CN110426356A - 一种天然胶原蛋白/纳米金复合物及同步监控天然胶原蛋白自组装的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然胶原蛋白/纳米金复合物及同步监控天然胶原蛋白自组装的方法。1)用醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白，得到天然胶原蛋白溶液；2)将天然胶原蛋白溶液与氯金酸溶液混合混匀；3)将还原剂溶液与步骤2)所得溶液混合混匀；4)将步骤3)所得溶液透析，得到自组装前的胶原蛋白/纳米金复合物，测定其在515‑525nm下的吸光度，记为A0；5)将步骤4)所得溶液自组装，测定自组装后的胶原蛋白/纳米金复合物在515‑525nm下的吸光度，记为A1；6)当A1：A0＞1时判定自组装完成，当A1：A0≤1时继续进行自组装。本发明提供的监控方法操作简单、价格低廉，且能呈现胶原蛋白自组装的多重信息。
Description
技术领域
本发明属于生物、化学、材料等技术的交叉领域，更具体地，涉及一种天然胶原蛋白/纳米金复合物及同步监控天然胶原蛋白自组装的方法。
背景技术
胶原蛋白是动物结缔组织中含量最为丰富、分布最为广泛的蛋白质种类之一，其结构域特征为3条肽链螺旋缠绕形成的三螺旋结构。由于胶原蛋白良好的生物相容性、较低的免疫活性以及优越的生物降解性而被广泛应用于生物材料、食品科学、医学美容等领域。自组装是胶原蛋白最重要的分子行为之一。在生命体内，具有三螺旋结构的胶原蛋白能够自发组装形成微纤维，微纤维进一步捆扎形成纤维状网络结构，并为细胞生长、粘附、迁移等活动提供平台；在生命体外，完整三螺旋结构的胶原蛋白在适宜的浓度、pH、温度等条件下也能自组装形成胶原纤维或胶原凝胶。而且，胶原蛋白自组装所构筑的胶原海绵或凝胶已被成功用作食品增稠剂、3D支架材料等。此外，生命体外以自组装模式形成的胶原纤维或凝胶在热稳定性、耐酶降解性和生物力学性能等方面均显著优于胶原单体分子的体外性能表现。因此，构建简单且有效的监控胶原蛋白自组装的方法就显得尤为迫切与必要，这将为构筑性能优越的胶原纤维或凝胶奠定理论基础。
目前，监控胶原蛋白自组装的方法主要有：(1)浊度法：胶原蛋白在自组装进程中伴随着明显的浊度变化，进而导致特定波长下吸光强度的改变。因此，可以通过紫外分光光度计测定吸光强度的变化来监控胶原蛋白自组装。浊度法操作简便，但该方法仅能获取浊度变化的单一信息。(2)电子显微技术：胶原蛋白自组装产物呈现出独特的网络状结构。因此，可通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、原子力显微镜等电子显微技术观察胶原蛋白自组装产物的微观形貌，从而监控胶原蛋白自组装。尽管电子显微技术在获取胶原蛋白自组装微观信息上取得了令人满意的结果，但是该技术需要复杂仪器设备、且存在样品制作繁琐、测试成本高昂等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种简便、有效的监控胶原蛋白自组装并同步制备天然胶原蛋白/纳米金复合物的方法。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种制备天然胶原蛋白/纳米金复合物并同步监控天然胶原蛋白自组装的方法，该方法包括如下步骤：
1)用醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白，得到浓度为1-10mg/mL的天然胶原蛋白溶液；
2)将步骤1)的天然胶原蛋白溶液与浓度为0.001-0.01mol/L的氯金酸溶液混合混匀；
3)将0.05～0.2mol/L的还原剂溶液与步骤2)所得溶液混合混匀，所述还原剂溶液为硼氢化钠和/或抗坏血酸溶液；
4)将步骤3)所得溶液进行透析，得到自组装前的胶原蛋白/纳米金复合物，测定其在515-525nm下的吸光度，记为A0；
5)将步骤4)所得溶液在25-35℃的条件下进行自组装，测定自组装后的胶原蛋白/纳米金复合物在515-525nm下的吸光度，记为A1；
6)当A1：A0＞1时判定自组装完成，当A1：A0≤1时继续进行自组装。
作为优选方案，步骤1)-步骤3)中，控制温度为4-15℃，上述温度可充分保证天然胶原蛋白保持其在本申请中的性能不变性。
作为优选方案，步骤1)中，所述天然胶原蛋白选自从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤以及跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原中的至少一种。
作为优选方案，步骤2)中，天然胶原蛋白溶液与氯金酸溶液的体积比为10-15：1。
根据本发明，步骤2)中和步骤3)，本领域技术人员可根据需要对混合的时间进行调整，优选步骤2)的混合搅拌时间为0.5-2h，步骤3)的混合搅拌时间为6-18h。
作为优选方案，天然胶原蛋白溶液与步骤3)中的还原剂溶液的体积比为15-40：1，更优选为15-20：1。
作为优选方案，步骤4)中，透析采用pH为7.0-10.0的磷酸盐缓冲溶液和/或pH为7.0-10.0的Tris-HCl缓冲溶液，透析时的温度为4-15℃。如将步骤3)所得溶液置于截留分子量为12000-15000道尔顿的透析袋，以pH为7.0-10.0的磷酸盐缓冲溶液为透析液，在4-15℃下透析，直至透析液pH不再降低为止，每隔3-4h更换一次透析液，通常优选控制透析时间为12-48h。
作为优选方案，步骤5)中，自组装的时间为0.5-3.5h。
作为优选方案，步骤6)中，满足A1：A0＞1.13即可判定较充分实现自组装，最优选为A1：A0＞1.19。
作为进一步的优选方案，还包括：测定650-700nm下的自组装前的天然胶原蛋白/纳米金复合物及自组装后的天然胶原蛋白/纳米金复合物的吸光度，分别记为B0、B1，满足(B1/A1)＞(B0/A0)即可判定较充分实现自组装。
作为更进一步的优选方案，满足A1：A0＞1.13以及(B1/A1)＞(B0/A0)可判定非常充分实现自组装。此时比较自组装前后天然胶原蛋白/纳米金复合物溶液的紫外可见光谱，可观察到最大吸收波长的偏移。
本发明的第二方面提供上述的方法制备得到的天然胶原蛋白/纳米金复合物。
本发明的优点和积极效果：
本发明在天然胶原蛋白分子中引入了纳米金粒子，在监控的同时同步制备天然胶原蛋白/纳米金复合物并保持了胶原蛋白的自组装特性。与现有技术相比，本发明提供的监控方法不需要复杂仪器设备，操作简单、价格低廉，且能呈现胶原蛋白自组装的多重信息。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了实施例1的天然胶原蛋白和天然胶原蛋白/纳米金复合物的紫外光谱图。
图2示出了实施例1的天然胶原蛋白和天然胶原蛋白/纳米金复合物的圆二色谱图。
图3示出了实施例1的天然胶原蛋白/纳米金复合物自组装前后的紫外光谱图。
图4示出了实施例2的天然胶原蛋白/纳米金复合物自组装前后的紫外光谱图。
图5示出了实施例3的天然胶原蛋白/纳米金复合物自组装前后的紫外光谱图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
实施例1
称取适量牛跟腱天然胶原蛋白样品，用0.5mol/L醋酸配制成浓度为2mg/mL的样品10mL，加入1mL 0.002mol/L的氯金酸溶液后搅拌1小时，缓慢滴加0.1mol/L的硼氢化钠溶液0.6mL，并搅拌12小时。再将配置好的天然胶原溶液装入截留分子量为12000道尔顿透析袋中，以pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液为透析液，每隔3h更换一次透析液，透析48小时，得到牛跟腱胶原蛋白/纳米金复合物备用。取复合物4mL在35℃培养箱中孵育3小时，通过紫外分光光度计测试自组装前后复合物的紫外吸收光谱。
图1示出了实施例1的天然胶原蛋白和天然胶原蛋白/纳米金复合物的紫外光谱图。单纯的胶原蛋白在400-800nm范围内没有紫外吸收，而胶原蛋白/纳米复合物在520nm处呈现了明显的紫外吸收，该紫外吸收峰对应于纳米金的紫外吸收，从而证实胶原蛋白/纳米金复合物的成功制备。
图2示出了实施例1的天然胶原蛋白和天然胶原蛋白/纳米金复合物的圆二色谱图。单纯的胶原蛋白在222nm处和198nm处分别呈现一个正峰和一个负峰，这是天然胶原蛋白具有三螺旋结构结构的重要特征。同时，与单纯的胶原蛋白相比，天然胶原蛋白/纳米金复合物的圆二色谱图没有明显的变化，表明天然胶原蛋白/纳米金复合物保持了三螺旋结构，而具有自组装特性。
图3示出了实施例1的天然胶原蛋白/纳米金复合物自组装前后的紫外光谱图。与未组装的复合物相比，自组装后复合物的E520明显增大(由0.2766增加至0.3300)，λmax发生蓝移，E650/E520显著增加(由0.3184增加至0.3360)。
实施例2
称取适量牛跟腱胶原蛋白样品，用0.5mol/L醋酸配制成浓度为1mg/mL的样品10mL，加入1mL 0.001mol/L的氯金酸溶液后搅拌1小时，缓慢滴加0.05mol/L的硼氢化钠溶液0.6mL，并搅拌12小时。再将配置好的胶原溶液装入截留分子量为12000道尔顿透析袋中，以pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液为透析液，每隔3h更换一次透析液，透析48小时，得到牛跟腱胶原蛋白/纳米金复合物备用。取复合物4mL在35℃培养箱中孵育3小时，通过紫外分光光度计测试自组装前后复合物的紫外吸收光谱。
图4示出了实施例2的天然胶原蛋白/纳米金复合物自组装前后的紫外光谱图。与未组装的复合物相比，自组装后复合物的E520明显增大(由0.2882增加至0.3276)，λmax发生蓝移，E650/E520显著增加(由0.3159增加至0.3370)。
实施例3
称取适量草鱼皮胶原蛋白样品，用0.5mol/L醋酸配制成浓度为2mg/mL的样品10mL，加入1mL 0.001mol/L的氯金酸溶液后搅拌1小时，缓慢滴加0.05mol/L的硼氢化钠溶液0.6mL，并搅拌12小时。再将配置好的胶原溶液装入截留分子量为12000道尔顿透析袋中，以pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液为透析液，每隔3h更换一次透析液，透析48小时，得到牛跟腱胶原蛋白/纳米金复合物备用。取复合物4mL在30℃培养箱中孵育3小时，通过紫外分光光度计测试自组装前后复合物的紫外吸收光谱。
图5示出了实施例3的天然胶原蛋白/纳米金复合物自组装前后的紫外光谱图。与未组装的复合物相比，自组装后复合物的E520明显增大(由0.9671增加至1.0969)，λmax发生蓝移，E650/E520显著增加(由0.1949增加至0.4450)。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种制备天然胶原蛋白/纳米金复合物并同步监控天然胶原蛋白自组装的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)用醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白，得到浓度为1-10mg/mL的天然胶原蛋白溶液；
2)将步骤1)的天然胶原蛋白溶液与浓度为0.001-0.01mol/L的氯金酸溶液混合混匀；
3)将0.05～0.2mol/L的还原剂溶液与步骤2)所得溶液混合混匀，所述还原剂溶液为硼氢化钠和/或抗坏血酸溶液；
4)将步骤3)所得溶液进行透析，得到自组装前的胶原蛋白/纳米金复合物，测定其在515-525nm下的吸光度，记为A0；
5)将步骤4)所得溶液在25-35℃的条件下进行自组装，测定自组装后的胶原蛋白/纳米金复合物在515-525nm下的吸光度，记为A1；
6)当A1：A0＞1时判定自组装完成，当A1：A0≤1时继续进行自组装。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)-步骤3)中，控制温度为4-15℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中，所述天然胶原蛋白选自从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤以及跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中，天然胶原蛋白溶液与氯金酸溶液的体积比为10-15：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，天然胶原蛋白溶液与步骤3)中的还原剂溶液的体积比为15-40：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中，透析采用pH为7.0-10.0的磷酸盐缓冲溶液和/或pH为7.0-10.0的Tris-HCl缓冲溶液，透析时的温度为4-15℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤5)中，自组装的时间为0.5-3.5h。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤6)中，满足A1：A0＞1.13。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括：测定650-700nm下的自组装前的天然胶原蛋白/纳米金复合物及自组装后的天然胶原蛋白/纳米金复合物的吸光度，分别记为B0、B1，满足(B1/A1)＞(B0/A0)。
10.由权利要求1-9中任意一项所述的方法制备得到的天然胶原蛋白/纳米金复合物。
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