CN110437313A - 一种Rakicidins酯化衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种Rakicidins酯化衍生物及其制备方法与应用。本发明所述Rakicidins酯化衍生物，通过对Rakicidins化合物的3位进行酯化反应，将不同氯甲酸酯类连接到Rakicidins化合物结构上，实现对Rakicidins化合物的结构修饰。本发明所述Rakicidins酯化衍生物的活性显示，所述衍生物对常氧和乏氧培养下的人结肠癌细胞HCT‑8和人胰腺癌细胞PANC‑1均具有一定的体外抑制作用，可作为新型抗癌或抑菌备选药物进行开发利用。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种Rakicidins酯化衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
目前，已从海洋微生物的代谢产物中分离出几百种生物活性物质，其中部分是可能有临床应用价值的具有抗肿瘤活性或抑菌活性的抗生素，Rakicidins化合物即是其中一类重要具有应用价值的抗肿瘤抗生素，目前已报道从小单孢菌和链霉菌中发现了一系列具有抗肿瘤活性或抑菌活性的Rakicidins化合物。本实验组也从该类株菌的代谢产物中陆续发现了一些Rakicidins类组分，如Rakicidin A和B，以及新天然产物Rakicidin B1、E、G、H和I等，其化学结构及组分如下：
Rakicidins类化合物因为其15元环脂肽结构中含1个稀有罕见的4-氨基-2,4-戊二烯酸辛酰胺并有抗肿瘤细胞活性而受到关注。Yamazaki(2007)研究发现，Rakicidin A具有卓越的乏氧选择性抗肿瘤细胞活性，在乏氧条件下抗结肠癌HCT-8细胞活性是常氧条件下的17.5倍；Takeuchi(2011)也首次报道了Rakicidin A在乏氧条件下能够诱导髓性慢性白血病干细胞的凋亡。虽然该Rakicidin A的抗乏氧肿瘤细胞及抗CSC的作用机制尚不清楚，但Rakicidin A已被许多同行认为是一个极富开发前景的抗乏氧肿瘤细胞及抗CSC药物。同样的，其他具有近似结构的Rakicidin B、B1、E、G、H和I化合物也均对肿瘤细胞株具有显著的抑制活性，具有较大的临床研发价值和应用前景。
因此，基于Rakicidins化合物进行更深入的结构及性能研究，对于其临床开发及应用，具有重要的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种Rakicidins酯化衍生物，以实现Rakicidins化合物的深入开发研究；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述Rakicidins酯化衍生物的制备方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种Rakicidins酯化衍生物，所述Rakicidins酯化衍生物是由Rakicidins化合物经酯化反应获得的衍生物，所述Rakicidins酯化衍生物具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
式中，所示R选自C1-C4的烷基；
所述Rakicidins化合物包括Rakicidin A、Rakicidin B、Rakicidin B1、RakicidinE、Rakicidin G、Rakicidin H或Rakicidin I。
优选的，所述的Rakicidins酯化衍生物，所述R选自丙基、异丙基、丁基或异丁基。
本发明还公开了一种制备所述Rakicidins酯化衍生物的方法，包括如下步骤：
(1)取选定结构的Rakicidins化合物溶于有机溶剂，加入选定结构的氯甲酸酯，并加入缚酸剂保持反应体系pH值碱性进行反应；
(2)反应结束后，将反应液经洗涤、脱水、浓缩得到粗品；
(3)将所得粗品经半制备液相制备得到所需酯化衍生物，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述Rakicidins化合物与所述氯甲酸酯和所述缚酸剂的摩尔比为1：1.5-2.5：3-5。
具体的，所述步骤(1)中，所述有机溶剂包括乙酸乙酯。
具体的，所述步骤(1)中，所述缚酸剂包括三乙胺、吡啶和/或二乙胺。
具体的，所述步骤(1)中，所述反应温度为-5～0℃。
具体的，所述步骤(2)中，所述洗涤步骤具体包括将所述反应液经1mol/L的HCl、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤的步骤。
具体的，所述步骤(3)中，所述半制备液相制备步骤具体包括：将所述粗品用甲醇溶解，采用Welch Material，5μm，250mm×10mm半制备液相色谱进行分离，以体积比750：250的乙腈-水为洗脱液，控制洗脱液流速6-8ml/min进行洗脱，分段收集，即得。
本发明还公开了所述的Rakicidin B1酯化衍生物及其药学上可接受的盐用于制备具有抗肿瘤活性药物的用途。
本发明还公开了一种具有抗肿瘤活性的药物，即以所述Rakicidin B1酯化衍生物及其药学上可接受的盐为活性成分，并添加药学上可接受的载体。
本发明所述Rakicidins酯化衍生物，通过对已知的Rakicidins化合物的3位进行酯化反应，将不同氯甲酸酯类连接到Rakicidins化合物结构上，实现对Rakicidins化合物的结构修饰，有效解决了现有Rakicidins类化合物难以在结构母核上引入其它基团修饰的问题。
本发明方案以所述Rakicidin B1酯化衍生物为例，其活性显示，所述衍生物对常氧和乏氧培养下的人结肠癌细胞HCT-8和人胰腺癌细胞PANC-1均具有一定的体外抑制作用，可作为新型抗癌或抑菌备选药物进行开发利用；且相比于原始Rakicidin B1化合物，所述衍生物的极性减小，溶解性能增强。本发明所述Rakicidins酯化衍生物，通过对Rakicidinss化合物的结构改造，有利于发挥自身上游原料的成本可控优势，使Rakicidins化合物的附加值更大，有助于实现产品牌的产业化前景，创造更大的市场经济价值。
具体实施方式
本发明下述实施例中按照如下所示方程式进行Rakicidin B1酯化衍生物的合成上述Rakicidin B1化合物采用现有技术已知方法进行发酵合成，下列实施例1-4中分别合成C01-C04所示的化合物：
实施例1
本实施例用于合成上述C01所示Rakicidin B1酯化衍生物，具体包括如下步骤：
(1)将Rakicidin B1化合物(0.62g，1mmol)、三乙胺(0.44mL，3.0mmol)以及25mL的乙酸乙酯加入50mL的茄型瓶中，在-5℃下搅拌0.5h，随后将氯甲酸丙酯(0.17mL，1.5mmol)缓慢滴加到茄型瓶中，继续搅拌6h，反应期间用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm，乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)跟踪反应完全后停止反应；
(2)反应结束后，将收集的反应液先后经1mol/L的HCl、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，再经无水Na2SO4脱水，浓缩后得到酯化衍生物C01的粗品；
(3)将所述粗品用甲醇溶解，采用Welch Material，5μm，250mm×10mm半制备液相色谱进行分离，以体积比750：250的乙腈-水为洗脱液，控制洗脱液流速6ml/min进行洗脱，分段收集，冻干，即得样品。
经观察鉴定，本实施例合成的目标化合物C01为白色无定型粉末，分子量为707.4585[M+H]+，其核磁数据为：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.96(s,1H),8.63(d,J＝9.3Hz,1H),7.76(s,1H),7.23(s,1H),6.89(d,J＝15.0Hz,1H),6.15(d,J＝15.0Hz,1H),5.45(s,1H),5.31(s,1H),5.30(s,2H),5.16(d,J＝10.6Hz,1H),5.12(s,1H),4.57(d,J＝18.5Hz,2H),4.06(m,2H),3.67(d,J＝18.5Hz,1H),2.97(s,3H),2.95(m,1H),1.61(d,J＝6.9Hz,1H),1.39(m,1H),1.24(m,16H),1.14(m,6H),1.06(d,J＝6.6Hz,3H),0.98(d,J＝6.2Hz,3H),0.89(dd,J＝13.9,6.9Hz,6H),0.83(d,J＝6.0Hz,3H)。可见，本实施例合成化合物结构正确。
实施例2
本实施例用于合成上述C02所示Rakicidin B1酯化衍生物，具体包括如下步骤：
(1)将Rakicidin B1化合物(0.62g，1mmol)、三乙胺(0.73mL，5.0mmol)以及25mL的乙酸乙酯加入50mL的茄型瓶中，在-5℃下搅拌1h，随后将氯甲酸异丙酯(0.28mL，2.5mmol)缓慢滴加到茄型瓶中，继续搅拌8h，反应期间用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm，乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)跟踪反应完全后停止反应；
(2)反应结束后，将收集的反应液先后经1mol/L的HCl、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，再经无水Na2SO4脱水，浓缩后得到酯化衍生物C02的粗品；
(3)将所述粗品用甲醇溶解，采用Welch Material，5μm，250mm×10mm半制备液相色谱进行分离，以体积比750：250的乙腈-水为洗脱液，控制洗脱液流速8ml/min进行洗脱，分段收集，冻干，即得样品。
经观察鉴定，本实施例合成的目标化合物C02为白色无定型粉末，分子量为707.4590[M+H]+，其核磁数据为：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.97(s,1H),8.59(d,J＝10.1Hz,1H),7.75(s,1H),7.21(s,1H),6.89(d,J＝14.9Hz,1H),6.17(d,J＝14.9Hz,1H),5.45(s,1H),5.31(s,1H),5.28(d,J＝10.3Hz,1H),5.16(d,J＝9.8Hz,1H),5.08(s,1H),4.73(m,1H),4.59(d,J＝18.3Hz,1H),3.66(d,J＝18.3Hz,1H),2.97(s,3H),2.93(m,1H),1.71(m,1H),1.24(m,20H),1.21(d,J＝7.0Hz,6H),1.18(m,5H),1.06(d,J＝6.9Hz,3H),0.98(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(t,J＝7.0Hz,6H)。可见，本实施例合成化合物结构正确。
实施例3
本实施例用于合成上述C03所示Rakicidin B1酯化衍生物，具体包括如下步骤：
(1)将Rakicidin B1化合物(0.62g，1mmol)、三乙胺(0.44mL，3.0mmol)以及25mL的乙酸乙酯加入50mL的茄型瓶中，在-5℃下搅拌0.5h，随后将氯甲酸丁酯(0.2mL，1.5mmol)缓慢滴加到茄型瓶中，继续搅拌6h，反应期间用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm，乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)跟踪反应完全后停止反应；
(2)反应结束后，将收集的反应液先后经1mol/L的HCl、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，再经无水Na2SO4脱水，浓缩后得到酯化衍生物C03的粗品；
(3)将所述粗品用甲醇溶解，采用Welch Material，5μm，250mm×10mm半制备液相色谱进行分离，以体积比750：250的乙腈-水为洗脱液，控制洗脱液流速7ml/min进行洗脱，分段收集，冻干，即得样品。
经观察鉴定，本实施例合成的目标化合物C03为白色无定型粉末，分子量为721.4731[M+H]+，其核磁数据为：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.98(s,1H),8.63(d,J＝10.1Hz,1H),7.77(s,1H),7.24(s,1H),6.89(d,J＝15.0Hz,1H),6.16(d,J＝15.0Hz,1H),5.45(s,1H),5.31(m,1H),5.30(s,1H),5.17(d,J＝10.1Hz,1H),5.11(d,J＝2.3Hz,1H),4.58(d,J＝18.3Hz,1H),4.14(m,1H),4.09(m,1H),3.67(d,J＝18.3Hz,1H),3.65(s,1H),2.96(s,3H),2.92(m,1H),1.57(m,1H),1.35(m,2H),1.27(m,3H),1.24(m,20H),1.16(m,2H),1.12(m,1H),1.05(d,J＝6.9Hz,3H),0.97(d,J＝6.9Hz,3H),0.89(t,J＝7.3Hz,3H),0.85(t,J＝7.1Hz,3H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。可见，本实施例合成化合物结构正确。
实施例4
本实施例用于合成上述C04所示Rakicidin B1酯化衍生物，具体包括如下步骤：
(1)将Rakicidin B1化合物(0.62g，1mmol)、三乙胺(0.73mL，5.0mmol)以及20mL的乙酸乙酯加入50mL的茄型瓶中，在-5℃下搅拌0.5h，随后将氯甲酸异丁酯(0.33mL，2.5mmol)缓慢滴加到茄型瓶中，继续搅拌6h，反应期间用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm，乙腈-水700：300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)跟踪反应完全后停止反应；
(2)反应结束后，将收集的反应液先后经1mol/L的HCl、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，再经无水Na2SO4脱水，浓缩后得到酯化衍生物C04的粗品；
(3)将所述粗品用甲醇溶解，采用Welch Material，5μm，250mm×10mm半制备液相色谱进行分离，以体积比750：250的乙腈-水为洗脱液，控制洗脱液流速8ml/min进行洗脱，分段收集，冻干，即得样品。
经观察鉴定，本实施例合成的目标化合物C04为白色无定型粉末，分子量为721.4731[M+H]+，其核磁数据为：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.97(s,1H),8.64(d,J＝10.0Hz,1H),7.77(s,1H),7.23(s,1H),6.89(d,J＝14.9Hz,1H),6.15(d,J＝14.9Hz,1H),5.46(s,1H),5.32(d,J＝10.1Hz,1H),5.30(s,1H),5.17(d,J＝9.7Hz,1H),5.13(d,J＝2.3Hz,1H),4.59(d,J＝18.3Hz,1H),3.91(dd,J＝10.3,6.4Hz,1H),3.79(dd,J＝10.3,6.4Hz,1H),3.68(d,J＝18.5Hz,1H),2.98(m,1H),2.97(s,3H),1.89(m,1H),1.71(m,1H),1.29(m,3H),1.24(m,20H),1.12(m,2H),1.06(t,J＝7.0Hz,3H),0.98(d,J＝6.9Hz,3H),0.91(d,J＝5.9Hz,6H),0.85(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(t,J＝7.1Hz,3H)。可见，本实施例合成化合物结构正确。
从上述实施例结果可知，本发明方案基于已知的Rakicidins化合物进行3位的酯化反应，可以将不同氯甲酸酯类连接到Rakicidins化合物结构上获得相应结构的酯化衍生物。
实验例
1、抗肿瘤活性测试
分别将上述合成的C01、C02、C03和C04四个3位酯化衍生物样品溶解在DMSO中使得溶度达到1ug/ml，再分别稀释使得终浓度为0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml、0.015625ug/ml。
普通培养：取处于指数增长期的人结肠癌细胞HCT-8、人胰腺癌细胞PANC-1分别种在96孔板里(细胞浓度为HCT-8 5.0×104个/ml，PANC-14.0×104个/ml，100ul/孔)，培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培养基，每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔，继续培养至48hr，终止培养。
分别将上述C01、C02、C03和C04四个3位酯化衍生物样品溶解在DMSO中使得溶度达到1ug/ml，再分别稀释使得终浓度为0.4444ug/ml、0.148148ug/ml、0.0493827ug/ml、0.0164609ug/ml、0.00548697ug/ml、0.00182899ug/ml。
乏氧培养：取处于指数增长期的人肠癌细胞HCT-8、人胰腺癌细胞PANC-1分别种在96孔板里(细胞浓度为HCT-8 5.0×104个/ml，PANC-14.0×104个/ml，100ul/孔)，乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养箱37℃，培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培养基，每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔。乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养箱37℃，继续培养至48hr，终止培养。
MTT法检测：将终止培养的细胞，每孔加CCK-8 10ul，在培养箱继续培养2小时，弃上清，每孔加入150ul DMSO溶液，摇床10分钟轻轻地混匀，在450nm波长下酶标仪读出每孔的OD值，并计算抑制率。通过对抑制率的换算，使用SPSS软件计算出IC50值，结果见下表1和表2。
抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值×100％。
表1四个3位酯化衍生物乏氧状态下对人结肠癌细胞HCT-8的抑制活性
表2四个3位酯化衍生物乏氧状态下对人胰腺癌细胞PANC-1的抑制活性
上述结果表明，本发明所述Rakicidin B1酯化衍生物在常氧和乏氧状态下对人结肠癌细胞HCT-8人胰腺癌细胞PANC-1均具有一定的抗肿瘤活性，且乏氧状态下更强，具有临床应用价值和潜力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种Rakicidins酯化衍生物，其特征在于，所述Rakicidins酯化衍生物是由Rakicidins化合物经酯化反应获得的衍生物，所述Rakicidins酯化衍生物具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
式中，所述R选自C1-C4的烷基；
所述Rakicidins化合物包括Rakicidin A、Rakicidin B、Rakicidin B1、RakicidinE、Rakicidin G、Rakicidin H或Rakicidin I。
2.一种制备权利要求1所述Rakicidins酯化衍生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取选定结构的Rakicidins化合物溶于有机溶剂，加入选定结构的氯甲酸酯，并加入缚酸剂保持反应体系pH值碱性进行反应；
(2)反应结束后，将反应液经洗涤、脱水、浓缩得到粗品；
(3)将所得粗品经半制备液相制备得到所需酯化衍生物，即得。
3.根据权利要求2所述Rakicidins酯化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述Rakicidins化合物与所述氯甲酸酯和所述缚酸剂的摩尔比为1：1.5-2.5：3-5。
4.根据权利要求2或3所述Rakicidins酯化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述有机溶剂包括乙酸乙酯。
5.根据权利要求2-4任一项所述Rakicidins酯化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述缚酸剂包括三乙胺、吡啶和/或二乙胺。
6.根据权利要求2-5任一项所述Rakicidins酯化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应温度为-5～0℃。
7.根据权利要求2-6任一项所述Rakicidins酯化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述洗涤步骤具体包括将所述反应液经1mol/L的HCl、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤的步骤。
8.根据权利要求2-7任一项所述Rakicidins酯化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述半制备液相制备步骤具体包括：将所述粗品用甲醇溶解，采用WelchMaterial，5μm，250mm×10mm半制备液相色谱进行分离，以体积比750：250的乙腈-水为洗脱液，控制洗脱液流速6-8ml/min进行洗脱，分段收集，即得。
9.权利要求1所述的Rakicidins酯化衍生物及其药学上可接受的盐用于制备具有抗肿瘤活性药物的用途。
10.一种具有抗肿瘤活性的药物，其特征在于，以权利要求1所述Rakicidins酯化衍生物及其药学上可接受的盐为活性成分，并添加药学上可接受的载体。
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