CN110468131B

CN110468131B - 基于美洲大蠊Orco基因设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110468131B
Application number: CN201910742626.2A
Authority: CN
Inventors: 李娜; 李胜; 黄润
Original assignee: Guangmeiyuan R & D Center Key Laboratory Of Insect Developmental Biology And Applied Technology Huashi Meizhou City; South China Normal University
Current assignee: Guangmeiyuan R & D Center Key Laboratory Of Insect Developmental Biology And Applied Technology Huashi Meizhou City; South China Normal University
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: CN110468131A

Abstract

本发明公开了基于美洲大蠊Orco基因设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用，所述dsRNA为由如Seq ID No.1所示的核苷酸序列作为正义链及由与Seq ID No.1所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成反义链的双链RNA。所述dsRNA可广泛应用于制备防治美洲大蠊、干扰美洲大蠊化学通讯或控制美洲大蠊成虫交配繁殖的产品或防控美洲大蠊及其他具有相同基因靶标序列的昆虫中。通过阻断美洲大蠊嗅觉系统的关键基因，抑制性信息素对雄虫的诱导作用，可有效控制美洲大蠊的交配和繁殖，为美洲大蠊的防控提供了新的技术和策略。

Description

基于美洲大蠊Orco基因设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及卫生害虫防治领域，具体涉及基于美洲大蠊Orco基因设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用。

背景技术

蟑螂是一类重要的世界性卫生害虫，对人类健康和公共卫生造成严重危害。蟑螂携带多种病原微生物，可引发霍乱、炭疽、结核等传染性疾病。蟑螂排泄物和虫蜕也是重要的过敏原，容易导致皮疹、哮喘等过敏反应。因此，从源头遏止蟑螂的繁殖和种群扩张成为卫生害虫防治领域中亟需解决并渐趋紧迫的重要问题。

美洲大蠊(Periplaneta americana L.)是蜚蠊目蟑螂中最常见种之一，也是华南地区优势种群，具有超强的环境适应能力和生命力，惊人的繁殖力和解毒能力。美洲大蠊在我国已发展为城镇蟑螂群落的优势物种，加之全球温室效应逐渐增强，危害和爆发频率逐年加重并且有不断北迁的趋势。目前对美洲大蠊防治仍主要依赖于传统的化学农药，但抗药性、药剂残留和再猖獗等问题日益攀升，严重威胁着人畜健康和生态环境。因此，发掘新的生物防治方法、探索新的美洲大蠊防治策略势在必行。

交配行为是昆虫实现个体繁殖和种群扩张的关键环节，而雌雄具有不同的交配行为特征。如在交配前，美洲大蠊雌虫会展露性腺并释放挥发性气味，激发雄虫产生性兴奋，增加触角摆动频率，增强虫体活动能力，从而形成定位、探查、趋近、交尾等一系列交配行为。在此过程中，对外界气味化合物(或性信息素)的识别是引起交配行为的首要条件。

昆虫嗅觉系统是识别气味化合物，尤其是性信息素的主要感知系统，包括中枢神经系统和外周神经系统，其中触角是外周神经系统的延伸。昆虫对外界的气味分子的识别主要依赖于触角。触角表面分布着不同类型的嗅觉感受器(俗称感觉毛)，感受器的表皮上有许多孔隙，外界气味分子可以通过孔隙进入到感受器中。嗅觉感受器的外部形态有所不同，但具有相似的内部结构。感受器典型结构是其内的一个或者多个神经元细胞的树突伸到表皮外部的腔内形成外树突节，外树突节浸在淋巴液中。

嗅觉受体(odorant receptors，OR)是识别外界气味分子的关键蛋白，可将化学信号转变为电信号，最终传入中枢神经系统。嗅觉受体还是一类位于神经元树突膜上的跨膜蛋白，具有疏水特性，一般包含350-450个氨基酸，通常N-端在胞内，C-端在胞外。嗅觉受体可分为两大类：一类是在不同昆虫间具有高度变异性，同源性极低，称为传统气味受体(conventional odorant receptor)，其中包括了普通气味受体(general odorantreceptor)和性信息素受体(pheromone receptor，PR)；另一类是在不同昆虫间高度保守的非典型气味受体，亦称气味受体辅助受体或复合受体(odorant receptor co-receptor，Orco)，它们的结构和功能非常保守，可与各种传统嗅觉受体形成异源二聚体，辅助后者在嗅觉神经元上正确定位，发挥共受体的功能。普通嗅觉受体只有与高度保守的Orco共同形成特异性的阳离子通道，才可识别特定的外界气味分子。

鉴于昆虫Orco基因特殊的功能地位，其表达水平的变化对于嗅觉识别，以及相应的行为发生和变化具有十分重要的作用。然而，目前为止，关于Orco的功能探索主要集中基因鉴定、基因分化、嗅觉编码及进化等基础研究领域；研究对象多集中在完全变态昆虫，例如果蝇、蚊虫、蛾类等；行为分析仅见于昆虫聚集、排斥、迁飞等方面，对于交配行为，尤其是Orco基因在蜚蠊目昆虫交配行为机制的功能研究非常有限。因此，探究美洲大蠊交配行为相关的Orco分子的调控作用，不仅可以加深以往对于挥发性信息素-受体调控机制的理解，还有望揭示Orco在美洲大蠊交配行为中的关键作用。预期研究结果不仅是昆虫行为研究领域的重要突破，而且为未来寻求新的生物防治蟑螂方法和策略及为高效、安全、绿色的有害生物综合防治提供新理论和新思路。

发明内容

本发明的所要解决的第一个技术问题在于：提供一种能够用于防控昆虫的的dsRNA。

本发明的所要解决的第二个技术问题在于：提供上述dsRNA的制备方法。

本发明的所要解决的第三个技术问题在于：提供编码上述dsRNA的基因及含有该编码基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

本发明的所要解决的第四个技术问题在于：提供上述dsRNA的应用。

为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案为：基于美洲大蠊Orco基因设计的dsRNA，所述dsRNA为由如Seq ID No.1所示的核苷酸序列作为正义链及由与Seq ID No.1所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列作为反义链组成的双链RNA。

为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案为：上述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：将核苷酸序列如Seq ID No.5所示的DNA片段克隆到载体中，基于克隆后的载体设计引物并进行PCR扩增，将PCR扩增产物转录合成即得。

优选地，将核苷酸序列如Seq ID No.5所示的DNA片段克隆到pMD18-T载体，命名为pMD18-T-Orco，然后以pMD18-T-Orco为模板，设计两端含有T7启动子的引物1和引物2，进行PCR扩增，将PCR产物转录合成得到dsRNA；

其中，引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，引物2的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。

为解决上述第三个技术问题，本发明的技术方案为：编码上述dsRNA的基因。

上述基因的制备方法，包括以下步骤：基于上述基因设计包含有T7启动子引物对进行PCR扩增即得。

含有上述基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。

为解决上述第四个技术问题，本发明的技术方案为：上述dsRNA在制备用于防治美洲大蠊、干扰美洲大蠊化学通讯或控制美洲大蠊成虫交配繁殖的产品中的应用。

上述dsRNA在防治美洲大蠊或控制美洲大蠊交配繁殖中的应用。

一种防控美洲大蠊的方法，包括以下步骤：将上述dsRNA导入到美洲大蠊雄虫体内。

进一步地，所述导入操作为注射操作；优选地，所述注射操作为以显微注射的方式注入到美洲大蠊雄虫的腹腔中。

进一步地，所述导入操作也可以为饲喂等其他导入方式。

更优选地，所述注射操作是从沿腹部从下往上方向的第3至第4腹节处注入。

进一步地，导入操作是在羽化后的第三天。

优选地，所述方法还包括在羽化后的第五天重复导入操作一次。

本发明的有益效果在于：本发明方案通过阻断美洲大蠊嗅觉系统的关键基因，抑制性信息素对雄虫的诱导作用，可有效控制美洲大蠊的交配和繁殖，为美洲大蠊的防控提供了新的技术和策略，设计的dsRNA能够抑制美洲大蠊Orco基因表达，通过降低美洲大蠊嗅觉复合受体基因Orco的表达，从而实现对美洲大蠊交配和繁殖的控制，通过将具有抑制Orco基因表达的物质导入到美洲大蠊昆虫体内，通过合成特异的dsRNA来靶向嗅觉复合受体基因Orco，以干扰雄性美洲大蠊接受雌性美洲大蠊所释放的性信息素，从而达到阻断美洲大蠊雌雄体的正常两性交配，最终达到防治美洲大蠊的目的，提供了一种开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法。

附图说明

图1为本发明实施例2中Orco基因在不同组织中的干扰效果验证结果图；

图2为本发明实施例2中Orco基因干扰对雄虫交配时间影响的测试结果图；

图3为本发明实施例2中Orco基因干扰后对雌虫挥发性气味选择趋向性测试结果图；

图4为本发明实施例2中Orco基因干扰后美洲大蠊雄虫的吸引指数测试结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

本发明实施例1为：一种基于美洲大蠊Orco基因设计的dsRNA，该dsRNA的核苷酸序列的正义链序列如Seq ID No.1所示，反义链序列为由与Seq ID No.1所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列，正义链序列具体如下：CACCAAGCGGAAGAUGUAAACGAUCUCACAGCCAAUACAAUCACCGUGCUAUUCUUCGUUCAUUCCAUUACCAAGUUCUUUUACUUCGCGAUCCGAAGAAACAAGUUCUACAGGACGCUGGCCACAUGGAACAACGCAAACAGCCAUCCUCUGUUUGCUGAGAACCAUGCCAGACAUCACGCCACGGCUGUGGGAAGCAUGAGACGAUUGGUUAUGUACGUGGUUGCCGUCACUGUGUUGAGCGGAUUUGCUUGGACUGGCAUCACGUUCGUAGGAGAUAGUGUCCAUGAGAUUGCUGACCCCGAGAAUGCUAAUGAGACGAUUAUCGAGGAGUUGCCGCGUCUCAUGGUGAGAUCGUGGUACCCCUGGAACGCCAUGUCAGGAGGAGGAUACUUCGUUUC。其制备过程如下：

通过对嗅觉受体Orco基因的序列(Seq ID No.2)进行了分子克隆，并对DNA测序检验了序列的真实性和同源性，以此利用体外合成的方法获得质量合格、效果可靠的美洲大蠊Orco基因的dsRNA产物。

一、美洲大蠊品系的维持

美洲大蠊品系采购于腾飞育种基地(安徽，中国)，实验室长期将其饲喂于透气性良好的塑料箱中，饲养环境为温度28+1℃、相对湿度70％-80％、光周期合理(亮：暗＝12h:12h)的封闭温室。并定期按时按量给予美洲大蠊充足的狗粮(购自艾嘉生物科技，天津)和饮用水。分拣羽化后的雌雄虫，按需进行交配以维持种群的数量和规模。

二、基因克隆和序列分析

取性成熟美洲大蠊的触角(antenna)、口器(mouthparts)和跗骨(tarsus)的样品均经液氮研磨后放入TRIzol试剂(Life technologies,Carlsbad,CA,USA)中，按照标准流程提取上述样品的总RNA。使用NanoDrop One微量分光光度计(Thermo FisherScientific,Waltham,Massachusetts,USA)测定样本RNA的浓度，并进行电泳检测。采用TURBO DNA酶(Life technologies,Carlsbad,CA,USA)处理样本中残留的基因组DNA后，统一起始浓度为1μg的RNA作为合成cDNA的模板。cDNA合成体系选用PrimeScript II反转录酶(Takara Bio,Shiga,Japan)和oligo(dT)引物(Promega,Madison,WI,USA)，按照说明书合成cDNA模板。

从已报道的其他物种的Orco基因的序列，在美洲大蠊基因组(Li et al.,2018b.The genomic and functional landscapes of developmental plasticity inthe American cockroach.Nat.Commun.9,1008)中进行同源比对，找到美洲大蠊Orco基因的完整序列，如SEQ ID No.2所示，具体如下：

ATGTACAAGGCACGGCTCCACGGCCTGGTCGCGGACCTGTGGCCGTTGATTCGGATAATGCAGATGACCGGATTCTTTCTACTGGACTACCACGAGGACATGAGCTTCGGATGGACTTCAATCAGGGCGGGTTACTCGGGAACCGTCTCCGGTCTCATGGTGATACAGTTCCTGCTGCTCTTTCTGAACCTGATGCACCAAGCGGAAGATGTAAACGATCTCACAGCCAATACAATCACCGTGCTATTCTTCGTTCATTCCATTACCAAGTTCTTTTACTTCGCGATCCGAAGAAACAAGTTCTACAGGACGCTGGCCACATGGAACAACGCAAACAGCCATCCTCTGTTTGCTGAGAACCATGCCAGACATCACGCCACGGCTGTGGGAAGCATGAGACGATTGGTTATGTACGTGGTTGCCGTCACTGTGTTGAGCGGATTTGCTTGGACTGGCATCACGTTCGTAGGAGATAGTGTCCATGAGATTGCTGACCCCGAGAATGCTAATGAGACGATTATCGAGGAGTTGCCGCGTCTCATGGTGAGATCGTGGTACCCCTGGAACGCCATGTCAGGAGGAGGATACTTCGTTTCTTTCATAATACAGCTGATCTGGCTGTTCCTGGCTCTACTGCACGCCATGCTGATGGACACGATGTTCTGCTGCTGGCTGATCTACACCTGCGAGCAGTTGATTCACCTCAAAGAGATCATGAAACCTCTCATGGAGCTGAGCGCTTCTCTGGACACCGTAGTGCCTCACTCCGCGGAGCTCTTCCGTGCAGTCAGCGCCAATACCAACAACCCTGCGGCTACAGGCGATGACGGCATCCGTGCTATATACAGCAATCAACACGACTTCTCGAATTTCCGGCTAAATACTGGCACATTGGCGAACGTCAATACTGGTAACGTGGGACCAAACGGCTTGACAAAGAAACAGGAGCTTCTGGTACGGTCAGCCATCAAGTACTGGGTGGAACGCCATAAGCACGTCGTCAGGTTTGTCAGCAACATCGGAGACACTTATGGTGCTGCCCTCCTGCTGCACATGTTGACAAGTACAGTCACACTAACCCTTCTGGCGTACCAGGCTACTAAGATCGAAGGCGTGGACGTGTACGCCTGCACTGTAATAGGCTACTTGGTCTACACCCTGGGCCAGGTGTTCCTCTTCTGCTTCTATGGCAACCGACTTATTGAAGAGAGCTCGTCTGTGATGGAAGCTGCCTACAGCTGTCAATGGTACGACGGATCGGAGGAAGCCAAGACGTTCATTCAGATCGTGTGTCAGCAGTGTCAGAAGGCCATGAGCATCTCCGGAGCCAAGTTCTTCACTGTGTCGCTCGACTTGTTCGCTTCGGTGCTGGGTGCCGTGGTGACATACTTTATGGTGCTGGTGCAACTCAACTAG。

利用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将整个美洲大蠊Orco基因开放阅读框序列复制粘贴到网站中，通过设计参数筛选得到dsRNA靶向序列I(如SEQ ID No.5所示，具体为CACCAAGCGGAAGATGTAAACGATCTCACAGCCAATACAATCACCGTGCTATTCTTCGTTCATTCCATTACCAAGTTCTTTTACTTCGCGATCCGAAGAAACAAGTTCTACAGGACGCTGGCCACATGGAACAACGCAAACAGCCATCCTCTGTTTGCTGAGAACCATGCCAGACATCACGCCACGGCTGTGGGAAGCATGAGACGATTGGTTATGTACGTGGTTGCCGTCACTGTGTTGAGCGGATTTGCTTGGACTGGCATCACGTTCGTAGGAGATAGTGTCCATGAGATTGCTGACCCCGAGAATGCTAATGAGACGATTATCGAGGAGTTGCCGCGTCTCATGGTGAGATCGTGGTACCCCTGGAACGCCATGTCAGGAGGAGGATACTTCGTTTC)。然后设计引物:Orco Fp:CACCAAGCGGAAGATGTAAACG(SEQ ID No.3)和Orco Rp:GAAACGAAGTATCCTCCTCCTGAC(SEQ IDNo.4)。以cDNA为模板扩增得到含有靶向序列的DNA片段I，并将其克隆到pMD18-T载体(Aidlab，China)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，载体命名为pMD18-T-Orco。

采用PCR在靶向序列两侧引入T7启动子，具体方法为用设计两端含有T7启动子的引物，Orco T7Fp:TAATACGACTCACTATAGGCACCAAGCGGAAGATGTAAACG(SEQ ID No.6)和OrcoT7Rp:TAATACGACTCACTATAGGGAAACGAAGTATCCTCCTCCTGAC(SEQ ID No.7)。以pMD18-T-Orco载体为模板进行扩增，得到两端含有T7启动子的PCR产物，然后利用T7RiboMAX ExpressRNAi System(Promega,Madison,Wisconsin,USA)来合成正向和反向RNA，在T7RNA聚合酶和DNaseI依次处理后将两条正反向的RNA混合并70℃处理10min，然后逐渐降温到室温使其退火变成dsRNA I，序列为由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列及与SEQ ID No.1所示的核苷酸反向互补的核苷酸组成的双链RNA。

同样地，根据GFP基因序列(常用于分子克隆技术中)设计dsGFP引物：GFP Fp:CACAAGTTCAGCGTGTCCG(如SEQ ID No.8所示)和GFP Rp:GTTCACCTTGATGCCGTTC(如SEQ IDNo.9所示)。以质粒pEGFP-N1(Takara,Kusatsu,Shiga Prefecture,Japan)为模板扩增得到含有靶向序列的DNA片段II，并将其克隆、测序、验证序列后获得载体，命名为pMD18-T-GFP。dsRNAII靶向的DNA片段序列如SEQ ID No.10所示。设计两端含有T7启动子的引物，GFPT7Fp:TAATACGACTCACTATAGGCACAAGTTCAGCGTGTCCG(SEQ ID No.11)和GFP T7Rp：TAATACGACTCACTATAGGGTTCACCTTGATGCCGTTC(SEQ ID No.12)。以pMD18-T-GFP载体为模板进行扩增，得到两端含有T7启动子的PCR产物，然后利用T7RiboMAX Express RNAi System(Promega,Madison,WI,USA)合成dsRNA II，序列为由SEQ ID No.13(CACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAAC)所示的核苷酸序列和与SEQ ID No.13所示的核苷酸反向互补的核苷酸组成的双链RNA。

本发明实施例二为：一种基于美洲大蠊Orco基因在美洲大蠊防治中的应用：

就嗅觉受体Orco对美洲大蠊的交配行为进行深入研究，干扰Orco基因后，测定了美洲大蠊触角、口器和跗骨等部位的Orco基因的表达水平，确定干扰Orco的效率，尤其是与嗅觉密切相关的触角Orco的干扰效率，并在此基础上检测了雄虫的交配参数。在此项研究中，结果显示Orco的转录水平的降低显著推迟了美洲大蠊雄虫的交配时间。并进一步检测了选择偏好性的差异。

一、对美洲大蠊活体注射特异抑制美洲大蠊Orco基因的dsRNA

挑选刚完成羽化的健康的美洲大蠊雌雄虫，单只单独饲养。在羽化后第三天，采用二氧化碳无损害麻醉的方式处理雄虫，随后将其放置于解剖台上，利用显微注射方法将总量为4μg的靶向Orco基因的dsRNA沿腹部第3至第4腹节处(从下往上方向)缓慢注入其腹腔中。同时注射相同剂量的GFP基因干扰片段作为阴性对照。为保证持续干扰效果，两天后进行二次注射。已完成注射dsRNA的美洲大蠊雄虫仍单只放置于培养皿中(直径120mm，高20mm)；并放入同天羽化的单只美洲大蠊雌虫(此时已性成熟)，培养皿中置入充足的商业品化狗粮和饮用水。随后，利用摄像设备持续观察并拍摄雌雄虫的交配的起始时间和交配过程的时长。为保证有效统计的重复数，注射Orco基因和GFP基因的dsRNA的美洲大蠊雄虫各为20只。

二、dsRNA对Orco基因干扰效果验证

第二次注射dsRNA(包括Orco基因和GFP基因)48小时后，再次采用二氧化碳熏晕的方式处理美洲大蠊雄虫，切除并取下触角，经液氮研磨后放入TRIzol试剂中，按照标准流程提取触角的总RNA，利用超微量分光光度计Nanodrop One(Thermo Fisher Scientific，Waltham,Massachusetts,USA)测定总RNA浓度，然后量取2μg RNA进行反转录得到cDNA。利用NCBI网站在线设计qPCR引物，使用定量PCR方法来检测检测靶基因干扰效果(具体引物序列如表1所示)。Orco基因干扰率的计算公式为(dsGFP表达量-dsOrco表达量)/dsGFP表达量*100％。结果显示，触角中的Orco基因表达水平降低了71.8％；而口器和跗骨的Orco基因表达水平没有显著变化(如图1所示)。由于高丰度表达的基因更容易被RNAi诱导沉默，上述结果不仅表明了触角Orco基因主要的表达场所，也表明了RNAi诱导沉默系统在美洲大蠊中具有高效性。

表1用于Orco基因定量PCR的引物序列

三、美洲大蠊雄虫交配能力观察与统计

以在美洲大蠊体内无任何内源靶点的dsGFP注射组为对照，观察等量注射过dsOrco的处理组雄性美洲大蠊的交配性能，并进行统计。实验结果发现，注射对照组的美洲大蠊在羽化后第4天开始进行交配，并且在羽化后第5天以后全部具备交配能力；Orco基因干扰组的美洲大蠊雄虫则只有在羽化后第7天始有交配现象，并且在第9天后才具有完全的交配能力(如图2所示)。表明了Orco基因的诱导沉默会显著延迟美洲大蠊的交配，进而影响其繁殖。

四、Orco基因干扰后“Y”型管实验

与对照组相比，注射Orco基因dsRNA的美洲大蠊雄虫对雌虫挥发性的气味选择偏好显著降低，表现为无法正确识别含有雌虫挥发性性信息素的气味(如图3所示)；此外对美洲大蠊雄虫的吸引指数分析发现，雄虫在干扰Orco基因后，其吸引指数发生了偏转(如图4所示)。吸引指数(Attraction index)的计算公式如下：

或，吸引指数＝(N_v-N_a)/(N_v+N_a+N_nc)

其中，N_v为选择雌虫挥发性气味的雄虫个数；N_a为选择空气的雄虫个数，N_nc为没有做出选择的雄虫个数。数据的统计方式为非参检验的Mann-Whitney检验。

本实施例的结果表明：Orco基因干扰组的美洲大蠊交配时间较注射对照组的美洲大蠊产生延迟及少数无交配现象，并且“Y”型管选择实验证明美洲大蠊雄虫对雌虫的趋向性消失，进而可说明干扰Orco基因对美洲大蠊的交配及繁衍有显著的延迟作用和减弱效应。

本发明就嗅觉受体Orco对美洲大蠊的交配行为进行了深入研究，由于嗅觉在识别美洲大蠊性信息素过程中不可或缺，因此，找到并鉴定了嗅觉受体，尤其是嗅觉复合受体基因Orco在美洲大蠊交配和繁殖过程中具有关键作用。本发明的结果显示了干扰嗅觉复合受体基因Orco的表达会显著推迟美洲大蠊的交配，为美洲大蠊的防控提供了新的策略。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 华南师范大学

梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心

<120> 基于美洲大蠊Orco基因设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccaagcgg aagauguaaa cgaucucaca gccaauacaa ucaccgugcu auucuucguu 60

cauuccauua ccaaguucuu uuacuucgcg auccgaagaa acaaguucua caggacgcug 120

gccacaugga acaacgcaaa cagccauccu cuguuugcug agaaccaugc cagacaucac 180

gccacggcug ugggaagcau gagacgauug guuauguacg ugguugccgu cacuguguug 240

agcggauuug cuuggacugg caucacguuc guaggagaua guguccauga gauugcugac 300

cccgagaaug cuaaugagac gauuaucgag gaguugccgc gucucauggu gagaucgugg 360

uaccccugga acgccauguc aggaggagga uacuucguuu c 401

<210> 2

<211> 1416

<212> DNA

<213> Periplaneta americana

<400> 2

atgtacaagg cacggctcca cggcctggtc gcggacctgt ggccgttgat tcggataatg 60

cagatgaccg gattctttct actggactac cacgaggaca tgagcttcgg atggacttca 120

atcagggcgg gttactcggg aaccgtctcc ggtctcatgg tgatacagtt cctgctgctc 180

tttctgaacc tgatgcacca agcggaagat gtaaacgatc tcacagccaa tacaatcacc 240

gtgctattct tcgttcattc cattaccaag ttcttttact tcgcgatccg aagaaacaag 300

ttctacagga cgctggccac atggaacaac gcaaacagcc atcctctgtt tgctgagaac 360

catgccagac atcacgccac ggctgtggga agcatgagac gattggttat gtacgtggtt 420

gccgtcactg tgttgagcgg atttgcttgg actggcatca cgttcgtagg agatagtgtc 480

catgagattg ctgaccccga gaatgctaat gagacgatta tcgaggagtt gccgcgtctc 540

atggtgagat cgtggtaccc ctggaacgcc atgtcaggag gaggatactt cgtttctttc 600

ataatacagc tgatctggct gttcctggct ctactgcacg ccatgctgat ggacacgatg 660

ttctgctgct ggctgatcta cacctgcgag cagttgattc acctcaaaga gatcatgaaa 720

cctctcatgg agctgagcgc ttctctggac accgtagtgc ctcactccgc ggagctcttc 780

cgtgcagtca gcgccaatac caacaaccct gcggctacag gcgatgacgg catccgtgct 840

atatacagca atcaacacga cttctcgaat ttccggctaa atactggcac attggcgaac 900

gtcaatactg gtaacgtggg accaaacggc ttgacaaaga aacaggagct tctggtacgg 960

tcagccatca agtactgggt ggaacgccat aagcacgtcg tcaggtttgt cagcaacatc 1020

ggagacactt atggtgctgc cctcctgctg cacatgttga caagtacagt cacactaacc 1080

cttctggcgt accaggctac taagatcgaa ggcgtggacg tgtacgcctg cactgtaata 1140

ggctacttgg tctacaccct gggccaggtg ttcctcttct gcttctatgg caaccgactt 1200

attgaagaga gctcgtctgt gatggaagct gcctacagct gtcaatggta cgacggatcg 1260

gaggaagcca agacgttcat tcagatcgtg tgtcagcagt gtcagaaggc catgagcatc 1320

tccggagcca agttcttcac tgtgtcgctc gacttgttcg cttcggtgct gggtgccgtg 1380

gtgacatact ttatggtgct ggtgcaactc aactag 1416

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccaagcgg aagatgtaaa cg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaacgaagt atcctcctcc tgac 24

<210> 5

<211> 401

<212> DNA

<213> Periplaneta americana

<400> 5

caccaagcgg aagatgtaaa cgatctcaca gccaatacaa tcaccgtgct attcttcgtt 60

cattccatta ccaagttctt ttacttcgcg atccgaagaa acaagttcta caggacgctg 120

gccacatgga acaacgcaaa cagccatcct ctgtttgctg agaaccatgc cagacatcac 180

gccacggctg tgggaagcat gagacgattg gttatgtacg tggttgccgt cactgtgttg 240

agcggatttg cttggactgg catcacgttc gtaggagata gtgtccatga gattgctgac 300

cccgagaatg ctaatgagac gattatcgag gagttgccgc gtctcatggt gagatcgtgg 360

tacccctgga acgccatgtc aggaggagga tacttcgttt c 401

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggc accaagcgga agatgtaaac g 41

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg aaacgaagta tcctcctcct gac 43

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacaagttca gcgtgtccg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttcaccttg atgccgttc 19

<210> 10

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 60

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 120

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 180

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 240

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 300

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 360

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 420

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taatacgact cactataggc acaagttcag cgtgtccg 38

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taatacgact cactataggg ttcaccttga tgccgttc 38

<210> 13

<211> 420

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cacaaguuca gcguguccgg cgagggcgag ggcgaugcca ccuacggcaa gcugacccug 60

aaguucaucu gcaccaccgg caagcugccc gugcccuggc ccacccucgu gaccacccug 120

accuacggcg ugcagugcuu cagccgcuac cccgaccaca ugaagcagca cgacuucuuc 180

aaguccgcca ugcccgaagg cuacguccag gagcgcacca ucuucuucaa ggacgacggc 240

aacuacaaga cccgcgccga ggugaaguuc gagggcgaca cccuggugaa ccgcaucgag 300

cugaagggca ucgacuucaa ggaggacggc aacauccugg ggcacaagcu ggaguacaac 360

uacaacagcc acaacgucua uaucauggcc gacaagcaga agaacggcau caaggugaac 420

Claims

1.一种防控美洲大蠊的方法，其特征在于：包括以下步骤：将dsRNA导入到美洲大蠊雄虫体内，所述dsRNA为由如Seq ID No.1所示的核苷酸序列作为正义链及由与Seq ID No.1所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列作为反义链组成的双链RNA。

2.根据权利要求1所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：所述导入操作为注射操作。

3.根据权利要求2所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：所述注射操作是从沿腹部从下往上方向的第3至第4腹节处注入。

4.根据权利要求1所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：导入操作是在羽化后的第三天。

5.根据权利要求1所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：所述方法还包括在羽化后的第五天重复导入操作一次。