CN110464720B

CN110464720B - 一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物及其应用

Info

Publication number: CN110464720B
Application number: CN201910797530.6A
Authority: CN
Inventors: 毛茜; 李松林; 曹馨慈
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: TIANJIN TASLY MODERN TCM RESOURCES CO Ltd; Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110464720A

Abstract

本发明公开了一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物，先取蝉蜕药材粉碎后，以乙醇回流提取，过滤，合并滤液，回收乙醇提取液，减压浓缩，得到蝉蜕浸膏；上D101型大孔树脂柱，先用蒸馏水冲洗，再依次使用体积浓度为25％、50％和95％的乙醇洗脱，收集体积浓度95％乙醇洗脱部位，减压浓缩，得到蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物。本发明通过大量实验筛选，发现蝉蜕乙酰多巴胺组合物可降低肠易激综合征模型小鼠血浆SP、血浆CGRP水平；减少结肠VIP、结肠5‑HT含量，可从多层次、多环节改善肠易激综合征内脏高敏感性，具有很好的治疗肠易激综合征的作用。

Description

一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物。

背景技术

蝉蜕来源于蝉科昆虫黑蚱Cryptotympana atrata的若虫羽化时脱落的皮壳，具有疏散风热，利咽，透疹，明目退翳，解痉等作用。蝉蜕药材含乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体、五聚体。已有研究表明，此类成分具有较强的活性，是蝉蜕主要活性物质。

肠易激综合征是一种慢性的以肠道功能紊乱为特征的疾病，是一组包括腹痛、腹胀、排便习惯改变和大便性状异常、粘液便等表现的临床综合征，持续存在或反复发作。肠易激综合征病人出现的症状主要为腹痛、腹泻、便秘，以腹泻为多见，常伴有腹胀感、排便不净感、排便窘迫感，且大多数病人伴有失眠、焦虑、抑郁、头昏、头痛等精神症状。近年来，肠易激综合征患病率呈上升趋势，愈发影响患者的身心健康和生活质量，已成为临床上亟待解决的难题之一。

目前还没有关于蝉蜕乙酰多巴胺多聚体用于肠易激综合征疾病防治的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物及其临床应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物，它是通过以下方法制备得到的：

(1)取蝉蜕药材粉碎后，以乙醇，加热回流提取1～3次，每次1～3小时；过滤，合并滤液，回收乙醇提取液，减压浓缩，得到蝉蜕浸膏；

(2)取步骤(1)得到的蝉蜕浸膏，上D101型大孔树脂柱，首先用蒸馏水冲洗，再依次使用体积浓度为25％、50％和95％的乙醇洗脱，收集体积浓度95％乙醇洗脱部位，减压浓缩，得到蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物。

作为优选方案，以上所述的具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物，它是通过以下方法制备得到的：

(1)取蝉蜕药材粉碎后，以1：10的固液比加入体积浓度为95％的乙醇，加热回流提取1～3次，每次1～3小时；过滤，合并滤液，回收乙醇提取液，减压浓缩至相对密度为1.04～1.12蝉蜕浸膏；

(2)取步骤(1)得到的蝉蜕浸膏，上D101型大孔树脂柱，首先用蒸馏水冲洗，流速为1.5BV/h，再依次使用体积浓度为25％、50％和95％的乙醇以1.5BV/h流速洗脱，收集体积浓度95％乙醇洗脱部位，减压浓缩，得到蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物。

作为优选方案，以上所述的具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物，它包括重量比为6:1:6:1的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体。

作为优选方案，以上所述的具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物在制备防治肠易激综合征的药物中的应用。

一种药物制剂，它由具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物与药学上可接受的载体制成。所述的药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂或合剂。

有益效果：与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明通过大量实验筛选，对蝉蜕中的乙酰多巴胺多聚体组合物进行提取，得到含有重量特定比例的乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体和五聚体；然后本发明以肠易激综合征内脏高敏感模型，发现蝉蜕乙酰多巴胺组合物可降低肠易激综合征模型鼠血浆SP、血浆CGRP水平；减少结肠VIP、结肠5-HT含量，表明蝉蜕乙酰多巴胺组合物可从多层次、多环节改善肠易激综合征内脏高敏感性，发挥其对肠易激综合征的治疗作用。

附图说明

图1为本发明的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物中的的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体的结构示意图。图中A为乙酰多巴胺二聚体，B为乙酰多巴胺三聚体；C为乙酰多巴胺四聚体；D为乙酰多巴胺五聚体。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1

(1)取蝉蜕药材粉碎后，以1：10的固液比加入体积浓度为95％的乙醇，加热回流提取2次，每次3小时；过滤，合并滤液，回收乙醇提取液，减压浓缩至相对密度为1.04蝉蜕浸膏；

本发明乙酰多巴胺多聚体组合物的采用UPLC-QTOF-MS/MS(色谱条件：采用WatersACQUITY UPLC SYSTEM分析蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物中的化学成分，样品过0.22μm有机微孔薄膜后上样分析。液相条件为：二极管矩阵检测器；自动进样器；ACQUITY HSS C18column(100mm×2.1mm,Φ＝1.8μm)；流动相为0.1％甲酸-水(流动相A)和乙腈(流动相B)；流速0.4mL/min；柱温40℃；进样量2μL；洗脱梯度为：0-8.5min，15-50％B；8.5-10.5min，50-95％B。

质谱条件：采用Synapt G2-S Q-TOF Mass Spectrometer系统(Waters MSTechnologies,英国)获得化合物的质谱信息。质谱条件为：电喷雾离子源；离子范围m/z 50～1500；碰撞气为氦气；辅助气体和屏蔽气体为氮气；喷雾电压：3.0kV；离子源温度550.0℃；辅助气和喷雾气压40.0psi；裂解电压：40V；MS碰撞能：6eV；MS/MS碰撞能：30-60V。)，组合物含有重量比例为6:1:6:1的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体。

实施例2蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物对肠易激综合征内脏高敏感大鼠的治疗作用

(一)实验方法

1.肠易激综合征内脏高敏感大鼠模型制备及分组给药

孕大鼠所产下的乳鼠，从新生8d至14d，使用Φ2.5mm的动脉扩张器进行直结肠刺激，直肠内给予60mmHg(约3mL水)的压力，持续1min。30min后重新刺激一次。从新生15d至21d换用Φ3.5mm的冠状动脉扩张器按上述步骤进行直结肠刺激。共刺激14d。

普通饲料正常喂养至出生第60d后，60只雄性大鼠按体重随机分为空白对照组、模型对照组、马来酸曲美布汀组(阳性对照组)，实施例1蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物低、中、高剂量组，每组10只。

出生后第60d起开始灌胃给药。实验剂量为：马来酸曲美布汀组灌胃马来酸曲美布汀17mg·kg^-1，蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物低剂量组、中剂量组、高剂量组分别予以蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物1.3、2.5、5.0g·kg^-1灌胃给药，空白及模型对照组灌胃相应体积的生理盐水，每日1次，连续给药30d。期间各组大鼠普通饲料喂养，自由饮用纯净水。大鼠每周称体重1次，每周灌胃给药量按体重变化调整。

2.腹部撤回反射评分(Abdominal withdrawal reflex，AWR)

给药结束后进行此项实验检测。实验前24h大鼠禁食不禁水，乙醚吸入麻醉后将石蜡油润滑后的自制球囊导管插入大鼠肛门，插入肛门内的球囊约7.0cm，距肛门外1.0cm处将其固定在大鼠尾根部后，导管根部开口连接注射器。大鼠苏醒后，将其放在18cm×5cm×7cm特制的透明塑料筒中，使之不能前后移动，亦不能转侧。大鼠适应30min后扩张肛门内的球囊从而引起大鼠结直肠扩张。每只大鼠球囊扩张3次，容量分别为1.0，1.5，2.0mL，每次扩张持续30s，间隔5min，以防肠道缺血。每个容量重复3次，取3次评分的均值。

AWR评分标准参考：1分，给予结直肠扩张刺激时大鼠情绪基本稳定；2分，给予刺激时变得不稳定,偶尔扭动头部；3分，腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面；4分，腹背部肌肉较强烈收缩并把腹部抬离地面；5分，腹部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形并把腹部、会阴部抬离地面。

3.指标测定

大鼠血清SP、CGRP测定：给药结束后实验动物禁食24h，自由饮用纯净水，各组大鼠给予10％水合氯醛(腹腔注射3mL·kg-1)麻醉后，从腹主动脉中采集动脉血5mL置于塑料软管中，离心10min，转速3000r·min-1，取上清液保存于-20℃以下待测。采用酶联免疫分析法测定大鼠SP、CGRP，操作按试剂盒说明书进行。

大鼠组织VIP、5-HT测定：麻醉状态下，取实验大鼠盲肠上结肠组织，冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，按1：9于结肠组织中加入生理盐水研磨匀浆，离心取上清液，按ELISA试剂盒说明书操作测定大鼠结肠组织VIP、5-HT。

(二)实验结果

1.一般情况描述

实验期间，空白对照组大鼠精神状态良好，反应敏锐，毛发顺滑光亮，食欲正常，大便呈黑色颗粒状。造模期间模型鼠精神萎靡，活动减少，体重缓慢上升，毛发稀松发黄缺少光泽，肛周体毛被稀便沾染，有稀软便排出。上述现象经药物治疗后各剂量组大鼠均有明显改善，毛发顺泽，活动增多，腹泻减少，较模型组相比有显著好转。

2.AWR评分结果

给药前，与空白对照组相比，模型组大鼠AWR评分较高，差异悬殊(P＜0.01)，证明内脏高敏感模型复制成功。给药后，蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物剂量组AWR评分明显低于模型组(P＜0.01)，说明蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物各治疗组的内脏敏感性降低。此外，由于蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物各剂量组AWR分值不同，高、中剂量组的AWR分值低于低剂量组，表明蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物对大鼠内脏敏感性的改善与其剂量呈一定的相关性。见表1。

表1 蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物对肠易激综合征内脏高敏感性大鼠AWR评分的影响

组别	AWR/分
		空白对照组	1.42±0.13**
模型对照组	3.98±0.16
		马来酸曲美布汀	1.79±0.59**
蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物低剂量组	3.24±0.65
		蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物中剂量组	1.46±0.26**
蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物高剂量组	1.32±0.17**

注：与模型组比较，**：P<0.01。

3.血浆SP和CGRP结果

模型组大鼠血浆SP含量比空白组大鼠低，统计学差异显著(P<0.01)。给药后，蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物各治疗组和马来酸曲美布汀组大鼠血浆SP含量较模型组大鼠明显升高(P<0.05～0.01)，基本接近接近正常大鼠的水平，表明用药后可明显模型大鼠血浆SP水平的异常降低。

模型组大鼠血浆CGRP含量明显比空白对照组大鼠低，差异明显(P<0.01)。给药后，蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物各给药组和马来酸曲美布汀组大鼠血浆CGRP含量明显升高(P<0.01)，其中高、中剂量组血浆CGRP值接近正常组大鼠的水平，表明用药后模型大鼠的血浆CGRP水平恢复接近正常大鼠的水平。见表2。

表2 蝉蜕对大鼠血浆SP、CGRP表达的影响

注：与模型组比较，**：P<0.05；**：P<0.01。

4.结肠组织VIP和5-HT结果

模型组大鼠结肠组织VIP含量比空白对照组大鼠低，差异明显(P<0.01)。给药后，蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物各治疗组和马来酸曲美布汀组大鼠组织VIP含量较模型组大鼠明显升高(P<0.05～0.01)，其中高剂量组恢复接近正常水平。

模型组大鼠组织5-HT含量比空白对照组大鼠低，差异显著(P<0.05)。给药后，蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物各给药组和马来酸曲美布汀组大鼠组织5-HT含量明显升高(P<0.05～0.01)，各给药组均恢复到正常动物的水平。见表3。

表3 蝉蜕对大鼠组织VIP、5-HT表达的影响

注：与模型组比较，**：P<0.05；**：P<0.01。

本发明对蝉蜕中的乙酰多巴胺多聚体组合物进行提取，得到含有重量特定比例的乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体和五聚体；以肠易激综合征内脏高敏感大鼠为模型，发现蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物可降低血浆SP、血浆CGRP水平；减少结肠VIP、结肠5-HT含量，表明蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物可从多层次、多环节改善肠易激综合征内脏高敏感性，发挥其对肠易激综合征的治疗作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：

(2)取步骤(1)得到的蝉蜕浸膏，上D101型大孔树脂柱，首先用蒸馏水冲洗，再依次使用体积浓度为25％、50％和95％的乙醇洗脱，收集体积浓度95％乙醇洗脱部位，减压浓缩，得到蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物；

所述多聚体包括重量比为6:1:6:1的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体。

2.根据权利要求1所述的具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：

3.权利要求1或2所述的具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物在制备防治肠易激综合征的药物中的应用。

4.一种药物制剂，其特征在于，它由权利要求1或2所述的具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物与药学上可接受的载体制成。

5.根据权利要求4所述的一种药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂或合剂。