CN110438154A - 一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，所述基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法包括以下步骤：鲫鱼fst基因克隆，提取鲫鱼肌肉组织总RNA‑‑反转录为cDNA‑‑以cDNA为模板；经过PCR扩增后获得序列；转基因载体的构建，通过BamHI和Xmal酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2‑mylz2‑fst‑rabbit globin‑Tol2，mylz2启动子使目的基因在肌肉组织特异表达，rabbit globin可增加目的基因mRNA的稳定性；显微注射获得转基因鱼。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：目前在快速生长转基因鱼方面做得最深入的是朱作言院士团队研制的转生长激素基因黄河鲤，之后转生长激素鳟鱼、鲑鱼、鲫鲤、鲫鱼等相继产生。但是生长激素作为靶基因有如下弊端，首先，人们谈到激素均有一定的恐惧心理，影响转基因鱼的推广，即使生长激素为蛋白类激素。其次，在有些鱼类中，过表达生长激素基因，对鱼类生长并没有明显的促进作用，如在已驯化的虹鳟鱼中过表达鲑鱼生长激素基因，并未导致其生长速度加快。因此，在目前急需发现一种新的靶基因，通过过表达该基因也可获得快速生长转基因鱼。在我们研究中发现，过表达fst基因的鲫鱼生长速度显著加快，我们这一发现，增加了获得快长转基因鱼时靶基因的选择性。
在众多经济性状中，生长速度一直是制约水产动物养殖产量的重要因素，如何培育快速生长鱼类新品种一直是广大水产育种工作者努力的方向。卵泡抑素(Follistatin，FST)是ActRIIB的另一个配体蛋白，同时也可与抑肌素相互结合。在动物体内可与抑肌素以及转化生长因子家族一些其它的成员如激活素等结合，导致这些在特定的组织中的转化生长因子的作用受阻。起初卵泡抑素的研究主要集中于卵泡抑素/激活素之间的相互作用而影响卵母细胞的成熟和卵泡发育进程。后来在骨胳肌中特异性高表达卵泡抑素的转基因小鼠，表现出其肌肉组织生物量明显增加。目前有关fst基因的研究大多集中在小鼠、线虫、模式生物中，对于改基因在鱼类中的研究不存在技术问题，因为大多基因的研究都是从模式生物开始，然后再应用到经济动物中，目前的事实是该基因在鱼类中的研究还不深入。fst基因在鱼类中的研究仍处于起步阶段。由此，研究发现鲫鱼fst在肌肉组织中过表达，会促使鲫鱼生长速度显著增加。鲫鱼营养丰富，深受广大消费者喜爱，2018年全国的总产量为280多万吨，接近鲤鱼和鳙鱼的产量，远远超过青鱼(86万吨)的产量。但是，与四大家鱼相比，鲫鱼最大的缺点是生长速度慢，这严重制约了鲫鱼养殖业的进一步发展。
综上所述，现有技术存在的问题是：转基因快长鱼类研制是所用靶基因大多为生长激素基因，但是，在一些鱼类中过表达生长激素基因并不能获得快长转基因鱼品种，因此目前急需寻找其他能够促进鱼类生长的靶基因，发现转fst基因鲫鱼生长速度明显加快。
解决上述技术问题的难度：
1寻找一种靶基因，可以增加鲫鱼生长速度。发现fst基因在鲫鱼中过表达，可以显著加快其生长速度。
2启动子的选择。我们发现肌肉特异表达启动子mylz2可使靶基因在肌肉组织特异表达，且具有较强的表达活性。
3如何增加靶基因mRNA的稳定性。我们利用rabbit globin 3’UTR序列增加了靶基因mRNA的稳定性。
解决上述技术问题的意义：
鲫鱼营养丰富，深受广大消费者喜爱，2018年全国的总产量为280多万吨，接近鲤鱼和鳙鱼的产量，远远超过青鱼(86万吨)的产量。但是，与四大家鱼相比，鲫鱼最大的缺点是生长速度慢，这严重制约了鲫鱼养殖业的进一步发展。快长鲫鱼品种的建立，将突破鲫鱼养殖业发展的瓶颈，促进鲫鱼养殖业的进一步发展。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法。
本发明是这样实现的，一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，所述基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法包括以下步骤：
第一步，鲫鱼fst基因克隆，提取鲫鱼肌肉组织总RNA--反转录为cDNA--以cDNA为模板；经过PCR扩增后获得序列；
第二步，转基因载体的构建，通过BamHI和Xmal酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2-mylz2-fst-rabbit globin-Tol2，mylz2启动子使目的基因在肌肉组织特异表达，rabbit globin可增加目的基因mRNA的稳定性；
第三步，显微注射获得转基因鱼。
进一步，所述基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法鲫鱼fst基因克隆引物如下：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。
进一步，所述基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法经过PCR扩增后获得序列SEQID NO：3。
进一步，所述显微注射获得转基因鱼方法包括：
(1)在显微注射前，进行转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理；
(2)体外合成Tol2转座酶mRNA；
(3)对鲫鱼胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(4)将显微注射后的鲫鱼胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
进一步，所述体外合成Tol2转座酶mRNA具体包括：
首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
最后，纯化。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：目前，通过过表达基因获得快长鱼类的实例中，使用的均为高活性的泛表达启动子，虽然实现了鱼类快速增长的目的，但是非目的细胞中过表达靶基因，对鱼类的抗逆性及生理生化方面产生了一定的影响。本发明针对增加鱼类生长速度，以鲫鱼为对象，利用肌肉组织特异表达启动子，在鲫鱼肌肉组织中特异高表达fst基因，同时，利用rabbit globin序列增加了mRNA的稳定性，解决了特异启动子活性弱导致基因过表达量不高的问题，另外，目前使用最多的靶基因为生长激素基因，人们谈激素而色变的观念，一定程度上阻止了转基因鱼的推广。本发明发现，利用利用肌肉组织特异表达启动子mylz2和rabbit globin序列，过表达fst基因可以显著性增加鲫鱼的生长速度，实现了提高鲫鱼生长速度的目的，并有望推广至其他经济鱼类。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的转基因载体示意图。
图3是本发明实施例提供的转fst基因鲫鱼肌肉组织fst mRNA水平显著增加示意图。
图4是本发明实施例提供的饲养体重对比示意图。
图5是本发明实施例提供的饵料系数对比示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法包括以下步骤：
S101：鲫鱼fst基因克隆，提取鲫鱼肌肉组织总RNA--反转录为cDNA--以cDNA为模板；经过PCR扩增后获得序列；
S102：转基因载体的构建，通过BamHI和Xmal酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2-mylz2-fst-rabbit globin-Tol2，mylz2启动子使目的基因在肌肉组织特异表达，rabbit globin可增加目的基因mRNA的稳定性；
S103：显微注射获得转基因鱼。
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明实施例提供的基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法具体包括以下步骤：
步骤一，鲫鱼fst基因克隆
提取鲫鱼肌肉组织总RNA--反转录为cDNA--以cDNA为模板，引物如下：
SEQ ID NO：1，fst-F：5’-GAGGATCCGGTTCATTCAGCACTGCCTG-3’(下划线为BamHI及其保护碱基)
SEQ ID NO：2，fst-R：5’-TCCCCGGGTGGGCGCAGCATTGGATTGT-3’(下划线为Xmal及其保护碱基)
经过PCR扩增后获得如下序列如下SEQ ID NO：3：
GGTTCATTCAGCACTGCCTGAGTAAGAAGATTACTTTTGCACTGCTCGTCTAGATACTCTTTCTCTCTTTAACCATGCAAAGGATGCTAAAGCGACAGCTGCTCCACTCGAGAATGATTTTATTACTCTTATGGCTCTGTTATTTGACTGAAGATCAAAAAGTGCAAGCTGGTAACTGCTGGCTCCAACAAGGCAAGAACGGGAGATGTCAGGTCCTCTACATGCCTGGGATGAGTCGAGAGGAATGCTGCCGGAGTGGGAGGCTCGGCACATCTTGGACTGAGGAAGATGTGCCAAATAGCACATTATTCAGGTGGATGATCTTCAATGGCGGGGCTCCAAACTGCATACCTTGTAAAGAGACATGTGATAATGTGGACTGTGGCCCTGGGAAGAAATGTAAAATGAACAGGAGGAGTAAGCCTCGCTGCGTCTGCGCCCCAGACTGCTCTAACATCACCTGGAAGGGGTCGGTGTGCGGCTCAGATGGGAAAACATACAGAGATGAATGTGCCCTTTTGAAATCCAAATGCAAAGGGCACCCGGATCTGGAGGTGCAGTATCAAGGCAAATGCAAAAAGGCGTGCCATGATGTCATGTGTCCGGGAAGTTCGACTTGCGTGGTGGACCAGACAAACAACGCATACTGTGTGACGTGCAACCGCATATGCCCAGAGGTCACGTCTCCGGATAGCTATCTTTGTGGCAATGATGGGATTGTTTACGCCAACGCGTGCCATTTAAGGAGAGCCACGTGCTTGCTTGGTAGATCCATTGGTGTGGCATATGAAGGCAAATGCATCAAGGCCAAGTCATGCAATGATATCCATTGCAGCGTGGGGAAGAAGTGTCTATGGGATTCTAAGATGGGTCGTGGGCGCTGTGCAGTTTGCATGGAGTCATGCCCAGAAAGTCGCTCGGAGGAGGCCGTGTGTGCCAGCGACAACACCACATATCCCAGCGAGTGCGCCATGAAGCAGGCCGCTTGCTCTTTGGGGGTTCTCCTGGAGGTTAAGCATTCAGGATCTTGCAACTGTAAGTAATAATCTTAAAAGACAATCCAATGCTGCGCCCA
步骤二，转基因载体的构建
所用载体如图2所示，所用载体为含有肌肉组织特异表达mylz2启动子质粒载体，通过BamHI和Xmal酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2-mylz2-fst-rabbit globin-Tol2，mylz2启动子使目的基因在肌肉组织特异表达，rabbitglobin可增加目的基因mRNA的稳定性。
步骤三，显微注射获得转基因鱼：
(1)在显微注射前，进行所述转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理；
(2)体外合成Tol2转座酶mRNA，具体方法如下：
首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
最后，纯化；
(3)对鲫鱼胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(4)将显微注射后的鲫鱼胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生斑马雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
实验结果：
1、肌肉组织中fst mRNA水平检测，方法荧光定量PCR，如图3所示，具体操作步骤：
提取鲫鱼肌肉组织总RNA，反转录为cDNA，以此为模板，利用引物：
SEQ ID NO：4，RT-fst-F:5’-AAATGCATCAAGGCCAAGTC-3’
SEQ ID NO：5，RT-fst-R:5’-TGGGATATGTGGTGTTGTCG-3’
退火温度58度，长度227bp，所用试剂为TAKARA(SYBR)
以odc为参照基因的实时荧光定量PCR
引物用Primer Premier 5软件设计或(5’-3’):
SEQ ID NO：6，RT-odc-F:5’-ACACTATGACGGCTTGCACCG-3’
SEQ ID NO：7，RT-odc-R:5’-CCCACTGACTGCACGATCTGG-3’
反应体系如下：(模板cDNA为稀释5倍的原液)
反应条件如下：
95℃，3min；(94℃，15s；60℃，15s；72℃，45s；40个循环)
2、fst基因过表达个体生长速度显著高于对照组
将对照鲫鱼和转fst鲫鱼在相同环境条件下饲养6个月后称重(分别取10条)，如图4所示，发现对照组鲫鱼明显小于转fst鲫鱼，对照组鲫鱼平均体重为85.6g，而转fst鲫鱼的平均体重为115.1g，显著高于对照组，而且饵料系数显著低于对照组，如图5所示，说明转fst鲫鱼的饵料利用率较高，可进一步提高经济效益。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南文理学院
<120> 一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggatccgg ttcattcagc actgcctg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccccgggtg ggcgcagcat tggattgt 28
<210> 3
<211> 1075
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttcattca gcactgcctg agtaagaaga ttacttttgc actgctcgtc tagatactct 60
ttctctcttt aaccatgcaa aggatgctaa agcgacagct gctccactcg agaatgattt 120
tattactctt atggctctgt tatttgactg aagatcaaaa agtgcaagct ggtaactgct 180
ggctccaaca aggcaagaac gggagatgtc aggtcctcta catgcctggg atgagtcgag 240
aggaatgctg ccggagtggg aggctcggca catcttggac tgaggaagat gtgccaaata 300
gcacattatt caggtggatg atcttcaatg gcggggctcc aaactgcata ccttgtaaag 360
agacatgtga taatgtggac tgtggccctg ggaagaaatg taaaatgaac aggaggagta 420
agcctcgctg cgtctgcgcc ccagactgct ctaacatcac ctggaagggg tcggtgtgcg 480
gctcagatgg gaaaacatac agagatgaat gtgccctttt gaaatccaaa tgcaaagggc 540
acccggatct ggaggtgcag tatcaaggca aatgcaaaaa ggcgtgccat gatgtcatgt 600
gtccgggaag ttcgacttgc gtggtggacc agacaaacaa cgcatactgt gtgacgtgca 660
accgcatatg cccagaggtc acgtctccgg atagctatct ttgtggcaat gatgggattg 720
tttacgccaa cgcgtgccat ttaaggagag ccacgtgctt gcttggtaga tccattggtg 780
tggcatatga aggcaaatgc atcaaggcca agtcatgcaa tgatatccat tgcagcgtgg 840
ggaagaagtg tctatgggat tctaagatgg gtcgtgggcg ctgtgcagtt tgcatggagt 900
catgcccaga aagtcgctcg gaggaggccg tgtgtgccag cgacaacacc acatatccca 960
gcgagtgcgc catgaagcag gccgcttgct ctttgggggt tctcctggag gttaagcatt 1020
caggatcttg caactgtaag taataatctt aaaagacaat ccaatgctgc gccca 1075
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaatgcatca aggccaagtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgggatatgt ggtgttgtcg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acactatgac ggcttgcacc g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccactgact gcacgatctg g 21
Claims (5)
1.一种基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，其特征在于，所述基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法包括以下步骤：
第一步，鲫鱼fst基因克隆，提取鲫鱼肌肉组织总RNA、反转录为cDNA、以cDNA为模板；经过PCR扩增后获得序列；
第二步，转基因载体的构建，通过BamHI和Xmal酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2-mylz2-fst-rabbit globin-Tol2，mylz2启动子使目的基因在肌肉组织特异表达，rabbit globin可增加目的基因mRNA的稳定性；
第三步，显微注射获得转基因鱼。
2.如权利要求1所述的基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，其特征在于，所述基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法鲫鱼fst基因克隆引物如下：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。
3.如权利要求1所述的基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，其特征在于，所述基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法经过PCR扩增后获得序列SEQ ID NO：3。
4.如权利要求1所述的基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，其特征在于，所述显微注射获得转基因鱼方法包括：
(1)在显微注射前，进行转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理；
(2)体外合成Tol2转座酶mRNA；
(3)对鲫鱼胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(4)将显微注射后的鲫鱼胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
5.如权利要求4所述的基于转基因增加鲫鱼生长速度的方法，其特征在于，所述体外合成Tol2转座酶mRNA具体包括：
首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
最后，纯化。
Priority Applications (1)
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Family Applications (1)
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110438154A (zh) |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US20020157126A1 (en) * | 1997-08-01 | 2002-10-24 | Se-Jin Lee | Use of follistatin to increase muscle mass |
-
2019
- 2019-08-10 CN CN201910736762.0A patent/CN110438154A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020157126A1 (en) * | 1997-08-01 | 2002-10-24 | Se-Jin Lee | Use of follistatin to increase muscle mass |
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| 敖光明等: "《细胞生物学》", 31 July 1987, 北京农业大学出版社 * |
| 李西等: "转基因高表达卵泡抑素1对斑马鱼肌肉生长促进作用研究", 《中国科学:生命科学》 * |
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