CN110463608A

CN110463608A - 一种山慈菇人工快繁的新方法

Info

Publication number: CN110463608A
Application number: CN201910860167.8A
Authority: CN
Inventors: 黄衡宇; 徐福荣
Original assignee: Yunnan University of Traditional Chinese Medicine TCM
Current assignee: Yunnan University of Traditional Chinese Medicine TCM
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2039-09-11
Also published as: CN110463608B

Abstract

本发明公开了一种山慈菇人工快繁的新方法，包括以下步骤：(1)获取外植体；(2)将步骤1的假鳞茎先用自来水清洗表面泥土，再用洗衣粉溶液浸泡后流水冲洗，接着用乙醇溶液处理，再经消毒后冲洗；(3)获取无菌苗；(4)取步骤3中培养由芽点生长出来的幼芽转接入步骤3中的A培养基内进行增殖培养，将携带有愈伤组织的幼苗切下，继续转入B培养基中进行培养；(5)把步骤4中继代培养后具米粒大小假鳞茎的单苗接种于C培养基中进行培养；(6)炼苗和移栽。本发明对山慈姑离体快速繁殖进行了优化调整，简化了人工快繁过程，大大提高了繁殖效率，成本低、时间短，不仅提高了试管苗炼苗的成活率，且大大缩短了育苗周期。

Description

一种山慈菇人工快繁的新方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山慈菇人工快繁的新方法。

背景技术

山慈菇[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]，又名杜鹃兰，为兰科(Orchidaceae)杜鹃兰属(Cremastra))多年生草本植物，长于沟边湿地或山坡林下荫湿地，海拔500-2900m，通常产于云南贡山、凤庆、玉溪等地；分布范围包括国内的西藏、贵州、陕西南部以及山西南部等地，国外的尼泊尔、不丹、印度、越南、泰国和日本等国也有分布。

山慈菇以假鳞茎入药，为山慈菇基原植物之一，其味甘、微辛，有小毒，入肝脾经，具有清热解毒，润肺止咳、活血止痛、消肿散结的功效，内用可抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等，外用于治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等。现代研究表明山慈菇除了广泛用于抗肿瘤药物外，其有效成分中含有的秋水仙碱对肝脏有显著的保护作用，能减轻肝脏的病理损伤，防止肝内纤维化，对急慢性肝炎有消退黄疸和改善肝功能作用，能降低重症肝炎病死亡率；同时，秋水仙碱对急性痛风性关节炎也具有治疗作用，还具有降压作用。现代临床用于治疗肝硬化、食管贲门癌梗阻，宫颈癌等。尤其是山慈菇复方临床上用于抗肿瘤治疗，取得了良好的效果。

良好的功效使得市场需求量也日益增大，而山慈菇药源仍然依赖于野生资源的采挖；其后果直接导致野生种群数量急剧减少和生境片断化，加大了遗传漂变和近交的概率。此外山慈菇的种子细小，几乎不含胚乳，在自然条件下很难发育成幼苗。野生状态下，山慈菇多以无性繁殖为主，系数极低、周期漫长，致使其野生种群一经破坏便极难得以恢复。人工栽培中的分株繁殖周期长、效率低，育种进程缓慢，极度限制了山慈菇的种植规模。因此为保护濒危的野生兰科种质资源，为医学、病理等各方面研究提供资源保障。因此，急需寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来的无性繁殖方法来扩大山慈菇种苗的繁殖量，进行其高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种山慈菇人工快繁的新方法，以解决山慈菇人工栽培中的分株繁殖周期长、效率低，育种进程缓慢，种植规模极度受限的问题。

为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种山慈菇人工快繁的新方法，包括以下步骤：

(1)外植体的获取：选择表型性状优良的山慈菇植株，取其假鳞茎作为外植体；

(2)将步骤1的假鳞茎先用自来水清洗表面泥土，再用洗衣粉溶液浸泡并震荡搅动后流水冲洗，置于工作台；接着用维生素C(VC)溶液浸泡3-5min，再接着用乙醇溶液处理，再经汞水溶液消毒，最后冲洗，得到消毒灭菌好的假鳞茎；

(3)无菌苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好的假鳞茎按芽点用手术刀切割下来，放入A培养基中进行培养；

所述A培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

香蕉泥

萘乙酸NAA

6-苄胺基嘌呤6-BA

活性炭AC

蔗糖

琼脂粉；

(4)取步骤3中培养由芽点生长出来的幼芽转接入步骤3中的A培养基内进行增殖培养，同时在步骤3中发现外植体基部会产生愈伤组织，将携带有愈伤组织的幼苗切下，继续转入B培养基中进行培养；

所述B培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

香蕉泥

萘乙酸NAA

6-苄胺基嘌呤6-BA

激动素KT

活性炭AC

蔗糖

琼脂粉；

控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养，同步进行愈伤组织诱导，丛芽发生和增殖；接着观察发现愈伤组织开始增殖，待愈伤组织的表面出现紫色芽点，愈伤组织迅速分化出不定芽，不定芽开始分化出幼苗，并且有不定根的发生；接着将愈伤组织转接至相同的B培养基中继续增殖分化，而将获得的幼苗转入相同B培养基中继续培养，试管苗基部均有米粒大假鳞茎出现；

(5)把步骤4中继代培养后具米粒大小假鳞茎的单苗接种于C培养基中进行培养；

所述C培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

香蕉泥

萘乙酸NAA

活性炭AC

蔗糖

琼脂粉；

控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养至形成完整的根系；

(6)炼苗和移栽：取步骤5中的生根植株置于室温下炼苗，从C培养基中取出幼苗，将残留C培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中消毒后移栽至消毒后的基质中保温保湿培养，得移栽苗。

进一步地，步骤(2)中所述洗衣粉溶液的质量浓度为10％。

进一步地，步骤(2)中所述维生素C溶液的质量浓度为5％。

进一步地，步骤(2)中所述乙醇溶液的体积浓度为75％。

进一步地，步骤(2)中所述汞水溶液的质量浓度为0.1％。

进一步地，步骤(3)中所述A培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

所述A培养基的pH值为5.4-5.8。

进一步地，步骤(4)中所述B培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

所述B培养基的pH值为5.4-5.8。

进一步地，步骤(5)中所述C培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

所述C培养基的pH值为5.4-5.8。

进一步地，步骤(6)中所述生根植株高为6-8cm。

进一步地，步骤(6)中所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.2％。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。

2、本发明实现了高效快繁的目的，缩短了周期，繁殖系数可达5.84以上。

3、本发明通过愈伤组织诱导，丛芽发生和增殖同步进行，缩减了转接次数，解决了山慈菇无菌实生苗随着转接次数和增殖代数的增加，最终失去繁殖能力和无菌实生苗基因型参差不齐的问题。

4、本发明可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的优良种苗，解决了山慈菇由于长期人工分株繁殖造成病毒积累多，性状不稳定以及种植规模受限的问题。

5、本发明的分蘗和假鳞茎增殖是山慈菇一种新的人工繁育方式，诱导出的再生植株比较强壮，叶片宽大舒展，且具假鳞茎，在进行炼苗移栽时成活率可达95％以上。

6、本发明涉及诱导山慈菇试管苗假鳞茎诱导的技术，可以解决人工繁育中存在的系数低、不易成活和基因型不稳定等问题。

附图说明

图1为愈伤组织各个生长阶段的图；

其中图1-A为15d后愈伤组织开始增殖图；图1-B为愈伤组织的表面出现紫色芽点图；图1-C为愈伤组织迅速分化出不定芽图。

图2为具有假鳞茎的生根苗图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种山慈菇人工快繁的新方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择表型性状优良的山慈菇植株，取其假鳞茎作为外植体。

2、将步骤1的假鳞茎先用自来水清洗表面泥土，再用10％洗衣粉溶液(质量比)浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台；5％维生素C(VC)溶液(质量比)浸泡3min，75％乙醇溶液(体积比)处理13s，再经0.1％汞水溶液(质量比)消毒9min，最后无菌水冲洗6次，每次3min。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、无菌苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好假鳞茎按芽点用手术刀切割为2cm大小，接入下列A培养基中进行培养。

A培养基：

1/2MS基本培养液

4、取步骤3中培养70d后由芽点生长出来的幼芽转接入步骤3中的培养基内进行增殖培养，同时在步骤3中发现外植体基部会产生愈伤组织，将携带有少量愈伤组织的幼苗切下，继续转入B培养基(增殖培养基)中进行培养。

B培养基：

1/2MS基本培养液

在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行培养，同步进行愈伤组织诱导，丛芽发生和增殖。15d后观察发现愈伤组织开始增殖，30d后愈伤组织的表面出现紫色芽点，40d后愈伤组织迅速分化出不定芽，60d后不定芽开始分化出幼苗，并且有不定根的发生，见图1。将不定丛芽切割为2株一丛，转接至相同的B培养基中继续培养60d，繁殖系数达到5.84；在继代增殖培养中，采用将老苗叶片剪除，仅留一半叶柄的“剪切”方式进行转接，除愈伤组织产生的不定丛芽外，所有增殖培养的新苗均由剪后老苗基部分蘗产生，故试管苗的粗壮程度随转接代数的增加而增加；另一方面，由于每一代的“剪切”式转接，均可淘汰部分弱小、基茎无分蘗能力的材料；将幼苗切下转入相同B培养基中继续增殖，试管苗基部有米粒大假鳞茎出现。

5、把步骤4中继代培养具米粒大小假鳞茎的单苗接种于C培养基中进行培养。

C培养基：

1/2MS基本培养液

在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行培养，15d之后苗逐渐长大，30d之后假鳞茎开始膨大并有黄色的根出现，60d以后生根数量增加，根系增长，形成完整的根系，生根率达到100％。

6、炼苗和移栽：取步骤5中6cm高的生根植株置于室温下炼苗3d后，从C培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒3min，后移栽至消毒后的基质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率为95％。

实施例2

一种山慈菇人工快繁的新方法，包括以下步骤：

2、将步骤1的假鳞茎先用自来水清洗表面泥土，再用10％洗衣粉溶液(质量比)浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台；5％维生素C(VC)溶液(质量比)浸泡3min，75％乙醇溶液(体积比)处理15s，再经0.1％汞水溶液(质量比)消毒8min，最后无菌水冲洗5次，每次3min。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、无菌苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好假鳞茎按芽点用手术刀切割为1.7cm大小，接入下列A培养基中进行培养。

A培养基：

1/2MS基本培养液

B培养基：

1/2MS基本培养液

在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行培养，同步进行愈伤组织诱导，丛芽发生和增殖。15d后观察发现愈伤组织开始增殖，30d后愈伤组织的表面出现紫色芽点，40d后愈伤组织迅速分化出不定芽，60d后不定芽开始分化出幼苗，并且有不定根的发生。将不定丛芽切割为2株一丛，转接至相同的B培养基中继续培养60d，繁殖系数达到5.94；在继代增殖培养中，采用将老苗叶片剪除，仅留一半叶柄的“剪切”方式进行转接，除愈伤组织产生的不定丛芽外，所有增殖培养的新苗均由剪后老苗基部分蘗产生，故试管苗的粗壮程度随转接代数的增加而增加；另一方面，由于每一代的“剪切”式转接，均可淘汰部分弱小、基茎无分蘗能力的材料；将幼苗切下转入相同B培养基中继续增殖，试管苗基部有米粒大假鳞茎出现。

C培养基：

1/2MS基本培养液

6、炼苗和移栽：取步骤5中7cm高的生根植株置于室温下炼苗3d后，从C培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.2％的多菌灵溶液中消毒2min，后移栽至消毒后的基质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率为98％。

实施例3

一种山慈菇人工快繁的新方法，包括以下步骤：

2、将步骤1的假鳞茎先用自来水清洗表面泥土，再用10％洗衣粉溶液(质量比)浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台；5％维生素C(VC)溶液(质量比)浸泡3min，75％乙醇溶液(体积比)处理14s，再经0.1％汞水溶液(质量比)消毒10min，最后无菌水冲洗5次，每次3min。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、无菌苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好假鳞茎按芽点用手术刀切割为1.6cm大小，接入下列A培养基中进行培养。

A培养基：

1/2MS基本培养液

B培养基：

1/2MS基本培养液

在光照度1500-2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行培养，同步进行愈伤组织诱导，丛芽发生和增殖。15d后观察发现愈伤组织开始增殖，30d后愈伤组织的表面出现紫色芽点，40d后愈伤组织迅速分化出不定芽，60d后不定芽开始分化出幼苗，并且有不定根的发生。将不定丛芽切割为3株一丛，转接至相同的B培养基中继续培养60d，繁殖系数达到5.91；在继代增殖培养中，采用将老苗叶片剪除，仅留一半叶柄的“剪切”方式进行转接，除愈伤组织产生的不定丛芽外，所有增殖培养的新苗均由剪后老苗基部分蘗产生，故试管苗的粗壮程度随转接代数的增加而增加；另一方面，由于每一代的“剪切”式转接，均可淘汰部分弱小、基茎无分蘗能力的材料；将幼苗切下转入相同B培养基中继续增殖，试管苗基部有米粒大假鳞茎出现。

C培养基：

1/2MS基本培养液

6、炼苗和移栽：取步骤5中8cm高的生根植株置于室温下炼苗3d后，从C培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.12％的多菌灵溶液中消毒3min，后移栽至消毒后的基质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率达96％。

本发明的技术原理：

1、外植体选用山慈菇的假鳞茎，保证了其具优良、稳定的基因型，解决了由于遗传漂变和近交繁殖所产生的种质衰退问题。

2、山慈菇种子通过人工非共生性萌发虽然可以获得大量种苗，但是随着转接次数和增殖代数的增加，导致试管苗失去繁殖能力，最终陷入一个死循环；而且通过种子组培获得种苗存在基因型参差不齐的问题。本发明在保证较高繁殖系数的前提下，创造了保持山慈菇优良种性最有效的增殖方式：即低代数试管苗适宜采用愈伤组织-丛生芽增殖，而不适宜直接生根培养；高代数试管苗则适合采用分蘖、假鳞茎繁殖等方式进行增殖；从而克服了无菌实生苗存在的上述问题。

3、早期愈伤组织-不定丛芽途径仅起到增加试管苗基数的目的，扩繁及复壮均采用分蘗或假鳞茎增殖途径，其增殖系数高，达5.84以上。

4、通过生根培养阶段培养基组分香蕉量的增加使用，使分蘗或假鳞茎增殖诱导出的再生植株均具假鳞茎，且比较强壮，叶片宽大舒展，如图2所示，在进行炼苗移栽时成活率高，可达95％以上，从而解决了山慈菇炼苗移栽成活率低的问题。

5、本发明对山慈姑离体快速繁殖进行了优化调整，同步进行愈伤组织生长、丛芽发生和增殖以及分蘗苗的诱导和生长，简化其人工快繁过程，大大提高了繁殖效率；探索出山慈菇最有效的增殖途径：依靠分蘗和假鳞茎增殖，将优良性状固定下来，且成活率高、易于标准化、工厂化操作，从而解决了人工栽培中的分株繁殖周期长、效率低，育种进程缓慢，极度限制山慈菇的种植规模的问题。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将步骤1的假鳞茎先用自来水清洗表面泥土，再用洗衣粉溶液浸泡并震荡搅动后流水冲洗，置于工作台；接着用维生素C溶液浸泡，再接着用乙醇溶液处理，再经汞水溶液消毒，最后冲洗，得到消毒灭菌好的假鳞茎；

(3)无菌苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好的假鳞茎按芽点用手术刀切割茎段，放入A培养基中进行培养；

所述A培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

香蕉泥

萘乙酸NAA

6-苄胺基嘌呤6-BA

活性炭AC

蔗糖

琼脂粉；

所述B培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

香蕉泥

萘乙酸NAA

6-苄胺基嘌呤6-BA

激动素KT

活性炭AC

蔗糖

琼脂粉；

所述C培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

香蕉泥

萘乙酸NAA

活性炭AC

蔗糖

琼脂粉；

2.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(2)中所述洗衣粉溶液的质量浓度为10％。

3.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(2)中所述维生素C溶液的质量浓度为5％。

4.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙醇溶液的体积浓度为75％。

5.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(2)中所述汞水溶液的质量浓度为0.1％。

6.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(3)中所述A培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

所述A培养基的pH值为5.4-5.8。

7.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(4)中所述B培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

所述B培养基的pH值为5.4-5.8。

8.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(5)中所述C培养基，包括以下组分：

1/2MS基本培养液

所述C培养基的pH值为5.4-5.8。

9.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(6)中所述生根植株高为6-8cm。

10.根据权利要求1所述的山慈菇人工快繁的新方法，其特征在于，步骤(6)中所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.2％。