CN110446502A - 用于联合非混合使用的含猪病原体的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及第一疫苗和第二疫苗的组合产品，所述第一疫苗包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原，所述第二疫苗包含活减毒的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，所述组合产品用于通过第一疫苗和第二疫苗向动物的联合非混合施用而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。本发明还涉及包含第一疫苗和第二疫苗的成套试剂盒和使用这些疫苗保护动物对抗此类感染的方法。
Description
发明的总体领域
本发明总体涉及猪健康的领域。猪对许多致病性的微生物易感。感染的控制通常通过农场和饲料管理，用药物诸如抗病毒药物和抗生素治疗，或使用疫苗预防性治疗来完成。特别地，本发明涉及针对2型猪圆环病毒(PCV2或PCV-2)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒和任选胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)的疫苗，并且涉及使用此类疫苗保护动物对抗此类感染的方法。
发明背景
PCV-2与在幼猪中观察到的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)相关。这种疾病于1991年首次在加拿大遇到。临床体征和病理学首次发表于1996年，并且包括进行性消瘦、呼吸困难、呼吸急促，和偶尔的黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。
Nayar等人(Can. Vet. J. Volume 38, June 1997)在具有PMWS的临床症状的猪中检测到猪圆环病毒，并得出结论认为，一种不同于被认为是PK-15细胞的天然栖息物的已知PCV的PCV可与PMWS相关。后来的出版物(Hamel等人，J.Virol., 72(6), 5262-5267,1998；Meehan等人，J. Gen.Virol., 79, 2171-2179, 1998)证实了这些发现，并且提出(Meehan等人，同上)将新的致病性PCV称为PCV-2，而原始的PK-15细胞培养物分离物(Tischer等人，Nature 295, 64-66, 1982)应该被称为PCV-1。PCV-2是一种小的(17-22nm)二十面体无包膜病毒，其含有环状单链DNA基因组。PCV-2基因组的长度为约1768bp。源自世界不同区域的PCV-2分离株似乎彼此密切相关并且显示约95％至99％的核苷酸序列同一性(Fenaux等人，J.Clin. Micorbiol., 38(7), 2494-2503, 2000)。PCV的ORF2编码病毒的衣壳蛋白。PCV 2的ORF2基因编码约233个氨基酸的蛋白质。所有PCV-2分离株的ORF2基因共有91-100％的核苷酸序列同一性和90-100％推导的氨基酸序列同一性。
猪肺炎支原体(Mhyo)是一种已知引起疾病猪地方性肺炎的细菌物种，所述猪地方性肺炎是一种影响猪的高度传染性和慢性疾病。Mhyo的尺寸小(400-1200 nm)，具有小的基因组(893-920千碱基对(kb))，且缺乏细胞壁。Mhyo附着于猪肺部中的上皮细胞的纤毛。它们引起纤毛停止跳动，结块和纤毛丢失，最终导致上皮细胞死亡。这是见于患有猪地方性肺炎的猪的肺部中的病变的来源。这种损害阻碍了正常的纤毛清除，并且经常发生继发感染。这引起动物增重显著减少。以前估计美国的损失高达每年10亿美元。猪地方性肺炎在全世界流行，并且Mhyo存在于几乎每个猪群。由Mhyo在猪中存在诱导的免疫应答是缓慢且无效的。因此，这种疾病的治疗是最重要的，但仅限于抗生素，目前这些抗生素仅部分有效，因为它们没有完全消除感染。已发现疫苗降低疾病的严重程度，但没有完全预防受感染猪发生疾病。
PRRS病毒于1987年首次在北美和中欧报道。PRRS病毒是一种小的包膜RNA病毒。它包含单链，正义的RNA基因组，其大小为约15千碱基。所述基因组含有九个开放阅读框。所述病毒是巢病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)的成员。PRRSV的两种原型毒株是北美毒株VR-2332和欧洲毒株Lelystad病毒(LV)。欧洲和北美PRRSV毒株引起类似的临床症状。最近在中国出现了北美基因型的高致病性毒株。此毒株HP-PRRSV比所有其他毒株毒性更强，并且在亚洲国家引起巨大损失。临床体征包括母猪的繁殖失败，诸如流产和产下死胎或木乃伊胎儿，以及耳朵和外阴的紫绀。在新生猪中，所述疾病引起呼吸窘迫，且对呼吸道感染诸如革拉泽氏病(Glässer's disease)的易感性增加。
胞内劳森氏菌引起增殖性肠病，也称为回肠炎，这是全世界断奶后猪的常见肠道疾病。特征性病变是回肠肠隐窝中未成熟肠细胞的增殖；这些细胞通常在其顶端细胞质内含有致病细菌。在尸检时，通过1.5-2.5µm长的弧菌状细菌的可视化(特别是在肠细胞中，但是也经常在位于隐窝之间的固有层中，和在肠系膜淋巴结中的巨噬细胞内)，可以确认组织学病变为劳森氏菌阳性的。从肠细胞清除细菌导致相关增殖性病变的消退，表明细菌对隐窝的直接局部作用。在表现出疾病的动物中和仅表现出亚临床感染的动物二者中，已经使用PCR证实了这些病变中胞内劳森氏菌的存在。临床病例通常存在于生长-育肥期；在一些较老的肥育猪中，已记录到急性出血形式。
针对上述鉴定的病原体的疫苗是众所周知的。用于针对PCV 2感染预防性治疗动物(特别是猪)的常规疫苗可以基于作为(非复制型)免疫原的完整的灭活PCV-2病毒。此外，在本领域中已经显示ORF2编码的衣壳蛋白(例如当重组表达时)，适合作为2型猪圆环病毒的亚单位免疫原用于适当的疫苗中。这是可以理解的，因为该亚单位在循环系统中，以与病毒本身相同的方式出现(它形成病毒样颗粒)，本质的区别仅在于衣壳内不存在DNA和非结构蛋白的事实。在本领域中，几种针对PCV2的疫苗是商购可得的。Porcilis® PCV (可得自MSD Animal Health, Boxmeer，荷兰)是用于针对2型猪圆环病毒保护猪的疫苗，其用于3周及更大的猪中。当作为两针(两剂)疫苗给予时，免疫持续时间(DOI)为22周，几乎完全覆盖猪的育肥期。Ingelvac CircoFlex® (可得自Boehringer Ingelheim, Ingelheim)是用于针对2型猪圆环病毒保护猪的疫苗，其用于两周及更大的猪中。它仅作为一针(一剂)疫苗注册。Circovac® (可得自Merial，法国里昂)是用于针对2型猪圆环病毒保护猪的疫苗，其用于3周及更大的猪中。Suvaxyn® PCV (可得自Zoetis, Capelle a/d IJssel，荷兰)是用于针对2型猪圆环病毒保护猪的疫苗，其用于3周及更大的猪中。其他PCV2疫苗描述于例如WO2007/028823、WO 2007/094893和WO2008/076915中。
关于猪肺炎支原体，存在许多商业疫苗，且这些通常用于大多数商业猪养殖操作中。通常，这些疫苗包含非复制型免疫原，诸如亚单位蛋白和/或菌苗(即，这样的组合物，其包含杀死细菌(作为完整细胞，(部分)裂解，均质化，弗氏压碎(French pressed)，这种组合)，或包含另一种形式的杀死细菌，只要所述组合物源自杀死的细菌培养物)，其通常通过肠胃外注射施用。一些实例为：RespiSure® (Zoetis)、Ingelvac® M. hyo，和MycoFLEX®(Boehringer Ingelheim)、Hyoresp® (Merial)、Stellamune® Mycoplasma (ElancoAnimal Health)、Fostera® PCV MH (Zoetis)和M+Pac®和Porcilis® Mhyo (均可得自MSD Animal Health)。
关于PRRS病毒，尽管灭活病毒疫苗已经被描述并且是商购可得的，但是包含活减毒形式的欧洲型(I型)或北美型(II型)的修饰活疫苗(MLV疫苗)是用于其控制的主要免疫学工具。几种疫苗在本领域中是商购可得的。Porcilis® PRRS (可得自MSD AnimalHealth, Boxmeer，荷兰)是包含活减毒的I型PRRS病毒的疫苗，并且注册用于减少由PRRS病毒感染引起的感染(病毒血症)。Ingelvac PRRS® MLV (可得自Boehringer Ingelheim,Ingelheim)是有助于减少由PRRS病毒引起的疾病的疫苗，并且该疫苗提供针对不同类型毒株的交叉保护。Fostera® PRRS (可得自Zoeitis, Florham Park, New Jersey, USA)也是MLV疫苗，且注册用于针对由PRRS病毒引起的呼吸和生殖形式的疾病的保护。又另一种PRRS MLV疫苗是可得自Merck Animal Health, Madison, NJ, USA的PrimePac PRRS (II型)。其他PRRS疫苗描述于例如WO2006/074986、US 8728487和WO2014/048955中。
通过诱导主动保护来对抗胞内劳森氏菌的疫苗是商购可得的，并在本领域中描述。这些疫苗可以如下商品名获得：Enterisol® Ileitis (Boehringer IngelheimVetmedica, USA)，其为活减毒疫苗和Porcilis® Ileitis (Merck Animal Health,USA)，其为包含菌苗形式的胞内劳森氏菌的非复制型免疫原的疫苗。
发明目的
一直需要方便、安全和有效的猪健康管理手段。特别是，需要方便、安全和有效的疫苗，其可用于预防性治疗猪，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。
发明内容
为了实现本发明的目的，已经设计出第一疫苗和第二疫苗的组合，所述第一疫苗包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原，且第二疫苗包含活减毒的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，其中所述组合用于通过第一疫苗和第二疫苗向动物的联合非混合施用而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。
尽管对于上文提到的每种病原体，疫苗是已知并且商购可得的，但是没有用于联合非混合施用的可得疫苗组合，这种疫苗的组合提供所需的功效并且同时对于在动物(特别是年幼的动物)中的使用是安全的。众所周知，并非所有考虑或建议的抗原组合都可以产生安全且有效的组合疫苗。相应地，疫苗的联合非混合使用(也称为同时施用)可引起相互作用，导致安全性问题或对疫苗中存在的单个免疫原的应答减弱。在活疫苗的情况下，可出现疫苗毒株的复制减少。不同免疫原之间的干扰可以由各种免疫事件(诸如抗原竞争)引起。抗原竞争描述了这样的现象：与单独给予相同免疫原时相比，在存在其他免疫原的情况下对特定免疫原(也称为抗原)的免疫应答可减弱。
作为众所周知的疫苗干扰问题(甚至在未混合的情况下施用时)的证据，是由欧洲药品管理局(EMA)兽医用药品委员会(CVMP)于2013年7月18日发布的指南，标题为“Guideline on the requirements for combined vaccines and associations of immunological veterinary medicinal products (IVMPs)”(EMA/CVMP/IWP/594618/2010)。在5.1节中，指出“IVMP的联合基础应该是可接受的安全性的证明，并且所涉及的 IVMP之间不存在严重干扰。如果联合的安全性概况不如对单独产品确认的安全性概况有 利，则应通过适当的收益-风险分析来证明联合的合理性，其中联合的收益明显胜过降低安 全性的风险。在这种情况下，应修改单独产品的SPC，以反映由于IVMP的联合使用而导致的 安全性概况。如果联合中的产品之间的某种水平的干扰导致功效降低，则IVMP的联合需要 进一步逐案证明合理性。还应该注意，对任何有关IVMP的生产或组成具有影响的变化也需 要所述联合的兼容性的重新评估。”。
此外，特别是对于与活PRRS病毒的任何组合施用：如果有的话，预期对其他免疫原的功效将具有负面影响，因为通常已知PRRS病毒是免疫抑制的。参见例如Zhou Y1, Bai J,Li Y, Wang X, Wang X, Jiang P的Can J Vet Res. 2012 Oct;76(4):255-60:“Suppression of immune responses in pigs by nonstructural protein 1 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.”。
总而言之，众所周知，针对多种病原体的组合疫苗接种并不简单，并且需要实验来确定安全性和功效，特别是当组合疫苗接种涉及活PRRS病毒时。
应注意，本发明还涉及包含第一疫苗和单独的第二疫苗的成套试剂盒(kit-of-parts)，所述第一疫苗包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原，并且所述第二疫苗包含活减毒的PRRS病毒，所述成套试剂盒用于通过第一疫苗和第二疫苗向动物的联合非混合施用而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。
本发明还涉及通过包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原的第一疫苗和包含活减毒的PRRS病毒的第二疫苗的联合非混合施用，而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染的方法。
本发明还涉及包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原的疫苗，其用于通过所述疫苗和包含活减毒的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒的另一疫苗向动物的联合非混合施用，而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。相应地，本发明涉及包含活减毒的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒的疫苗，其用于通过所述疫苗和包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原的另一疫苗向动物的联合非混合施用，而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。如下文“本发明的实施方案”部分中所述的每个具体实施方案可与这两种疫苗组合，用于根据本发明的用途。
应注意，在疫苗中，免疫原(也称为抗原)通常与药学上可接受的载体组合，所述药学上可接受的载体即生物相容性介质，也即，在施用后不在主体动物中诱导显著的不良反应，能够在疫苗施用后将免疫原呈递给宿主动物的免疫系统的介质，诸如含有水和/或任何其他生物相容性溶剂的液体，或固体载体，诸如通常用于获得冷冻干燥的疫苗(基于糖和/或蛋白质)，任选地包含免疫刺激剂(佐剂)，其在施用于动物后诱导免疫应答以治疗动物对抗野生型微生物感染，即用于帮助预防、减轻或治愈这种感染或由其引起的病症。取决于疫苗的预期用途或所需性质，添加任选其他物质，诸如稳定剂、粘度调节剂或其他组分。
定义
疫苗是药物组合物，其对于向主体动物施用是安全的，并且能够在该动物中诱导针对致病性微生物的保护性免疫，即诱导成功的预防性治疗，如下文所定义。
病原体的非复制型免疫原是除了作为整体的活复制型病原体(以野生型或减毒形式)以外，对应于病原体的任何物质或化合物，将激发针对该病原体的免疫应答，作为这种免疫应答的结果，使得相应的毒性病原体或一种或多种其毒力因子将被宿主的免疫系统识别，并最终至少部分被中和。非复制型免疫原的典型实例是杀死的完整病原体(该术语包括裂解形式的这些病原体)和这些病原体的亚基，诸如衣壳蛋白、表面表达的分子(例如重组表达的蛋白质或脂多糖)和外泌的分子，诸如毒素。
活减毒的病原体是具有降低的毒力的病原体的活的、能够复制的形式。减毒过程采用感染性病原体并改变它，使得其变得无害或毒性较小，通常通过病原体通过细胞系统的多次传代，或通过遗传修饰病原体来实现。
针对病原体感染的预防性治疗是帮助预防、减轻或治愈该病原体的感染或由该感染引起、由致病性的病原体的治疗后攻击导致的病症，特别是减少在此类攻击后其在宿主中的载量，并任选地帮助预防或减轻由病原体的治疗后感染导致的一种或多种临床表现。
疫苗的联合非混合施用(也称为同时施用)是单独地(因此在施用前不混合)向目标动物施用这些疫苗，但是在使得可能发生免疫干扰的时间框内，通常在24小时内施用。联合非混合使用的实例是在目标动物中的分开的应用位点同时施用，以及在相同或分开的应用位点但在不同时间施用，通常相隔1-6小时进行施用。
疫苗的同时施用意指在完全相同的时间或至少在1小时的时间框内施用，优选在55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2分钟或甚至1分钟的时间框内施用。
用于预防性治疗的疫苗的单剂量施用意指为了获得保护性免疫，不需要通过疫苗的第二次施用来加强疫苗接种。在两针方案中，第一次(初免)疫苗接种通常在第一次施用起6周内加强，通常在第一次施用起3周或甚至2周内加强，并且仅在第二次(加强)施用后，可获得保护性免疫，即成功的预防性治疗，如上文所定义。
本发明的实施方案
在根据本发明使用的第一疫苗和第二疫苗的组合的一个实施方案中，联合非混合施用同时发生。这个实施方案具有以下优点：为了应用两种疫苗，动物仅需要处理一次。
在本发明疫苗组合的另一个实施方案中，将第二疫苗施用于动物的真皮中。至少PRRS疫苗的这种施用已显示是安全和有效的，而同时与肌肉内施用相比时，对动物的压力较小。关于至真皮内的施用(也称为皮内施用)，尽管这种施用通常使用无针疫苗接种装置诸如IDAL® 疫苗接种器(可得自MSD Animal Health, Boxmeer, 荷兰)进行，但，“皮内”施用本身不应等同于“无针”施用。实际上，世界卫生组织在其2009年8月27日标题为“Intradermal Delivery of Vaccines; A review of the literature and thepotential for development for use in low- and middle-income countries”的文件中清楚地指出，“无针”疫苗接种并不一定意指“皮内”疫苗接种(参见综述的表1，第3页)。只有在无针装置“经配置用于皮内疫苗接种”时，疫苗才确实可以被(至少部分地)递送到真皮中。否则，疫苗可以以其整体皮下或肌肉内递送。
在第一疫苗和第二疫苗的组合的又另一个实施方案中，第一疫苗包含胞内劳森氏菌的非复制型免疫原。在这个实施方案中，疫苗的新型组合能够通过仅使用一个疫苗接种方案提供针对四种主要猪病原体的保护。在一个实施方案中，胞内劳森氏菌的免疫原在施用前24小时内、优选在施用前6小时内与PCV2和猪肺炎支原体的免疫原组合。在临施用前组合抗原提供了更多的选择赋形剂的自由度，因为尽管长期稳定性对于很多药物组合物、甚至对于包括PCV2 ORF2抗原的组合疫苗(例如，可得自MSD Animal Health的Porcilis®PCV M Hyo)是已知的(本身是已知的)，但可能仍然不能直接实现，至少对于任何和所有药学上可接受的载体组合物不能直接实现。在进一步的实施方案中，胞内劳森氏菌的免疫原以包含冷冻干燥的杀死的胞内劳森氏菌的全细胞的组合物的形式加入疫苗中。
在第一疫苗和第二疫苗的新型组合的仍另一个实施方案中，第一疫苗和第二疫苗通过单剂量施用。发现单剂量施用导致针对所有病原体的有效疫苗接种。这提供了一种非常方便和经济的方式以针对这些病原体保护动物。
在另一个实施方案中，非复制型免疫原是由PCV2的ORF2基因编码的重组表达的蛋白质，例如由本领域已知的杆状病毒表达的蛋白质。已经证明这种重组蛋白适合应用于本发明中。特别地，ORF2蛋白可以在杆状病毒表达系统中表达，诸如WO2007/028823、WO2007/094893或WO2008/076915中所述。
在再另一个实施方案中，猪肺炎支原体的非复制型免疫原包含杀死的完整猪肺炎支原体。这种Mhyo抗原相对易于生产，并且在日常养猪业实践中具有良好的功效跟踪记录。
现在将使用以下实施例更详细地解释本发明。
实施例
研究1：通过Porcilis® PCV MHyo与其中重构的劳森氏菌免疫原，和Porcilis® PRRS的联合非混合使用的安全性和针对PRRSv攻击的保护作用。
进行这个研究以评估与重构在Porcilis® PCV M Hyo中的冷冻干燥的杀死的胞内劳森氏菌全细胞(也称为“冷冻干燥的劳森氏菌”)联合非混合使用的Porcilis® PRRS的安全性和功效。该研究使用60只PRRSV抗体阴性仔猪进行，均匀分布于5组，每组12只仔猪。在三周龄，使用2 mL的Porcilis® PRRS肌肉内(IM；组1和3)或0.2 mL的Porcilis® PRRS皮内(ID；组2和4)向四个组接种疫苗。来自组1和2的仔猪在接受PRRS疫苗后几分钟内用重构在Porcilis® PCV M Hyo (2 mL; IM)中的冷冻干燥的劳森氏菌接种疫苗。组5中的仔猪(也是12只仔猪)未接种疫苗并用作未接种疫苗的攻击对照。疫苗接种后4周，使用异源毒性PRRSV 1型毒株(分离株2)通过鼻内(IN)途径攻击所有仔猪。
在攻击感染后，测量以下参数：临床体征，直肠温度和PRRSV病毒血症和血清学。
在任何组中均未观察到与PRRSV攻击相关的临床体征。
从攻击前一天开始直至攻击后10天，测量直肠温度12天。在任何疫苗接种组之间未观察到显著差异。在攻击后的几个时间点，所有PRRS疫苗接种组的直肠温度与对照组相比较低。IM或ID疫苗接种组之间没有统计学显著差异，用Porcilis® PRRS单独处理或用Porcilis PRRS与重构在Porcilis® PCV M Hyo中的冷冻干燥的劳森氏菌的组合处理的组之间也没有统计学显著差异。
在使用Porcilis® PRRS对仔猪疫苗接种的情况下，以及在使用Porcilis® PRRS对仔猪进行疫苗接种与重构在Porcilis® PCV M Hyo中的冷冻干燥的劳森氏菌的疫苗接种组合的情况下，显示与未接种疫苗的对照相比PRRSV病毒血症的显著减少(图1)。通过IM或ID途径施用的Porcilis® PRRS的单一使用和非混合联合使用之间未检测到显著差异。
所有疫苗接种组在接种疫苗后4周，在攻击当天显示抗PRRSV抗体滴度，而对照组则没有。攻击后4周，所有组均显示抗PRRSV抗体滴度，并且疫苗接种组中的滴度高于攻击当天。通过IM或ID途径施用的Porcilis® PRRS的单一使用和非混合联合使用之间未检测到统计学显著差异。
总之，重构在Porcilis® PCV M Hyo中的冷冻干燥的劳森氏菌的同时施用对通过IM或ID途径的Porcilis® PRRS疫苗接种没有负面影响。预想不到的是，劳森氏菌-PCV-Mhyo三联疫苗的联合使用对PRRS疫苗的功效完全没有负面影响(参见研究5)。
研究2：Porcilis® PCV MHyo与其中重构的劳森氏菌免疫原，和Porcilis® PRRS的联合非混合使用的PCV2功效研究。
将总共45只具有低至中度母源PCV2抗体滴度(<5.5log2)、没有PCV2病毒载量且无PRRSV抗体滴度的仔猪分配至3个处理组：各15只仔猪的3个组。仔猪在3周龄时接种疫苗一次。组1和2的仔猪使用溶解于Porcilis PCV M Hyo中的劳森氏菌FD进行疫苗接种，均为单剂量(肌肉内途径；IM)，并且来自组1的仔猪还在大约同时使用Porcilis PRRS进行疫苗接种(经肌肉内和皮内途径二者；IM和ID)。来自组3的动物保持未接种疫苗(对照)。
在5周龄(疫苗接种后2周)，使用鼻内应用的野生型PCV2攻击病毒攻击每只动物。攻击后21天，对所有动物尸检，并对腹股沟淋巴结、扁桃体和肺取样用于PCV2的检测。
在疫苗接种时、攻击前一天、攻击后2周和3周，采集血清样品。检查样品的PCV2抗体和病毒核酸。检查在攻击前一天、在攻击后2和3周采集的粪便和鼻拭子的病毒核酸。
血清学显示两个疫苗接种组在攻击时产生抗PCV2抗体至相当的水平(6 log2)，而对照组中的抗体已显著下降。攻击后，疫苗接种组中的抗体升至约13 log2，在攻击后3周测量。在对照组中，在该时间的水平为5 log2。攻击后，可以在对照动物中，在血清、鼻和粪便拭子中检测到病毒核酸。疫苗接种动物中的水平显著较低。在粪便样品中，使用两种疫苗同时进行疫苗接种的动物没有可检测水平的病毒核酸，表明这个组得到针对PCV2攻击最佳保护。通过组织中的qPCR测量证实了这种令人惊讶的可能改善保护的发现，如可见于图2中(左到右分别代表在扁桃体、肺和腹股沟淋巴结中发现的PCV2拷贝数)。在接受两种疫苗的动物(左栏)中一致地发现病毒载量的最低值，甚至低于接受商业PCV疫苗Porcilis® PCVM Hyo的动物(中栏)，其仍然显著低于对照(右栏)。
研究3：在猪中与Porcilis® PRRS同时使用的在Porcilis® PCV M Hyo中重构的冷冻干燥的劳森氏菌针对劳森氏菌攻击的功效。
对于这项研究，使用了75只3周龄的仔猪，分成三组。组1用重构在Porcilis® PCVM Hyo (2ml IM)中的冷冻干燥的劳森氏菌抗原进行疫苗接种，同时(1小时内)施用Porcilis® PRRS (2ml IM + 0.2ml ID)，组2用重构在Porcilis PCV M Hyo (2ml IM)中的冷冻干燥的劳森氏菌抗原进行疫苗接种，且组3保持作为未接种疫苗的对照。在7周龄(疫苗接种后4周)，用均质化的劳森氏菌感染的肠粘膜口服攻击所有猪。攻击后，每天观察猪的临床体征。在攻击之前和之后，定期收集血清血液(用于血清学)和粪便(用于qPCR)样品。攻击后3周，将猪安乐死并进行验尸检查。宏观检查肠的胞内劳森氏菌感染，且收集回肠样品用于qPCR和(免疫)组织学评分。
在疫苗接种当天，大多数猪对劳森氏菌呈血清阴性，而其他猪具有低至中等抗体滴度。疫苗接种后，组1和2的滴度显示出抗体滴度的类似增加，而对照显示略微降低并保持在低水平。在疫苗接种当天，猪具有低至中度的母源PCV抗体滴度。疫苗接种后，组1和组2的PCV抗体滴度显示出相似的增加，而对照显示母体抗体减少。在疫苗接种当天，猪对Mhyo和PRRSv呈血清阴性。疫苗接种后，组1和2显示出对Mhyo的相似抗体应答，而对照组3保持血清阴性直至试验结束。组1对PRRS疫苗接种应答，而组2和组3保持血清阴性直至攻击。
对于劳森氏菌攻击后的不同参数的结果总结于下表1中(攻击后21天的PCR数据，以log10 pg DNA/µl计)。
表1
| 组 | 对粪便的PCR | 对粘膜的PCR | 宏观回肠评分 | 免疫组织学回肠评分 |
| 1 | 0.00 | 0.22 | 40 | 0.6 |
| 2 | 0.60 | 0.41 | 84 | 0.8 |
| 3 | 1.72 | 1.15 | 161 | 5.0 |
从结果可以得出结论，溶解于Porcilis® PCV M Hyo中的劳森氏菌冷冻干燥抗原与Porcilis® PRRS同时施用(组1)，在疫苗接种后4周诱导针对劳森氏菌感染的显著保护。这通过脱落，感染(qPCR回肠粘膜)，宏观回肠病变评分以及微观回肠病变评分的显著减少来证实。没有观察到Porcilis® PRRS对劳森氏菌功效的负面影响。相反，联合混合使用组对于上述参数倾向于更好。
研究4：Porcilis® PCV MHyo与其中重构的冷冻干燥的劳森氏菌，和Porcilis® PRRS在3周龄SPF仔猪中的联合非混合使用针对疫苗接种后4周的猪肺炎支原体攻击感染的功效
对于这个研究，使用来自没有猪肺炎支原体和PRRS病毒的兽群的100只3周龄的猪，每组25只动物。一组用Porcilis® PCV M Hyo + 冷冻干燥的劳森氏菌进行IM疫苗接种，并且同时使用Porcilis® PRRS疫苗接种(IM + ID；参见上文)；一组用Porcilis® PCV M Hyo进行疫苗接种，且大约同时(1小时内)用Porcilis® PRRS疫苗接种(IM + ID)，且一组用Porcilis® PCV M Hyo进行疫苗接种；第四组未接种疫苗并作为攻击对照。疫苗接种后四周，用毒性猪肺炎支原体菌株感染所有动物，且三周后对所有动物进行肺部病变的尸检研究。
所有动物在接种疫苗时对猪肺炎支原体呈血清学阴性，且未接种疫苗的动物保持血清学阴性直至攻击感染。疫苗接种后4周和攻击感染后3周，疫苗接种组显示出针对猪肺炎支原体的相似的血清学应答。
与未接种疫苗的动物相比，观察到所有疫苗接种组的病变评分显著降低。Porcilis® PCV M Hyo + 冷冻干燥的劳森氏菌，与Porcilis® PRRS同时疫苗接种具有90％的降低， Porcilis® PCV M Hyo与Porcilis® PRRS同时疫苗接种具有95％的降低。Porcilis® PCV M Hyo诱导中值猪肺炎支原体病变的100％降低。疫苗接种组之间的差异不显著。
可以得出结论，单独或与冷冻干燥的劳森氏菌抗原和Porcilis® PRRS组合的Porcilis® PCV M Hyo的联合非混合使用有效减少猪肺炎支原体诱导的肺部病变。
研究5：灭活的PCV疫苗的使用对活PRRS疫苗的功效的影响。
在这个实验中，检查混合第一疫苗和第二疫苗的效果，所述第一疫苗含有2型猪圆环病毒的非复制型免疫原(CircoFLEX, Boehringer Ingelheim)，所述第二疫苗包含活减毒的猪生殖和呼吸综合征病毒(Ingelvac PRRS, Boehringer Ingelheim)。由于活PRRS病毒的存活是混合这两种疫苗时的主要关键参数，检查在1、2和4小时孵育后的PRRS病毒存活。
在第-1天，将MA104细胞以105个细胞/ml接种，并以225μl/孔放入孔中。将这些细胞保持于37℃，具有5％二氧化碳含量的空气中。在第0天，将Ingelvac PRRS在PBS中预稀释至5.3 log10 TCID50/ml的滴度。将这个混合物用PBS (对照)稀释或用CircoFLEX (两个不同批次)稀释至5.0 log10 TCID50/ml的最终滴度。将最终混合物在室温下孵育1、2和4小时，以模拟用新鲜混合的组合疫苗接种疫苗时的稳定的实际情况。此后，将25μl的每种孵育混合物在MA104细胞中于37℃和5％二氧化碳下孵育7天以使PRRS病毒生长。在第7天，读出PRRS病毒。数据在下文的表2中给出。
表2：与PCV孵育后的PRRS滴度，以10 log TCID50/ml计
| 样品 | 开始 | 1小时孵育 | 2小时孵育 | 4小时孵育 |
| PRRS对照 | 5.0 | 4.90 | 4.80 | 4.64 |
| PRRS + PCV批次1 | 5.0 | 3.90 | 3.90 | 3.15 |
| PRRS + PCV批次2 | 5.0 | 3.85 | 3.55 | 3.55 |
从表中可以看出，PRRS病毒通过在室温下与PCV疫苗短暂孵育而丧失活力。疫苗功效将受到疫苗滴度损失的负面影响。
Claims (14)
1.第一疫苗和第二疫苗的组合产品，所述第一疫苗包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原，所述第二疫苗包含活减毒的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，所述组合产品用于通过第一疫苗和第二疫苗向动物的联合非混合施用而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。
2.根据权利要求1使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，所述联合非混合施用同时发生。
3.根据前述权利要求中任一项使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，所述第二疫苗被施用至动物的真皮中。
4.根据前述权利要求中任一项使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，所述第一疫苗包含胞内劳森氏菌的非复制型免疫原。
5.根据权利要求4使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，在施用疫苗前24小时内，将胞内劳森氏菌的免疫原加入第一疫苗。
6.根据权利要求5使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，胞内劳森氏菌的免疫原包含冷冻干燥的胞内劳森氏菌的杀死的全细胞。
7.根据前述权利要求中任一项使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，所述第一疫苗和第二疫苗通过单剂量施用。
8.根据前述权利要求中任一项使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，所述PCV2的非复制型免疫原是由PCV2的ORF2基因编码的重组表达的蛋白质。
9.根据权利要求8使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，所述PCV2的非复制型免疫原是杆状病毒表达的PCV2的蛋白。
10.根据前述权利要求中任一项使用的第一疫苗和第二疫苗的组合产品，其特征在于，猪肺炎支原体的非复制型免疫原包括杀死的完整猪肺炎支原体。
11.成套试剂盒，其包含第一疫苗和单独的第二疫苗，所述第一疫苗包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原，所述第二疫苗包含活减毒的PRRS病毒，所述成套试剂盒用于通过第一疫苗和第二疫苗向动物的联合非混合施用而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。
12.通过包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原的第一疫苗和包含活减毒的PRRS病毒的第二疫苗的联合非混合施用，而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染的方法。
13.一种疫苗，其包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原，所述疫苗用于通过所述疫苗和包含活减毒的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒的另一疫苗向动物的联合非混合施用，而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。
14.一种疫苗，其包含活减毒的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒，所述疫苗用于通过所述疫苗和包含2型猪圆环病毒(PCV2)的非复制型免疫原和猪肺炎支原体的非复制型免疫原的另一疫苗向动物的联合非混合施用，而预防性治疗动物，对抗2型猪圆环病毒感染，猪肺炎支原体感染和PRRS病毒感染。
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