色谱信息进行对比分析即可；
所述有机溶剂为丙酸乙酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯或氯仿；所述混合溶剂萃取体系中海狗人参丸粉末样品和混合溶剂的质量体积比不大于1:25g/mL；所述有机溶剂和水的体积比不大于1:1；所述有机溶剂和盐析剂的体积质量比为1:1.6～4mL/g。
2.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述有机溶剂为碳酸二甲酯；所述混合溶剂萃取体系中海狗人参丸粉末样品和有机溶剂的质量体积比为1:25g/mL。
3.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述有机溶剂和水的体积比为1:8。
4.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述盐析剂为所述盐析剂为NaCl、Na2SO4、MgSO4、NH4Cl或硫酸铵中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述有机溶剂和盐析剂的体积质量比为2.5:8mL/g。
6.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述HPLC分析选用的色谱柱为YMC-Triart C18色谱柱；流动相选用流动相A：乙腈，流动相B：磷酸二氢钾水溶液；洗脱条件为：0～15min，25～35％流动相A；15～25min，35％流动相A；25～45min，35～50％流动相A；45～60min，50％～65％流动相A。
7.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述非法添加物为伐地那非类、雄性激素类、育亨宾、α受体拮抗剂、红地那非类、他达拉非类、西地那非类、硫代那非类、他达拉非类和伐地那非类化合物中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述筛查方法，其特征在于，所述海狗人参丸多维指纹图谱数据库的建立及对比分析过程如下：
S1：在220nm的检测波长下利用紫外光谱检测测定多批次海狗人参丸样品的色谱信息，拟合得到标准指纹图谱R0；HPLC分析结果与标准指纹图谱R0进行比对可对海狗人参丸中是否存在非法添加物作出初步判断；
S2：在230nm的检测波长下利用紫外光谱检测测定多批次海狗人参丸样品的色谱信息，得到海狗人参丸的一级指纹图谱，拟合得到标准指纹图谱R1；通过比较一级指纹图谱的差异，并与非法添加物的色谱定位比较，可初步直观的判定出非法添加物的存在；
S3：分别在246nm、278nm、280nm、284nm、294nm和355nm的检测波长下利用紫外光谱检测测定多批次海狗人参丸样品的色谱信息，得到海狗人参丸的二级级指纹图谱，分别拟合得到标准指纹图谱R2、R3、R4、R5、R6和R7；通过比较一级图谱的差异，并与非法添加物的色谱定位比较，可对非法添加物进行进一步的确认；
S4：分别在激发波长280nm和275nm及发射波长330nm和470nm下进行检测，利用荧光检测测定多批次海狗人参丸样品的荧光光谱信息，得到海狗人参丸的二级指纹图谱，分别拟合得到标准指纹图谱R8和R9；通过比较一级图谱的差异，并与非法添加物的色谱定位比较，可对非法添加物进行筛查。
9.根据权利要求8所述筛查方法，其特征在于，S3中在246nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R2用于伐地那非类和雄性激素类的确认；S3中在278nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R3用于育亨宾和α受体拮抗剂的确认；S3中在280nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R4用于红地那非类的确认；S3中284nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R5用于他达拉非类的确认；S3中294nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R6用于西地那非类的确认；S3中355nm检测波长下得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R7用于硫代那非类的确认。
10.根据权利要求8所述筛查方法，其特征在于，S4中激发波长280nm和发射波长330下进行检测得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R8用于他达拉非类的确认；S4中激发波长275nm和发射波长470nm下进行检测得到的二级指纹图谱和标准指纹图谱R9用于伐地那非类的确认。
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