CN110463701B

CN110463701B - 正庚醛在作为使昆虫产生驱避行为的驱避化合物中的应用

Info

Publication number: CN110463701B
Application number: CN201810448259.0A
Authority: CN
Inventors: 刘杨; 王桂荣; 刘一鹏
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN110463701A

Abstract

本申请涉及正庚醛在作为使昆虫产生驱避行为的驱避化合物中的应用。在本申请中，首次筛选到了正庚醛一种性能良好的昆虫驱避化合物。

Description

正庚醛在作为使昆虫产生驱避行为的驱避化合物中的应用

技术领域

本申请涉及正庚醛在作为使昆虫产生驱避行为的驱避化合物中的应用。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella(L.)属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是十字花科作物的世界性重大害虫，也是我国几个重大农业害虫之一。主要分布在长江流域以及长江以南广大地区如湖北、江苏、上海、浙江、福建、广东、广西等地。近20年来，随着南菜北移，小菜蛾在中国北方造成了经济损失。在陕西、河北、山东等地均造成严重为害，产量损失达30％以上。由于小菜蛾发生世代多、世代重叠现象严重且繁殖量多、繁殖速度快，防治难度很大，所以人们一开始就依赖于使用有机合成杀虫剂进行防治。但杀虫剂的长期广泛大量使用，使小菜蛾的抗药性得到迅速发展。先后在我国的广东、广西、四川、湖南、湖北、江苏、浙江、云南、山西、天津、河北、山东等地发现了小菜蛾对有机氯拟除虫菊酯、有机磷氨基甲酸酯、昆虫生长调节剂和苏云金杆菌等50多种杀虫剂产生了抗药性。华南、华中和华东的大部分地区对氰戊菊酯和溴氰菊酯的抗性倍数高达2000倍。

因此，迫切需要新的害虫防治法来应对小菜蛾的危害。

发明内容

本申请之一提供了正庚醛在作为使昆虫产生驱避行为的驱避化合物中的应用。

在一个具体实施方式中，所述昆虫为菜蛾科(Plutellidae)昆虫中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述昆虫为菜蛾属(Plutella)昆虫中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述昆虫为小菜蛾(Plutella xylostella)。

本申请之二提供了一种驱避剂，其包括溶剂和正庚醛。

在一个具体实施方式中，所述正庚醛在驱避剂中的含量为10ng/μL以上。

在一个具体实施方式中，所述正庚醛在驱避剂中的含量≥10ng/μL并且≤10³ng/μL。

在一个具体实施方式中，所述正庚醛在驱避剂中的含量为10³ng/μL以上。

在一个具体实施方式中，所述正庚醛在驱避剂中的含量≥10³ng/μL并且≤10⁵ng/μL。

在一个具体实施方式中，所述溶剂选自液态石蜡油和/或正己烷。

本申请的有益效果：

本申请首次发现小菜蛾的OR16基因(SEQ ID No.7)为使小菜蛾产生驱避行为的气味受体基因，利用其特性，可以筛选例如正庚醛等能够使小菜蛾等昆虫产生驱避行为的气味化合物，从而进一步地将这些对昆虫产生驱避行为的气味化合物作为驱避剂应用的生产实践中。相对于传统气味化合物筛选而言，通过这种方式筛选可以一次性筛选多个气味化合物，这样筛选出来的使昆虫产生驱避行为的气味化合物具有简单方便，灵敏度以及准确度高的优点。

通过利用小菜蛾的OR16基因灵敏识别特定气味的功能，筛选得到可用于使昆虫产生驱避行为的气味物质，可以大大简化开发引诱剂组分的工序，降低工作量，并明显缩短了开发周期。并且在本申请中，首次筛选到了正庚醛一种性能良好的昆虫驱避化合物。

附图说明

图1为双电极电压钳记录小菜蛾Orco基因和小菜蛾OR16基因共表达的爪蟾卵母细胞对不同剂量下的正庚醛反应轨迹图。

图2为梯度浓度的正庚醛刺激注射小菜蛾OR16基因和小菜蛾Orco基因的爪蟾卵母细胞所引起的反应曲线，将最大的反应标准化为100，误差线由SEM作出(n＝7)，横坐标表示正庚醛的浓度，即-8表示为1×10^-8mol/L、-7表示为1×10^-7mol/L、-6表示为1×10^-6mol/L、-5表示为1×10^-5mol/L、-4表示为1×10^-4mol/L、-3表示为1×10^-3mol/L、-2表示为1×10^- ²mol/L。

图3为雄性小菜蛾对三种浓度梯度下的正庚醛的趋向反应。其中，横坐标中的数值代表的是小菜蛾雄蛾选择的气味源的百分比，NS表示在P﹥0.05水平下表示没有显著差异，**表示在P﹤0.01水平下表示具有显著差异；***表示在P﹤0.001水平下表示具有显著差异。

图4为雌性小菜蛾对三种浓度梯度下的正庚醛的趋向反应。横坐标中的数值代表的是小菜蛾雌蛾选择的气味源的百分比，NS表示在P﹥0.05水平下表示没有显著差异，**表示在P﹤0.01水平下表示具有显著差异；***表示在P﹤0.001水平下表示具有显著差异。

具体实施方式

以下通过优选的实施例的形式对本申请的上述内容作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本申请的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

小菜蛾用白菜室内人工饲养，室内饲养温度为27±1℃，光照为16:8(L：D)，相对湿度为65±5％。

PCR试剂盒购自Thermo Fisher Scientific(美国)。

RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen(美国)。

反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas(立陶宛)。

SMART RACE试剂盒SMART RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech(美国)。

克隆载体pGM-T Vector购自全式金(中国)。

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自全式金(中国)。

凝胶成像系统ChemiDoc XRs购自Bio-Rad(美国)。

质粒小提试剂盒购自天根(中国)。

表达载体pT7Ts购自Invitrogen(美国)。

抗生素氨苄青霉素、IPTG和Xgal购自Sigma(美国)。

限制性内切酶购自Takara(日本)。

cRNA合成试剂盒mMESSAGE mMACHINE T7购自Ambion(美国)。

微量紫外/可见分光光度计NanoDrop ND-2000购自Nanodrop(美国)。

细胞24孔培养板购自NEST(中国)。

细胞恒温培养箱购自SANYO(日本)。

电压钳记录系统OC-725C oocyte clamp购自Warner Instruments(美国)。

实施例1

1.小菜蛾的饲养与组织收集

饲养的小菜蛾在4龄期区分雌雄，放入塑料盒中，直至化蛹并羽化，羽化的小菜蛾成虫用10％的蜂蜜水喂养。取羽化后的1至3天的成虫的触角立即冻于液氮中，然后置于-70℃保存。

2.利用小菜蛾的触角RNA的提取

RNA提取的全部过程均在无RNA酶条件下进行。整个提取步骤如下所示：

1)从-70℃冰箱取出保存的200头左右成虫触角组织，倒入匀浆器中并加入1mLTrizol试剂，充分研磨组织，将研磨好的组织溶液转移到置于冰上的无RNA酶的1.5mL离心管中。

2)4℃，12000rpm离心10min。

3)将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。为了充分裂解核蛋白复合体，室温放置5min。

4)向离心管中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min。

5)4℃，12000rpm离心15min。

6)将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，向离心管中加入0.5mL异丙醇，缓慢混匀后，室温放置10min。

7)4℃，12000rpm离心10min。

8)吸弃上清，向离心管中加入1mL 75％乙醇，缓慢混匀。

9)4℃，7500rpm离心5min。

10)吸弃上清，室温干燥10min至无明显水痕。

11)加入10-20μL DEPC水(根据沉淀量决定)溶解沉淀，55-60℃孵育10min。

3.cDNA第一条链合成

实验在无RNA酶条件下，实验步骤按照RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit的说明书操作。

1)在无RNA酶的1.5mL离心管中加入：总RNA 0.1ng-5μg，1μL oligo(dT)18引物，用无RNA酶水补至12μL，缓慢混匀后离心。

2)65℃温育5min后，立即置于冰上。

3)依次加入：4μL 5×Reaction缓冲液，1μL RiboLockRNase Inhibitor(20u/μL)，2μL 10mM dNTP Mix，1μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/μL)使总体积达到20μL，缓慢混匀后离心。

4)42℃温育1h后，70℃温育5min，保存于-20℃冰箱。

4.小菜蛾的Orco基因和OR16基因的克隆

以第3小节获得的cDNA为模板，使用PxylOrcoF1(SEQ ID No.1)和PxylOrcoR1(SEQID No.2)引物对扩增小菜蛾的Orco基因(SEQ ID No.3)，小菜蛾的Orco基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。小菜蛾Orco基因与下述的小菜蛾OR16基因共表达从而使OR16基因产生的蛋白具有功能。

PCR反应体系为：2μL cDNA作为模版，0.25μL primeSTAR HS DNA聚合酶，5μL 5×PrimeSTAR缓冲液(加Mg²⁺)，2μL dNTP混合物(0.25mM)，上下游引物(10μM)各0.5μL，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应条件为：94℃5min预热变性，98℃10s、55℃30s、72℃1.5min进行35个循环，72℃延伸10min。

接下来对小菜蛾Orco基因的PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，切下目的条带处的凝胶放入1.5mL离心管中，使用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(按照试剂盒说明书操作)，将回收到的小菜蛾的Orco基因的PCR产物连接到pEASY-Blunt载体上(按照pEASY-Blunt载体试剂盒说明书操作)，连接体系转化全式金Trans1 T1化学感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，进行蓝白斑筛选，培养过夜后，挑取16个白色单克隆进行PCR验证，用PxylOrcoF1/PxylOrcoR1引物对进行PCR验证，进一步将PCR验证正确的克隆测序。测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，得到阳性重组质粒pEASY-B-Orco。

以第3小节获得的cDNA为模板，使用PxylOR16F1(SEQ ID No.5)和PxylOR16R1(SEQID No.6)引物对扩增小菜蛾的OR16基因(SEQ ID No.7)，小菜蛾的OR16基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

接下来对小菜蛾OR16基因的PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，切下目的条带处的凝胶放入1.5mL离心管中，使用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(按照试剂盒说明书操作)，将回收到的小菜蛾OR16的PCR产物连接到pEASY-Blunt载体上(按照pEASY-Blunt载体试剂盒说明书操作)，连接体系转化全式金Trans1 T1化学感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，进行蓝白斑筛选，培养过夜后，挑取16个白色单克隆进行PCR验证，用PxylOR16F1/PxylOR16R1引物对进行PCR验证，进一步将PCR验证正确的克隆测序。测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，得到阳性重组质粒pEASY-B-OR16。

5.爪蟾卵母细胞异源表达系统中表达气味受体

以PxylOrcoF2(SEQ ID No.9，含有Spe I酶切位点和Kozak序列)和PxylOrcoR2(SEQ ID No.10，含有Not I酶切位点)为引物，以重组质粒pEASY-B-Orco为模板进行Orco基因的PCR扩增。

PCR反应体系为：1μL质粒作为模版，0.25μL primeSTAR HS DNA聚合酶，5μL 5×PrimeSTAR缓冲液(加Mg²⁺)，2μL dNTP混合物(0.25mM)，上下游引物(10μM)各0.5μL，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应条件为：94℃5min预热变性，98℃10s、55℃30s、72℃1.5min进行35个循环，72℃延伸10min。

接下来对小菜蛾Orco基因的PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，切下目的条带处的凝胶放入1.5mL离心管中，用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(按照试剂盒说明书操作)，回收的片段及表达载体pT7Ts分别用Spe I和Not I双酶切，然后将两者用T4连接酶进行连接，进一步将连接体系转化至Trans1-T1化学感受态细胞中(按照试剂盒说明书操作)，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜后，挑取8个克隆以PxylOrcoF2/PxylOrcoR2为引物进行PCR验证，将PCR验证正确的克隆进一步进行测序验证。正反向测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，得到阳性重组质粒pT7Ts-Orco。

将阳性重组质粒pT7Ts-Orco用Sma I单酶切并电泳检测是否完全切开，得到线性化的pT7Ts-Orco。

线性化的pT7Ts-Orco的酚氯仿抽提，实验步骤如下：

1)在线性化的pT7Ts-Orco中加灭菌超纯水至100μL，然后加入100μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，震荡15s，充分混匀。

2)常温，12000rpm离心10min。

3)将上清小心吸取至干净的1.5mL离心管中后，加入0.5μL GenElute LPA(Ambion，美国)，10μL 3M NaAc(pH＝5.2)，200μL 100％乙醇，缓慢混匀，-20℃沉淀2h。

4)取出沉淀后的样品，4℃，14000rpm离心30min。

5)吸弃上清后，加入1mL 80％乙醇，缓慢混匀。

6)4℃，14000rpm离心5min。

7)小心吸弃上清后，风干，8μL加水稀释，电泳检测线性化的pT7Ts-Orco是否完全切开。

利用酚氯仿抽提后的线性化的pT7Ts-Orco在电泳检测的基础上，利用mMESSAGEMmachineT7试剂盒(Ambion，美国)进行Orco基因的cRNA合成，详细实验步骤为：

1)在无RNA酶的1.5mL离心管中根据说明书依次加入2×NTP/CAP、10×Reaction缓冲液、线性化的pT7Ts-Orco模版和T7 Enzyme mix，震荡混匀离心，37℃温育2h。

2)向体系中加入30μL无RNA酶的水和30μL的氯化锂溶液，4℃静置过夜。

3)4℃，14000rpm离心30min。

4)吸弃上清，加1mL 70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心5min，弃乙醇，风干沉淀。

5)4℃，14000rpm离心5min。

6)小心吸弃上清，风干沉淀，根据沉淀量加水稀释，充分混匀。

7)取1μL样品与3μL无RNA酶的水充分混匀，2μL用于电泳检测，2μL用于测定浓度。

8)剩余的样品置于70℃温育5min，迅速置于冰上冷却。

9)依据微量紫外/可见分光光度计NanoDrop ND-2000(Nanodrop，美国)测定的浓度加无RNA酶的水稀释到cRNA浓度为2μg/μL，存放于-70℃冰箱。

以PxylOR16F2(SEQ ID No.11，含有Spe I酶切位点和Kozak序列)和PxylOR16R2(SEQ ID No.12，含有Not I酶切位点)为引物，以重组质粒pEASY-B-OR16为模板进行OR16基因的PCR扩增。

表达载体pT7Ts与OR16基因的PCR产物连接得到重组质粒pT7Ts-OR16，操作参照重组质粒pT7Ts-Orco的构建步骤。

接下来对重组质粒pT7Ts-OR16用Sma I线性化，操作参照pT7Ts-Orco的线性化。

进一步对线性化的pT7Ts-OR16进行酚氯仿抽提以及利用酚氯仿抽提后的线性化的pT7Ts-OR16进行OR16的cRNA的合成，最后得到浓度为2μg/μL的cRNA，存放于-70℃冰箱。操作参照Orco基因的cRNA合成。

将Orco基因的cRNA和OR16基因的cRNA等量混合，得到混合的cRNA，挑选健康成熟的爪蟾卵母细胞以27.6nL的体积进行混合的cRNA注射，放于18℃恒温培养箱中培养3天。

6.双电极电压钳筛选可以感知正庚醛的特定气味受体

6.1.分别将选定的56种植物挥发物用二甲基亚砜(DMSO)配制成1mol/L的母液，再用1×Ringer(9.6mM NaCl,0.2mM KCl,0.5mM MgCl₂-6H₂O,0.5mM HEPES,0.6mM CaCl₂,pH7.6)配制成终浓度为1×10^-4mol/L的灌流液；其中，56种植物挥发物依次为：2-苯乙醇、顺-3-己烯-1-醇、β-香茅醇、香叶醇、顺-2-己烯-1-醇、马鞭草烯醇、正己醇、(S)-顺式-马鞭草烯醇、反式-3-己烯-1-醇、3,7-二甲基-3-辛醇、合成右旋龙脑、(+)-冰片、正乙酸己酯、(-)-反式-松香芹醇、(-)-芳樟醇、芳樟醇、苯甲酸甲酯、正己酸乙酯、月桂烯、α-蒎烯、(-)-β-蒎烯、莰烯、α-律草烯、(S)-(-)-柠檬烯、α-松油烯、(-)-反式石竹烯、(-)-氧化石竹烯、金合欢烯(异构体混合物)、2-己烯醛、4-乙基苯甲醛、3-乙烯基苯甲醛、(1R)-(-)-桃金娘烯醛、苯甲醛、正庚醛、顺-3-己烯基乙酸酯、乙酸反-2-己烯酯、顺-3-己烯基乙酸酯、1,4-二乙基苯、4′-乙基苯乙酮、乙酸苄酯、正十四烷、乙酸壬酯、乙酸己酯、罗勒烯、正十三烷、水杨酸甲酯、β-紫罗兰酮、樟脑、橙花叔醇、2,6-二叔丁基苯酚、1-氨基蒽、2-十五烷酮、苯乙酮、异丙基苯、苯甲醛和丁酸乙酯。

6.2利用双电极电压钳系统测定上述第5小节中共表达小菜蛾Orco基因和小菜蛾OR16基因的爪蟾卵母细胞对上述56种植物挥发物的电流值，每种植物挥发物至少测定6个爪蟾卵母细胞。利用仪器OC-725C oocyte clamp进行记录数据，利用仪器Digidata1440A和软件pCLAMP 10.2获取数据，数据用平均值±SEM表示(n≥8)。结果表明，在1×10^-4M的浓度下，小菜蛾的OR16蛋白对正庚醛的反应平均值高达760nA，而对其余的测定化合物的反应平均值均为0，表明小菜蛾的OR16蛋白能被正庚醛强烈激活。

6.3.正庚醛对表达OR16基因的卵母细胞的EC₅₀

将1mol/L正庚醛梯度稀释成终浓度为1×10^-7、1×10^-6、1×10^-5、5×10^-5、1×10^-4、1×10^-3、2×10^-3mol/L，使用双电极电压钳记录小菜蛾的Orco基因和小菜蛾OR16基因共表达的爪蟾卵母细胞对上述梯度浓度的正庚醛的剂量反应轨迹图，如图1所示，反应值随浓度的增加而增大。利用软件GraphPad Prism 5.0拟合出如图2所示的反应值与剂量的反应曲线，并利用该软件计算出正庚醛对表达OR16基因的卵母细胞OR16的EC₅₀值为1.757×10^- ⁵mol/L。

实施例2

吸取12μL正庚醛，用石蜡油作为溶剂，配制成浓度为1×10⁴ng/μL的母液。定容至终体积1mL，混合均匀。制成后的驱避剂母液可以放入冰箱保存，保存温度为-22℃。使用时，将驱避剂母液用石蜡油按照1×10³ng/μL、100ng/μL和10ng/μL进行稀释。

驱避剂的配制：

吸取100μL的驱避剂母液，加入石蜡油至终体积为1mL，混合均匀。得到浓度为1×10³ng/μL的正庚醛溶液1#；

吸取100μL的浓度为1×10³ng/μL的正庚醛溶液，加入石蜡油至终体积为1mL，混合均匀。得到浓度为100ng/μL的正庚醛溶液2#；

吸取100μL的浓度为100ng/μL的正庚醛溶液，加入石蜡油至终体积为1mL，混合均匀。得到浓度为10ng/μL的正庚醛溶液3#；

对比例1

以溶剂石蜡油作为驱避剂的阴性对照4#。

实施例3

驱避实验：

利用Y型管测定小菜蛾雌雄成虫对单个植物挥发物的行为选择反应。Y型管由无色透明的玻璃管组成，Y型管的直径约为2.7cm，主体长26.5cm，两臂长16.5cm两臂之间的角度为60°，将Y型管放在100×60×80cm的行为箱内，行为箱内部的上下面均安装有3支40W的日光灯提供光照。使用QC-1B大气采样仪作为气流动力系统(北京劳动保护研究所)，由大气采样仪流出的气体首先经过活性炭进行过滤，再经过加湿瓶进行加湿，最后经过流量计以及气味源到达Y型管的两臂。Y型管两个侧壁的气体流速为500mL/min，所有的装置之间均通过硅胶管相连接，室内的温度保持在26±1℃。实验的时间安排在18:00到22:00之间。

在小菜蛾4龄期区分为雌雄两组分别进行其对植物挥发物以及1#至3#样品的行为反应。将雌性和雄性小菜蛾分别放入塑料盒中，直至化蛹并羽化，羽化的小菜蛾成虫用10％的蜂蜜水喂养，2天后进行Y型管实验。在实验开始之前调节两测管的气流速度，使其一致。对于每种测试样品(即植物挥发物以及1#至3#样品)，雌性成虫处理组和雄性成虫处理组分别为36头，每组处理分6次完成，每次6头。每完成3次处理后，调换新的Y型管，且把实验组气味与对照组4#对换位置，以消除位置效应对小菜蛾的影响。实验结束后用丙酮清洗Y型管，并在100℃的恒温箱中干燥过夜。

取10μL的不同植物挥发物的灌流液以及1#至3#滴在1.5×1.5cm的滤纸上分别放入Y型管其中一侧的管臂，另一管臂以10μL的4#为对照。将小菜蛾成虫放入Y型管的主管臂中，每次放入六头，打开大气采样仪开始计时10min，在这个时间段，当小菜蛾进入植物挥发物一侧的管臂，超过主管臂4cm，且停留1min以上，记录为选择该植物挥发物。若进入另一侧管臂，则记录为对植物挥发物或1#至3#样品没有反应。若停留在主管臂之中，记录为该结果无效。

结果分析：

通过Y型管实验检测小菜蛾成虫，在测试的56种植物挥发物中，小菜蛾成虫仅对正庚醛的不同浓度具有行为反应。进一步的结果表明，相对于液体石蜡，小菜蛾雄蛾对浓度分别为1×10³ng/μL、100ng/μL和10ng/μL的正庚醛具有明显的驱避性(图3)；小菜蛾雌蛾对浓度为1×10³ng/μL的正庚醛具有驱避反应，而浓度和100ng/μL和10ng/μL的正庚醛对雌蛾没有驱避作用(图4)。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 正庚醛在作为使昆虫产生驱避行为的驱避化合物中的应用

<130> LHA1860265

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 1

atgatgaaca aagtgaaagc ccag 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 2

ttatttcagt tgcaccaaca ccatg 25

<210> 3

<211> 1422

<212> DNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 3

atgatgaaca aagtgaaagc ccagggcctc gtgtccgact tgatgcccaa catcaagttg 60

atgcagatgg ccgggcattt tctattcaac tatcacgaag aaaatggcgg catgtccatg 120

ctcctccgca agatctacgc cagcgtgcac gcgttcctca tcgtgatcca ctacctgtgc 180

atgctgctca acatggcgca gtactccgac gacgtcaacg agctcaccgc caacaccatc 240

acggttcttt tcttcgccca cacggtcatc aagctcttgt acttcgccat caattctaag 300

agcttttaca gaaccctggc ggtatggaac cagtcgaaca gccacccgct gttcacggag 360

tcggacgcgc gctaccacca gctcgcgctc accaagatga ggaggctcat gtacttcatc 420

tgcgccgtca ccgtgctgtc tgttatcagc tgggtgaccc tgacgttctt cggggagtcg 480

gtccgcttca tcccggacaa ggagaccaac gagacgctca cggagcccgc cccccgcctg 540

ccgctgaagg cctggtaccc cttcgacgcc atgagtggcg ggatgtacat tgtcgctttc 600

gcttatcagg tatactggct cctcttcgcc atggctatag cgaacctcat ggacgtgatg 660

ttctgctcgt ggctgctgtt cgcgtgcgag cagctgcagc acctgaaggc catcatgaag 720

ccgctgatgg agctgagcgc ctcgctcgac acctaccgcc cgaatactgc cgagctgttt 780

cgcgctaatt ctgcagacaa agaaaaagtc ccagacccgg tagacatgga catccgtggc 840

atatactcca cacagcacga cttcggcatg acgctgcggg gcgcgggggg gaggctgcag 900

aacttcggcg ggcagcaggt caacaacccc aacggcctga cgcagaagca ggagatgctg 960

gctcggtccg ccatcaagta ctgggtggag aggcataaac acgtagtcag attagtggca 1020

tctatcggag acacatacgg cacagccttg ctattccaca tgttggtgtc gactatcact 1080

ttaactttac tggcgtatca ggcaaccaag atcgacggat tgaacgtcta cgctttcagc 1140

accatcggct acctgagcta cacgctcgga caagtgttcc atttctgcat tttcggaaac 1200

cgacttattg aagagagctc atcggtgatg gaggcggcct actcctgcca gtggtacgac 1260

ggctccgagg aggccaagac cttcgtgcag atcgtgtgcc agcagtgcca gaaggccatg 1320

agcatctcgg gagccaagtt cttcaccgtg tctttggatt tgttcgcttc ggtactgggt 1380

gccgttgtca catacttcat ggtgttggtg caactgaaat aa 1422

<210> 4

<211> 473

<212> PRT

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 4

Met Met Asn Lys Val Lys Ala Gln Gly Leu Val Ser Asp Leu Met Pro

1 5 10 15

Asn Ile Lys Leu Met Gln Met Ala Gly His Phe Leu Phe Asn Tyr His

20 25 30

Glu Glu Asn Gly Gly Met Ser Met Leu Leu Arg Lys Ile Tyr Ala Ser

35 40 45

Val His Ala Phe Leu Ile Val Ile His Tyr Leu Cys Met Leu Leu Asn

50 55 60

Met Ala Gln Tyr Ser Asp Asp Val Asn Glu Leu Thr Ala Asn Thr Ile

65 70 75 80

Thr Val Leu Phe Phe Ala His Thr Val Ile Lys Leu Leu Tyr Phe Ala

85 90 95

Ile Asn Ser Lys Ser Phe Tyr Arg Thr Leu Ala Val Trp Asn Gln Ser

100 105 110

Asn Ser His Pro Leu Phe Thr Glu Ser Asp Ala Arg Tyr His Gln Leu

115 120 125

Ala Leu Thr Lys Met Arg Arg Leu Met Tyr Phe Ile Cys Ala Val Thr

130 135 140

Val Leu Ser Val Ile Ser Trp Val Thr Leu Thr Phe Phe Gly Glu Ser

145 150 155 160

Val Arg Phe Ile Pro Asp Lys Glu Thr Asn Glu Thr Leu Thr Glu Pro

165 170 175

Ala Pro Arg Leu Pro Leu Lys Ala Trp Tyr Pro Phe Asp Ala Met Ser

180 185 190

Gly Gly Met Tyr Ile Val Ala Phe Ala Tyr Gln Val Tyr Trp Leu Leu

195 200 205

Phe Ala Met Ala Ile Ala Asn Leu Met Asp Val Met Phe Cys Ser Trp

210 215 220

Leu Leu Phe Ala Cys Glu Gln Leu Gln His Leu Lys Ala Ile Met Lys

225 230 235 240

Pro Leu Met Glu Leu Ser Ala Ser Leu Asp Thr Tyr Arg Pro Asn Thr

245 250 255

Ala Glu Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asp Lys Glu Lys Val Pro Asp

260 265 270

Pro Val Asp Met Asp Ile Arg Gly Ile Tyr Ser Thr Gln His Asp Phe

275 280 285

Gly Met Thr Leu Arg Gly Ala Gly Gly Arg Leu Gln Asn Phe Gly Gly

290 295 300

Gln Gln Val Asn Asn Pro Asn Gly Leu Thr Gln Lys Gln Glu Met Leu

305 310 315 320

Ala Arg Ser Ala Ile Lys Tyr Trp Val Glu Arg His Lys His Val Val

325 330 335

Arg Leu Val Ala Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu Leu Phe

340 345 350

His Met Leu Val Ser Thr Ile Thr Leu Thr Leu Leu Ala Tyr Gln Ala

355 360 365

Thr Lys Ile Asp Gly Leu Asn Val Tyr Ala Phe Ser Thr Ile Gly Tyr

370 375 380

Leu Ser Tyr Thr Leu Gly Gln Val Phe His Phe Cys Ile Phe Gly Asn

385 390 395 400

Arg Leu Ile Glu Glu Ser Ser Ser Val Met Glu Ala Ala Tyr Ser Cys

405 410 415

Gln Trp Tyr Asp Gly Ser Glu Glu Ala Lys Thr Phe Val Gln Ile Val

420 425 430

Cys Gln Gln Cys Gln Lys Ala Met Ser Ile Ser Gly Ala Lys Phe Phe

435 440 445

Thr Val Ser Leu Asp Leu Phe Ala Ser Val Leu Gly Ala Val Val Thr

450 455 460

Tyr Phe Met Val Leu Val Gln Leu Lys

465 470

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 6

atgtcggtcg atccgacggt 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 7

ttagttttcc ttatacattg tg 22

<210> 7

<211> 1218

<212> DNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 7

atgtcggtcg atccgacggt tcaggaacaa gctaaagctg aaatattgca atcactgaat 60

ctgagtatat tcagtatgcg gcaattcgga ctatcgtttg ataaacctcc aaacagacgg 120

gcgttcataa agcaaaagct tatactgtat ttgtgctttt tcggtatttc ctaccacatc 180

tttagcgaca tagtcaatat tggagtcaca ctggcaacca cgccgcgtgt agaatttgtg 240

gtgcctcttt tccatacttt cggttacgga gcgctcagta gcttcaagct gtggtccgtg 300

tggtacaaga aggacgtgtt cgagcagcgc atcgcggacc tggtggacat ctggccggtg 360

ccgccgctgg cgcccgagct gcaagctatc aaggacaaga gcctcctggc actgcgcatc 420

gcacacagat ttttctttgg gctgaacgtg tctgccgtgt ggattttcaa cttgactcca 480

gtgatgatct acgtgtacga gagctggtgg cagggccggc ccgacgccgt ggtgggcttc 540

ccctggacct gctggtaccc cttcgacaag tgggacccca ccaaccacgt ctttgtgtac 600

ctgttcgaga tcctctccgg agtgacgtgc gtgtgggcca tgtcagcgtc agacctgatg 660

ctgacgggca tggcgagcca catctgcatg ctgctgcgca tcctgcacca gcgcctcacg 720

agcctcgccg ccagcgagca gccgccgccc gaccactacc gagatattgt cagctgcatc 780

aagctgcatc agaggcttat tgtatactgt aatgatttgg aggaagcatt ttcaatcgtg 840

aatcttgtga atatcgtcct cagctctata aatatatgct gcgttgtatt tgtaatcgtg 900

ctgcttgagc ctctgagtgc cctcagcaac aagatgttcc tcggagcggc gctcatccag 960

gtgggcgtga tctgctggta cgcggatgac atctaccatg ccaactcggc ggtggcggca 1020

gcggcataca gctgccagtg gcacaagacc agccccagct gccagagagc gctcatgttt 1080

cttatcaaga ggtcccaaaa accgattgcc ttgactgcta tgaatttcac aaatattaat 1140

ttgactactt tttcatcgat actctacaaa tcatattctt attttgctct actgtacaca 1200

atgtataagg aaaactaa 1218

<210> 8

<211> 405

<212> PRT

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 8

Met Ser Val Asp Pro Thr Val Gln Glu Gln Ala Lys Ala Glu Ile Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Asn Leu Ser Ile Phe Ser Met Arg Gln Phe Gly Leu Ser

20 25 30

Phe Asp Lys Pro Pro Asn Arg Arg Ala Phe Ile Lys Gln Lys Leu Ile

35 40 45

Leu Tyr Leu Cys Phe Phe Gly Ile Ser Tyr His Ile Phe Ser Asp Ile

50 55 60

Val Asn Ile Gly Val Thr Leu Ala Thr Thr Pro Arg Val Glu Phe Val

65 70 75 80

Val Pro Leu Phe His Thr Phe Gly Tyr Gly Ala Leu Ser Ser Phe Lys

85 90 95

Leu Trp Ser Val Trp Tyr Lys Lys Asp Val Phe Glu Gln Arg Ile Ala

100 105 110

Asp Leu Val Asp Ile Trp Pro Val Pro Pro Leu Ala Pro Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Ile Lys Asp Lys Ser Leu Leu Ala Leu Arg Ile Ala His Arg Phe

130 135 140

Phe Phe Gly Leu Asn Val Ser Ala Val Trp Ile Phe Asn Leu Thr Pro

145 150 155 160

Val Met Ile Tyr Val Tyr Glu Ser Trp Trp Gln Gly Arg Pro Asp Ala

165 170 175

Val Val Gly Phe Pro Trp Thr Cys Trp Tyr Pro Phe Asp Lys Trp Asp

180 185 190

Pro Thr Asn His Val Phe Val Tyr Leu Phe Glu Ile Leu Ser Gly Val

195 200 205

Thr Cys Val Trp Ala Met Ser Ala Ser Asp Leu Met Leu Thr Gly Met

210 215 220

Ala Ser His Ile Cys Met Leu Leu Arg Ile Leu His Gln Arg Leu Thr

225 230 235 240

Ser Leu Ala Ala Ser Glu Gln Pro Pro Pro Asp His Tyr Arg Asp Ile

245 250 255

Val Ser Cys Ile Lys Leu His Gln Arg Leu Ile Val Tyr Cys Asn Asp

260 265 270

Leu Glu Glu Ala Phe Ser Ile Val Asn Leu Val Asn Ile Val Leu Ser

275 280 285

Ser Ile Asn Ile Cys Cys Val Val Phe Val Ile Val Leu Leu Glu Pro

290 295 300

Leu Ser Ala Leu Ser Asn Lys Met Phe Leu Gly Ala Ala Leu Ile Gln

305 310 315 320

Val Gly Val Ile Cys Trp Tyr Ala Asp Asp Ile Tyr His Ala Asn Ser

325 330 335

Ala Val Ala Ala Ala Ala Tyr Ser Cys Gln Trp His Lys Thr Ser Pro

340 345 350

Ser Cys Gln Arg Ala Leu Met Phe Leu Ile Lys Arg Ser Gln Lys Pro

355 360 365

Ile Ala Leu Thr Ala Met Asn Phe Thr Asn Ile Asn Leu Thr Thr Phe

370 375 380

Ser Ser Ile Leu Tyr Lys Ser Tyr Ser Tyr Phe Ala Leu Leu Tyr Thr

385 390 395 400

Met Tyr Lys Glu Asn

405

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 9

gactagtgcc accatgatga acaaagtgaa agcccag 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 10

atttgcggcc gcttatttca gttgcaccaa caccatg 37

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 11

cggactagtg ccaccatgtc ggtcgatccg acggt 35

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 12

atttgcggcc gcttagtttt ccttatacat tgtg 34

Claims

1.正庚醛在作为使雄性小菜蛾(Plutella xylostella)产生驱避行为的驱避化合物中的应用。