CN110448554B - D-青霉胺联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用 - Google Patents

D-青霉胺联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开属于抗真菌药物联合用药技术领域，具体涉及D‑青霉胺联合氟康唑药物在制备抗真菌产品中的应用。白色念珠菌是一种危害程度较大的感染真菌，临床常用的抗真菌药物品种有限。并且随着治疗的进行，耐药菌株不断出现。本公开针对D‑青霉胺与氟康唑抗真菌药物联合应用于耐药型白色念珠菌的治疗展开了研究，研究结果显示，D‑青霉胺可以显著地降低氟康唑药物的使用剂量，降低菌株耐药几率，并且减少药物的用量有利于消除药物体内累积带来的毒副作用。另外，D‑青霉胺与氟康唑药物的联用对耐药型菌株具有选择性的抑制效果，也为克服真菌耐药提供了研究的依据。

Description

D-青霉胺联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用
技术领域
本公开属于抗真菌药物联合用药技术领域，具体涉及D-青霉胺与三唑类药物联合在制备抑制耐药型白色念珠菌产品方面的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来，侵袭性真菌感染在肿瘤患者器官移植、导管插管患者及艾滋病患者等免疫力低下者的人群中的发生率越来越高。念珠菌是临床分离具有较高比例的侵袭性真菌，其中白色念珠菌(Candida albicans,CA)引起的感染是念珠菌感染的主要组成部分。唑类抗真菌药物尤其是氟康唑(Fluconazole,FLC)，凭借其安全、有效、价廉和低毒的特性成为预防和治疗白色念珠菌所引起感染的首选药。然而，由于氟康唑在临床治疗中的频繁使用，真菌的耐药现象逐渐增多，给临床治疗深部真菌感染带来极大的挑战。研究新的抗菌药物耗时长，经济投入大，因此联合用药成为克服真菌耐药的有效策略之一。近年来研究表明，许多非抗真菌药物自身虽无强大的抗真菌作用，但能明显增加唑类药物的敏感性，这对于克服真菌耐药性提供了一种有效的途径，也为新药开发提供了新的线索与思路。唑类抗真菌药物在临床上治疗深部侵袭性真菌病的应用非常广泛，如果能通过联合用药的途径将抗真菌作用不强的非抗真菌药物与唑类药物联用，可以增加唑类这一安全、价廉的抗真菌药物的临床作用效果，意义重大。
D-青霉胺为青霉素的降解产物，是含有巯基的氨基酸，为铜、汞、锌和铝的有效络合剂，并能促使这些金属从肾脏排泄。Wilson病(肝豆状核变性)是一种铜先天性代谢缺陷疾病，D-青霉胺为当前有效的治疗药物，用药后可使尿铜排泄增加5～20倍，而改善症状。D-青霉胺对汞中毒也有解毒作用。
发明内容
本公开采用棋盘法来评价氟康唑与D-青霉胺联合对耐药型白色念珠菌的体外抗真菌活性，研究表明，两者的联用对耐药型白色念珠菌表现出协同作用，可以在达到相同抑菌效果的同时显著降低氟康唑的用量。该研究结果表明该药物联用组合有望应用于临床，为克服临床真菌耐药现状提供思路。
基于上述研究结果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供D-青霉胺与三唑类药物联合在制备抗真菌产品中的应用。
D-青霉胺是青霉素的降解产物，具有强大的螯合铜、锌、汞等金属离子的能力，临床上广泛地应用于因先天性铜代谢障碍而导致的Wilson病(肝豆状核变性)，D-青霉胺在该领域的各方面研究较为透彻全面，但目前尚未有与抗真菌治疗相关的报道。本专利公开表明D-青霉胺与抗真菌药物联用可以提高耐药真菌对氟康唑的敏感性，具有很好的抗真菌疗效。
氟康唑因其体内代谢时间长，毒性小，因此在临床上广泛应用。但由于其频繁使用，导致耐药株在临床不断出现，加大用药剂量后，使得药物在肝肾的代谢负担增加，延缓了患者的治疗效果。本公开研究表明，氟康唑与D-青霉胺的药物组合可以显著降低氟康唑的用量。
优选的，所述三唑类药物包括但不限于氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑及泊沙康唑；更为优选的，为氟康唑。
优选的，所述抗真菌产品包括抗真菌抑制模型工具药物及抗真菌药物。
优选的，所述真菌包括但不限于白色念珠菌；进一步的，所述白色念珠菌为耐药型白色念珠菌。
本公开第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括D-青霉胺与三唑类药物。
优选的，所述药物组合中，D-青霉胺的最低抑菌浓度为64μg/mL，氟康唑的最低抑菌浓度为0.125μg/mL。
在本公开的一些实施实例中，采用D-青霉胺与氟康唑联用的药物组合抑制耐药型白色念珠菌CA10，二者联用达到最低抑菌浓度的浓度分别为：D-青霉胺为64μg/mL；氟康唑为0.125μg/mL。根据本实验结果，临床上由CA10导致的真菌感染，在氟康唑浓度为0.125μg/mL以上且D-青霉胺为64μg/mL以上时，即可达到协同对抗耐药白色念珠菌CA10的效果。
本公开的一些实施例中，所述氟康唑和D-青霉胺的有效浓度配比为氟康唑：D-青霉胺＝0.125～1.5：64～100；优选的配比为0.125：64。
本公开第三方面，提供第二方面所述组合物在制备防治白色念珠菌引发疾病的药物中的应用。
所述疾病包括但不限于皮肤念珠菌疾病、粘膜念珠菌疾病、内脏及中枢神经念珠菌疾病。
其中，所述皮肤念珠菌疾病包括腑窝、腹股沟，乳房下，肛门、甲沟、指间等处的念珠菌感染。
所述粘膜念珠菌感染包括鹅口疮、口角炎、阴道炎等。
所述内脏及中枢神经念珠菌疾病包括肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎或败血症等。
所述药物中，D-青霉胺与三唑类药物联合作为活性成分占药物重量比的65-99％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液；本公开不排除一种或多种与该药物组合物具有相同或近似活性的成分间的联用，而这种联用很大可能上会降低所述药物组合物在组合物中的用量，比如该用量占总重量的1-65％，也有可能在联用效果极好时，极大地降低该组合物的使用量，比如该用量会低至占总重量的不足1％，本领域技术人员视具体情形通过常规实验可以获得所需的用量。
本公开所述药物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
这些药物组合物通常安全、无毒且为生物学上所需要的，因此，本公开中所述药学上可接受的载体或赋形剂是无毒且安全的。本公开所述的药学上可接受的载体和赋形剂通常为本领域人员所熟知的，或者可由本领域技术人员根据实际情况能够确定的。
所述药学上可接受的辅料包括但不限于赋形剂、载体等等。本领域技术人员可根据赋形剂所具有的不同的目的，选择适宜的赋形剂。比如根据药物性质或者给药模式，常用的赋形剂比如溶剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、填充剂、乳化剂、粘结剂、崩解剂、稳定剂、矫味剂、抗氧化剂、着色剂、稀释剂、pH调节剂、压力调节剂等，或者这些种类中的二种或多种的组合等等。
所述药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是常规剂型，比如液体剂型例如乳剂剂型、胶体类、真溶液类、微粒剂型、混旋剂型；比如其他常规机型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、口服液、粉剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包合物、填埋剂等。这些剂型可按照药学领域的常规制备方法制备，比如混合、制粒、压片、填充、溶解或混悬分散等等。
本公开的药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为经皮肤给药。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
本公开第四方面，提供一种真菌感染治疗方法，所述方法包括使用第二方面所述的药物组合物。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.D-青霉胺在临床上主要用于治疗Wilson病及重金属中毒的解毒剂，还有研究报道其对类风湿性关节炎等免疫性疾病也有一定的疗效，但目前D-青霉胺尚未有在抗真菌领域的报道。本公开首次提出D-青霉胺与抗真菌药物联合用于抗真菌治疗，有望为抗真菌药物开发提供思路。
2.本公开对D-青霉胺和氟康唑联合应用的研究表明，二者联用对耐药型白色念珠菌具有明显的效果。研究发现，D-青霉胺可以显著提高耐药白色念珠菌对氟康唑的敏感性，若有望应用于临床，可以大大降低氟康唑的用量，从而减少因用量过大带来的副作用，具有较大的临床意义。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例2中药物联用对耐药型白色念珠菌的菌丝影响的显微照片图；
图中为平行的三组菌培养结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，侵袭性真菌致病的发病率呈现逐渐升高的趋势，真菌的耐药问题是相关疾病治疗的主要难点。本公开通过棋盘法确立了氟康唑与D-青霉胺联合对白色念珠菌具有良好的体外抗真菌活性，表现出协同作用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。实施例1D-青霉胺与氟康唑联合抗真菌作用测定
1.材料
1.1药品与试剂
D-青霉胺(D-penicillamine，PCA)，大连美仑生物技术有限公司；
氟康唑(fluconazole，FLC)，大连美仑生物技术有限公司；
科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；
TTC-沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；
酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；
蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；
葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；
琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
PBS磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；
磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。
RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；
二甲基亚砜，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
药物溶液：D-青霉胺、氟康唑用无菌蒸馏水溶解，配成2560μg/mL的储备液，过滤分装。药液于4℃冰箱保存，备用。
PBS缓冲液：称取12gPBS磷酸盐缓冲剂至1L容量瓶，加入蒸馏水搅拌使其完全溶解，再加蒸溜水至刻度线，分装到试剂瓶后在121℃下高压灭菌30min，冷却后放4℃冰箱保存。
酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉10g，加水溶解在500mL锥形瓶中，充分搅拌均匀后121℃灭菌30min，冷却后4℃冰箱保存备用。
RPMI 1640液体培养液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及MOPS粉6.906g，加蒸馏水至约为200mL，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。
1.2仪器
AB204-N电子天平梅特勒-托利(上海)公司
SVE-4A1超净工作台新加坡ESCO公司
INCUCELL 55恒温培养箱德国MMM公司
VENTICELL 55干热灭菌箱德国MMM公司
HS-9041高温高压灭菌器韩国HANSHIN公司
不锈钢过滤器(2000ml)江苏天和仪器厂
96孔培养板美国COSTAR公司
可调式移液器Thermo Electron(上海)公司
SC-329常温冰箱中国海尔公司
-20℃低温冰柜中国海尔公司
G-560E涡旋混合器美国Si公司
1.3实验菌株
实验菌株：千佛山医院临床分离的白色念珠菌CA10，CA16；
菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色的所有菌株再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。
菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为1×106CFU/mL，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。
2.内容与方法
2.1D-青霉胺与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌作用测定
根据CLSI M27-A3方案的棋盘法，以RPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选D-青霉胺与氟康唑联合应用的浓度范围，即D-青霉胺为1024～32μg/mL，氟康唑的终浓度为512～0.125μg/mL。按浓度从低到高的顺序吸取氟康唑50μL，加入96孔平板的第2～11列，按浓度从低到高的顺序吸取D-青霉胺药液50μL，分别加入各96孔平板的第G～A行，除第12列外各孔再分别加100μL菌液，其余不足200μL的孔用RPMI-1640培养液补足。其中H1为生长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含RPMI-1640液体培养基。根据CLSI M27-A3方案的要求，将加药的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h，用肉眼观察结果并记录最低抑菌浓度。所有实验重复三次。
2.2评价方法与结果判定Loewe additivity理论
Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index，FICI)，表述如下：
ΣFIC＝FICA+FICB＝CA/MICA+CB/MICB
MICA和MICB分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，CA与CB为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI>4为拮抗作用，FICI在0.5与4之间为相加或无关作用，FICI≤0.5定义为协同作用。
3.结果
FICI模型D-青霉胺与氟康唑联用的协同作用
FICI模型的评价指标为FICI值，FICI≤0.5则定义为协同作用。由表1可以看出，各组合的FICI值均小于0.5，表现为较强的协同作用。
表1以FICI模型评价D-青霉胺与氟康唑联合用药抗耐药白色念珠菌作用
Figure BDA0002201280550000111
注解：FLC：氟康唑；PCA:D-青霉胺。MIC：最低抑菌浓度；MICFLC：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；CFLC：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；MICPCA：药物单用时D-青霉胺的最低抑菌浓度；CPCA：药物联用时D-青霉胺的最低抑菌浓度；FICI：分数抑菌浓度指数。
实施例2药物联用对耐药白色念珠菌菌丝生长的影响
1.材料
1.1药品与试剂
D-青霉胺(D-penicillamine，PCA)，大连美仑生物技术有限公司；
氟康唑(fluconazole，FLC)，大连美仑生物技术有限公司；
科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；
TTC-沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；
酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；
蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；
葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；
琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
PBS磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；
磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。
RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；
二甲基亚砜，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
药物溶液：D-青霉胺、氟康唑用无菌蒸馏水溶解，配成2560μg/mL的储备液，过滤分装。药液于4℃冰箱保存，备用。
PBS缓冲液：称取12gPBS磷酸盐缓冲剂至1L容量瓶，加入蒸馏水搅拌使其完全溶解，再加蒸溜水至刻度线，分装到试剂瓶后在121℃下高压灭菌30min，冷却后放4℃冰箱保存。
酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉10g，加水溶解在500mL锥形瓶中，充分搅拌均匀后121℃灭菌30min，冷却后4℃冰箱保存备用。
RPMI 1640液体培养液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及MOPS粉6.906g，加蒸馏水至约为200mL，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。
1.2仪器
AB204-N电子天平梅特勒-托利(上海)公司
SVE-4A1超净工作台新加坡ESCO公司
INCUCELL 55恒温培养箱德国MMM公司
VENTICELL 55干热灭菌箱德国MMM公司
HS-9041高温高压灭菌器韩国HANSHIN公司
不锈钢过滤器(2000ml)江苏天和仪器厂
96孔培养板美国COSTAR公司
可调式移液器Thermo Electron(上海)公司
SC-329常温冰箱中国海尔公司
-20℃低温冰柜中国海尔公司
G-560E涡旋混合器美国Si公司
Leica DMi8荧光导致显微镜德国徕卡公司
1.3实验菌株
实验菌株：千佛山医院临床分离的白色念珠菌CA10；
菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色的所有菌株再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。
菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为1×106CFU/mL，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。
2.内容与方法
本实施例共分为四组，分别是生长对照组，FLC单用组，PCA单用组合FLC+PCA联用组。具体操作如下：取紫外线灭菌30min的96孔细胞培养板，各加入40μL 5×105的菌悬液，FLC单用组加上50μL 4μg/mL的FLC溶液，PCA单用组加上50μL 256μg/mL的PCA溶液，FLC+PCA组加上4μg/mL的FLC溶液和256μg/mL的PCA溶液各50μ，各体系补加RPMI-1640培养基，使终体积均为200μL。最终白色念珠菌菌液工作浓度为105CFU/mL，FLC的工作浓度为1μg/mL，PCA的工作浓度为64μg/mL。将96孔细胞培养板置于恒温震荡培养箱，37℃、75rpm条件下培养4h。之后，取出培养板，吸出孔内培养基，并用无菌PBS轻柔洗孔三次以除去悬浮细胞和其它杂质。随后，加入1000μL 4％多聚甲醛固定液固定15min，将残余固定液吸出后晾干，将标本置于Leica DMi8荧光倒置显微镜下观察拍照。实验重复三次。
3.结果
在37℃及PH约为7左右的条件下，RPMI-1640培养基可诱导白色念珠菌酵母相细胞，完成98％-99％的菌丝相细胞的转换，是一种理想的菌丝诱导培养基，因此，本实施例采用RPMI-1640诱导菌丝形成。由图1可以看出，只含菌细胞和RPMI-1640培养基的生长对照组中，由RPMI-1640培养基诱导形成的菌丝长且密，错综复杂，相互缠绕重叠，视野内观察不到酵母相菌细胞。FLC和PCA单用组菌丝形态略有变化，但仍为长而密的菌丝态。而在FLC+PCA联用组，视野内菌丝长短明显变短，并且菌丝多散在，较少聚集成大的团块，同时视野内偶尔可见酵母相细胞。这一现象说明，FLC与PCA的联用可以抑制白色念珠菌由酵母态向菌丝态转变。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (7)

1.D-青霉胺与三唑类药物联合在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述三唑类药物为氟康唑，所述真菌为白色念珠菌；
所述联用中，D-青霉胺的最低抑菌浓度为64μg/mL，氟康唑的最低抑菌浓度为0.125μg/mL；
所述氟康唑和D-青霉胺的有效浓度配比为氟康唑：D-青霉胺=0.125：64。
2.如权利要求1所述D-青霉胺与三唑类药物联合在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述抗真菌产品为抗真菌抑制模型工具药物或抗真菌药物。
3.如权利要求1所述D-青霉胺与三唑类药物联合在制备抗真菌产品中的应用，其特征在于，所述白色念珠菌为敏感型白色念珠菌或耐药型白色念珠菌。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分为D-青霉胺与氟康唑；
所述药物组合中，D-青霉胺的最低抑菌浓度为64μg/mL，氟康唑的最低抑菌浓度为0.125μg/mL；
所述氟康唑和D-青霉胺的有效浓度配比为氟康唑：D-青霉胺=0.125~1.5：64~100。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述氟康唑和D-青霉胺的有效浓度配比为0.125：64。
6.权利要求4-5任一项所述药物组合物在制备防治白色念珠菌引发疾病的药物中的应用。
7.如权利要求6所述药物组合物在制备防治白色念珠菌引发疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为皮肤念珠菌疾病、粘膜念珠菌疾病、内脏及中枢神经念珠菌疾病；
其中，所述皮肤念珠菌疾病为腑窝、腹股沟、乳房下、肛门、甲沟、指间处的念珠菌感染；
所述粘膜念珠菌疾病为鹅口疮、口角炎、阴道炎；
所述内脏及中枢神经念珠菌疾病为肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎或败血症。
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