CN110467659A - 一种梨arf5多肽及抗体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种梨ARF5多肽及其多克隆抗体的制备方法，所述的ARF5多肽的氨基酸序列为：SLRDLSDESNNQSGIY。其多克隆抗体制备步骤如下：(1)梨ARF5抗原表位分析；(2)梨ARF5多肽合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗梨ARF5多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗梨ARF5多肽抗体。本发明制备的特异的抗梨ARF5合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与梨ARF5蛋白发生特异性结合反应，所述的多克隆抗体为实现ARF5在梨组织样本中的定性、定量检测奠定基础，为相关疾病的研究提供了一个重要工具。

Description

一种梨ARF5多肽及抗体制备方法

技术领域

本发明涉及一种梨多肽抗原及其多克隆抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测，具体是一种梨ARF5多肽及多克隆抗体的制备方法。

背景技术

梨属于蔷薇科(Rosaceae)，梨亚科(Pomoideae)，梨属(Pyrus)植物，是多年生落叶乔木果树。梨树在中国的栽培面积和产量仅次于苹果，可见其在果树生产中拥有很重要的地位。目前全世界76个梨生产国中，中国是栽培面积最大、品种最多、中产量最高的国家。

“中矮1号”是中国农业科学院果树研究所选育的中国第一个优良梨树矮化砧木，其株型矮化紧凑，且具有使嫁接树矮化、早果的作用。但其矮生和矮化机制尚不清楚，限制了新的矮生型品种和矮化砧木的选育及改良。植株高矮与茎的伸长紧密相关，生长素是调节植物茎伸长的重要激素之一，而植物对生长素的反应受很多基因的调控，生长素反应因子(auxin response factor，ARF)则是其中一类较为重要的转录因子，通过调节植物对生长素的反应而调控植株的生长发育。

ARF为植物界特有基因，在蕨类植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物等不同植物的基因组中均有表达，含有B3型特异于植物的脱氧核糖核酸结合结构域，可以直接与受控基因启动子区域的生长素应答元件(auxin response elements，AuxREs)结合，从而激活或抑制基因的表达：富含谷氨酸(ARF5、ARF6、 ARF7、ARF8、ARF19)结构域的ARFs激活转录，而丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸和甘氨酸(ARF1、ARF2、 ARF3、ARF4、ARF9)含量增加导致靶基因转录抑制。此外，ARF包含与其它ARF或Aux/IAA蛋白相互作用所需的PB1(Phox和Bem1)结构域。最近，第二个蛋白质相互模块同源二聚化DD域位于DBD中，已经在ARF1和ARF5中被发现。业已证实，在缺乏生长素的情况下，Aux/IAA蛋白与其伴侣ARF相互作用，从而使ARF完全失活，抑制生长素反应基因的表达；当生长素存在时，Aux/IAA蛋白被 SKP-Cullin-F-boxTIR1/AFB(SCFTIR1/AFBs)E3泛素连接酶复合物泛素化降解，抑制作用被解除。

不同ARF参与多种生长素调控的多种发育过程，包括开花、叶片衰老、雌蕊和种子形成、根茎发育、血管组织形成和器官的背轴同一性。ARF基因突变被发现强烈干扰合子胚胎发育。ARF5是ARFs家族成员之一，Hardtke等发现，在拟南芥中ARF5基因发生突变后，植株的维管组织混乱，提示ARF5在维管组织的形成中发挥重要作用；亦有研究证实，在胚胎发生转变过程中起作用的ARF中，ARF5对胚胎发育特别重要。以上说明ARF5在植物发育过程中扮演重要角色。然而目前仅有文献从mRNA水平分析ARF5 在“中矮1号”不同器官的表达情况，由于缺乏商品化的梨ARF5多克隆抗体，使得ARF5的相关研究仅停留在基因水平，严重阻碍了ARF5调控梨树生长发育功能的研究。

发明内容：

为解决上述现有技术存在的问题，弥补现有梨全长功能蛋白研究的空白，本发明公开了一种梨ARF5 多肽，其序列为：SLRDLSDESNNQSGIY，用此多肽制备的多克隆抗体，具有制备方法简单、快速、成本低、效价高的特点，可以特异性结合梨样本中ARF5蛋白。

一种梨ARF5多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤1，多肽序列的分析和设计：利用DNAstar软件对ARF5蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定ARF5 蛋白662-677位16个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列信息为SLRDLSDESNNQSGIY。

步骤2，多肽合成和交联：交由吉尔生化合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；为增强多肽的抗原性，将ARF5多肽与载体蛋白卵清白蛋白(OVA)采用水溶性碳化二亚胺(EDC)交联法进行交联。

步骤3，多肽免疫和抗血清制备：将交联后的ARF5-OVA与弗氏佐剂混合乳化，在新西兰兔背部进行皮下多点注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时停止免疫。

步骤4，抗体纯化：实验兔抗体效价达到标准后，采用颈主动脉取血，3000rpm离心10min分离血清，采用蛋白A(Protein A)纯化全抗体以及肽亲和纯化，得到目标抗体。

步骤5，抗ARF5抗体鉴定：采用免疫印迹法鉴定抗体：将所获得的ARF5抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，用于检测抗原，确认该抗体能够与天然ARF5蛋白相互作用，可用于免疫印迹实验。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明采用分子生物学技术，合成并鉴定了梨ARF5多肽，氨基酸序列信息为：SLRDLSDESNNQSGIY。

2)本发明制备的梨ARF5多克隆抗体具有很强的特异性，可用于免疫印迹和免疫组化等实验，建立体外免疫分析，为深入研究梨ARF5的功能提供一个重要工具。

3)本发明制备的梨ARF5多克隆抗体，可用于免疫荧光激光共聚焦显微镜观察。

附图说明

图1为免疫印迹图(用该发明多肽去免疫动物，得到的多克隆抗体，在梨果肉蛋白中检测ARF5天然蛋白，泳道中98kDa的条带即为ARF5蛋白的信号)。

具体实施方式

1、梨ARF5序列分析、多肽位点选择及合成

利用生物信息学相关软件，对梨ARF5基因进行分析，结果发现：梨ARF5基因的cDNA序列包含3642 bp。

经DNAstar软件对梨ARF5氨基酸序列进行亲水性(Hydrophilicity)、抗原性(Antigenicity)、表面可及性(Surface probability)和同源性(Homology)分析，选择综合性评分最高的肽段，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定ARF5 蛋白N端S662-Y677位，作为拟合成的多肽靶序列，其氨基酸序列为SLRDLSDESNNQSGIY，如SEQ ID NO.1所示，其理论分子质量为98kDa，多肽交由吉尔生化完成。

2、梨ARF5多肽的合成及鉴定

多肽合成交由吉尔生化完成，方法简述为：选取FMOC-ARG(PBF)-WANG RESIN树脂，六氢吡啶去除树脂上的FMOC3；用HOBT+DIC作为缩合剂加入第二个氨基酸，FMOC-CYS(TRT)-OH反应，反应完全后，继续去除FMOC，接下一个氨基酸，循环直到接完最后一个氨基酸；用TFA溶液处理做好的树脂，得到粗品多肽；溶解掉粗品多肽，加入配比好的谷胱甘肽低温下搅拌，隔6-12h打一下MS确认氧化状态，同时用巯基检测剂辅助判断是否氧化完全；氧化完全后送至纯化得到精品多肽采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。

3、梨ARF5多肽交联

采用EDC作为交联剂将载体蛋白OVA与合成多肽进行交联：取4mg OVA溶于0.4ml偶联缓冲液中；取4mg多肽溶于1ml偶联缓冲液中，然后把其加入到载体蛋白溶液中；取2mgEDC溶于0.5ml超纯水中，然后将其立即加入到OVA-多肽的溶液中。将溶液室温下交联2h。之后用超滤的方式纯化偶联产物，并用0.01M磷酸盐缓冲液置换。最后定容至4ml，分装保存。

4、多肽免疫和抗血清制备

将步骤三所得的分装保存的复合蛋白500μl，加入等体积完全弗氏佐剂混匀，乳化器乳化10min后检测乳化结果，取1滴抗原滴于去离子水中，1min不溶解扩散则表明乳化完全，可用于后续实验操作。

采用兔龄3个月，体重2-3kg的健康新西兰兔，耳源静脉采集血液并分离血清，-80℃保存作为阴性对照血清。新西兰兔适应性喂养后行背部皮下多点注射免疫。首次免疫2周后，将OVA-多肽500μl，与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行免疫，作为第1次加强免疫，要求背部皮下多点。第2次免疫2周后，进行第2次加强免疫，方法和要求同第1次加强免疫。1周后，采用耳缘静脉微量取血。

5、抗血清效价检测

1)间接ELISA法检测免疫血清效价，用未交联的合成多肽包被酶标板，每孔加入5μg/ml，4℃包被过夜，然后室温下用BSA封闭2h。

2)倍比稀释待测抗体：第一孔加入1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、 1:128000、1:256000。每孔按照100ul的体积加入酶标板，同时设置阴性对照及空白对照，37℃反应2h。

3)结束后甩掉板内液体，加入洗涤液洗板3次，每次浸泡2min。

4)加入HRP标记山羊抗兔IgG使用比例为1:1000，用1×PBST稀释，37℃孵育30min。

5)加入洗涤液洗板5次，每次浸泡3min。

6)将TMB显色液A、B、C液按照每10ml A液加入100μl B液和5μl C液的比例混合均匀，即为工作液，每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育15min。

7)加入TMB终止液D 50μl终止反应，酶标仪450nm读取吸光值。

6、抗体亲和纯化

1)IgG纯化：用移液器取2ml 50％的Protein-A Sepharose混悬液，加到5ml层析柱中，去掉顶盖和底帽，液体流出后的柱床体积即为1ml，然后用4倍柱体积的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱。取出对应的血清 2ml，与2ml磷酸盐缓冲液混合后加入5ml层析柱中，旋转混合器上室温(20-25℃)混旋3h，让血清样品流出。再用3倍柱体积磷酸盐缓冲液洗层析柱，加入4ml洗脱液进行洗脱。

2)肽亲和纯化：在层析柱中加入2ml NHS-Activated Sefinose TM 4FF，待柱内液体流干，用1mM 盐酸洗涤3次，再加入耦合缓冲液洗涤1次。加入4ml BSA-多肽溶液于NHS活化的琼脂糖中。混合震荡反应，4℃过夜。去离子水进行洗涤树脂一次。加入两倍柱体积的封闭液于室温震荡反应1h。流出封闭液后加入三倍柱体积的去离子水洗涤树脂。树脂洗涤分别通过洗涤缓冲液，去离子水，顺序洗涤两次。然后向层析柱内加入4ml IgG，室温下颠倒孵育1h。用磷酸盐缓冲液冲洗层析柱3次，然后用10ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体至于超滤管中超滤到0.5ml，获得纯化的梨ARF5抗体。加入抗体保存液进行保存。用间接ELISA法测定抗体效价并用Bradford法测定蛋白浓度。

7、梨果肉组织ARF5蛋白质的免疫印迹检测

取1-2g植物果实样本放入液氮中研磨至粉碎，采用本公司生产的试剂盒(植物果实蛋白提取试剂盒) 提取样本总蛋白，常规方法配制SDA-PAGE凝胶，将10μl蛋白浓度为2mg/ml的裂解液加样，恒压80V 约30min，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换160V电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶 (约60min)时终止电泳，采用电转膜方法恒压80V电转90min，转膜至PVDF膜。将PVDF膜于5％ (M/V)脱脂奶粉中封闭1h。将所获得的ARF5抗体作为一抗，采用浓度为1.5μg/ml与上述转膜得到的抗原在4℃下杂交过夜。然后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体在37℃杂交1h，TBST缓冲液洗膜，采用ECL显色法进行显色，在暗室中用X片进行显色和曝光，得到免疫印迹结果。通过图1可知，纯化得到的多克隆抗体能特异性识别梨果肉组织样本中ARF5蛋白。

其中梨果肉组织蛋白提取方法：

1)取1-2g植物果实样本，放入液氮中研磨至粉碎。

2)加入1ml Buffer A工作液，65℃孵育10min，期间涡旋混匀3次。

3)4℃、20000rpm离心20min，收集上清。

4)上清中加入4ml Buffer B缓冲液，-20℃过夜，4℃、12000rpm离心20min。

5)每毫升冷Buffer C工作液中加10μl DTT(1M)和10μL PMSF(0.1M)，混匀，冰上保存，如果沉淀有颜色可重复步骤4-5。

6)向沉淀中加入冰上预冷的Buffer C工作液，溶解沉淀，4℃、12000rpm离心20min，转移上清液至新管中。

7)BCA法进行蛋白定量，分装，-70℃保存，避免反复冻溶。

8、实验结果

1)抗血清效价：新西兰兔抗血清效价在1:256000以上(表1)

表1梨ARF5多克隆抗血清的效价(三次重复)

表1为间接ELISA法检测鹅ARF5多克隆抗血清的效价结果，采用间接ELISA法检测发现所制得的兔抗梨ARF5多克隆抗体效价在1:128000以上。

2)免疫印迹：免疫印迹实验结果显示条带清晰，特异性好，提示本发明制备的抗体能特异性结合梨果肉组织中ARF5蛋白，可用于检测梨组织样本中ARF5蛋白的表达水平(图1)。

前述尽管已经示出和描述了本发明的实施例，但这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，在不脱离本发明和宗旨情况下，可以对上述实施例进行多种变化和修改，本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 沈阳万类生物科技有限公司

<120> 一种梨ARF5多肽及抗体制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Pyrus

<400> 1

Ser Leu Arg Asp Leu Ser Asp Glu Ser Asn Asn Gln Ser Gly Ile Tyr

1 5 10 15

Claims (6)

1.一种梨ARF5多肽，其特征在于：多肽的氨基酸序列为SLRDLSDESNNQSGIY。

2.一种抗梨ARF5多肽的抗体制备方法，其特征在于：权利要求1的多肽与载体蛋白交联形成复合蛋白，用复合蛋白免疫动物，取免疫动物的血制备抗血清，从血清中分离纯化抗体。

3.根据权利2所述一种ARF5多肽的抗体制备方法，其特征在于：载体蛋白为卵清白蛋白(OVA)。

4.根据权利3所述一种ARF5多肽的抗体制备方法，其特征在于：通过交联剂将多肽与载体蛋白中的羧基与伯胺共价交联。

5.根据权利4所述一种ARF5多肽的抗体制备方法，其特征在于：所述复合蛋白与免疫佐剂混合乳化后，在背部通过多点皮下注射，初次免疫后，经过2次加强免疫，得到抗血清，血清效价在1:128000以上。

6.根据权利5所述一种ARF5多肽的抗体制备方法，其特征在于：权利要求5中得到的抗血清经过抗体亲和纯化后可以从抗血清中获得高纯度抗体。