CN110418636A - 将肽、蛋白质和核酸负载至乳糜微粒和体细胞中的胆固醇酯囊泡 - Google Patents

将肽、蛋白质和核酸负载至乳糜微粒和体细胞中的胆固醇酯囊泡 Download PDF

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Abstract

本发明涉及脂质囊泡口服制剂中的一种或多种靶向细胞内受体的大分子，特别是肽、蛋白质、核酸及其混合物，任选与小分子组合。本发明将所述大分子包封在包含一种或多种胆固醇酯的中性脂质囊泡中。包封在所述囊泡中的大分子的独特性质包括高口服生物利用度，在本发明中定义为至少50％，即基于口服至肠胃外AUC通常超过50％。提供了非限制性实例，用于大的亲水性分子，例如肽、蛋白质和核酸，其迄今为止非常难以被哺乳动物肠道吸收。在现有技术中，所述分子通常小于25％生物可利用，即使在制剂中具有保护性包衣和任选的吸收增强组分物质仍然如此。本发明的另一个特征是口服使用后的高组织浓度，这是由乳糜微粒递送至体细胞的胆固醇体快速摄取的结果。公开了胰岛素的优选实施方案，其中胆固醇体包封口服生物利用度至少为66％。在本发明之前，胰岛素和其他肽和蛋白质的口服生物利用度最大为25％，通常为5％‑10％。提供了另外的优选实例，用于在癌症免疫治疗实践中治疗癌症、特别是细胞内靶向的一种或多种大分子。

Description

将肽、蛋白质和核酸负载至乳糜微粒和体细胞中的胆固醇酯 囊泡
技术领域
本发明涉及包封大分子，特别是一些生物活性的肽、蛋白质、核酸及其混合物的方式，以及实现这些大分子的口服吸收和细胞内递送的第一方式。本发明公开的发明是CholestosomeTM，其是中性电荷的脂质囊泡，其在中心处对于亲水性大分子具有高有效负荷能力。含有大分子并包含一种或多种胆固醇酯的胆固醇体(胆固醇体)表现出优于常规递送技术的三种独特性质。第一是高口服生物利用度，在本发明中定义为至少50％，即基于口服至肠胃外AUC通常超过50％。对于大的亲水性分子，例如肽、蛋白质、核酸和荧光质粒，提供了非限制性实例，所有这些分子迄今为止都被哺乳动物肠道非常差地吸收。第二方面是将完整的囊泡及其大分子内容物负载到乳糜微粒(chylomicron)中，这是肠上皮细胞吸收囊泡所特有的特征，然后将完整的囊泡直接转移到乳糜微粒中。第三方面是与细胞对接的体细胞对完整囊泡及其大分子内容物的受体介导的负载。
在本发明的另外方面，靶向远端肠中的免疫激活途径现在是可行的。本发明提供了远端肠递送和树突细胞的摄取，这些因子的总和允许原位口服激活免疫系统对抗癌症。在免疫系统的树突细胞内递送核酸、肽和蛋白质的实用方式的发明立即实现了以先前技术从未被认为可能的方式调节先天和适应性免疫应答的独特方法，因为这是第一次，调节步骤可以在体内而非离体进行。
相关申请
本申请要求2016年8月23日提交的美国临时申请序列号US62/378,599的优先权，其名称为“Chylomicrons as Carriers for Cholesteryl Ester Vesicles Loaded withPeptides and Proteins for Oral Absorption and Intracellular Delivery”，其全部内容其通过引用并入本发明。
背景技术和发明概述
有许多新的治疗产品，其中大肽、蛋白质或其他大分子起到治疗或诊断物质的作用。这些中的大多数被认为对细胞表面受体具有其主要作用，其反过来影响信号传导途径的细胞内序列以控制体内分子的合成和降解。大多数这些分子太大而不能被胃肠道细胞完整地吸收，以及它们在胃的条件下被降解成组分氨基酸。总的来说，这些分子不被口服吸收，因此几乎在所有情况下它们都被注射到体内以发挥其治疗作用。
对于慢性病的治疗，对于通过非静脉内(IV)途径(例如皮下(SC)注射)递送大分子的兴趣很高，以便改善患者的便利性和依从性。另一方面，由于许多原因，通常的给药途径(肠胃外给药)对于大分子递送来说是次优的。与口服给药相比，肠胃外给药更昂贵并且需要硬件和训练有素的人员。皮下注射确实具有优于静脉内使用的优点，包括它可以由患者在家中进行。然而，口服给予肽(包括多肽，如单克隆抗体)、蛋白质和DNA将更加方便，并且可以提供更高的安全性，只要口服递送可以在不损害胃肠道的情况下完成或在不存在来自新材料的损害的情况下完成，所述新材料产生由递送材料本身引起的全身副作用或并发症。
技术人员通常认为，通过在哺乳动物中口服大蛋白质分子，不可能得到合理的生物利用度(大于皮下注射血液水平曲线下面积的50％)。当通过口服途径给予时，这些蛋白质不被肠上皮细胞完整地吸收。相反，它们被肠内腔中的酶分解成组分氨基酸成分，以及所述组分被肠上皮细胞吸收。在这种未受保护的制剂中，口服制剂由于前消化道的胃和十二指肠中的酸、蛋白酶或胆汁的降解而不具有生物可利用性。他们变得不活跃。对于诸如肽、蛋白质、一些小分子和核酸的药物化合物尤其如此。基本上所有由生物技术工业生产的治疗性蛋白质全部都易受这些胃肠道降解途径的影响，以及它们没有合理的生物利用度。
致力于降解问题的技术人员已经测试了多种保护策略，以便解决局部降解途径并改善大分子的口服生物利用度。自20世纪60年代以来，肠溶包衣已被用于绕过胃中的酸屏障，其中酸激活肽酶并降解蛋白质和肽、从而可以快速吸收组分氨基酸。肠溶包衣可防止胃中的酸降解，但该分子仍易受十二指肠中酶和胆汁酸的快速降解。肠溶包衣不会阻止肠上皮细胞吸收和降解肽或蛋白质。因此，通过肠溶包衣肽或蛋白质实现的典型生物利用度为约5％或甚至更低。
蛋白质包衣已作为保护包衣使用多年，通常具有吸收增强剂N-[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠(SNAC)。该组合物的实例在Emisphere网站(www.emisphere.com)上和在2015年8月26日的新闻稿中公开，描述了其应用于索马鲁肽(Novo Nordisk正在开发的GLP-1激动剂)的技术(蛋白质包衣和吸收增强剂SNAC)的使用。根据Novo Nordisk的公开内容，典型的口服生物利用度低至1％并且最高2.5％，其中每周一次1.0mg SC剂量与每天一次口服40mg剂量的Clintrials.gov NCT 01923181的HbA1c降低相匹配。值得注意的是，截至2015年10月，Emisphere技术目前已被公开在3期试验中与索马鲁肽一起口服使用。
在一些情况下，技术人员，如Kidron 2013(1)已成功对重要的肽如胰岛素和GLP-1进行肠溶包衣，并进一步将蛋白酶抑制剂与所述制剂结合，以抑制局部酶降解，并进一步结合SNAC或N-[10-(2-羟基苯甲酰基)氨基]癸酸钠(SNAD)作为扩散细胞之间的间隙的方式，以迫使大分子绕过肠上皮细胞本身进入门静脉血液。即使制剂中的所有这三种成分都完全被运用并局部运作，使用这些策略实现的最佳口服生物利用度为10-20％。剩下的和仍未解决的问题是完整的胰岛素或GLP-1不被摄入肠上皮细胞并以完整和活性形式转移到血液中。即使肠上皮细胞内化完整的肽，肠上皮细胞本身也可能进一步降解被摄入肠上皮细胞的未受保护的胰岛素或GLP-1或蛋白质或核酸物质。因此，在最坏的情况分析中，在肠上皮细胞周围采取多肽的吸收增强剂是Kidron或Emisphere使用的策略中最成功的组成部分。
以与Kidron类似的方式，其他人尝试制备保护性外包衣或颗粒，例如脂质体，其通常包含磷脂或磷脂和大分子(例如聚乙二醇)的混合物，例如，参见Irvine 2011(2)。如以下摘自Irvine的美国专利申请文件2011-0229529(2)所解释的，脂质体尚未解决上述问题。脂质体已被广泛用作小分子的递送载体；然而，对于脂质体内的许多大分子药物来说仍然难以实现高水平的包封，因为这些较大的分子往往是水溶性的，因此与典型脂质体的亲脂性内核不相容。虽然通过微米和纳米颗粒的药物递送可以包封蛋白质和小分子药物，但是这仍然通常产生每质量颗粒具有非常低的总质量的包封药物，在这种情况下通常约1:1000至1:10,000质量比的蛋白质:磷脂混合物(参见例如Balu-Iyer US7,662,405)(3)。
脂质体很少负载高达1％重量:重量，即使使用亲脂性分子如多柔比星也是如此。由发明人开发的胆固醇体通常将负载至少20％并且在呈现的非限制性实(例如胰岛素)中高于60％(重量:重量，如本发明中另外描述的)。
此外，许多药物制剂从脂质体中过快地泄漏，从而无法维持有用的药物递送动力学。此外，聚合物颗粒合成中使用的有机溶剂和这些颗粒内的疏水/酸性环境可导致对治疗的破坏。(参见Zhu等人，Nat.Biotechnol.2000 18:52-57.)(4)
使用脂质体还存在其他问题，甚至超过水溶性蛋白质或小分子的上述少量包封。具体地，大多数脂质体的内容物是磷脂，通常是磷脂酰胆碱，它们是两亲性的。这些纳米尺寸的脂质颗粒具有高度带正电的表面，因此被肠上皮细胞的外膜以及外周细胞的细胞膜排斥。
因此，基于磷脂的脂质体不被口服吸收，以及当胃肠外注射时也不能将其内容物传递到细胞中。因此，目前组合物的脂质体不适合包封蛋白质或肽(包括多肽如单克隆抗体)。即使可以某种方式将足够的蛋白质或肽负载到这些颗粒中，它们也不能解决口服吸收问题，因为没有基于磷脂的脂质体可以在分子有效负荷完整的情况下结合到乳糜微粒中。
Tseng及其同事在2007年进一步分析了这些问题(5)，其中测试了这样的假设：向磷脂酰胆碱脂质体中加入胆固醇会改变它们的性质并改善负载。他们发现负载只有适度的改进。没有足够的胆固醇来改变外表面的正电荷。对他们来说更重要的是他们观察到脂质体中胆固醇的增加阻止了负载分子的退出。“脂质体中胆固醇含量的增加导致非电解质和电解质溶质的膜渗透性显著降低。通过脂质体优化的药物递送需要脂质体载体最终变得可渗透并在靶标区域释放包封的药物，但它也需要血液中的高稳定性”。因此整个脂质体领域大部分都放弃将胆固醇作为脂质体的组分，由于含有胆固醇的脂质体的分子释放性质的劣化，并且进一步教导整个领域远离本发明的特定胆固醇酯囊泡。
当通过注射给予哺乳动物时，Irvine的特定脂质体确实增加了大分子的细胞内递送，以及它已成功用于细胞中核酸材料的转染。然而，脂质体中的磷脂组合物在胃酸中特别不稳定并且被肠胆汁酸降解，这导致肽和蛋白质在肠中释放，在那里它们易于降解。因此，在基于磷脂的脂质体中使用大分子几乎不会改善口服生物利用度。当通过注射给予时，它们作为控释制剂广泛用于医学中。脂质体制造技术通常依赖于磷脂组合物，以及最常产生阳离子颗粒，从而提供了与本发明人在具有中性表面的囊泡中使用胆固醇酯相反的教导。事实上，如果囊泡是以本领域公开的脂质体的方式由磷脂制成，则本发明的每一个独特有益的方面(口服吸收，生物利用度高于50％，完整结合至乳糜微粒中，细胞内递送完整的有效负荷而无需对内体的依赖性)都将丧失，因为如果它们被细胞摄取，则结果是内体步骤。
先前通过肠上皮细胞递送用于口服吸收的大分子的尝试依赖于纳米尺寸颗粒的包封。大多数工作都是用不同成分的脂质体进行的。认识到脂质体的缺点，其他人已经生产了基于脂质或聚合物的合成纳米颗粒，其目的同样是保护蛋白质和肽免于胃肠道中的降解。例如，Geho 2013(6)。一些制剂包括蛋白酶抑制剂和肽，以增加肽吸收的量。改善是适度的，口服生物利用度可从5％到大约10％，但对于提高生物利用度的策略仍然处于不可行的范围。问题是必须提供多少才能达到与注射相同的血液水平。
Geho使用分子伴侣技术通过在所述细胞之间的间隙之间穿过而携带包封的分子穿过胃肠道。这些技术依赖于在细胞之间产生局部间隙并迫使分子进入所述间隙之间。该方法适度地改善口服生物利用度(通常高达15-20％)，但它们也具有局部损伤十二指肠的肠上皮细胞和其他必需细胞的风险。Kidron和其他人依赖于Geho的方面，通常是蛋白酶抑制剂和使用化学方法如SNAC或SNAD扩大细胞间隙的方法。改善是适度的，口服生物利用度可从5％到大约10％，但对于提高生物利用度的策略仍然处于不可行的范围。问题是必须提供多少才能达到与注射相同的血液水平。
在改善口服胰岛素生物利用度的挑战的组合方法中，Sonaje及其同事在大鼠中实现了约17-20％的胰岛素生物利用度，代表了迄今为止的方法的最佳组合(7-9)。它们的前提是外源性胰岛素的口服给药可通过门静脉循环将药物直接递送到肝脏中，从而模仿内源性分泌的胰岛素的生理命运。这种特征可以提供所需的肝脏激活，同时避免高胰岛素血症及其相关的长期并发症。Kidron和Geho以及据我们所知，所有其他从事胰岛素和GLP-1的技术人员都接受这一前提，因此专注于保护胰岛素以使其在细胞周围移动，而非在细胞中被降解。因此，目前用于改善口服生物利用度的标准是防止降解并试图使分子在肠上皮细胞周围移动，在那里它可以被带入门静脉血液中(1,6)。Sonaje使用壳聚糖纳米粒子(NP)，认为该载体可以防止有害的胃环境，从而避免酶促降解。他们最近的研究描述了由壳聚糖(CS)和聚(γ-谷氨酸)组成的pH响应性NP系统，以用于口服递送胰岛素(7)。壳聚糖是一种无毒、软组织相容的阳离子多糖，它粘附在粘膜表面，并且瞬间打开连续上皮细胞之间的紧密连接(TJ)。因此，与传统的片剂或粉末制剂相比，用CS NP制备的药物具有递送优势。这些CS NP可以粘附并渗透小肠中的粘液层。随后，渗入的CS NP瞬时打开上皮细胞之间的TJ。因为它们对pH敏感，所以纳米颗粒变得不太稳定和崩解，从而释放负载的胰岛素。然后胰岛素通过打开的细胞旁路径渗透，从而绕过十二指肠的肠上皮细胞的吸收并进入体循环中。在该大鼠模型中计算的门冬胰岛素的生物利用度为17％。
这些技术人员后来的工作保留了CS包衣，但将吸收增强剂从聚(γ-谷氨酸)改变为添加DTPA，从而形成γ-聚谷氨酸-二亚乙基三胺五乙酸，称为γPGA-DTPA。实验结果表明，CS/γPGA-DTPA NP可以促进大鼠整个小肠的胰岛素吸收；在肾脏和膀胱中清楚地识别出吸收的胰岛素。除了产生血糖水平的长期降低之外，含有CS/γPGA-DTPA NP的肠溶包衣胶囊的口服摄入在治疗后4小时显示出最大胰岛素浓度。胰岛素的相对口服生物利用度约为20％(8)。这些研究确实将生物利用度从5-10％提高到接近理论极限25％。蛋白酶抑制剂显然是重要的但不充分，因此仍然有必要通过将蛋白质摄入肠上皮细胞同时防止进一步的分子分解代谢的新方法进一步改善蛋白质的差的生物利用度。问题仍然是进入肠上皮细胞的游离胰岛素在那些肠上皮细胞中降解。根据肠道释放的确切位置，将肠上皮细胞周围的胰岛素移动到门静脉血液中的策略仍然遭受无法在没有分解代谢下进行肠上皮细胞摄取的问题，而这是口服给药时胰岛素降解的主要方式。
关于使用包衣通过细胞膜的策略，存在使材料移动到细胞内的纳米颗粒。Hong2004描述了在US 2004-0037874A1中的胶束状纳米颗粒递送方式(10)。该阳离子纳米颗粒主要用于包封阴离子核酸，其可用于将遗传物质转染到细胞中。它可在通过细胞膜期间经历内体摄取，因此其内容物降解。此外，它不适合口服使用，因为它在胃肠道的恶劣环境中不稳定，以及不太可能被肠上皮细胞完整地摄取。
即使在肠胃外给药后，大多数大分子也会遇到膜通过的问题，以及大多数递送系统不能在细胞内提供完整的大分子。它们被排除在许多靶细胞之外，因此它们在血液中循环直至被清除或降解，但可能永远不会成功进入体细胞。内体摄取会破坏它们，以及它们可能永远不会以活性形式到达其细胞内靶标。单独或在递送方式中的大分子可能不能通过诸如血脑屏障的区域屏障，从而有效地防止大分子靶向选定的器官和组织例如脑。未能进入靶细胞可能是针对淀粉样蛋白途径中的靶标以从脑中清除淀粉样蛋白的许多单克隆抗体的临床试验失败和它们缺乏足以逆转阿尔茨海默病的活性的潜在原因。通常，这些蛋白质的大尺寸和缺乏脂溶性可限制其他新型靶标单克隆抗体的细胞内有效性。
Nagy在2014年展示了一种复杂的细胞内递送系统，也应用于核酸，其中细胞内的释放依赖于颗粒本身的酶促降解(11)。然而，这种颗粒在胃肠道中也不稳定，并且它不会被完整地放入乳糜微粒中以递送到淋巴管，然后递送到体细胞。Nagy颗粒也会在摄取它的细胞的内体中降解。
所有这些技术都面临着这种和所有其他基于脂质的颗粒的主要限制，这是由于不能被肠上皮细胞完整地摄取并且无法在通过肠上皮细胞进入肠屏障的基底外侧的血液期间保持完整。
因为口服给药的分子如蛋白质、肽和遗传物质要么在胃肠道(GI)中消化，要么不能以完整的形式扩散通过肠上皮细胞的细胞膜，或两者都有，技术人员普遍认为口服生物利用度屏障仍然为通过胃肠道吸收25％或更少，因此对于蛋白质、肽和核酸，IV或SC施用是施用这种活性药剂的唯一可靠方式。
使用现有技术困扰口服递送肽的基本挑战是必须被口服施用以在患者中实现期望结果的药物量。例如，如果所述分子如与索马鲁肽实例一样是2.5％生物可利用的，那么口服剂量是注射剂量的40倍，这是物品后果的成本，这可对分子本身的生产很重要。由于差的溶解度或表面包衣降解所导致的生物利用度差可意味着，即使某种药物能够耐受消化环境，它也不能以任何有意义的方式口服给药。例如，它可能需要以比静脉内给药或通过另一种可注射给药途径所需的剂量大得多的剂量给药。
这是一个绝望时期的迹象，即当一家大公司将上述口服索马鲁肽口服制剂纳入3期试验时，即使口服剂量比皮下注射剂量高10-40倍。除了明显的商品成本增加之外，另外的问题是吸收的可能性变化很大，如果由于特定日期的未知因素(例如食物效应)比通常吸收了更多，可导致毒副作用。
发明人公开了肠上皮细胞的新方法及其口服给予的蛋白质和肽的相关降解。本发明在构思上简单，使用无毒的制剂材料并且在小鼠和大鼠中出乎意料地产生接近100％的生物利用度。所得递送囊泡在胃肠道中是稳定的并且被肠上皮细胞完全吸收。然而，肠上皮细胞不会降解颗粒，而是将颗粒及其内容物插入乳糜微粒中，通过淋巴管递送到体细胞。因此，递送囊泡保护其内容物通过胃肠道和通过体细胞的细胞膜，从而首次向靶细胞内递送完整有效负荷。表达用于乳糜微粒对接的表面受体从而使得能够细胞内递送囊泡及其内容物的任何细胞都是这种新型递送方式的靶细胞。McCourt(12)以及Schentag和McCourt(13)已经公开了本发明的特征。克服25％生物利用度屏障的意外能力是本发明公开的本发明的主题。
显然，口服蛋白质的成功取决于创造新的制剂，其克服胃肠道中的酸和/或酶的降解，然后克服肠的肠上皮细胞膜的低渗透性，并且最终，递送方法必须克服目前不能将肽传递到细胞中并将它们在细胞膜的另一侧完整地从递送装置释放的问题。作为示例，所有上述限制和缺点已经针对胰岛素进行了补救，如本发明随后将公开的。
胰岛素是用于治疗患有糖尿病的患者的药物，并且是胰岛素依赖性糖尿病的唯一治疗。糖尿病的特征在于绝对或相对胰岛素缺乏的病理状况，从而导致高血糖，并且是21世纪人类健康的主要威胁之一。糖尿病患者的全球负担在2010年设定为2.2亿，以及在2025年设定为3.3亿。I型糖尿病主要由胰腺未能产生胰岛素引起。II型糖尿病涉及身体对胰岛素作用的反应性缺乏，这种状态被称为胰岛素抗性。胰岛素抗性是许多其他代谢疾病的前兆，例如肥胖、肝脂肪变性、动脉粥样硬化性心脏病、甚至许多形式的癌症。
所有糖尿病患者中约有20％-30％使用每日胰岛素注射来维持其葡萄糖水平。估计有10％的糖尿病患者完全依赖胰岛素注射。
目前，胰岛素给药的唯一途径是注射。每日注射胰岛素会给患者带来相当大的痛苦，并会影响患者的依从性。最大的问题是低血糖，这可以是严重的，在一些情况下会危及生命。脂肪营养不良、脂肪萎缩和脂肪肥大等副作用发生在注射部位。另外，皮下注射胰岛素通常不提供代谢的精细连续调节，其通常由从胰腺通过门静脉直接分泌到肝脏中的胰岛素发生。
本发明解决了对胰岛素和肽如胰岛素给药的替代解决方案的需求。本发明第一次提供与可注射剂量相同的口服剂量的胰岛素，这将是实现100％口服生物利用度的递送方式的预期结果。
最近的口服胰岛素和其他肽制剂需要蛋白酶抑制剂和吸收促进剂(1)。实验数据表明蛋白酶抑制剂可部分克服口服胰岛素制剂的胃肠道降解问题(1)。然而，即使在口服吸收有所改善的情况下，最大效果将根本不吸收转化为10-15％吸收。即使有了这些改进，口服生物利用度仍然很低且可变，因此口服剂量通常比注射剂量大10倍，如果在给药的任何一天全部给药剂量实际上被吸收，则使患者暴露于潜在致死量的胰岛素。
非常重要的是，本发明的递送方法第一次解决了以下问题：通过在囊泡上进行的转化步骤，在分子有效负荷完整的情况下将脂质囊泡结合至乳糜微粒中，从而细胞内递送至肠上皮细胞而无肠上皮细胞代谢。只有使用本发明公开的胆固醇酯来构建脂质囊泡才能成功结合至乳糜微粒中。没有其他已知的生物包封方法将提供胃肠的肠上皮细胞对囊泡的完整摄取。
在本发明中应该注意的是，发明人选择了高负载(即，负荷为以重量计负载负荷的囊泡的总重量的20％至96％，25％至95％，通常为25％至90％，30％至80％，25％至75％，所述负载负荷的囊泡包含活性化合物和囊泡，优选的囊泡粒度为750nm至7,500nm，更通常为1,500至2,500nm，更通常为2000nm)和缓释性质，其使用C8至C14胆固醇酯的优选特异性混合物专门用于在穿过胃肠道肠上皮细胞膜的过程中保护分子，从而保持有效负荷完整，同时将整个囊泡结合到乳糜微粒中。
乳糜微粒然后成为脂质如胆固醇酯的完美脂质递送方式，因此细胞不会对摄取产生抗性(通常会发生)。当胆固醇酯囊泡及其完整有效负荷通过细胞膜进入细胞质时，没有内体步骤。胆固醇酯包封的蛋白质的释放仅在递送至那些细胞后发生在体细胞内部，这赋予所公开的递送方法相对于任何现有系统的巨大优势。因此，本发明人公开了特洛伊木马的类似物，其当然是在有专利之前发明的，但迄今为止还没有用于合成肽递送装置，当释放发生时，该递送装置在细胞内产生意料不到的效果，并且通常被从细胞排出的分子现在在其内部实现预期的结果。
还应注意，所公开的方法仅用胆固醇酯才如所公开的那样起作用，因为只有这些分子在乳糜微粒的细胞内递送和细胞内的释放全部过程中都在脂质中被完整地处理。
鉴于现有大分子疗法的局限性，对于以更方便的方式(例如口服)施用药物活性大分子的制剂和治疗仍然存在需求，以及对于允许蛋白质和其他分子进入细胞的制剂的需求仍在继续。使用一种制剂意味着实现两个方面(口服吸收和细胞内递送)仅是本发明的一个独特方面。
应该注意的是，在本发明中，发明人优选选择C8至C14胆固醇酯的具有高负载和缓释性质的特定混合物，专门用于在跨越胃肠道肠上皮细胞膜的过程中保护分子，然后在将整个囊泡结合到乳糜微粒中时保持有效负荷完整。
乳糜微粒然后成为脂质如胆固醇酯的完美脂质递送方式，因此细胞不会对摄取产生抗性(通常会发生)。当胆固醇酯囊泡及其完整有效负荷通过细胞膜进入细胞质时，没有内体步骤。胆固醇酯包封的蛋白质的释放仅发生在体细胞内部，这赋予所公开的递送方法相对于任何现有系统的巨大优势。
还应注意，所公开的方法仅用胆固醇酯才如所公开的那样起作用，因为只有这些分子在乳糜微粒的细胞内递送和细胞内的释放过程中都在脂质中被完整地处理。
鉴于现有大分子疗法的局限性，对于以更方便的方式(例如口服)施用药物活性大分子的制剂和治疗仍然存在需求，以及对于允许蛋白质和其他分子进入细胞的制剂的需求仍在继续。使用一种制剂意味着实现两个方面(口服吸收和细胞内递送)仅是本发明的一个独特方面。本发明还涉及将蛋白质或肽负载到表达乳糜微粒受体的细胞中的方法，所述乳糜微粒包含脂质囊泡内的分子。该方法适合于口服使用，以及当用作口服递送方式时，肽和蛋白质的生物利用度几乎为100％，这取决于分子和包封方式。当使用本发明公开的方法时，细胞负载有完整的分子，以及在不形成内体的情况下进入细胞中。根据本发明，根据本发明的新型负载负荷的胆固醇体能够在患者或受试者的细胞内沉积活性分子并实现患者或受试者的治疗或诊断。该方法也通过递送细胞内代谢抑制剂而增强，因为非代谢分子从细胞中释放出来以在生物流体中循环直至另外排出。
发明内容
本发明涉及将亲水性大分子包封在包含一种或多种胆固醇酯的脂质囊泡内，并借助于囊泡的有利表面性质，将蛋白质或肽移动到胃肠道肠上皮细胞内并且这些细胞不降解所述蛋白质或所述囊泡的方法。作为第二步，肠上皮细胞将完整的囊泡移动到乳糜微粒中以便淋巴转移到血液中。作为第三步，乳糜微粒与细胞(优选表达乳糜微粒受体)对接，然后用胆固醇酯囊泡及其大分子有效负荷负载这些细胞。该新发明的结果是所述大分子的高口服生物利用度和细胞内递送。本发明公开的递送工具令人惊讶地完成了口服摄取和细胞内递送，二者在本发明之前都没有用大分子成功完成。现有技术的方法集中于在肠上皮细胞周围和之间移动这些和类似的较大分子，但是没有成功地移动分子通过肠上皮细胞和从肠上皮细胞移动至体细胞内。
如上所述，本发明的一个实施方案是将蛋白质或肽移动到胃肠道肠上皮细胞的高尔基体中的乳糜微粒中，然后从肠上皮细胞释放负载的乳糜微粒以在淋巴管和血液中循环直至将组合物递送至表达乳糜微粒附着受体的细胞中的方法。该方法适合于口服使用，以及当用作口服递送方式时，肽和蛋白质的生物利用度几乎为100％，这取决于分子和包封方式。当使用本发明公开的方法时，细胞负载有完整的分子，以及令人惊讶地进入细胞而不形成降解内体。根据本发明，根据本发明制备的新型负载负荷的胆固醇酯囊泡能够在患者或受试者的细胞内沉积活性分子并实现对患者或受试者的治疗或诊断。在实施方案中，该方法也通过递送细胞内代谢抑制剂而增强，因为非代谢分子从细胞中释放以在生物流体中循环直至另外排泄。现有技术的方法集中于不结合至乳糜微粒中并且在不需要内体的情况下不易通过细胞膜的包衣。这些现有技术方法在完整有效负荷的细胞内细胞递送方面效果较差。
本发明通过完全实施的实施例提供了包含一种或多种肽和任选的一种或多种细胞内肽代谢抑制剂的组合物，其用于在治疗有此需要的人类患者中口服使用。在优选的实施方案中，所述组合物可用于治疗癌症、感染性疾病、糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和代谢综合征。
在一个优选的实施方案中，肽是胰岛素，其任选与GLP-1激动剂组合，但这些实施方案不是限制性的，任何量的任何肽、蛋白质或其他分子都明显落入本发明的范围内。负载的囊泡可以含有一种或多种肽作为混合物，以及肽的混合物还可以含有肽代谢抑制剂，以便一旦释放在细胞内延长分子的停留时间。
本发明的步骤需要一种或多种包衣材料，其基本上由C6至C26胆固醇酯(即，胆固醇酯由胆固醇和C6-C26脂肪酸形成，从而形成酯)和不会对囊泡的基本特征产生实质影响的其它组分组成，其提供增强的大分子向细胞的递送，尤其但不排他地，通过如本发明另外描述的口服给药途径，所述C6至C26胆固醇酯优选C6-C22、C8-C22、C8-C18，优选C8至C14胆固醇酯，其独特地形成具有亲水中空中心和在囊泡的内表面和外表面上的中性电荷的囊泡。囊泡一旦负载有大分子例如肽(在优选实施方案中为胰岛素)，就通过位于肠上皮细胞的顶端刷状缘上的肠的肠上皮细胞表面转运蛋白独特地进入肠上皮细胞中。包含大分子的完整囊泡在摄取后在细胞内没有改变，因为囊泡的表面被肠上皮细胞识别为营养元素(两种组分，脂肪酸和胆固醇一起作为胆固醇酯被需要)。肠上皮细胞将囊泡置于新生的乳糜微粒中，并且内部肽有效负荷保持完整且未被识别。从该步骤开始，通过肠上皮细胞将乳糜微粒送至淋巴通道，从而使这些负载负荷的胆固醇酯(脂质)囊泡的乳糜微粒递送到表达所述乳糜微粒的表面受体的非肠上皮细胞的体细胞中。
用于构建所述胆固醇酯囊泡的胆固醇酯由胆固醇(如本发明所定义)和一种或多种饱和或不饱和脂肪酸制备，如本发明中另外描述的。本发明中公开的囊泡作为优选的递送方式使用C6-C26、C6-C22、C8-C22、C8-C18，优选C8-C14的至少一种非离子胆固醇酯构建，囊泡组成的最佳实施方案是40:60至60:40，优选55:45至45:55或50:50的肉豆蔻酸与月桂酸的质量比，然后通过肠上皮细胞上的顶端表面转运蛋白最佳地识别，并作为完整的囊泡进入这些细胞。
这些胆固醇酯囊泡围绕一个或多个包封的活性分子环化。由短于C6、特别是C2-C5(包括C4)的脂肪酸制备的胆固醇酯不易环化，使得它们不适合用于根据本发明的囊泡中的包封。长于C16的胆固醇酯不能通过顶端脂肪酸转运蛋白被最佳地内化到肠上皮细胞中。该递送方式适用于不同大小的分子，以及在没有包封在胆固醇酯中的情况下，在没有所述分子负载到所述胆固醇酯囊泡中的情况下，所有这些分子都不能明显地通过肠上皮细胞膜。囊泡的特定组成带来了肠上皮细胞的摄取和以口服吸收的营养脂肪酸和胆固醇的方式使用细胞途径进入肠上皮细胞以到达高尔基体的能力。根据本发明，本发明的新型负载负荷的囊泡将在患者或受试者的细胞内沉积完整的肽、蛋白质或核酸分子，并实现患者或受试者的治疗。
令人惊讶的是，本发明范围内的完整胆固醇酯囊泡通过特定的脂肪酸转运蛋白进入十二指肠的肠上皮细胞。更令人惊讶的是，内化的囊泡然后连同其完整的内容物在外膜保持完整的情况下被快速转移，进入高尔基体中的乳糜微粒。载有胆固醇酯囊泡内的肽的乳糜微粒进入淋巴管，然后通过胸导管进入血流，此后提供将包封的肽直接转运到体细胞中的方式，所述体细胞表达载脂蛋白的表面受体，所述载脂蛋白是肠上皮细胞负载的乳糜微粒的组成部分。结果是出乎意料地高的生物利用度，如本发明所定义，在50％至高达100％的量级。
一旦进入体细胞，胆固醇酯水解酶作用于递送装置的胆固醇和脂肪酸之间的键，结果是释放所述肽并任选地释放细胞内肽代谢抑制剂。体细胞任选地将递送的肽结合至细胞中、代谢它们和/或将肽作为游离肽或胆固醇酯囊泡内的肽从细胞中排出到血液中。令人惊讶的是，发明人已经发现，细胞可任选地排出完整的胆固醇酯囊泡以继续其围绕身体的行程，其仍然具有完整的有效负荷。这些可以被其他细胞完整地摄取，包括不表达乳糜微粒表面受体的细胞(载脂蛋白)。与大鼠相比，这种不寻常的再循环模式在小鼠中出乎意料地更显著，以及导致动物中更长的保留时间，以及在一些情况下，更有利的药代动力学。预计这种再循环模式也将发生在人类身上。
本发明要求保护的负载肽的胆固醇酯囊泡的优选实施方案在小鼠和大鼠的研究中提供高血液水平的胰岛素和几乎完全的口服生物利用度。胆固醇酯囊泡选择为1:1摩尔比的C12:C14胆固醇酯，并在特定的pH和胰岛素浓度下制备，将最大量的胰岛素递送到乳糜微粒中，从而递送到体细胞中。本发明公开的方法可以适用于包封任何肽，包括寡肽和多肽(包括多肽，例如单克隆抗体)以及蛋白质和其他大分子，包括大小和分子量变化很大的多核苷酸，例如DNA和RNA，从而通过口服途径进入细胞。在公开的优选实施方案中，胆固醇酯囊泡被用于负载具有GFP质粒的细胞，然后细胞表达特征性绿色荧光，从而证明根据本发明的胆固醇酯囊泡可以容易地包封大量核酸并将这些大分子递送到细胞中，如本发明中另外描述的。
因此，在实施方案中，本发明涉及口服剂型的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及口服剂型的药物组合物，其用于施用于哺乳动物，尤其包括人，其包含包封芯的囊泡，所述芯包含至少一种作为大分子的药物活性剂(例如，肽、蛋白质、核酸、其他活性剂，包括抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂等)，优选胰岛素，和任选的一种或多种另外的分子，其中所述囊泡具有外表面包衣，所述外表面包衣基本上由一种或多种胆固醇酯组成，所述胆固醇酯得自胆固醇和C6-C26脂肪酸(优选C8-C22脂肪酸，或C8-C14脂肪酸)，其中所述囊泡的所述外表面包衣在所述组合物通过细胞膜期间保持完整，使得所述囊泡及其芯进入所述哺乳动物的体细胞而没有内体形成，所述大分子和任选的另外的分子以重量计占囊泡总重量的20％至96％，通常25％至95％。在优选的方面，大分子是胰岛素，以及组合物还包含GLP-1激动剂和胰岛素和/或GLP-1激动剂的降解抑制剂。
在替代实施方案中，本发明涉及口服剂型的药物组合物，其包含至少一种药学活性剂，其是胰岛素和任选的一种或多种另外的分子，其全部包封在囊泡的芯内，其中囊泡具有外表面，所述外表面包含一种或多种胆固醇酯，所述胆固醇酯得自胆固醇和一种或多种C6-C26、优选C8-C14饱和或不饱和脂肪酸，其中所述药物活性剂以重量计占所述活性剂和所述囊泡的约20％至约96％，约25％至约95％，优选约25％至约80％，以及在将组合物口服给予患者后该组合物产生至少50％的活性剂生物利用度。在一个替代实施方案中，活性剂是胰岛素，以及组合物还包含GLP-1分子和任选的所述胰岛素和所述GLP-1分子中的一种或两种的细胞内代谢抑制剂。在另一个实施方案中，组合物包含从胆固醇酯和C8-C14脂肪酸得到的胆固醇酯，以及该组合物在给予患者后产生60％至100％生物利用度。在其他实施方案中，在根据本发明的组合物中，脂肪酸选自肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、Sapienic acid、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸或其混合物。
在其他实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含包封在囊泡芯内的聚-新表位mRNA癌症免疫治疗抗原构建体和任选佐剂，以产生负载负荷的囊泡，其中所述负载负荷的囊泡的外表面包含一种或多种胆固醇酯，其得自胆固醇和一种或多种C6-C26，优选C8-C14饱和或不饱和脂肪酸，其中所述抗原构建体和所述任选的佐剂以重量计占所述负载负荷的囊泡的约1％至约96％，优选所述负载负荷的囊泡重量的约1％至约50％，约2％至约25％。在一个替代实施方案中，所述组合物为口服剂型，其中所述组合物适于将mRNA癌症免疫治疗抗原构建体和任选的佐剂递送至患者或受试者的回肠和/或阑尾。在其他实施方案中，佐剂是脂多糖(LPS)佐剂。在另一个实施方案中，根据本发明，聚-新表位mRNA癌症免疫治疗抗原构建体是自体同源的，这意味着该构建体来源于待治疗患者的癌细胞。在替代实施方案中，癌症免疫疗法构建体是同种异体的，这意味着构建体源自不是从所述患者得到的合适的癌细胞。另一个实施方案涉及治疗有需要的患者的癌症的方法，包括向所述患者施用有效量的如上所述的组合物，其单独或与佐剂组合，并且单独或与检查点抑制剂组合。在本发明的另一个实施方案中，使用所述脂质囊泡将整个质粒转运到细胞中。后一发现提供了使用口服剂型用核酸转染细胞的方法。由于不需要病毒载体，所公开的转染方法代表了将核酸构建体插入细胞的新颖且可更安全的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于给予患者或受试者的呈药物剂型的组合物，其包含一种或多种包封在脂质囊泡中的大分子，以提供完整负载的囊泡，其中所述负载的囊泡的外表面包衣包含至少一种胆固醇酯，其得自胆固醇和C6-C26脂肪酸(优选C6-C22，C8-C22，C8-C18，优选C8至C14脂肪酸)，所述大分子在所述患者或受试者的细胞中得到的细胞内浓度比所述大分子在不存在所述囊泡的情况下得到的浓度高至少10倍。
在本发明的优选方面，将组合物配制成口服剂型，用于给予患者或受试者，优选人类患者。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包括上述组合物，其中所述负载的囊泡的外表面包衣在所述负载的囊泡穿过所述患者或受试者的细胞膜期间保持完整而没有内体形成，其中所述囊泡通过胆固醇酯水解酶在所述囊泡上的作用任选地在细胞内释放所述一种或多种大分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述大分子选自蛋白质、肽、核酸及其混合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包括上述组合物，其中所述大分子得到的细胞内浓度比不存在所述囊泡时由大分子得到的浓度高至少250倍。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中完整囊泡结合至所述患者或受试者的表达乳糜微粒表面受体的细胞(靶细胞)，以及完整的囊泡通过细胞中的胆固醇酯水解酶在所述囊泡上的作用在细胞中释放大分子。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中在所述患者或受试者中，表达表面乳糜微粒受体的细胞中大分子的细胞内浓度比不表达表面乳糜微粒受体的细胞中大分子的细胞内浓度大至少10倍。
本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，包括上述组合物，其中表达表面乳糜微粒受体的细胞中大分子的细胞内浓度比不形成负载乳糜微粒的囊泡中大分子的细胞内浓度大至少10倍。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中表达表面乳糜微粒受体的细胞中大分子的细胞内浓度比不形成负载的乳糜微粒的囊泡中大分子的细胞内浓度大至少250倍。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中完整负载的囊泡进入患者或受试者的细胞，以及细胞使用胆固醇酯水解酶从囊泡释放大分子，其中细胞任选地将一部分完整囊泡从细胞排出，进入细胞周围的细胞外液。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中完整的囊泡在所述细胞中被胆固醇酯水解酶打开，以及所述大分子作用于所述细胞中的组分。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述细胞代谢所述大分子和/或从所述细胞中排出所述大分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中大分子在包封入完整囊泡期间和在细胞中通过胆固醇酯水解酶释放时未改变，以及与包封在囊泡中的大分子相同且具有相同活性。
另一个实施方案涉及一种组合物，包括上述组合物，其中大分子是胰岛素。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其为口服剂型，其任选地是肠溶包衣的，其中当通过皮下或静脉内注射向患者或受试者施用胰岛素时，所述大分子以曲线下面积(AUC)血液浓度的至少50％至100％的浓度到达患者或受试者的血流。
在又一个另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其在囊泡芯中进一步包含与所述大分子组合的蛋白酶抑制剂。
另一个实施方案涉及一种组合物，包括上述组合物，其中蛋白酶抑制剂抑制细胞代谢大分子，以及其中与不存在蛋白酶抑制剂相比所述细胞将更多的大分子排出到周围的细胞外液中。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述囊泡包含胰岛素和至少一种另外的大分子。
本发明还涉及一种实施方案，其中所述组合物包括上述组合物，其进一步包括胰岛素和/或另外的大分子的细胞外代谢抑制剂。
另一个实施方案涉及口服剂型的组合物，包括上述组合物，其中完整囊泡穿过肠的肠上皮细胞并进入肠上皮细胞中的乳糜微粒中，以及其中患者或受试者中的细胞表达乳糜微粒的受体，且细胞与缺乏乳糜微粒表面受体的细胞相比具有更高的细胞内浓度，释放更多的胰岛素和另外的大分子。
另一个实施方案涉及一种组合物，包括上述组合物，其中另外的大分子是杆菌肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其还包含IDE抑制剂、DPP-IV抑制剂或其混合物。
本发明的另外的实施方案涉及一种组合物，包括上述组合物，其还包含GLP-1拮抗剂。
在又一个另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其在所述囊泡芯中包含两种大分子。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中第一大分子是胰岛素，以及第二大分子是GLP1激动剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述囊泡任选地包含大分子的细胞代谢抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述大分子是曲妥珠单抗，以及其中曲妥珠单抗在pH5.5-6.5、优选pH约6.0以重量计以负荷载荷的囊泡的总重量的40-60％负载到所述囊泡中。
本发明还涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述大分子是艾塞那肽，以及所述囊泡还包含DPP-IV抑制剂。
本发明还涉及另一种组合物，包括如上所述的组合物，其中所述DPP-IV抑制剂是西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin)或其混合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述大分子是GLP-1分子，其经过修饰以改善对DPP-IV酶促降解的稳定性或经过修饰以延长其在血液中的循环时间。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中GLP-1分子是利拉鲁肽(liraglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)、索马鲁肽(semaglutide)、利西拉肽(lixisenatide)、阿必鲁泰(albiglutide)或其衍生物，以及所述组合物任选地包含GLP-1分子的细胞内代谢抑制剂。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述大分子是选自利拉鲁肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽、利西拉肽、阿必鲁泰或其衍生物的GLP-1分子，以及所述组合物还包括选自重组胰岛素、NPH胰岛素、慢胰岛素(Lente insulin)、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、novolog或德谷胰岛素(insulin degludec)的胰岛素，以及所述组合物任选地包含所述GLP-1分子和胰岛素中的一种或两种的细胞内代谢抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中GLP-1分子是利西拉肽，胰岛素是甘精胰岛素，以及任选的细胞内代谢抑制剂是西他列汀。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胰岛素是赖脯胰岛素，以及GLP-1分子是杜拉鲁肽，以及任选的抑制剂是利格列汀。
本发明还涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胰岛素是德谷胰岛素，GLP-1分子是索马鲁肽，以及任选的抑制剂是西他列汀。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胰岛素是Novolog，GLP-1分子是利拉鲁肽，以及任选的抑制剂是西他列汀。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中大分子的口服给药使患者或受试者中的大分子的生物利用度至少为50％。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中生物利用度为85-100％。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中口服给予大分子产生的组织浓度比大分子的血浆浓度高至少10倍。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中大分子的口服给药产生的组织浓度比大分子的血浆浓度高至少20倍。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中大分子的口服给药产生的组织浓度高达大分子血浆浓度的250倍。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胆固醇酯是两种不同胆固醇酯的混合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胆固醇酯组分由脂肪酸得到，所述脂肪酸的长度相差超过两个碳单元。
在另外的备选实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胆固醇酯组分由脂肪酸得到，所述脂肪酸的长度相差不超过两个碳单元。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胆固醇酯组分由脂肪酸得到，所述脂肪酸的长度相差两个碳单元。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述囊泡还包含有效量的磷脂酰丝氨酸以靶向细胞用于凋亡。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中大分子是核酸，优选包括质粒。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中核酸是pgWizGFP质粒。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述大分子是疫苗，以及所述囊泡还包含佐剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及口服剂型的组合物，包括上述组合物，其中将囊泡包封在具有肠溶包衣的胶囊中以在7.0-7.8的pH释放囊泡。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中囊泡在7.4的pH从胶囊中释放。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中大分子是胰岛素，以及另外的分子是蛋白酶抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中蛋白酶抑制剂选自：抑肽酶(aprotonin)、大豆胰蛋白酶(SBTI)及其混合物。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中胰岛素是重组胰岛素。
在另一个可供选择的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述囊泡包含作为SNAC或SNAD的盐的化合物，以及所述盐选自单钠盐、二钠盐及其组合。
在另一个备选实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其还包含ω-3脂肪酸。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其还包含EDTA或其盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种口服剂型的组合物，包括上述组合物，其包含抑制所述组合物在受试者胃中消化的包衣。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述包衣是肠溶包衣或明胶包衣。
在另一个可供选择的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述脂肪酸选自肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、Sapienic acid、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸或其混合物。
另一个实施方案涉及制备多个负载大分子的脂质囊泡的方法，其中囊泡的外表面包衣包含至少一种胆固醇酯，其得自胆固醇和C8-C26脂肪酸(通常为C6-C22、C8-C22、C8-C18，更通常为C8-C14胆固醇酯)，包括以下步骤：
1.超声混合以下：
a)极性溶剂混合物，其含有一种或多种大分子和任选的所述大分子的至少一种表面改性剂；和
b)非极性溶剂混合物，其基本上由至少一种选自肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的非离子脂肪酸胆固醇酯组成，
其中将所述极性溶剂混合物a)和所述非极性溶剂混合物b)超声处理，直至所述一种或多种大分子、所述表面改性剂、所述至少一种脂肪酸胆固醇酯、所述非极性溶剂和所述极性溶剂在所述混合后形成囊泡的均匀分散体；和，
2.蒸发所述非极性溶剂，从而将所述囊泡留在所述极性溶剂中，
其中每个所述囊泡包含基本上由多个非离子脂肪酸胆固醇酯分子组成的外层和含有所述大分子的中空腔室。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括上述方法，其中极性溶剂包含pH在2.5至3.5(优选3)范围内的缓冲液中的胰岛素，缓冲液中胰岛素的初始浓度为7.5至8.5mg/ml，优选8mg/ml，缓冲液的温度为35-39℃(优选37℃)，以及将缓冲液(a)和非极性溶剂组合物(b)的混合物超声处理20分钟。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括上述方法，包括在步骤1(通过超声处理混合)或步骤2(蒸发)期间和/或之后对多个负载芯的囊泡进行分散步骤以防止聚集。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括上述方法，其中使用十二烷基硫酸钠进行分散步骤。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括上述方法，包括在步骤1(通过超声处理混合)、步骤2(蒸发)或分散步骤期间和/或之后使用明胶悬浮液对多个负载芯的囊泡进行稳定化步骤处理。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症的组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及包含包封在脂质囊泡中的肿瘤裂解物或肿瘤抗原的组合物，其中囊泡的外表面包衣包含一种或多种胆固醇酯，所述胆固醇酯得自胆固醇和C6-C26脂肪酸(优选地，例如，C6-C22脂肪酸、C8-C22脂肪酸或C8-C14脂肪酸)，其中囊泡的外表面包衣在所述组合物通过细胞膜期间保持完整，使得囊泡及其芯进入淋巴细胞，包括树突细胞，而没有内体形成，并通过细胞胆固醇酯水解酶的作用在细胞中释放所述包封的裂解物或抗原，其中细胞中裂解物或抗原的细胞内浓度比从未包封在囊泡中并递送至细胞的相同浓度的肿瘤裂解物或抗原得到的细胞内浓度大至少10倍(通常至少100倍)并且更经常至少250倍。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中肿瘤裂解物包含选自蛋白质、肽、核酸或其混合物的大分子，以及抗原是肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及口服剂型的组合物，包括上述组合物，其包含在7.3至7.6的pH靶向释放肿瘤裂解物或抗原的包衣，其中所述肿瘤裂解物或抗原针对患者或受试者的回肠中的树突细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中肿瘤裂解物或抗原是自体同源的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中回肠释放的组合物另外含有胆固醇体包封的佐剂，其包含一种或多种被证明可激活树突细胞的物质。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述佐剂是脂多糖(LPS)。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中有效量的一种或多种检查点抑制剂单克隆抗体任选地被包封在囊泡中，其中检查点抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗(atezolizumab)或其混合物，以及组合物任选地包含佐剂，所述佐剂包含一种或多种被证明可激活树突细胞的物质。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述佐剂是脂多糖(LPS)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中回肠释放的组合物另外含有用于树突细胞的胆固醇体包封的刺激物质，优选IMO-2125，以及其中通过树突细胞暴露于组合物后干扰素γ浓度的增加证明了该物质对树突细胞的激活。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中肿瘤裂解物的来源是同种异体的或来自待给予该组合物的患者以外的患者。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中囊泡包含肿瘤抗原，而非肿瘤裂解物。
在另外的实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中肿瘤抗原是gp100黑素瘤肿瘤抗原。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述抗原是自体同源的聚-新表位mRNA癌症免疫治疗抗原构建体，其中所述抗原来自待治疗的患者的癌细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括上述组合物，其中所述聚-新表位mRNA癌症免疫治疗抗原构建体是同种异体的，其中所述抗原来源于指定类型但未从待治疗的患者得到的癌细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的患者的癌症的方法，包括向患者口服施用如上所述的组合物，其中所述组合物激活所述患者中针对癌细胞的细胞免疫应答。
本发明的另一个实施方案涉及一种方法，包括如上所述的治疗有需要的患者的癌症的方法，包括将有效量的如上所述的组合物直接注射到患者的肿瘤中，其中所述组合物激活所述患者中针对癌细胞的细胞免疫应答。
在一个替代实施方案中，本发明涉及一种方法，包括如上所述的治疗有需要的癌症的方法，其中所述细胞免疫应答通过当所述组合物暴露于所述患者的T细胞时响应于所述组合物的刺激释放IL-2或IFNγ而体外检测。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包括如上所述的组合物，其中所述囊泡由月桂酸胆固醇酯或棕榈酸胆固醇酯中的一种或多种和肉豆蔻酸胆固醇酯组成。
附图说明
图1.显示在中空芯中由肉豆蔻酸胆固醇酯、月桂酸胆固醇酯和胰岛素组装脂质囊泡的图。有两种呈铁路轨道形式的晶格模型。横穿尾部的距离约为20A(2纳米)。在脂质体中，它会更长，因为尾部不会相互交叉而是首尾相连。胰岛素单体的最长距离为37A(3.7nm)(品红色球)。屏幕上的距离(The distance across the screen)为386.836A或38.6nm。在单晶格(RR轨道模型)中，任何分子都没有真正的构象灵活性以移动进来。
图1A，表1显示了胆固醇体和替代递送方式之间的性质比较。性质确定胆固醇体在所有类别中都优于或至少相等。该比较的一个特别重要的方面是几乎任何分子都可以包封在胆固醇体中而不改变分子本身。在大多数情况下，必须对分子进行修饰以满足递送方法的需要。设计灵活性是药物递送系统的有利特性。胆固醇体不受现有技术中递送方式的大多数限制。
图1B，表3.胆固醇酯的其他制剂的总结，其在不同温度在两种不同溶剂中混合各种摩尔比后获得，以达到已知囊泡直径的胆固醇体
图2.胆固醇体，其通过组合相差两个CH2单元的两种短链胆固醇酯、以1:1的摩尔比混合的辛酸胆固醇酯(C6)和癸酸胆固醇酯(C8)制备。由该组合产生的胆固醇体的平均粒度为350nm。当将FITC结合至这些胆固醇体中并在MCF-7细胞上进行测试时，没有发生活力损失，以及绿色荧光显示这些胆固醇体在细胞中浓缩。
图3.胆固醇体，其通过组合相差4个CH2单元的两种长链胆固醇酯、以1:1的摩尔比混合的硬脂酸胆固醇酯(C18)和山嵛酸胆固醇酯(C22)制备。由该组合产生的胆固醇体的粒度范围为392nm(如果在65℃在氯仿中制备)至3899nm(如果在55℃在乙醚中制备)。当将FITC结合至这些胆固醇体中并在MCF-7细胞上进行测试时，没有发生活力损失，以及绿色荧光显示这些胆固醇体在细胞中浓缩。
图4.胆固醇体，其通过组合相差10个CH2单元的两种胆固醇酯、以1:4的摩尔比混合的月桂酸胆固醇酯(C12)和山嵛酸胆固醇酯(C22)制备。当在65℃在氯仿中制备时，由该组合产生的胆固醇体具有1500nm的平均粒度。当将FITC结合至这些胆固醇体中并在MCF-7细胞上进行测试时，没有发生活力损失，以及绿色荧光显示这些胆固醇体在细胞中浓缩。
图5.胆固醇体，其通过组合相差8个CH2单元的两种胆固醇酯、以1:4的摩尔比混合的肉豆蔻酸胆固醇酯(C14)和山嵛酸胆固醇酯(C22)制备。当在65℃制备时，由该组合产生的胆固醇体具有690nm的平均粒度。当将FITC结合至这些胆固醇体中并在MCF-7细胞上进行测试时，没有发生活力损失，以及绿色荧光显示这些胆固醇体在细胞中浓缩。
图6.胆固醇体，其通过组合相差两个CH2单元的两种胆固醇酯、以1:1的摩尔比混合的肉豆蔻酸胆固醇酯(C14)和棕榈酸胆固醇酯(C16)制备。当在65℃在氯仿中制备时，由该组合产生的胆固醇体具有1890nm的平均粒度。当将FITC结合至这些胆固醇体中并在MCF-7细胞上进行测试时，没有发生活力损失，以及绿色荧光显示这些胆固醇体在细胞中浓缩。
图7.胰岛素胆固醇体制剂1117的测试-第6周对第18周。冰箱中含有胰岛素的胆固醇体的稳定性；通过ELISA测定对总量、沉淀和上清液进行连续取样。
图8.胰岛素制剂1117。在两个不同囊泡群之间的NICOMP分布-囊泡平均粒度#1(33％的囊泡)＝平均208nm；SD＝29.2；囊泡平均粒度#2(囊泡的67％)平均1191nm，SD＝133。
图9.在指定的pH和离子强度下制备的胰岛素-胆固醇体中的平均脂质浓度(n＝2)。
图10显示当制剂的pH为3.0时，在较低的缓冲液离子强度下，胰岛素胆固醇体囊泡中的平均胰岛素浓度最高。
图11.在较高离子强度下，在pH(6-8)下制剂的包封效率(EE)最大化。pH(3和5)胆固醇体的E.E.使用1xPBS的离子强度最大化。
图12.在胰岛素存在下，通过DLS测定的作为离子强度的函数的pH 3Ins-胆固醇体囊泡粒度。
图13.在胰岛素存在下，通过DLS测定的作为离子强度的函数的pH3-8Ins-胆固醇体囊囊泡粒度。注意酸性和碱性条件下的粒度差异。
图14.反应混合物：表面活性剂之前的胰岛素-胆固醇体。
图15.反应混合物：添加表面活性剂后的胰岛素-胆固醇体。
图16.反应混合物：表面活性剂后和过滤后去除未包封的胰岛素的胰岛素-胆固醇体-粒度分布。
图17.胰岛素胆固醇体制剂1117在20x、80x和100x的透射EM，其显示较大的中心，解释为亲水口袋。
图18.用于在单层Caco2细胞的顶侧暴露于胆固醇体包封的分子后收集基底外侧液体的装置(用CaCo2细胞进行Biocoat(BectonDickinson)transwell测定)的图示。给予细胞FITC胆固醇体胰岛素或未包封的FITC胰岛素，将其加入到分化的Caco2单层的顶侧的培养基中。如方法中所述诱导细胞形成乳糜微粒。将所有粒度的胆固醇体包封的分子摄入Caco-2细胞中，并从该处通过高尔基体结合至乳糜微粒中。肠上皮细胞的摄取过程比Caco-2细胞所示的过程更快速和有效。乳糜微粒的其他典型组分是APO-B、其他载脂蛋白和甘油三酯。在形成后，乳糜微粒被Caco-2细胞分泌到单层基底外侧的淋巴液中。负载有胆固醇体的乳糜微粒被捕获在Caco2单层的基底外侧的液体中。
图19.Caco-2测试：2000nm颗粒，单独的和胆固醇体包封的FITC胰岛素；时间＝0是基线。
图20.Caco-2测试：2000nm颗粒，单独的和胆固醇体包封的FITC胰岛素；时间＝24小时。
图21.Caco-2测试：2000nm颗粒，单独的和胆固醇体包封的FITC胰岛素；在caco2单层的顶端和基底外侧的FITC读数，在这种情况下时间＝24h。
图22.胆固醇体介导的FITC-胆固醇体胰岛素向MCF-7细胞中的递送。图像A显示24小时后负载有FITC-胆固醇体的MCF-7细胞的相衬显微镜。图B显示24小时后负载有FITC-胆固醇体胰岛素的MCF-7细胞的荧光。
图23.比较游离FITC-胰岛素(A行)、FITC-胆固醇体胰岛素(B行)和FITC-胆固醇体胰岛素-乳糜微粒(C行)将FITC-胰岛素递送到MCF-7细胞中的能力。第一列是暗视野，第二列是荧光，以及第三列是叠加。如C行所示，来自FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒的负载几乎高出1000倍。在该实验中，与我们之前使用FITC胰岛素胆固醇体的一些实验相比，MCF-7细胞的FITC胰岛素胆固醇体负载得到改善，以及此处来自FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒的负载甚至更大。在所有情况下，通过Caco-2细胞将FITC胰岛素胆固醇体加工成乳糜微粒产生细胞内胰岛素量的强烈改善。在该图像中，细胞膜不仅显著更浓缩FITC胰岛素，而且这些细胞的细胞质负载有FITC胰岛素，以及在2小时时甚至没有内体可见的分布。
图24.胆固醇体中的胰岛素：总胰岛素的平均生物利用度-小鼠为66％。胰岛素-胆固醇体制剂1117。小鼠剂量为1U/kg，每个数据点2只小鼠。晚期峰值是由细胞胞吐作用引起的-涉及游离胰岛素和总胰岛素。
图25.胆固醇体中的胰岛素：游离胰岛素的生物利用度-在IV制剂中校正游离胰岛素后。IV胆固醇体-胰岛素包含3％游离胰岛素；(因此，IV剂量高3％，相应地口服剂量低3％，因为胃肠道中的游离胰岛素未被吸收。胰岛素-胆固醇体制剂1117；小鼠剂量为1U/kg，每个数据点有2只小鼠。
图26.给药后6小时的小鼠血浆和靶组织中的FITC胰岛素浓度。胆固醇体包封的FITC胰岛素显示口服高吸收和口服给药的组织分布高于IV给予的相同剂量。该测定反映了当血浆FITC浓度低时细胞中高浓度的FITC。
图27.口服给予1单位/kg胆固醇体胰岛素1412制剂的大鼠中胰岛素浓度对时间的关系。本研究中的AUC为295.7。
图28.皮下给予人重组胰岛素1.0u/kg的大鼠的胰岛素浓度对时间的关系。胰岛素AUC为344.4。
图29.以1.0u/kg的剂量皮下给予胰岛素胆固醇体的大鼠中胰岛素浓度对时间的关系。胰岛素的AUC为322.5。
图30.在给药后4小时大鼠血浆和靶组织中的FITC胰岛素浓度。胆固醇体包封的FITC胰岛素显示口服高吸收和口服给药的组织分布高于SC给予的相同剂量。该测定反映了当血浆FITC浓度低时细胞中高浓度的FITC。
图31.曲妥珠单抗(赫赛汀)的聚集和降解对照数据，其中使用JENWAY分光光度计(稀释因子：7.5)将280nm处的吸光度与降解检测波长(350nm)进行比较。注意由于包封、冻干和透析导致的最小聚集/降解。
图32.分析曲妥珠单抗-胆固醇体和IgG-胆固醇体制剂的脂质含量、抗体含量和粒度，然后将1.5ml部分与蛋白质G-琼脂糖混合以从胆固醇体分离游离抗体。如方法中所述测定脂质和抗体浓度。*由差异决定；**为从蛋白质G-琼脂糖洗脱后的脂质。
图33.曲妥珠单抗-胆固醇体(1510)处理的和IgG-胆固醇体(1519)处理的184B5(蓝色条)和MCF-7(灰色条)细胞的生长(A)。
图34.曲妥珠单抗-胆固醇体(1510)处理的和IgG-胆固醇体(1519)处理的184B5(蓝色条)和MCF-7(灰色条)细胞的细胞存活率(B)。细胞如所述生长并如方法中所述处理。
图35.通过冻干(中间条)并随后透析(第三条)浓缩后曲妥珠单抗的分析。曲妥珠单抗储液浓度如所述在冻干和透析后测量。所述条上方的值表示检测到的蛋白质的量(作为输入的百分比，即未处理的，设定为100％)。蛋白质量通过与曲妥珠单抗标准曲线比较确定。
图35A，表4.用于制备pgWizGFP的每柱的Qiagen缓冲液组分。
图36.由肉豆蔻酸胆固醇酯和棕榈酸胆固醇酯以1:1摩尔比制备的胆固醇体，其使人视网膜上皮细胞负载FITC。图A显示用肉豆蔻酸酯/棕榈酸酯制备的FITC-胆固醇体处理2小时的ARPE-19细胞的图像。左上图是相衬图像；右上是2小时的绿色荧光通道图像；左下图是红色荧光通道图像；右下图是合并的图像。
图37.显示用由肉豆蔻酸胆固醇酯/棕榈酸胆固醇酯制备的pgWizGFP胆固醇体(上图，30小时)和由肉豆蔻酸胆固醇酯/月桂酸胆固醇酯制备的pgWizGFP胆固醇体(下图，24小时)处理的MCF7细胞的图像。在每个图中，最左边的图像是相衬，下一个是绿色荧光通道，再下一个是红色荧光通道，以及最右边是合并的图像。图像显示，两种制剂均用pgWizGFP质粒负载MCF7细胞，表达绿色荧光。培养基对照图(未显示)具有可忽略的荧光，与背景自发荧光一致。
图38.显示了用由肉豆蔻酸胆固醇酯/棕榈酸胆固醇酯制备的pgWizGFP胆固醇体(上图)和由肉豆蔻酸胆固醇酯/月桂酸胆固醇酯制备的pgWizGFP胆固醇体(中图)和单独的培养基(下图)处理24小时的ARPE-19人视网膜细胞的图像。在每个图中，最左边的图像是相衬，下一个是绿色荧光通道，下一个是红色荧光通道，以及最右边是合并的图像。图像显示两种制剂均用pgWizGFP质粒负载ARPE-19细胞，从而导致在24小时的绿色荧光表达。单独的培养基以及单独的pgWizGFP(未显示)在24小时显示边缘荧光，从而表明很少的背景自发荧光和未包封的质粒可忽略不计地进入细胞。
具体实施方式
在整个说明书中使用以下术语来描述本发明。在术语未在本发明中给出具体定义的情况下，该术语具有与本领域普通技术人员所理解的相同的含义。可以使用一种或多种根据本发明的脂质囊泡包封的化合物治疗的疾病状态或病症的定义是本领域通常已知的定义。
应注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物，除非明确且清楚地限于一个指示物。因此，例如，提及“一种化合物”包括两种或更多种不同的化合物。如本发明所使用的，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中的项目的叙述不排除可以替换的其他类似项目或可以添加到列出的项目中的其他项目。
在整个说明书中使用术语“患者”或“受试者”来描述施用根据本发明的组合物的动物，优选人。对于将组合物给予特定动物如家畜(用于兽医应用)或人类患者，术语患者或受试者是指该特定动物。
术语“化合物”在本发明中用于指本发明公开的任何特定化学化合物。在其上下文中的使用中，该术语通常是指如本发明所公开的单一化合物及其药学上可接受的盐，但在一些情况下还可以指所公开化合物的立体异构体和/或光学异构体(包括外消旋混合物)。
术语“基本上由......组成”用于描述组合物的组分或组合物的元素的组分，其含有那些组分和不会实质上改变组合物或元素的基础和新特征的任何其他组分，其原则上和在一些情况下，仅包含那些组分。
如在本申请中所使用的，术语“约”和“近似”用作等同物。本申请中使用的有或没有约/近似的任何数字旨在涵盖本领域技术人员在本发明的相关方面所理解的任何正常波动。
大约或约：如本发明所用，术语“大约”或“约”应用于一个或多个感兴趣的值，是指与所述参考值类似的值。在一些实施方案中，取决于上下文，术语“大约”或“约”是指在任意方向上(大于或小于)落在所述参考值的15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，更通常5％或更少的值范围内，除非另外陈述或者根据上下文以其它方式显而易见(除了该值将超过可能值的100％或小于0％)。
术语“治疗”是指治愈或至少有利地影响疾病。在上下文中的另一个实施方案中，“治疗”是指预防/降低疾病和/或病症的可能性。在另一个实施方案中，“治疗”是指降低疾病的发病率。在另一个实施方案中，“治疗”是指改善疾病的症状。在另一个实施方案中，“治疗”是指诱导疾病或病症的缓解。在另一个实施方案中，“治疗”是指减缓疾病的进展。
在本发明的实践中选择脂肪酸的方法
适用于本发明实践的脂肪酸列于下表2中，其进一步的特征在于结构、碳与双键数的比率(C:D的比率)和双键的位置：
表2.有效用于形成胆固醇酯的脂肪酸的列表
其特征在于结构、碳与双键数的比率(C:D比率)和双键的位置
在上表2中，C是碳数，D是脂肪酸分子的烷基链中的双键数，显示了分子的C:D比率。双键的位置表示为羰基(其为链中的位置1)后的碳数。以这种方式，对于肉豆蔻烯酸，n-5意指在位置14-5＝位置9处发现双键。
在本发明的实践中用于酯化的胆固醇
在本发明中使用术语“胆固醇”以描述任何可与脂肪酸缩合制备胆固醇酯的胆固醇化合物，该胆固醇酯可用于形成依照本发明的胆固醇体。术语“胆固醇”包括被认定为胆固醇自身的分子，以及任何具有其它氧化位点的相关胆固醇分子(“胆固醇的氧化类似物”)，例如(但不限于)：7-酮基胆固醇、25-羟基胆固醇、7-β-羟基胆固醇、胆固醇、5-α、6-α环氧化物、4-β羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇、24,25-环氧胆固醇。可改变氧化固醇中被引入的氧化官能团的类型(过氧羟基、羟基、酮基、环氧基)、数量和位置以及改变其立体化学性质。这些不同胆固醇可被用于提供胆固醇酯，其具有不同的溶解特性，从而在提供具有中性表面的胆固醇体时提供一些灵活性，并提供可向胆固醇酯分子中引入亲水性的基团。胆固醇型分子还可包括任何含有酯形成所必需的OH的基于固醇结构的化合物，如维生素D。
对于上表2中所列出的任意对酯(当使用一对酯时)，有利的胆固醇体形成中的摩尔比为0.05至0.95。近似相等烷基链长度的胆固醇酯对与活性分子之间的组成产物比为约2:2:96至约48:48:4，通常为45:45:10至2:2:96、约40:40:20至约5:5:90、约40:40:20至约25:25:50。注意在很多胆固醇体制剂中，当使用两种(或更多种)胆固醇酯时，该比率可在所使用的胆固醇酯的1:1比率的上下(例如60:40至40:60或者55:45至45:55)浮动。
在本发明的实践中选择胆固醇酯的方法。
通过举例的方式，以下原则定义了选择胆固醇体中的胆固醇酯成分的基础、选择酯或酯对以用于包封目的的方式，并根据表2中所列的胆固醇酯的所公开的生理化学性质：
1)被选定结合的酯应能够将其自身排列为优化酯对之间的酯连接相互作用。该静电相互作用对于取向目的来说是十分重要的，其中该囊泡具有所需的疏水性外表面和亲水性中心。
2)烷基相互作用应能够优化范德华力。
3)静电相互作用和烷基相互作用范德华力的总和是保持囊泡形状并因而保留分子在内部的基本性质。胆固醇体囊泡稳定性的其它关键因素包括酯的双疏水性末端与含有被包封分子的水性成分之间的排斥程度。
4)囊泡的总大小变成烷基链的长度的函数。所选定酯的增加的长度将增加整个囊泡的总体疏水特性。
5)使用较小链长度的酯将实际上增加囊泡的总体疏水特性(就每种酯的总体结构而言)。
6)需要更多疏水性区域以帮助包封在囊泡内的分子可受益于具有更长烷基链的酯。
7)更小且需要更多亲水性成分以帮助包封的分子将受益于长度更短的酯对。
8)其它的选择是使用不饱和烷基链(如表2中所列的那些)，其中这些脂肪酸被用于制备用来形成胆固醇酯的酯侧链。
9)不饱和脂肪酸的使用提供了对囊泡结构的额外结构修饰，其增加了水和双键特性之间的额外的静电相互作用。
10)在选择用于形成囊泡的酯的过程中，CH2链长的选择范围为，例如从2个CH2单元到低于27个CH2的长度，所产生的结构不会很紧密，这是由于使烷基链适应以使其在囊泡中的相互作用最大化的挑战。囊泡壁的胆固醇成分不会改变。CH2单元内的范德华力相互作用决定了烷基相互作用的柔性。然而，为了有益的亲水性囊泡中心，在该囊泡中的最佳构型为更长的烷基链，意味着较大的酯分子在制剂稳定性中具有更大的效用来稳定暴露于水性环境的更亲水的囊泡中心。
11)胆固醇酯对的选择是基于脂肪酸与十二指肠的肠上皮细胞上的成对脂肪酸转运蛋白的相对亲和力。在Caco2细胞上，与较长链相比，这些转运蛋白更加热衷于摄取较短链脂肪酸
基于它们与十二指肠肠上皮细胞表面上的胆固醇转运蛋白的反应性，选择胆固醇酯用于囊泡的组合物，这有利于它们快速和完全摄入肠上皮细胞。实施本发明的关键步骤是通过在肠上皮细胞上独特表达的顶端表面转运蛋白进行摄取(14)。进一步的必要步骤是通过这些转运蛋白摄取完整的两种酯的胆固醇酯囊泡，这些转运蛋白也在Caco-2细胞上被发现(15)。本发明人意外地发现由不同胆固醇酯制成的囊泡被这些转运蛋白摄取。因为这种摄取不涉及内体，以及因为这些转运蛋白不会破坏胆固醇酯囊泡，所选择的材料出乎意料地产生了由多于一种胆固醇酯产生的完整囊泡。因此，在进入肠上皮细胞期间囊泡或其内容物没有变化。进一步实施本发明，可以组装胆固醇酯囊泡的特定组合以利用这些转运蛋白的最佳功能，其中较短链的胆固醇酯如癸酸酯、辛酸酯、肉豆蔻酸酯和月桂酸酯比较长链的酯如棕榈酸酯、油酸酯、硬脂酸酯和山嵛酸酯被更多和更完整地被摄取。
一旦进入内部，胆固醇酯囊泡提供额外的益处，即，在肠上皮细胞内乳糜微粒形成期间保护囊泡的有效负荷内容物，因为肠上皮细胞是少数不会将胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸组分的体细胞之一。该特征和乳糜微粒形成步骤是肠上皮细胞的独特性质，因此是本发明公开的本发明实践中的必要步骤，因为本发明人选择胆固醇酯对来优化分子的负载和对肠上皮细胞的顶端转运蛋白的相对亲和力。
常规细胞(本发明中认为不是肠上皮细胞的细胞)也具有用于所公开的胆固醇酯囊泡的表面转运蛋白，以及如本发明人在此显示的，不是肠上皮细胞的常规细胞(MCF-7细胞被用作非限制性实例)在通过细胞膜期间也摄取本发明的胆固醇酯囊泡(没有内体形成步骤)。
令人惊讶的是，胆固醇酯囊泡的后细胞摄取处理在常规细胞和肠上皮细胞之间不同。具体地，胆固醇酯囊泡在受体介导的内吞作用后到达细胞内是胆固醇酯水解酶释放的信号，以及该酶的特定作用打开囊泡以将其有效负荷释放到细胞质中。这在肠上皮细胞中不会发生，因为仅在这些细胞中，完整的囊泡才不会水解并以完整的形式结合至乳糜微粒中。
囊泡的胆固醇酯组分的其他有利性质是
1.它们的表面中性电荷使肠上皮细胞能够选择性地识别本发明的这些成分，
2.脂质囊泡包衣的整个组合物包含少量的安全膳食成分(脂肪酸胆固醇酯)，从而提供安全的递送方式，和
3.特别是在渗透性方面，特别是它们彼此“包装(pack)”的可能性以及将要加入囊泡本身的药物的要求。
图2-6通过选自表2的不同胆固醇酯对形成胆固醇体囊泡基质的实例说明了分子模拟图。在图11-13中，代表性肽分子是胰岛素，一种6kd大小的肽，其通常是水溶性的。在图14-15中，应用胆固醇体囊泡结构来包封贝伐单抗，一种大小约150kd的代表性单克隆抗体。在图16中，显示了与由肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯形成的胆固醇体囊泡相关的所有3种代表性分子。
对于长度相差大于6个CH2单元的酯对(其被定义为中间体)，可以保持酯相互作用并使分子以相反的方向转变以仍然具有填充到囊泡中的烷基链。这种排列可用于包装具有疏水/亲水特征的交替结构区域的分子，以及当结合至所述囊泡中时，可凭此分离不同分子类型。
酯对的选择受到需要被包封的分子结构及其与囊泡相互作用的能力的影响。
胆固醇体的中性电荷vs脂质体的正电荷
脂质体无法完整穿过Caco-2肠上皮细胞屏障，事实上，在胃肠道中很多都被分解打开，从而收获其各自的磷脂成分。因而脂质体及其有效负荷物无法被肠上皮细胞摄取，这可以是由于它们的表面电荷。胆固醇体是由胆固醇酯组成，其为用于吸收至十二指肠肠上皮细胞中的最终形式(已经通过胆固醇酯酶转换为可吸收的部分)。由于它们是由胆固醇酯组成，胆固醇体已经是中性颗粒，并且优选以这种形式被十二指肠的肠上皮细胞完整吸收并用于形成乳糜微粒。只要包封的分子完全位于中空中心内，胆固醇体就被完整摄取并在肠上皮细胞的高尔基体内完整进入乳糜微粒。
脂质体不负载蛋白质，而胆固醇体优先负载蛋白质
脂质体不负载有效量的蛋白质、遗传物质(多核苷酸，如DNA和/或RNA，如此处另外所述)、肽(尤其包括多肽，如单克隆抗体)和包括大分子抗生素在内的很多大分子(低于2％，意味着如果包封100至1000mg的剂量，则载体的量会非常大，而上述剂量是肽或单克隆抗体的典型剂量)。很多水溶性且带有正电荷的分子不容易被负载到纳米颗粒中，如磷脂基脂质体。相反，胆固醇体的内部(芯)相对于包封膜来说尺寸较大，并且是亲水的。电荷为中性的，这是可与负载蛋白质、肽、基因以及带有电荷的亲水性小分子相容的系统。由于所有这些分子都无法穿过胃肠道屏障，胆固醇体囊泡的使用首次提供了通过肠上皮细胞而非被迫绕过肠上皮细胞的口服吸收的蛋白质和肽的前景。
脂质体及其内容物不会进入乳糜微粒
脂质体的磷脂包衣在胃肠道内被降解，并因而在到达十二指肠吸收位点之前脂质体自身就被降解，且其内容物在胃肠道中被释放。因而即使蛋白质可被负载到脂质体中，在其被肠上皮细胞吸收之前就与脂质体一起被破坏。由磷脂组成的脂质体不可能结合到乳糜微粒中。
脂质体不通过细胞膜
脂质体不仅无法与其负载物一起被口服吸收，它们还无法进入细胞，并且确定的是，当其表面上缺少APO时，其无法与需要脂质的细胞对接。当通过静脉内注射时，脂质体被肝脏收获，并在那里被分解为其磷脂成分。通常这不会为其内容物提供胞内递送，尽管当靶细胞为肝细胞时肝脏内较高局部浓度的负载分子可提供好处。
可用于组合物中的胆固醇酯
包含胆固醇和脂肪酸的胆固醇酯，所述脂肪酸优选C4-C36脂肪酸，通常是C6-C26脂肪酸或C6-C22脂肪酸酸，更常见的是C8-C20脂肪酸，甚至更常见的是C8-C14脂肪酸。在一些实施方案中，可适用于本发明实践的脂肪酸选自肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、Sapienic acid、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸或它们的混合物。C4至C6的脂肪酸通常不特别适合于本发明，因为发明人已经发现这些脂肪酸通常不形成囊泡。
脂质颗粒
如Negrete和同事的美国专利申请文件2011-0268653(16)中所定义的，“脂质颗粒”是指具有膜结构的颗粒，其中两亲脂质分子排列为其极性基团朝向水相。该脂质膜结构的实例包括如脂质体、多层囊泡(MLV)和胶束结构的构型。
‘脂质体’是指封闭纳米球，其通过在水中形成磷脂分子的双分子层膜并封闭该双分子层膜的尾端而形成，其中磷脂分子的疏水性部分位于内部，且亲水性部分位于外部。脂质体的实例包括具有由磷脂双分子层膜形成的单层的纳米球，和具有由多个磷脂双分子层形成的多层的纳米球。由于脂质体具有该结构，因此在该脂质体的内部和外部都存在水溶液，且脂质双分子层起到了边界的作用。
‘胶束’是指两亲分子的聚集体。胶束在水性介质中具有这样一种形式，其中该两亲分子的亲脂性部分的位置朝向胶束的中心，且亲水性部分的位置朝向其外部。在该胶束中，球体的中心是亲脂性的，且外周部分是亲水性的。胶束结构的实例包括球状、层状、柱状、椭圆体、微粒体和片层结构以及液态晶体。注意该结构很难包封亲水性分子，如蛋白质和肽，其负载量为1:1000或更差。这与具有亲水性中心(源自酯官能团的取向)和疏水性外侧的胆固醇体相反。
在一些实施方案中，内部和外部可相同，其中固醇核位于外表面和内腔室上，而酯尾端在分子的假双分子层类型中交错。当乳糜微粒摄入胆固醇体时，真正亲水的外侧通过被转化且负载的乳糜微粒的载脂蛋白组分被重建，且该载脂蛋白还有助于该转化的乳糜微粒与细胞的对接。简单来说，相对于此前的努力，胆固醇体以两个阶段形成乳糜颗粒的这一过程是完全新颖且意料不到的。
有效量
在说明书中使用术语“有效量”是用来描述制剂或其它成分的浓度或量，该制剂或成分在其用途范围内的用量能够产生本发明预期的效果。该制剂或成分可用于在所治疗的疾病或状况中产生有利改变，根据所治疗的疾病或状况，该改变可为减缓、有利的生理结果、所治疗的疾病状态或状况的恢复或减轻、避免或减少状况或疾病状态发生的可能性。当结合使用制剂时，每种制剂都以有效量使用，其中有效量可包括协同量。本发明中所用的制剂量可根据制剂的性质、患者的年龄和体重以及多种可影响制剂的生物利用度和药代动力学的其它因素而变化，向患者给药的制剂量通常为每天约0.001mg/kg至约50mg/kg或更多、约0.5mg/kg至约25mg/kg、约0.1至15mg/kg、约1mg至约10mg/kg，以及此处所述其它量。为了避免疑虑，在对递送系统所增加的质量进行校正后，给予所述动物的所述制剂中成分的剂量与通过肠胃外手段给药的剂量大致相同。普通技术人员可以容易地认识到在治疗过程中可对服药日程或剂量进行改变。
术语“共同给药”被用于描述有效量的两种以上活性化合物(在该情况中为根据本发明的化合物)与另外的试剂或其它生物活性剂组合给药。尽管术语共同给药优选包括同时向患者给药两种以上的活性化合物，但只要向患者或受试者给药的化合物量能够在血液、血清或血浆中、或者在肺部组织中同时产生有效浓度，则这些化合物实际上不必在完全相同的时间或在相同组合物中给药(尽管这可以是优选的)。
活性剂
术语“活性分子”、“活性剂”或“活性化合物”应指任何在生物系统中具有活性且可被结合至此处所述的胆固醇体中的分子。本发明的胆固醇体在其较大的中性电荷的核中能够容易适应大量活性化合物，包括小分子和大分子，尤其包括在其它情况下无法有效被口服递送的化合物。这是由于负载负荷的胆固醇体在递送活性化合物时提供的独特机制(如此处所述)，其通过肠上皮细胞进入乳糜微粒，并然后进入向其给药该负载负荷的胆固醇体的患者或受试者的细胞中。这些活性分子包括在标准口服递送技术中不稳定并通常仅能以肠胃外给药的小分子，以及大分子，如蛋白质(包括糖蛋白)和多肽(如胰岛素、干扰素、hCG、C-活性蛋白、包括各种白介素的细胞因子、生长因子)，包括抗体(如多克隆抗体、单克隆抗体(如此处其它地方所述)、抗体片段(单链可变片段或scFv、抗原结合片段或Fab、3G抗体))、免疫原性多肽和寡肽的其它多肽、多核苷酸(包括DNA和RNA，如裸DNA、质粒DNA、mRNA、siRNA、shRNA、双官能shRNA、微RNA(其中包括miR-122)以及DNA和RNA的各种寡核苷酸)。质粒可以被负载进入细胞并产生荧光表达，包括但不限于本发明公开的pgWizGFP，也在本发明活性剂的范围内。许多抗感染剂，包括抗生素(如万古霉素和青霉素)和抗病毒剂和其他活性分子，特别是包括大分子抗生素以及本发明详细公开的许多抗癌剂，也可以通过本发明递送。
应注意，依照本发明的胆固醇体事实上可用于递送具有各种尺寸和分子量的任何活性分子。本发明的胆固醇体还可用于局部递送一些活性分子以提供通过患者或受试者的皮肤的较高生物利用度，其中包括局部抗生素、局部抗真菌剂、局部血小板衍生的生长因子、其它生长因子、用于牛皮癣的局部抗TNF以及例如局部疫苗和美容剂的局部递送，等等。可将多种化疗剂、抗生素和抗病毒剂结合至到本发明的胆固醇体中。根据本发明的胆固醇体特别适合这些化合物，甚至是小分子，因为通过本发明的组合物依照活性分子递送机制将化合物递送进入细胞中产生了对各种微生物，包括细菌和病毒，都十分有效的疗法。
用于本发明的其他化合物也在下文和以下实施例中描述。
术语“癌症”是指具有失去正常控制的独特特征的肿瘤细胞的增殖，其导致不受调控的生长、缺少分化、局部组织侵袭和/或转移。如本发明所用，新生物(neoplasm)包括但不限于受试者或宿主组织中细胞形态学不规则以及与相同类型组织的正常增生相比，受试者组织中细胞的病理性增生。此外，新生物包括侵袭性或非侵袭性的良性肿瘤和恶性肿瘤(例如，结肠肿瘤)。恶性新生物与良性新生物区别在于前者显示较大程度的发育异常，或细胞分化和定向的损失，并且具有侵袭和转移的性质。在本发明中术语癌症还包括耐药癌症，包括多重耐药癌症。新生物或瘤变(本发明的肿瘤裂解物可自其中衍生得到)的实例包括但不限于，癌(例如，鳞状细胞癌、腺癌、肝细胞癌和肾细胞癌)，特别是膀胱癌、骨癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌(结肠直肠癌)、食管癌、头部癌症、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈部癌症、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病，如急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、急性T细胞成淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、嗜碱细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、粒细胞性白血病、毛细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、巨核细胞性白血病、小原粒型白血病、单核细胞性白血病、中性粒细胞性白血病和干细胞白血病；良性和恶性淋巴瘤，特别是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B细胞淋巴瘤；良性和恶性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤，特别是尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神经上皮样瘤和滑膜肉瘤；中枢神经系统肿瘤(例如，胶质瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、神经节瘤、神经节神经胶质瘤、髓母细胞瘤、松果体细胞肿瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤和神经鞘瘤)；生殖系肿瘤(例如，肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、混合型小细胞和非小细胞癌、胸膜间皮瘤，包括转移性胸膜间皮瘤小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和黑色素瘤)；混合型瘤变，特别是癌肉瘤和霍奇金病；以及混合起源的肿瘤，如维尔姆斯肿瘤和畸胎癌。值得注意的是，包括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、成神经管细胞瘤和B细胞淋巴瘤在内的一些上皮肿瘤表现出自噬增加，并且是根据本发明的化合物和疗法的主要目标癌症。
术语“另外的抗癌剂”用于描述另外的化合物，其可以与一种或多种组合物共同施用，所述组合物包含根据本发明的囊泡以用于治疗癌症。这些药剂包括，例如，依维莫司、曲贝替定、Abraxane、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、恩扎妥林(enzastaurin)、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制剂、VEGFR抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、Map激酶激酶(mek)抑制剂、VEGF trap抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙替尼、尼罗替尼、decatanib、帕尼单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、诺拉曲塞、azd2171、巴他布林、奥法木单抗、扎木单抗、edotecarin、粉防己碱、卢比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利单抗(ipilimumab)、棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR1KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、vitespan、Rta 744、Sdx 102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr 311、罗米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、伊立替康、多柔比星脂质体、5'-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]二钠盐七水合物、喜树碱、PEG-标记的伊立替康、他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、缀合的雌激素、贝伐珠单抗、IMC-1C11、CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹诺酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly 10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸盐[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中x＝1至2.4]的乙酸盐、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、洛那法尼(lonafarnib)、BMS-214662、替吡法尼(tipifarnib)；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰基苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨鲁米特、arnsacrine、阿那格雷、L-门冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、格列卫、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米磷酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、13-顺式-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脱氧核苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、光辉霉素、长春碱、长春瑞滨、托泊替康、雷佐生、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠单抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、伊立替康、托泊替康、多柔比星、多西紫杉醇、长春瑞滨、贝伐单抗(单克隆抗体)和艾比特思、不含克列莫佛的紫杉醇、埃坡霉素B(epithilone B)、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、PTK787/ZK 222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、达贝泊汀、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、唑来磷酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组氨瑞林、PEG化的干扰素α-2a、干扰素α-2a、PEG化的干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-门冬酰胺酶、来那度胺、吉妥珠单抗、氢化可的松、白介素-11、右丙亚胺、阿仑单抗、全反式维甲酸、酮康唑、白介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲泼尼龙、替伊莫单抗、雄激素类、地西他滨、六甲密胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、依替膦酸二钠(editronate)、米托坦、环孢菌素、柔红霉素脂质体、Edwina-门冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞匹坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲泼尼龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、聚乙二醇非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀和阿法达贝泊汀、伊匹单抗(ipilumumab)、维罗非尼(vemurafenib)等。可以组合使用的其他抗癌剂包括免疫疗法，例如伊匹单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)。这些化合物可以与含有本发明组合物的囊泡分开给药，或者在一些情况下，可以与一种或多种大分子和本发明另外描述的任选另外的化合物一起包含在本发明的囊泡中。
在本发明中注意到，相比于通过现有技术方法递送的相同活性分子，向胆固醇体中加入活性分子并将其给药至患者或受试者将在相同剂量水平产生更大的疗效。实际上，将负载负荷的胆固醇体包装到乳糜微粒中的机制使得活性分子在其实际活性位点(细胞中)的量或浓度变得大得多，因而导致比现有技术方法大得多的疗效。在很多例子中，根据本发明被递送到细胞中的活性剂的量或浓度是通过现有技术(现有)手段递送的活性剂浓度的至少2倍，通常为10倍到1000倍。
适于包封在胆固醇体中的肽
在优选的实施方案中，本发明提供用于口服或细胞内使用的负载肽的胆固醇体药物组合物，其包含通常选自亲水肽的肽或蛋白质，所述亲水肽包括但不限于胰岛素、干扰素α、干扰素β、人生长激素、催乳素、催产素、降钙素、牛生长激素、猪生长激素、葛瑞林、艾塞那肽、延伸蛋白-4(extendin-4)、GLP-1、任何GLP-1激动剂、PYY36、胃泌酸调节素、GLP-2和胰高血糖素，其中任何一种都被本发明另外描述的胆固醇酯包封。在另一个实施方案中，蛋白质是胰岛素促分泌素。在另一个实施方案中，蛋白质是GLP-1。在另一个实施方案中，蛋白质是GLP-1类似物。在另一个实施方案中，蛋白质是GLP-1模拟物。在另一个实施方案中，蛋白质是肠降血糖素模拟物。在另一个实施方案中，蛋白质模拟GLP-1肠降血糖素。在另一个实施方案中，蛋白质是GLP-2。在另一个实施方案中，蛋白质是GLP-2类似物。在另一个实施方案中，蛋白质是GLP-2模拟物。可施用该组合物以改善器官和组织(例如胰腺或肝脏)的结构或功能，以增加或启动哺乳动物的生长或在会受益于胰岛素治疗的那些个体中施用胰岛素。
胰岛素、GLP-1和用于实施本发明的组合物
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物的胰岛素是人胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是重组胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是重组人胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是牛胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是猪胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是胰岛素的金属复合物(例如胰岛素的锌复合物、鱼精蛋白锌胰岛素或球蛋白锌胰岛素)。
在另一个实施方案中，胰岛素以六聚体的形式包含在本发明中。在另一个实施方案中，胰岛素被分类为快速作用，其中所述分类包括例如胰岛素类似物门冬胰岛素、赖脯胰岛素和谷赖胰岛素。
在另一个实施方案中，胰岛素被分类为短效胰岛素，其中所述分类包括常规胰岛素。
在另一个实施方案中，胰岛素被分类为长效胰岛素，所述分类包括例如甘精胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素。
在另一个实施方案中，胰岛素是慢胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是半慢胰岛素(semilente insulin)。在另一个实施方案中，胰岛素是特慢胰岛素。
在另一个实施方案中，胰岛素是NPH胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是甘精胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是赖脯胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素是门冬胰岛素。
在另一个实施方案中，胰岛素是任何上述类型胰岛素中的两种或更多种的组合。在另一个实施方案中，胰岛素是本领域已知的任何其他类型的胰岛素。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在另一个实施方案中，一种或多种上述类型的胰岛素可任选地与胰岛素代谢抑制剂组合，当胰岛素从体细胞内的递送装置释放时，所述抑制剂能够阻止胰岛素的细胞内代谢。
在另一个实施方案中，一种或多种上述类型的胰岛素可以与一种或多种上述肽或优选实施方案中未列出的肽组合。本领域已知的任何肽都在本发明的范围内。
在代谢综合征中，存在已知的所谓的回肠激素分泌，其调节营养摄入、微生物组活动和代谢平衡之间的平衡。因此，回肠激素包括但不限于GLP-1，肠高血糖素，C末端甘氨酸延伸的GLP-1(7-37)，(PG(78-108))；介入肽-2(PG(111-122)酰胺)；GLP-2(PG(126-158)，GRPP(PG(1-30))，胃泌酸调节素(PG(33-69)和其他待分离的肽级分，PYY(PYY 1-36)和(PYY3-36)，胆囊收缩素(CCK)，胃泌素，肠-胰高血糖素和促胰液素。这些肽中的一种或多种的任何一种或任何组合适合于包封在本发明的胆固醇酯中。
在另一个实施方案中，本发明的负载肽的胆固醇体包含一种或多种胰岛素和一种或多种GLP-1，其以任何摩尔比有效用于治疗有需要的患者。
在另一个实施方案中，本发明的负载肽的胆固醇体包含一种或多种胰岛素和一种或多种胰高血糖素分子，其以任何摩尔比有效用于治疗有需要的患者。
在另一个实施方案中，本发明的负载肽的胆固醇体提供了治疗受试者的糖尿病的方法，包括口服给予受试者药物组合物，所述药物组合物包含胰岛素和任选的其他肽和任选的一种或多种所述物质的细胞内代谢抑制剂，从而治疗糖尿病。
在另一个实施方案中，所述负载肽的胆固醇体包含一种或多种胰岛素和一种或多种GLP-1，任选地含有细胞内胰岛素代谢抑制剂，并任选地含有细胞内GLP-1代谢的抑制剂。在具有胰岛素和GLP-1的胆固醇体的芯内含有的任何GLP-1细胞内代谢抑制剂和任何胰岛素细胞内代谢抑制剂均属于本发明的范围。
在一个优选的实施方案中，GLP-1细胞内代谢的抑制剂是DPP-4抑制剂，例如西他列汀、沙格列汀、利格列汀，对于本领域技术人员来说显而易见的是，任何DPP-4抑制剂都在本发明范围内。胰岛素细胞内代谢的任何抑制剂都在本发明的范围内。在优选的实施方案中，胰岛素细胞内代谢的抑制剂将是胰岛素降解酶(IDE)的抑制剂，其通常是锌金属蛋白酶的抑制剂，如Leissring在2010年所公开的(17)。
Leissring公开了IDE的新型肽异羟肟酸抑制剂。所得化合物的效力比现有抑制剂高约10(6)倍，无毒，以及与常规锌-金属蛋白酶相比，对于IDE具有惊人的选择性。这些IDE抑制剂通过涉及内化胰岛素分解代谢降低的机制增强胰岛素信号传导。IDE的活性位点的独特结构以及我们的抑制剂的作用模式表明，可以开发出与常规锌-金属蛋白酶交叉反应最低的抑制剂。该组公开的适用于本发明的一种特定形式的IDE抑制剂是ML345(18)。
在另一个实施方案中，所述负载肽的胆固醇体包含甘精胰岛素和利西拉肽以及任选的体细胞内代谢抑制剂。抑制细胞内酶降解并因此适合包含在该制剂中的一般抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂。
在另一个实施方案中，所述负载肽的胆固醇体包含杜拉鲁肽。
在另一个实施方案中，所述负载肽的胆固醇体包含索马鲁肽。
在另一个实施方案中，所述负载肽的胆固醇体包含利拉鲁肽。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物中使用的胰岛素的量在人中为0.5-3单位(u)/kg。在一个实施方案中，用于测量本发明的方法和组合物中的胰岛素的单位是USP胰岛素单位。在一个实施方案中，用于测量胰岛素的单位是毫克。在另一个实施方案中，一个USP胰岛素单位相当于34.7mg胰岛素。
在另一个实施方案中，用于人类患者的胰岛素量为0.1-1.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.2-1.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.3-1.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.5-1.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.1-2.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.2-2.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.3-2.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.5-2.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为0.7-2.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为1.0-2.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为1.2-2.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为1.0-1.2u/kg。在另一个实施方案中，所述量为1.0-1.5u/kg。在另一个实施方案中，所述量为1.0-2.5u/kg。在另一个实施方案中，所述量为1.0-3.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为2.0-3.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为1.0-5.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为2.0-5.0u/kg。在另一个实施方案中，所述量为3.0-5.0u/kg.
在另一个实施方案中，本发明提供治疗受试者的糖尿病的方法，包括口服给予受试者药物组合物，所述药物组合物包含胰岛素和任选的其他肽和任选的一种或多种所述物质的细胞内代谢抑制剂，从而治疗糖尿病。
在一些实施方案中，将负载负荷的囊泡置于胶囊中，并进一步将胶囊表面进行肠溶包衣以防止药物组合物在胃肠道的胃酸中降解。
在一些实施方案中，负载肽的胆固醇体的表面层在约2至约14的pH范围内保持完整。
在其他实施方案中，负载负荷的胆固醇体是单层囊泡，其直径为约250nm至多于10,000nm(10微米)，约10nm至约1000nm，通常为约50nm至约750nm，约1000至约2500nm，约200至约300nm，取决于材料是经受挤出步骤还是未挤出使用。因此，应注意，当活性分子较大时使用较大的胆固醇体，而当活性分子较小时使用小的胆固醇体。
在一个实施方案中，蛋白质是重组蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是胰岛素。在另一个实施方案中，蛋白质是胰高血糖素。在另一个实施方案中，蛋白质是干扰素γ。在另一个实施方案中，蛋白质是干扰素α。在另一个实施方案中，蛋白质是干扰素β。在另一个实施方案中，蛋白质是促红细胞生成素。在另一个实施方案中，蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。在另一个实施方案中，蛋白质是本领域已知的任何其他蛋白质。
在另一个实施方案中，蛋白质是生长激素。在一个实施方案中，生长激素是垂体生长激素(somatotropin)。在另一个实施方案中，生长激素是胰岛素生长因子-I(IGF-I)。在另一个实施方案中，生长激素是本领域已知的任何其他生长激素。
在另一个实施方案中，蛋白质的分子量(MW)为1-50千道尔顿(kDa)。在另一个实施方案中，MW为1-450kDa。在另一个实施方案中，MW为1-400kDa。在另一个实施方案中，MW为1-350kDa。在另一个实施方案中，MW为1-300kDa。在另一个实施方案中，MW为1-250kDa。在另一个实施方案中，MW为1-200kDa。在另一个实施方案中，MW为10-50kDa。在另一个实施方案中，MW为15-50kDa。在另一个实施方案中，MW为20-50kDa。在另一个实施方案中，MW为25-50kDa。在另一个实施方案中，MW为30-50kDa。在另一个实施方案中，MW为35-50kDa。在另一个实施方案中，MW为1-100kDa。在另一个实施方案中，MW为1-90kDa。在另一个实施方案中，MW为1-80kDa。在另一个实施方案中，MW为1-70kDa。在另一个实施方案中，MW为1-60kDa。在另一个实施方案中，MW为10-100kDa。在另一个实施方案中，MW为15-100kDa。在另一个实施方案中，MW为20-100kDa。在另一个实施方案中，MW为25-100kDa。在另一个实施方案中，MW为30-100kDa。在另一个实施方案中，MW为10-80kDa。在另一个实施方案中，MW为15-80kDa。在另一个实施方案中，MW为20-80kDa。在另一个实施方案中，MW为25-80kDa。在另一个实施方案中，MW为30-80kDa。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在另一个实施方案中，MW小于20kDa。在另一个实施方案中，MW小于25kDa。在另一个实施方案中，MW小于30kDa。在另一个实施方案中，MW小于35kDa。在另一个实施方案中，MW小于40kDa。在另一个实施方案中，MW小于45kDa。在另一个实施方案中，MW小于50kDa。在另一个实施方案中，MW小于55kDa。在另一个实施方案中，MW小于60kDa。在另一个实施方案中，MW小于65kDa。在另一个实施方案中，MW小于70kDa。在另一个实施方案中，MW小于75kDa。在另一个实施方案中，MW小于80kDa。在另一个实施方案中，MW小于85kDa。在另一个实施方案中，MW小于90kDa。在另一个实施方案中，MW小于95kDa。在另一个实施方案中，MW小于100kDa。
上述一些蛋白质的分子量如下：胰岛素-6千道尔顿(kDa)；胰高血糖素-3.5kDa；干扰素，28kDa，生长激素-21.5-47kDa；人血清白蛋白-69kDa；促红细胞生成素-34kDa；G-CSF-30-34kDa；曲妥珠单抗150kDa；过氧化氢酶280kDa。因此，在一个实施方案中，这些蛋白质的分子量适合于通过本发明的方法给药。
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物用于施用人血清白蛋白。在一个实施方案中，人血清白蛋白不被认为是药学活性成分；然而，它可以在本发明的上下文中用作可以优先结合白蛋白的活性成分的治疗上有益的载体。
每种类型的蛋白质代表本发明的单独实施方案。
用于本发明的负载的胆固醇酯囊泡的途径
在一个实施方案中，本发明提供胆固醇酯囊泡组合物，其包含活性药剂，该分子在优选的实施方案中是大分子，更常见的是肽(“负载肽的胆固醇体”)，例如药物活性剂(该术语包括治疗和诊断剂)，其由中性电荷表面层包封，所述中性电荷表面层包含一种或多种胆固醇酯，其由胆固醇和一种或多种饱和或不饱和脂肪酸产生。根据本发明的胆固醇体包封一种或多种不同大小和重量的不同活性药剂分子，尤其是使用现有技术方法难以通过口服途径递送的药物活性分子，包括脂质体、聚乙二醇化、树枝状大分子、阳离子纳米颗粒等。
图1A，表1：公开了胆固醇酯囊泡和替代递送技术的性质的对比分析。
使用胆固醇体进行口服吸收和细胞内递送
根据本发明，所述负载肽的胆固醇体在给予哺乳动物、患者或受试者后具有特定的组成，能够完整地结合至乳糜微粒中(该过程中的具体步骤在体内通过肠道肠上皮细胞独特地进行)以产生含有所述胆固醇体囊泡及其完整有效负荷的乳糜微粒。然后，所述载有负荷的乳糜微粒被胃肠上皮细胞释放到淋巴管中，随后通过淋巴进入胸导管进入血液。在通过心脏行进之后，所述负载有囊泡的乳糜微粒可接近所有接受所述动脉血液供应的细胞，尽管只有表达乳糜微粒对接受体的细胞才能接近所述内容物。在乳糜微粒与这些细胞的受体介导的对接后，胆固醇体及其有效负荷被完整地递送到所述细胞中，其中所述胆固醇体通过胆固醇水解酶的作用被分解以破坏胆固醇和脂肪酸之间的键，从而在膜内部释放包封的活性分子进入所述细胞的细胞质。本发明的影响是直接在细胞内递送口服给药的活性分子以实现治疗或诊断。
当用所述胆固醇酯包封时，本发明的药物组合物和口服治疗方法使得能够乳糜微粒靶向地细胞内递送多种活性成分，所述活性成分在未受保护的状态下由于体内降解而无效。例如，本发明能够有效递送可用于治疗如本发明所定义的炎症相关代谢紊乱的大分子、用于体内特定部位的疫苗、用于在核糖体和细胞核中起作用的细胞内的遗传物质、以及甚至在一些具体实施方案中在可能通过皮肤屏障的皮肤上局部递送。本发明还公开了使用根据本发明的组合物治疗疾病状态和/或病症的其他方法。事实上，任何药学活性分子都可以以本发明的方式有效地递送到患者或受试者的靶细胞中，以及有效治疗的结果是现有技术的递送方法所无法比拟的。通过将根据本发明的组合物给予有需要的患者来治疗疾病状态和病症的方法代表了根据本发明的另外的实施方案。用于根据本发明的治疗方法的组合物的有效剂量可以为每天少至1微克或更少，至1克或更多。其他有效剂量将取决于患者或受试者的大小和年龄，患者的总体健康状况以及分子在许多其他事实中的效力。预期剂量范围小于约0.0001mg/kg/天至约100mg/kg/天或更多，更常使用约0.001mg/kg/天至约25mg/kg/天的范围。
在一些实施方案中，药物组合物是单层囊泡，其中囊泡总重量的约10％至约98％、约20％至约96％、通常约50％至约96％、通常约90％至约96％是分子或所述药物活性剂的重量。
在本发明中，活性分子(优选包括药物活性剂)与一种或多种胆固醇酯的质量比为约4:96至约96:4，约10:90至约96:4，通常约10:90至约96:4，通常约20:80至约90:10，约20:80至约50:50，约50:50至约96:4，约90:10至约96:4。
在本发明中，药物组合物在结合至所述胆固醇体囊泡中时不会改变，以及在所述体细胞内通过胆固醇酯水解酶释放时，所述药物组合物与活性剂具有相同的活性并且相同。
在另一个实施方案中，使用胆固醇酯相互交错的相互交错交替的烷基链模型，通过基于药物活性剂-胆固醇酯官能团相互作用选择一种或多种胆固醇酯，从而使活性分子(包括药物活性剂)与一种或多种胆固醇酯的质量比最大化。下文的实施例2描述了确保最佳药学活性剂-胆固醇酯官能团相互作用的制剂标准。
在另一个实施方案中，药物组合物是通过以下方法制备的胆固醇体囊泡，所述方法包括使一种或多种胆固醇酯在乙醚中反应，在真空下除去所得有机相并引入含有高浓度待包封的肽的水相。
在另一个实施方案中，胆固醇酯基于它们与十二指肠的肠上皮细胞表面上的胆固醇转运蛋白的反应性和在肠上皮细胞中直至结合至乳糜微粒中保持完整的能力来选择。
在根据本发明的实施方案中，胆固醇酯通过以下方法得到：将胆固醇用C6至C36饱和或不饱和脂肪酸、通常为C8至C26脂肪酸、甚至更通常为C8-C22脂肪酸或C8-C14脂肪酸酯化。在一些优选的实施方案中，胆固醇酯选自肉豆蔻酸胆固醇酯、月桂酸胆固醇酯、十二烷酸胆固醇酯、棕榈酸胆固醇酯、花生四烯酸胆固醇酯、山嵛酸胆固醇酯、亚油酸胆固醇酯、亚麻酸胆固醇酯、油酸胆固醇酯和硬脂酸胆固醇酯。
根据本发明的胆固醇体在分子的递送系统中是独特的。本发明人第一次成功地将蛋白质和其他分子和化合物伪装成脂肪酸，脂肪酸是本领域公知的作为食物的膳食脂质。最具体地，所选择的口服摄取材料是膳食胆固醇酯。令人惊讶的是，胆固醇酯提供了具有以下性质的独特的胆固醇酯囊泡，这些性质使被胆固醇体包封的产品(尤其是在其它情况下无法真正被成功递送到患者中的大分子)与脂质体或任何其它囊泡区分开：
1.递送方式和系统的所有成分材料均是常见的膳食成分，且在多数应用中，这些物质每天的总剂量低于来自食物的量。
2.包封到胆固醇体中的操作温度通常为35至45摄氏度，而这是使体循环形式的肽和蛋白稳定的最佳温度。
3.所述递送方式将提供所有有利的方面，而无需考虑分子尺寸、电荷、结合或降解途径。
4.胆固醇体包封的蛋白质显示出完全穿过Caco2肠上皮细胞屏障，并完整地进入乳糜微粒中。
5.绕过了肝脏以及与之相关的首过清除途径。
6.在经口摄取一直到胞内摄取的全过程中，胆固醇体和含有该胆固醇体的乳糜微粒在穿过细胞膜时都为分子提供保护。
7.与细胞对接(Docking)；定量的细胞内负载；完全穿过细胞膜屏障。
8.通过胆固醇酯水解酶(一种内源性途径)在细胞质中卸下包封的内容物。
9.有效负荷分子在胞内位点有较高胞内浓度，而胆固醇体不使用内体摄取途径。
10.当进入天然形成的乳糜微粒时，胆固醇体及其包封的内容物分布到所有细胞中。
尽管一些递送系统可实现这10个特征中的一个或少量，但没有其它的递送系统能够实现所有这些宽泛的有利性质，尤其是当该递送系统使得此前无法被吸收的蛋白质能够被口服使用，并不改变有效负荷的分子且基本上对任何分子或化学化合物都可使用时。胆固醇体是第一种能够被用于任何分子的胞内递送系统。事实上，胆固醇体至少对大分子像对小分子一样有效，其中该大分子尤其包括蛋白质、肽、多核苷酸(RNA和DNA，例如包括裸DNA、质粒DNA、干扰RNA或“RNAi”(其中包括小型干扰RNA或“siRNA”)、小型发夹“shRNA”、双功能shRNA、微RNA和各种DNA和RNA的寡核苷酸)和大分子抗生素。
由于向患者或受试者的细胞内靶标递送活性分子的独特机制，本发明的负载负荷的胆固醇体能够将负载物(即，活性大分子)递送至患者或受试者(向该患者或受试者给药该组合物，优选口服)的细胞内，其浓度达到当以不含胆固醇体的形式提供时(即通过常规药物递送方式，包括在脂质体中递送)的至少2倍。在多数实施方案中，本发明将活性分子递送到细胞内的浓度为当以不含胆固醇体形式提供(递送至细胞内)时的至少10倍、25倍、50倍、100倍、250倍、500倍和1000倍或更多倍。
由于相对于用于分子和化学化合物递送的现有技术，胆固醇体是新颖的，发明人向读者提供了详细的比较数据来说明为何现有技术没有公开任何类似的系统。
在这些比较之后，将提供非限制性实例。
通常，胆固醇在膜中以及在脂质代谢中具有重要的结构功能。其是胆汁酸、维生素D和类固醇激素(糖皮质激素、雌激素、黄体酮、雄激素和醛固酮)的生物合成前体。此外，其有助于中枢神经系统的发育和运作，并且其在信号传导和精子发育方面具有主要功能。发现其与特定的膜蛋白或蛋白脂(‘刺猬’蛋白)共价相连，这在胚胎发育中具有重要功能。
胆固醇酯，优选具有连接到羟基的长链脂肪酸(通常通过含有至少8个至26个碳原子的脂肪酸制备)，比游离胆固醇的极性小得多，并且是用于在血浆中的传输以及作为生物惰性储存(去毒)形态的优选形式。它们不参与生物膜，而是包装成为胞内脂质颗粒。
当需要用于膜形成和脂蛋白形成时，动物中的胆固醇酯水解酶从酯形式释放胆固醇和游离脂肪酸。它们还为肾上腺细胞中的激素合成提供胆固醇。已确定很多胆固醇酯水解酶，包括羧酸酯水解酶、溶酶体酸胆固醇酯脂肪酶、激素敏感性脂肪酶和肝细胞溶质胆固醇酯水解酶。这些酶位于不同组织和细胞器中，并具有多种功能。
发明人公开了一种新型递送技术，其将分子包封到被称为胆固醇体的胆固醇酯颗粒中，并且当该颗粒经口被肠道细胞吸收后，其进入乳糜微粒中以通过淋巴运输被递送至所有体细胞。当该囊泡从乳糜运输微粒中被细胞摄取后，胆固醇酯水解酶卸下该颗粒并在胞内位点释放分子。
本申请中胆固醇体结构的相关背景信息可见于2007年3月20日递交的、名称为“药物递送方式”的美国专利申请文件20070225264。
此处所用的相互交错(interdigitation)的原理为本领域技术人员已知。例如参见Yeagle,The Structure of Biological Membranes(CRC Press 2010)。
“乳糜微粒”为非常大的、非均质、富含脂质的颗粒，其直径在约750至约40,000nm的范围内。它们在胃肠道的肠上皮细胞中形成，并具有通过血流中的循环向细胞传输膳食脂肪和脂溶性维生素的功能。所分泌的乳糜微粒的尺寸不均匀性取决于脂肪吸收速率、所吸收的脂肪的类型和量。当胆固醇体非常大时，所得的包含这些大型胆固醇体的乳糜微粒也可较大。
“胆固醇体”在胃肠道的不利条件中稳定，具有较大的设计灵活性，且对多种分子呈现出较大的包封效率，并具有易于制备的优点。在图1A表1中强调了这些有利的胆固醇体的性质，其比较了多种递送系统。胆固醇体与脂质体之间的结构差异使得胆固醇体具有不同的物理和化学性质，并因此使得它们在希望的性质和功能方面具有优越性。例如，已显示胆固醇体在2至13的较宽pH范围内稳定。相反，根据2005年在Journal of Molecularstructure中一篇描述脂质体的综述文章中所述，“由于脂质体对胃液(pH 1.9)、消化道中的酶以及肠道中的胆汁酸(pH 8)的抵抗力较差，它们的经口给药是无效的。”胆固醇体抗pH降解，并因此能够被用作分子经口递送的首选方式，这是本发明的一个尤其新颖的方面。
“负载负荷的胆固醇体”是指包封有药物活性剂(特别是大分子)并将该试剂主要(尽管并不必一定是排他性的)包含在胆固醇体囊泡的芯中的胆固醇体。
其次，基于胆固醇酯的相互作用的结构特征产生经计算与PEG表面相似的静电表面性质，这被脂质体用以在血液系统带来更长时间。这使得胆固醇体中所含的药物或分子在体内停留时间更长，通常这是药物递送系统的优点，但如果分子无法从药物递送囊泡中释放则不一定是优点。
关于这一点的证据是，Zeta电势测量显示胆固醇体具有中性表面。在一种制剂中，胆固醇体具有-14的Zeta电势测量值，这是典型的未负载形式的胆固醇体自身的中性电荷。Zeta电势的中性电荷边界是指，具有约-40至+40，通常约-20至约+20的Zeta电势，通常约-40至+10、-5至+5或约0。对中性表面电荷的需要导致在其它类型的制剂中使用PEG。在各发明的实施方案的一些比较中，胆固醇体接近PEG的中性表面。
胆固醇体的结构修饰是基于改变酯的摩尔比，这造成不同的内表面和外表面性质，并且在胆固醇体中，这些性质并不是由机体基于亲水/疏水隔离(sequestration)来限定的(如在脂质体以及其它现有技术中的递送方式中那样)，并因此更易于限定和制造(尺寸受到超声的影响、通常受温度影响、通常受pH影响的证据(中性pH的水溶液在用于包封的分子上具有不同电荷，这可影响它们限定脂质囊泡尺寸的能力))。在以下图1A表1中总结了所有这些有利性质，并将其与其它递送系统比较。
如下面的图1A表1所示，胆固醇体与其它递送方式的比较证实，在所有种类中，胆固醇体具有优势，或至少效果相当。该比较的一个尤其重要的方面在于，几乎所有分子都可被包封到胆固醇体中，而不会对分子自身产生改变。其它递送系统不具有该特征，它们趋于对分子自身具有特异性。设计灵活性是药物递送系统的一个有利性质，而本发明明确地显示出了这一点。
图1A，表1
胆固醇体与其他常见药物递送方式的性质的比较
在上面的图1A表1中，合成聚合物通常指的是诸如PEG化的技术。载体蛋白质是指附着的生物分子，例如病毒载体。聚乙二醇化和载体蛋白构建体都是静脉内给药的，以及像脂质体一样，如果口服给药则不会被吸收，主要是因为它们在胃肠道中被降解。
肽口服吸收和有利的相关性质
虽然不受理论的限制，但本发明使得口服递送包封分子的制剂手段成为可能，在优选的实施方案中，将一种或多种肽或蛋白质包封在胆固醇酯囊泡中，所述胆固醇酯囊泡通过分子识别进入GI肠上皮细胞、被摄取、结合到乳糜微粒中，从而在通过胃肠道肠上皮细胞进入乳糜微粒期间完全保护分子的完整性，然后进入淋巴系统、血液和穿过体细胞膜。本发明公开的制剂是稳定的，以及在其被带入体细胞之前不释放活性成分。本发明的商业实施方案(称为胆固醇体)的特征包括以下内容：
1)通过特定的脂肪酸转运蛋白介导的摄取而完全通过Caco2肠上皮细胞屏障而无内体，然后将完整的囊泡插入乳糜微粒；
2)完全通过非肠上皮细胞的细胞膜屏障而没有内体，但通过胆固醇酯水解酶从囊泡中释放；
3)一种类似于特洛伊木马的细胞内递送方法，其中递送方法在很大程度上避免了内体摄取并产生在细胞质中游离的有效负荷；
4)相对独立于活性分子大小、电荷、结合或降解途径的高的口服生物利用度和向体细胞内的递送和摄取，因此在一些应用中，负载肽的胆固醇体的表面具有中性电荷；
5)活性成分在肝脏周围的淋巴管中循环-一种口服递送方法，其避免所谓的首过肝脏摄取，但最终到达肝脏；和
6)通过载脂蛋白附着于乳糜微粒表面促进肽向细胞内的递送，所述乳糜微粒能够与细胞和细胞内负荷对接，然后在胆固醇酯水解酶的作用下将包封的分子在细胞质中释放。
因此，根据本发明的负载肽的胆固醇体是将一种或多种肽(即优选实施方案中的活性分子)递送至被给予(优选口服)本发明组合物的患者或受试者的细胞内，使得细胞内浓度至少2倍于不在胆固醇体中给药时提供的(即，通过常规药物递送方式，包括在脂质体中递送)浓度的唯一可行方法。在大多数实施方案中，本发明在口服使用后将活性分子递送至细胞内，达到在不使用胆固醇体的情况下提供的浓度的至少10倍，25倍，50倍，100倍，250倍，500倍和1,000倍或更多的浓度。基于口服至肠胃外AUC(曲线下面积)计算，根据本发明的优选组合物的生物利用度为50％至约100％(例如99.9+％)、55％至99.9％、60％至99.5％、65％至99％、70％至98％、75％至95％、50％至95％等。因此，本发明的组合物(特别是口服组合物)提供了出人意料的高生物利用度。
因此，本发明提供了一种包封迄今为止无法容纳的各种大小和分子量的分子的方法(本身是意想不到的结果)，以及无论大小如何，本发明的组合物能够将活性分子以比现有技术高得多的浓度递送至细胞中的靶标。因此，根据本发明的可以给予患者的活性化合物的剂量通常小于使用传统组合物的剂量，并且少至使用不基于本发明的标准口服组合物所需要的剂量的1％至50％，通常为5％至50％或10％至25％。
与注射相比口服使用后的生物利用度
在药代动力学并且特别是药代动力学比较中，生物利用度是量化(通常是口服)吸收的方式。生物利用度是未改变药物的给药剂量的达到全身循环的分数，其是药物的主要药代动力学特性之一。通常，将药代动力学比较表示为在口服剂量后的曲线下面积(AUC)比在相同剂量的静脉内(IV)给药后的AUC。根据定义，当静脉内施用药物时，其生物利用度为100％。然而，当通过其他途径(例如口服)施用药物时，其生物利用度通常降低(由于不完全吸收和/或首过代谢)，或者它可能因患者而异。生物利用度是药代动力学中必不可少的工具之一，因为在计算非静脉内给药途径的剂量时必须考虑生物利用度。
在本申请中，发明人将表明，口服胆固醇体包封的胰岛素具有令人惊讶的高于先前用任何口服递送系统所见的生物利用度。在另外的实验中，当给予FITC胰岛素胆固醇体时，器官和组织的细胞含有高许多倍的FITC浓度。
胆固醇体自行缓慢进入细胞
被静脉内给药、不在乳糜微粒中的胆固醇体不会与细胞对接，因为它们缺乏将乳糜微粒与需要脂质的细胞对接所必需的表面载脂蛋白。然而，细胞膜确实具有脂肪酸的转运蛋白，其明显地吸收胆固醇体(参见MCF-7细胞数据)。因此，肠胃外施用胆固醇体确实允许对转运蛋白具有亲和力的一些胆固醇酯囊泡的细胞内摄取。如果口服给予这些相同的胆固醇体，并且将胆固醇体包封在乳糜微粒中呈递给细胞，则细胞内摄取要大得多。
胆固醇体本身进入体细胞，并且有效负荷完整
从实施例3中的MCF-7细胞的图像可以理解，单独的胆固醇体几乎总是存在明显的细胞摄取分子，因为在大多数体细胞上存在识别选择作为囊泡组分的胆固醇酯的表面转运蛋白。
由于向乳糜微粒中加入APO-B而与体细胞对接
当负载负荷的胆固醇体(其含有活性分子有效负荷)的乳糜微粒与需要胆固醇和甘油三酯的细胞对接并将包含所述胆固醇体的所述组分转移到细胞中而不需要在内体中的任何二次包封时，实现了包封在胆固醇体内并结合至乳糜微粒中的大分子的细胞内递送。在本发明人的观点中，用胆固醇体包封的大分子仍然可以形成内体，但是它并不是在摄取胆固醇酯胆固醇体期间正在进行的常规过程。
乳糜微粒仅在胆固醇体上扩大细胞摄取
胆固醇体在口服吸收后明显使得细胞摄取量更大，因为它们首先进入乳糜微粒中。然后乳糜微粒选择性地将脂质递送到有该需求的细胞中。有需要的细胞表达对接位点蛋白，该蛋白之后可与乳糜微粒表面上的APO-B相连，因而发生对接，并从乳糜微粒释放到该细胞的细胞质中。此外，由胆固醇体形成的乳糜微粒在到达每个细胞的表面上具有载脂蛋白识别性质。当乳糜微粒与细胞接触时，它们与表达表面蛋白的细胞对接，并因而要求运送包括甘油三酯和胆固醇酯的脂质。当从细胞分泌出脂肪酶后，所述脂质，如甘油三酯和胆固醇体，与其包封的负载物一起被细胞摄入。
相反，当脂质体被注入血液中时，不会期望它们与细胞对接，因为它们缺少用于与需要脂质的细胞对接的Apo E组分。脂质体在药物递送中用于使分子产生延长的血浆释放特性。此外，在有利条件下，当脂质体缓释系统中包封的药物进入细胞时，则期望存在负载物的胞内递送，而这是由于药物被从负载脂质体中释放后其自身的性质。
在细胞内卸下胆固醇体、细胞应答和胞吐作用途径
在这里，我们讨论胆固醇酯水解酶在胆固醇酯通过细胞膜后应用于胆固醇酯，因为该酶的作用是将胆固醇核与载体脂肪酸分离。当该酶作用于胆固醇酯时，大分子从胆固醇体中释放出来。一旦从递送系统中解放出来，下一步就是细胞内的药物作用。
细胞内的游离肽可被代谢，因此如果应有任何肽留下来进行胞吐作用和持续循环，就必须抑制这种代谢。对于本发明实践中的一些分子，例如胰岛素，本领域技术人员必须在胆固醇体囊泡中包含代谢抑制剂以防止该物质的过量细胞内代谢。
举例来说，如果目标是产生细胞外作用，则必须停止或减慢细胞内代谢，因此细胞选择游离分子的胞吐作用。这与胰岛素及其细胞内代谢特别相关，因为那是清除途径，细胞通过代谢迅速清除胰岛素。
我们进行了实验以证明蛋白酶抑制剂可以阻止胰岛素的细胞内代谢，从而有利于游离胰岛素的胞吐作用。
负载肽的胆固醇体制剂
以几个阶段形成胆固醇体，首先通过将选定的胆固醇酯对溶于有机溶剂(如醚)中，然后除去有机溶剂，并接着加入含有待包封的分子的水性成分，进行超声以形成单层膜，并在水中分子周围产生亲水的且相对不带电的中空袋。
所有配制阶段都是在严格限定的温度下在水浴中进行，该温度是基于酯的最低熔融温度。操作温度是选择胆固醇酯对的首要条件，因为所选择的酯对的熔融温度必须等于或低于会使选定用于包封的分子降解的温度。考虑到温度限制，必须选择在低于45℃的温度下形成双层膜的胆固醇酯对，而这是作为本发明的一部分公开的很多实施例选择肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的基础。
图1描绘了月桂酸胆固醇酯/肉豆蔻酸胆固醇酯(1:1摩尔浓度)胆固醇体的三维模型。胆固醇体可以有各种各样的大小。活性成分负载可以通过计算确定，例如优选实施例中所示的那些。
一旦添加水性分子或构建体，将混合物超声处理直至形成混浊溶液，从而使未溶解的酯的废物最小化，超声处理为单层囊泡形成提供能量。含水组分在加入之前也保持在目标温度，以及如前所述对于大多数肽、蛋白质和基因，可以耐受的最高温度仅为约45-50℃。在一些条件下，本发明人惊奇地发现胰岛素在高达55℃时保持稳定
然后过滤溶液并保存滤液用于挤出以符合尺寸。然后将样品储存在冰箱中，在那里它保持稳定超过30天。
新包封的分子被单层胆固醇酯囊泡包围，以及在中空口袋内，保护包封的分子免于与胃肠道的恶劣环境接触，以及远离酶和免疫系统的细胞。里面的分子保持不变。因此，提供根据本发明的负载负荷的胆固醇体是一种容易的常规任务。
胆固醇酯囊泡构建(图1)
胆固醇体的外膜由胆固醇酯组成，胆固醇酯排列形成基于胆固醇酯的脂质囊泡，通常在多种胆固醇酯具有相同或相似的分子长度的情况下，以便在由所述胆固醇体包封的大分子周围形成均匀的胶囊。胆固醇酯可以具有不同的长度，只要它们是共溶的，这将允许它们聚集在一起形成具有与脂质囊泡的总尺寸相关的相当大的中空芯的囊泡。事实上，一些配置的芯排量远远超过整个囊泡的80％，这提供了水溶性分子如胰岛素的有益的高负载。
这是基于不同摩尔分数的不同酯能够以最小能量构象共存和聚集的能力，其中囊泡的形成由胆固醇酯的性质及其相对摩尔分数决定。
图1中示出了分子(在这种情况下，胰岛素)周围的组装囊泡的图示。这里，链以圆形形式配置，以形成具有中性或轻微负电荷的中空中心(进行了Zeta电势测量以定义该性质，如将在所公开的每种制剂的实施例中所示。仅胆固醇体自身具有-14的Zeta电势读数)。
当胰岛素在胆固醇体中时，其Zeta电势变得更负。胆固醇体包封的制剂不具有高度正电荷，这与脂质体相反，其中在一些实验中Zeta电势可以高达+76。
在该实施例和其它实施例中，胆固醇酯可以具有不同的长度，只要它们是共溶的，这将允许它们聚集在一起形成单层囊泡。这是基于不同摩尔分数的不同酯能够以最小能量构象共存和聚集的能力，其中囊泡的中空芯由胆固醇酯的性质及其相对摩尔分数决定。
由于考虑了胆固醇体的组装并且参考如图1所示的3D图。首先考虑胆固醇体基质的内部和外部在结构上相同的假设，因为甾醇核向内指向腔中且向外指向表面。
通过选择胆固醇酯，技术人员可以改变的一个特征是酯尾的长度。尾部长度较短使得甾醇核彼此更接近并减少囊泡的疏水性(由于链长)。这可对胆固醇体的亲水特性产生增强的影响。这可以建模，以及示例在图2至6中示出。
此外，假设与链长无关，脂质囊泡的内核具有相同的包装，那么较大分子周围的较短链将增加分子与脂质的质量比。显然，较大的分子需要较大的内核，因此酯链长度对于构建较大的胆固醇体以适应更大的分子(例如单克隆抗体)是重要的。
与这些考虑因素相平衡的是酯链长度对内核的相对亲水性的影响。更长的酯链增加疏水特性并允许更疏水的分子包装到芯中。
还存在基质胆固醇酯与溶剂相互作用的问题。包括乙醇的含水溶剂组合可以总体上有助于包封过程，以及以固定比率的胆固醇酯增加包封的量。这是构建体的电荷和胆固醇体内核的电荷的影响。
例如，在氧化固醇的晶体结构中，通过包括诸如乙醇的醇来改变溶剂比有助于使氧分子彼此更接近，这可以帮助酯在胆固醇体中取向并且还有助于将分子更容易地带入胆固醇体囊泡的芯中。
在对这些相互作用进行建模时，发明人可检查胆固醇酯基质结构的模型，并预测对具体分子或药物来说何种酯是最佳选择。当同时考虑酯之间的相互作用、电荷、溶剂和分子时，可存在系统性的方法。
当使用表2中的大多数胆固醇酯时，胆固醇体囊泡生成期间的温度范围为35℃至45℃。在整个囊泡制备过程中温度保持恒定(+/-5℃)。温度保持低于任何单独酯的熔融温度。举例来说，为了使用肉豆蔻酸酯/月桂酸酯制备胆固醇体，温度最佳地保持在40℃+/-5℃。在超声处理之前向混合物组分中添加少量表面活性剂或带电离子增加了胆固醇体的总产率并促进了更均匀的颗粒的产生，如将公开的。
超声时间从10分钟到30分钟不等。这个时间表示为一个范围，因为离心时间是一个变量。最佳超声处理时间取决于在超声波仪中找到最佳超声处理点的能力，以及在最佳时机，溶液形成混浊外观，以及固体材料的量应该是最小的，如此时通过目视检查确定的。
要求保护的过滤技术包括用于初始粒度选择的真空过滤，然后用于更精细粒度选择的制剂挤出。
粒度对靶标的影响
胆固醇体组分混合物以新颖的方式不同，这取决于大分子组分的离子和物理化学特征。负载负荷的胆固醇体的尺寸经常影响靶标，因为一些胆固醇酯在形成胆固醇体时更适合于递送一些分子并因此影响酯链长度。
在一些实施方案中，药物组合物是单层囊泡，其直径为约100至约750nm，优选约225至约275nm，甚至更优选约250nm。DLS测量表明囊泡的直径范围为50nm至超过1000nm。囊泡的尺寸受特定大分子内容物、选择用于制造的胆固醇酯以及制造期间的温度和超声条件的影响。最终的尺寸选择可以通过以合适的孔径选择性挤出以及控制超声处理时间以及其他制备参数来建立。
电荷和分子模式如何影响胆固醇体的尺寸
具有更大的净正电荷的更大分子需要更长的胆固醇酯链长度以优化包封，前提是在包封过程中熔融温度与被包封分子的稳定性相容。具有更低的净正电荷的更小的分子可被具有更短链长度的胆固醇酯包封。调整胆固醇酯的链长度以提供基于本发明的胆固醇酯的脂质囊泡属于常规技术。
所述胆固醇体的表面可以是光滑的或粗糙的，这取决于成分平衡和混合物的特性。囊泡表面的特性将取决于酯本身以及酯之间的相互作用。希望酯聚集以优化分子相互作用并减少其间的空穴或空间。因此这些排列可产生粗糙表面。
本发明的图中的多数图例都具有粗糙的构象，这是因为酯自身排列以使得结构成分在囊泡表面上彼此交错，从而产生不均匀的结构排列(粗糙的)。在一些情况中，酯自身排列从而对齐，以产生具有恒定形状和尺寸的表面(光滑的)。
最终表面构象的性质将取决于所用的酯及其在制剂中的相对浓度的组合。总结来说，酯的选择以及分子的选择影响脂质囊泡的最终排列。尽管各种成分均影响表面构象，但新的表面性质，即允许被肠上皮细胞摄取的中性表面自身，应是最终制剂中所选定的分子电荷的净效应。表面应一直是中性的。
形成的胆固醇体和说明的实例的性质
令人惊讶的是，具有较大净正电荷的较大分子需要较短链长的胆固醇酯以实现最佳包封。
用于较大水溶性大分子如蛋白质和肽的优选胆固醇酯是通过C8至C14饱和或不饱和脂肪酸(通常是选自辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸的脂肪酸)的酯化(或提供相应胆固醇酯的相关方法)制备的那些。
将超过一种(优选两种)胆固醇酯混合以形成胆固醇体可以适应具有不同递送特性的不同大小的活性分子。
图1描绘了月桂酸胆固醇酯/肉豆蔻酸胆固醇酯(1:1摩尔浓度)胆固醇体的三维模型。胆固醇体可以具有多种粒度，例如，实施例中显示的囊泡的粒度范围可以是250nm至10,000nm(350nm至10,000nm、500nm至10,000nm、750nm至10,000nm、1,000nm至10,000nm、1,250nm至7,500nm、1,500nm至6,500nm、750nm至5,000nm、1000nm至5,000nm)
活性成分负荷可以通过以下方法测量：测量使用所公开的方法产生的囊泡中的亲水重量对脂质重量。成分负载也可以通过物理测量和计算确定，例如实施例1和2中公开的那些。
随后的实施例显示了更多的胆固醇体制剂，其以图2至6的方式通过细胞膜，但实际上当胆固醇体被吸收到肠上皮细胞中然后完整地传递到乳糜微粒中时，细胞内的递送要大得多。还将显示说明更大细胞内渗透的这些实例。
将胆固醇体负载到乳糜微粒中
通过高尔基体将胆固醇体及其分子有效负荷负载到乳糜微粒中是定量的，如通过重新测量Caco-2的顶侧并从基底外侧的乳糜微粒中回收的量中减去剩余量所证明的。因此，Caco-2细胞对胆固醇体的亲和力非常高。Caco-2细胞将位于顶侧的所有可用胆固醇体清除到基底外侧的乳糜微粒上。如实施例3中所证明的。因此，用于包封活性分子的胆固醇酯的早期选择是本发明实践中的必要步骤，以及本发明公开的技术的精心应用可允许技术人员将肽穿过肠上皮细胞负载到乳糜微粒和体细胞中。
药学上可接受的
术语“药学上可接受的”是指本发明化合物或载体、添加剂或赋形剂的盐形式或其他衍生物(例如活性代谢物或前药形式)，其对其施用的受试者不具有不可接受的毒性。
本发明制剂中的组分
本发明的制剂可包括药学可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。可接受的制剂材料优选在所用的剂量和浓度下对受试者无毒。药物制剂可含有用于改变、保持或保留例如pH、渗透性、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、组合物的吸收或渗透的材料。合适的制剂材料包括但不限于：氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖、二糖、和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普流罗尼、聚乙二醇(PEG)、脱水山梨糖醇酯、月桂基硫酸钠、聚山梨糖醇酯如聚山梨糖醇酯20和聚山梨糖醇酯80)，在该实施例中使用吐温(Tween)；吐温可用于在挤出步骤之前改善乳剂的产率；可在被加入脂质之前向水性制剂中加入吐温，或向脂质中加入吐温，然后加水。可使用最小量的吐温，即在10ml的水中小于约100微升。Triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、或四丁酚醛)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、或山梨醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。例如参见REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版,(A.R.Gennaro,ed.),1990,Mack Publishing Company。
本领域技术人员可根据例如预期的给药途径、递送形式和所需剂量确定最佳药物制剂。例如参见REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Id。该制剂可影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
药物制剂中的主要媒介(vehicle)或载体(carrier)可包括但不限于：注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其中可加入其它在用于肠胃外给药的组合物中常见的材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水为进一步的示例性载体。药物制剂可包含约pH7.0至8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0至5.5的乙酸盐缓冲液，其可进一步包括山梨醇或合适的替代物。可通过将所选择的具有所需纯度的组合物与任选的冻干饼(lyophilized cake)或水溶液形式的配方剂(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Id.)混合来制备本发明的药物制剂以用于储存。
此外，可使用合适的赋形剂(如蔗糖)将制剂配制为冻干物。
制剂成分以给药位点可接受的浓度存在。使用缓冲剂，以有利于将组合物保持在生理pH或略微较低的pH下，通常pH在约5至约8的范围内。
本发明的药物制剂可被肠胃外递送。当考虑肠胃外给药时，用于本发明的治疗制剂可为无热源的、肠胃外可接受的水溶液形式。制剂包括所需的免疫胶束制剂，其可提供之后可被通过积存注射而被递送的产品的控释或缓释。具有透明质酸的制剂具有在循环中延长缓释持续时间的效果。
根据本发明的制剂可被配制为吸入用制剂。在这些实施方案中，隐形(stealth)胆固醇体-分子制剂被配制为用于吸入的干粉，或也可与用于气雾递送(如通过喷雾法)的推进剂一起配制吸入溶液。在PCT申请PCT/US94/001875中进一步描述了肺部给药，其中描述了被化学修饰的蛋白质的肺部给药，并通过引用合并于此。
制剂可被配制为用于在皮肤上局部施用。在这些实施方案中，隐形胆固醇体-分子制剂被配制为油膏或乳剂，并被涂敷在皮肤表面上。
本发明的制剂可通过消化道递送，如口服递送，这代表了一种优选的给药途径。该药学可接受的组合物的制剂于此处被公开，并落入本领域的技术范围内。此处公开的以该方式给药的制剂可与常用于混合固体剂型(如片剂和胶囊)的载体一起配制，或不与上述载体一起配制。胶囊可被设计为，当生物利用度最大且前全身性降解(pre-systemicdegradation)最小时在胃肠道中的某点释放制剂的活性部分。优选对酸稳定但在十二指肠的pH(约5.0至6.0，或略微更高)下可降解的肠溶包衣。这些是本领域已知的。可包括其它试剂以促进吸收。也可使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和结合剂。
制剂可包含有效量的胆固醇体，最优选胆固醇体制剂与此处公开的药物组合物中的分子在具有无毒赋形剂的混合物中，该赋形剂适合制造片剂。通过将片剂溶于无菌水中或另一种合适的载体中，可以单位剂量形式制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
用于体内给药的药物组合物通常是无菌的。在一些实施方案中，这可通过透过无菌过滤膜过滤来实现。在一些实施方案中，当该组合物被冻干时，可在冻干和重新构建之前或之后使用该方法进行灭菌。在一些实施方案中，用于肠胃外给药的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。在一些实施方案中，肠外组合物通常被置于具有无菌通道的容器中，例如静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针头穿透的塞子的小瓶。
一旦配制了本发明的制剂，可将其在无菌小瓶中作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或作为脱水的或冻干的粉末储存。该制剂可以随时可用的形式或以在给药前重新构建的形式(如冻干)储存。
本发明的制剂的给药途径包括口服给药、通过静脉注射、腹膜内注射、脑内(间质内，intra-parenchymal)注射、脑室内注射、肌内注射、眼内注射、动脉内注射、门静脉内注射、或病灶内注射的途径；通过缓释系统或植入装置。该药物组合物可通过弹丸注射给药或通过输液连续给药，或通过植入装置给药。该药物制剂还可通过在所需分子被吸收或包封的位置上植入膜、海绵或其它合适的材料而被局部给药。当使用植入装置时，该装置可被植入或被局部涂敷到任何适合的组织或器官中，且所需分子的递送可通过扩散、定时释放弹丸(time-released bolus)或连续给药来实现。
保护分子有效负荷免受胃肠道中的酸和/或酶的降解
胆固醇酯囊泡本身在2至14范围内的pH值下保持完整，与之相反，脂质体在该相同条件下被迅速降解，并与本申请的组合物相比相对不稳定。如果必须保护其负载物组分免于在胃肠道中被降解，则可用以肠道为靶标的外层包封与不稳定负载物一起制备的胆固醇体，从而使得该负载负荷的胆固醇体到达十二指肠(肠上皮细胞的GI位点，其产生了结合胆固醇体的乳糜微粒)。
例如胰岛素和其它蛋白质/多肽的负载物是酸不稳定的，因此需要在被用于动物或体内系统(其中可能发生酸降解或酶降解)中之前施加保护胆固醇体中的胰岛素的肠溶包衣的额外步骤。在本领域实践的通常情况下，当胆固醇体的内容物是酸不稳定的肽和蛋白质、且当这些产品在用于经口吸收的制剂中被胆固醇体包封时，最终产品应与肠溶包衣一起给药，从而保护胆固醇体的内容物免受胃内的酸的影响。在多数情况中，当胆固醇体在十二指肠中被释放后，存在在十二指肠中被酶降解或发生胆汁盐介导的皂化的可能性，因此需要进行单独的胆固醇体与胆汁盐、胰脂肪酶和胰酯酶接触的稳定性研究。因此除非或者直到蛋白质或肽被确切证明不会被酸降解，否则该剂型将是填充有胆固醇体构建体的小胶囊，其之后被肠溶包衣包封，从而在pH 5.5至6.0时释放其内容物。用于此目的的合适的包衣可为Eudragit(19，20)或其它对酸稳定但具有与Eudragit聚合物相似的降解特性的肠溶聚合物，并且尽管胆固醇体自身在低pH下稳定，仍需要使用本领域已知的肠溶包衣来保护胆固醇体的内容物免于被酸降解。
肠溶包衣
如本发明所用，“肠溶包衣”在低于约5.0至7.0至约7.6(优选约5.0至约6.0或在该范围内略微更高)的范围的pH下基本不溶，并可由多种材料组成，包括但不限于一种或多种选自以下的组合物：聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)、被PVA(聚乙烯醇)稳定的壳聚糖(Chi)、脂质、藻酸盐、羧甲基乙基纤维素(CMEC)、乙酸偏苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、color con、食品釉和羟丙基甲基纤维素与乙基纤维素的混合物、聚乙烯醇乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯(CAP)、虫胶、甲基丙烯酸与丙烯酸乙酯的共聚物、和甲基丙烯酸与丙烯酸乙酯的共聚物，其中在聚合过程中加入甲基丙烯酸酯单体。
一旦将大分子结合至胆固醇体中，就将产品置于胶囊中。取决于胆固醇体组合物的预期释放位点，该胶囊可以是或可以不是肠溶包衣的。举例来说，可以将肠溶包衣施加到所述胶囊上以保护来防止胃中的酸并在pH5.5或其附近释放胆固醇体组合物。作为本发明中胆固醇体的用于癌症免疫治疗用途的第二个实例，所应用的肠溶包衣将在7.3至7.6之间的pH值下在回肠中释放胆固醇体。
肠溶包衣可使用聚合物在水或合适的有机溶剂中的溶液或通过使用聚合物水分散体通过常规包衣技术施用于所述胶囊，例如锅包衣或流化床包衣。作为另一个实施方案，控释肠溶包衣可应用于胶囊内的胶囊，每个胶囊含有独立的组合物并设计成顺序释放。所述释放的一个优选实施方案是在pH为5.5时在十二指肠处的外囊靶向释放，以及在pH 7.3至7.6在回肠处的内囊释放。举例来说，用于控释层的合适材料包括(丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物)、RS(丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物)、纤维素衍生物如乙基纤维素水分散体羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、等。
在以下非限制性实施例中进一步描述了本发明的这些和其他方面。
本申请的非限制性实施例
实施例1.逐步：制备和测试胆固醇酯囊泡
胆固醇酯囊泡制备
该实施例显示了制备胆固醇酯囊泡的步骤，该囊泡用于最终口服使用本发明公开的分子，胰岛素。本领域技术人员将理解，这些条件适合与GLP-1激动剂肽一起使用，只需很少的实验。用于包封口服药物分子、口服蛋白质、口服肽、口服基因或遗传物质的核酸构建体(术语“分子”在本实施例下文中用于定义这些中的一个或全部)的所得囊泡可以如下制备：
1.得到纯化的胆固醇酯和用于包封的组合物元件；
2.得到用于包封的分子，并在37℃-55℃进行纯度和稳定性的预测试；
3.使用酯和分子之间相互作用的计算机模型优化囊泡混合物中胆固醇酯的组分，以实现所述分子的最大囊泡负载；
4.任选地，制备囊泡包封的分子并包括荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记，用于进行包括显微术在内的生物学研究，所述FITC标记不是用于人体测试或治疗用途的产品的组分；
被认为用于形成囊泡的胆固醇酯和分子的研究
该实施例通常适用于用于包封肽、蛋白质和基因的胆固醇酯制剂，其中大多数必须在低于55摄氏度的温度负载到囊泡中。由于包封的分子不稳定，因此不能超过该温度，用于本发明实践的胆固醇酯的选择关键取决于在制剂中液体形式的胆固醇酯的使用。选择候选胆固醇酯的步骤如下：
定义每种酯的熔点。举例来说，肉豆蔻酸胆固醇酯的熔融转变温度为65摄氏度，在高于该温度时固体组分熔化。
制剂目标是在低于熔融温度的温度使用胆固醇酯(与脂质体制剂一致)，并考虑到许多蛋白质和肽在约40摄氏度或更高的温度开始变性。
对所选的肉豆蔻酸酯和月桂酸酯进行进一步的温度测试。在旋转蒸发器中从脂质中完全除去有机溶剂后，进行DSC，其显示两个熔融温度，一个约60℃，另一个在较高温度熔融，通常为80℃。该步骤未反映在单个组分熔体中，而是反映了一旦除去有机溶剂后以1:1摩尔比脂质组织稳定性的测试。
基于这些发现并考虑所配制的蛋白质和肽(包括例如胰岛素)的稳定性，包封程序的操作温度保持在40和55摄氏度之间。显示胰岛素在该温度范围内是稳定的。举例来说，最佳胰岛素制备为37-55摄氏度。
选择C6和C22之间的胆固醇酯对和用于包封分子的组合物
用于适当形成包封囊泡的特定胆固醇酯的选择涉及新方法和计算机化分子模型。胆固醇酯的性质和用于包封的靶分子与由分子周围的酯形成的囊泡的内中空芯之间的相互作用可用于定义有利的胆固醇体-分子性质，例如负载，基于体积对体积或基于重量对重量。
可用于包封的囊泡中的相关体积是酯链长的函数。根据实验条件，例如超声提供的能量，改变整个囊泡的直径。但相关的体积由内半径决定。内半径由与其它一起填充的所述对的一个组分的甾醇核与该其它成员对的甾醇核的长度决定。内半径是囊泡的外半径与所选择和填充的酯对的长度之间的差。随着链长的增加，内半径的长度减小。链长的增加增加了酯壁的疏水特性。随着链长的增加，外部甾醇核和内部暴露的甾醇核彼此远离。
在挑选用于最佳包封的酯对时，需要考虑几个因素，包括待包封的分子的电荷/偶极子(diploe)和尺寸。然后将其与作为链长的函数的壁中酯的静电分布进行比较。然后基于在水性环境中与分子的静电相容性来选择酯对。
胆固醇体的配制：
a)可以使用从短链到长链的胆固醇酯形成胆固醇体。我们在此具有C6和C22之间的具体实例。
b)胆固醇体可以使用相差超过2个CH2单元的胆固醇酯对形成。
c)脂质组分中酯对的增溶可以使用有机溶剂，所述有机溶剂的选择是所选择的酯对的溶解度的函数，包括氯仿和乙醚(ether)。
d)这些酯对可以形成不同尺寸的囊泡，以及可以将药物/分子递送到细胞中。
e)酯的摩尔分数可以变化。
f)除去有机溶剂的温度可以在40至65的范围内，再次，其为酯的摩尔比的函数和溶剂的函数，前者在大多数应用中最重要。
g)酯的增溶可以使用不同量的有机溶剂。
h)配制过程：
1)将所需质量的每种酯加入圆底(RB)烧瓶(各种尺寸)中，并加入适量的有机溶剂。
2)将RB烧瓶连接到旋转蒸发器中并置于所需温度的水浴中。旋转20分钟。
3)打开真空以除去有机溶剂。
4)除去溶剂后，加入已在所需温度的水浴中的水性组分。
5)超声处理20分钟。
6)过滤并回收脂质和滤液(准备)。
7)使用透析、过滤等方法去除未包封的药物。
图1B，表3总结了短链、中链和长链脂肪酸胆固醇酯混合物的测试结果，下图说明了这些胆固醇酯囊泡对MCF-7细胞的影响
相差两个CH2单元的两个短链的混合物(C6/C8)
在图2中，胆固醇体通过组合相差两个CH2单元的两种短链胆固醇酯，辛酸胆固醇酯(C6)和癸酸胆固醇酯(C8)，以1:1的摩尔比混合而制成。当在乙醚中制备时，由该组合产生的胆固醇体的平均粒度为350nm，当将FITC结合至这些胆固醇体中时，绿色荧光显示它们进入细胞。
相差4个CH2的两个长链的混合物(C18/C22)
在图3中，胆固醇体通过组合相差四个CH2单元的两种长链胆固醇酯，硬脂酸胆固醇酯(C18)和山嵛酸胆固醇酯(C22)，以1:1的摩尔比混合而制成。由该组合产生的胆固醇体的粒度范围为392nm(如果在65℃在氯仿中制备)至3899nm(如果在55℃在乙醚中制备)，当将FITC结合至这些胆固醇体中，绿色荧光显示它们进入细胞。
相差10个CH2单元的混合物(C12/C22)
在图4中，胆固醇体通过组合相差十个CH2单元的两种胆固醇酯，月桂酸胆固醇酯(C12)和山嵛酸胆固醇酯(C22)，以1:4的摩尔比混合而制成。当在65℃在氯仿中制备时，由该组合产生的胆固醇体具有1500nm的平均粒度。当将FITC结合至这些胆固醇体中时，绿色荧光显示它们进入细胞。
相差8个CH2单元的混合物(C14/C22)
在图5中，胆固醇体通过组合相差8个CH2单元的两种胆固醇酯，肉豆蔻酸胆固醇酯(C14)和山嵛酸胆固醇酯(C22)，以4:1的摩尔比混合而制成。当在65℃在氯仿中制备时，由该组合产生的胆固醇体具有690nm的平均粒度。当将FITC结合至这些胆固醇体中时，绿色荧光显示它们进入细胞。
相差两个CH2单元的混合物(C14/C16)
在图6中，胆固醇体通过组合相差两个CH2单元的两种中链胆固醇酯，肉豆蔻酸胆固醇酯(C14)和棕榈酸胆固醇酯(C16)，以1:1的摩尔比混合而制成。当在氯仿中制备时，由该组合产生的胆固醇体的平均粒度为1890nm，以及当将FITC结合至这些胆固醇体中时，绿色荧光显示它们进入细胞。
12C:14C胆固醇体对照的制备：
将5mL PBS缓冲液加入15mL离心管中并在水浴中温热至55℃。将80.0mg肉豆蔻酸胆固醇酯和75.0mg月桂酸胆固醇酯加入到100mL圆底烧瓶(RBF)中，并用5mL乙醚(1:1摩尔比，其通过DSC和相图构建测定)溶解。然后将含有155.0mg胆固醇酯和乙醚的RBF保持在预热至55℃的Buchi Rotavapor R-3系统中。将酯在速度设定4下暴露于低真空20分钟以除去溶剂。然后在释放真空密封之后移除RBF。将预热的5ml PBS加入到RBF中的酯中，并在预热至55℃的S Series Ultrasonics Sonicor或Elmasonic P中超声处理20分钟。将胆固醇体溶液通过40um Falcon细胞过滤器过滤到15mL离心管中并在4℃储存。
用于胆固醇体的负载计算的假设和程序：
在分析若干参数(包括通过HPLC测定的最终制剂中的脂质质量、通过显微镜和DLLS检测的囊泡的平均粒度以及制剂的水性组分的起始浓度)之后，确定囊泡中分子的负载。
在本发明的典型实践中，双层模型中的酯体积将占总体积的一小部分。
根据实验条件，总直径可变(nm)；
酯双层的宽度为2.5nm，因此总体积减去内部体积应等于脂质占据的体积。
因此外层半径-2.5nm是内层的半径。
计算包封体积的步骤：
a)使用DLS或显微镜测量颗粒直径。
b)通过将直径除以2来计算外半径。
c)那是R外。
d)R内＝R外-2.5nm。
e)计算酯占据的体积(假设为球形颗粒)
4/3*pi*[(R外)3-(R内)3]＝酯占据的体积。
f)使用SYBYL计算的单个酯的体积为640.45A^3，转化为立方纳米的体积为.640nm^3。
g)将来自部分e)的酯占据的体积除以单个酯的体积，以计算胆固醇体中酯的总数。
h)计算一种酯的质量：首先，找出肉豆蔻酸酯和月桂酸酯分子的平均质量：
肉豆蔻酸胆固醇酯MW＝597.0092；月桂酸胆固醇酯MW＝568.9560；所以，平均值＝582.98克/摩尔。然后，得到一种酯的质量＝582.98g/摩尔除以6.022E+23酯/摩尔＝9.680880106276984e-22g/酯。将其乘以部分g)中的酯/胆固醇体的数量，以得到一个胆固醇体的质量。
i)大部分胆固醇体是含有活性药剂的内芯。
基于HPLC方法测定制剂中脂质的质量。取脂质的总质量并除以来自h)部分的一个胆固醇体的质量，以确定胆固醇体的数量。
j)确定内芯的体积，即包封分子占据的体积。
V内球＝4/3*pi*(R内)3
k)将胆固醇体的以nm3计的体积转换为ml
1ml＝1cm3
106cm3＝1m3
1027nm3＝1m3
l)从i计算的胆固醇体的数量乘以来自k的体积。
m)这是每个制剂体积的包封体积
n)在制剂中水性分子的起始浓度乘以来自m的包封的体积。这给出了每质量脂质的每体积制剂的包封的材料质量。
实施例2.胰岛素的胆固醇酯组合物
在胆固醇体中的胰岛素的薄膜制剂的步骤和方法
该实施例显示了制备用于最终口服使用的包封在胆固醇酯囊泡中的胰岛素的步骤。作为具体实例，如实施例1中所述，以本发明的方式制备在细菌中制备的人重组胰岛素(Prospec labs，Israel)胆固醇体，其中胆固醇酯选自实施例1中优选公开的酯。本领域技术人员将理解，这些条件适合与GLP-1激动剂肽一起使用，只需要很少的实验并调整不同的分子特性。包封口服药物分子、口服蛋白质、口服肽、口服基因或遗传物质的核酸构建体的所得囊泡(术语“分子”在本实施例下文中用于定义这些中的一个或全部)可如本发明所公开的那样制备。
多批含胰岛素的胆固醇体使用1:1摩尔比的两种胆固醇酯(肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯)的优化共混物制备。用于组合物的胆固醇酯的选择由实施例1的公开化合物制成，通过负载计算对胰岛素进行了优化。
不过这并不意味着限制，在合理的实验之后，还有其他合适的胆固醇酯对用于与胰岛素或类似分子一起配制，以及它们可以在本发明的实践中被允许。
在含有胰岛素的最佳胆固醇体制剂的具体制备中，可以选择任何胆固醇酯作为胆固醇体的组分并且在本发明的精神内，只要胆固醇体制品的最终Zeta电势保持其中性或略微负的表面电荷。使用实施例1中公开的原理被选择用于胰岛素的两种酯是肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯，它们的酯链长度相差两个CH2单元，以及当如所公开的组合时，为以这种方式制备的胆固醇体囊泡提供大的内部亲水中心。该对位于脂肪酸链长的中间。考虑到较短链长囊泡的较低疏水性和由大于2个CH2单元的胆固醇酯形成胆固醇体的显著特性，其他链长也可以起作用。
为了产生体内使用的含胰岛素的胆固醇体的最佳负载和释放特征，优化特定胆固醇酯的量完全在本发明的范围内。
初始起始条件是基于月桂酸酯/肉豆蔻酸酯的1:1摩尔比，尽管各种胰岛素分子的制剂中的最终比率不限于此。为了最终选择胆固醇酯以得到最佳负载，对每种胰岛素分子都需要检查其自身结构和与推定的胆固醇酯的分子相互作用。如果最佳最终制剂需要更疏水的区域，则使用更长链的脂肪酸酯，因为疏水空间的整个比率将基于烷基链的长度而变化。如果我们需要对一些胰岛素分子使用更集中的亲水结构，则意图使用一种氧化固醇如25羟基、7-酮或其他羟基胆固醇与脂肪酸形成酯。
包封分子是胰岛素，包括但不限于常规胰岛素、NPN胰岛素、甘精胰岛素、德谷胰岛素或制备和显示在胰岛素效应测试中具有生物活性的任何胰岛素制剂。制备胆固醇体制剂的步骤包括以下内容：
准备适当温度(37-55℃)的水浴；将PBS中的水性胰岛素制剂(8mg/ml)置于水浴中以平衡温度；称取等摩尔量的月桂酸胆固醇酯和肉豆蔻酸胆固醇酯(每种75mg)并置于圆底烧瓶中；加入有机溶剂(乙醚)以溶解酯；手摇以使其溶解；将圆底烧瓶置于旋蒸仪上并旋转5分钟；将连接到旋蒸仪上的烧瓶置于水浴中；打开真空并旋转10分钟；关掉旋蒸仪和真空并向圆底烧瓶中加水；任选地加入吐温；在水浴中旋转旋蒸仪(无真空)20分钟；超声处理10至30分钟直到形成混浊制剂且仅最少量的固体脂质保留在圆底烧瓶中；从超声仪上移除并使用真空过滤进行过滤；留下混浊滤液；任选地压出滤液；在使用前将制剂储存在冰箱中。
在冰箱中，制剂1117稳定至少18周，如图7所示。
粒度的DLS分析使用NICOMP 380亚微米粒度分析仪(Brookhaven)进行。制剂1117的所述NICOMP的输出样品如图8所示，其中存在两个粒度分布，一个平均为208nm，第二个平均为1191nm。
胰岛素-胆固醇体的替代制备
胰岛素-胆固醇体也在圆底烧瓶中制备，而不形成脂质层。本发明人使用含有8.0mg/ml胰岛素溶液的15ml反应容器进行该制备。将5ml胰岛素溶液保持在37℃的水浴超声波仪中，同时缓慢注入脂质的醚溶液，并施加连续真空以除去醚。超声处理10-20分钟后，将现在非常浑浊的反应混合物从真空中取出并加工以确定粒度并除去聚集体。向混合物中加入吐温20以减少聚集物并通过离心促进未包封的胰岛素的分离。该制备产生大量包封的胰岛素，几乎没有聚集体，以及在一小时内包封超过300U的胰岛素，而不需要薄膜步骤。
在使用薄膜法制备胆固醇酯囊泡中的pH和胰岛素溶解度
已经进行了许多胆固醇体胰岛素制备。在检查这些数据时，pH影响制备中使用的胰岛素的负载和潜在溶解度。因此，胰岛素的溶解度极限在pH 3、5、6、7和8下进行了经验测试。每种制剂的脂质含量的数据相对于胰岛素溶液的pH在两个不同离子强度的PBS缓冲液中绘制在图9中。
每个测试pH的最大浓度应用于以下：
制备每种pH和离子强度组合的储液。将经验确定的最大浓度的人重组胰岛素(SAFC Biosciences和ProSpec)添加到储液中。然后根据需要使用1MHCl或1M NaOH将这些储液重新调节至所需pH。将5.0ml储液加热至55℃并用作制剂中的含水组分。
使用薄膜脂质层制备胰岛素-胆固醇体
将在15.0mL Crystalgen离心管中预热的5.0mL1xPBS加入到酯溶液中。含水混合物的超声处理在S系列超声波浴超声波仪(Sonicor，W.Babylon，NY)中进行。超声处理进行20分钟，每5分钟旋转圆底烧瓶90度。
20分钟后，使用预先称重的Falcon细胞过滤器将胆固醇体溶液排回到最初的15.0mL Crystalgen离心管中，然后将其储存在标准冰箱中。将预先称重的圆底烧瓶置于设定在37摄氏度的VWR干燥单元中。在使用后24小时记录15.0mL Crystalgen离心管和Falcon细胞过滤器的最终重量，以计算脂质量的近似百分比收率。脂质胆固醇体的表征和分析通过利用动态激光散射(DLLS；NanoBrook,Brookhaven Instruments,Inc.,Holtzville,NY)和高效液相色谱,HPLC(Prominence 2020LC-MS,Shimadzu,Tokyo,JP)进行。
胆固醇体的粒度：
在酸性pH(3、5和6)下，随着离子强度的增加，粒度增加。相反，随着离子强度降低，在碱性pH(8)下胆固醇体的粒度增加。pH(7)胆固醇体的粒度不受离子强度的影响，如图9和10所示。
包封效率(EE)：
pH值为(6-8)的制剂的EE在较高的离子强度下最大化。pH(3和5)胆固醇体的EE使用1xPBS的离子强度最大化，如图11所示。
pH(8)胆固醇体：
胰岛素在pH8.0时溶解度高，以及随着离子强度增加，包封在胆固醇体内的浓度在碱性pH(8)下增加。不幸的是，HPLC分析显示pH(8)环境破坏了胰岛素A/B二聚体，使得这些制剂不利，如图13所示。
pH(3-4)胆固醇体：
包封的胰岛素浓度在高和低离子强度下最大化。相反，脂质浓度在中心离子强度下最大化，如图11至13所示。
结论：
因为在所测试的离子强度范围内包封的胰岛素是最大的，以及在所述pH范围内存在相对一致的脂质结合以及粒度参数，由于胰岛素在pH8.0的不稳定性，所以在pH3-4时产生制剂是优选实施方案。
-在该研究中使用的pH 3胰岛素制剂(1117)在小鼠中口服生物可利用，如实施例4中所证明的。
加工反应混合物以除去聚集体
在将反应混合物超声处理10-20分钟后，将反应混合物用表面活性剂(任选地，在胰岛素的优选实施方案中为吐温20)处理、混合并离心。加入的表面活性剂用于调节反应混合物，使其在离心并除去第一上清液(未包封的胰岛素)后保持均匀分布。当观察到均匀分布，以及显微镜检查显示颗粒均匀分散，几乎没有聚集体时，该混合物准备用于从含有胰岛素-胆固醇体的反应混合物中过滤分离未包封的胰岛素。
从胰岛素-胆固醇体混合物中去除未包封的胰岛素
当使用表面活性剂时，可通过离心将胰岛素胆固醇体从上清液分离。此时，胰岛素胆固醇体没有聚集体，通常可以在PBS中均匀分布并储存在冰箱中直至使用。然而，可以通过过滤或透析进一步除去混合物中的游离胰岛素。
过滤使用0.45u亲水性PVDF无菌过滤器以除去未包封的过量胰岛素。将该混合物在过滤器上洗涤，然后从过滤器分离并储存，用作清洁的产品胰岛素-胆固醇体。过滤器分离允许额外使用胰岛素储液。使用300kDa MWCO透析管在中性pH对1xPBS透析一些制剂以除去未包封的胰岛素。还对在pH3 1xPBS中制备的制剂进行透析，同时使用0.45u亲水性PVDF无菌注射过滤器过滤在0.5x和2.0xPBS中的pH3制剂。通过反向流动回收过滤的材料。
聚集物和粒度的显微镜检查
通过暗视野显微镜进行反应混合物的初始分选，其有效地观察到粒度在500nm和5000nm之间的颗粒。提供了胰岛素制剂的图像，其中在光学显微镜下可见聚集，例如图14。进一步处理样品以使用增加量的表面活性剂不会改变颗粒的粒度但会减少聚集，如图14所示。表面活性剂分散的胰岛素-胆固醇体颗粒分布为平均粒度约1.7微米，范围从1.6到1.8，如图15所示。如图16所示，存在颗粒的高功率图像，其中可以理解颗粒由外半径和内半径组成。可以计算内芯和外膜的含量并用于定义颗粒负载，这将在下面的负载计算中详述。对这些颗粒的进一步分析使它们经受扫描电子显微镜检查，如图17所示。这里更容易看到在中心具有大亲水芯的胆固醇酯颗粒的性质。与下面的计算一致，该颗粒的芯超过颗粒含量的50％，在下面给出的胰岛素的实施例中，芯占整个囊泡含量的69％。
定义胰岛素-胆固醇体负载的计算：2000nm囊泡
这些计算是指如实施例2中制备的胆固醇体胰岛素。假设制备的胰岛素水溶液具有8mg/ml的起始胰岛素浓度。
假设HPLC测量制剂中的1mg/ml脂质(月桂酸胆固醇酯和肉豆蔻酸胆固醇酯的总质量)。
测量的囊泡直径为2000nm。
外半径＝R外＝1000nm
内半径＝R内＝1000nm-2.5nm＝997.5nm
R外 3＝1,000,000,000nm3
R内 3＝992518734.4nm3
酯的体积＝4/3*pi*(1,000,000,000-992518734.4)＝31321565nm3
酯数＝31321565/0.640＝48939945.8
在一个胆固醇体中酯的质量＝(48939945.8)*(9.6800x10-22)＝4.737x10-14克*1000mg/1克)＝在一个胆固醇体中4.747x10-11毫克胆固醇酯
假设来自脂质含量的HPLC测量的1mg/ml脂质。
1mg/(4.747x10-11)＝2.1×1010，在1ml中的胆固醇体的数量。
计算内部容积
4/3*pi*(R内)3＝4/3*pi*(992518734.4nm3)＝4155345101nm3
转换为ml
(4155345101nm3)*(1m3/1027nm3)*(106cm3/1m3)*(1ml/1cm3)＝4.155×10-12ml/胆固醇体
(2.1x1010)*(4.155x10-12)＝.087ml包封体积/ml制剂
8mg/ml*(.087)＝.698mg胰岛素/ml制剂
每毫升制剂1毫克脂质；因此，在这种情况下，质量:质量是每毫升制剂.698mg胰岛素/1mg脂质，包封率为69.8％。
在该技术的实际应用中，25％至约96％的负载范围，最可能25％至80％的胰岛素与总颗粒大小的w:w在本发明的范围内。
最终产量：浓度为每ml制剂约20单位胰岛素，由直径为1500nm至3000nm的囊泡组成。
例示的具有包封的胰岛素的胆固醇体的结构
作为实例，在图1的建模中示出的和通过在图16中的透射EM示出的是具有包封的胰岛素的负载的胆固醇体结构模型(制剂1117)。假设这些理想的脂质颗粒聚集成脂质团块，具有约1000-5000nm的团块的原始生产粒度。虽然发明人已经发现1000nm和3000nm之间的粒度适合于将大分子负载到细胞中并且在哺乳动物中是口服生物可利用的(例如胰岛素)，但是将这些大颗粒挤出到均匀粒度的250nm颗粒也是优选的实施方案。这可以使用本领域公知的标准高压挤出装置来实现。
实施例3.用于胆固醇体包封的肽、蛋白质和遗传物质的体外细胞测试方法
细胞测试方法概述
肠上皮细胞的摄取和结合至乳糜微粒中是为此目的发明的囊泡所显示的高口服生物利用度的重要组分。该实施例详述了胰岛素胆固醇体(来自实施例2)的制备和施用步骤，以及测试通过选择胆固醇酯所传递的细胞摄取和乳糜微粒结合特性的体外方法。测试系统以肠上皮细胞模型系统开始，此处用于Caco2细胞单层，其中胆固醇酯囊泡及其包封的分子用于通过Caco-2细胞膜，然后结合至乳糜微粒中，其可使用MCF-7细胞在从Caco-2细胞收集的基底外侧液中测量。
在胆固醇酯囊泡包封所述分子(例如，胰岛素)之后和在胆固醇酯囊泡包封所述FITC标记的分子(例如，胰岛素)之后发生的步骤如下：
1.在Caco2细胞单层中测试FITC标记的分子，并在24小时后收集在基底外侧液体上乳糜微粒包封的FITC-胆固醇体-分子，现在定义为结合至胆固醇体负载的乳糜微粒中；
2.将测试细胞(例如，MCF-7细胞)暴露于含有FITC-胆固醇体分子的乳糜微粒中，并通过这些测试细胞测定FITC-分子的摄取。虽然MCF-7细胞通常因其易于使用和与癌症相关而被选择，但工作人员将意识到在细胞靶向是科学研究的主题的情况下测试许多不同的用于摄取的细胞系，因为许多生物活性分子的细胞内摄取是新颖的且从药物递送领域中的现有技术不可预料的；
3.使用显微镜定义细胞内FITC分子是否包含在内体中或在细胞质中是否游离；早期时间点(2小时，4小时)将显示整个细胞中FITC的均匀分布，表明没有内体步骤。内体成像的典型后期时间点是在初次暴露后约24小时，以及内体可以在48小时甚至72小时被可视化，尽管到那时大多数细胞通过胞吐作用去除了内体FITC标记的内容物。
4.使用GLUT转运蛋白的蛋白质印迹表达定义分子的细胞内作用是否表达为细胞表面介导的由细胞内分子的作用控制的其他物质或分子的摄取；
Caco-2细胞培养
Caco-2肠上皮细胞在补充有20％胎牛血清(热灭活)、1nM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、292μg/ml L-谷氨酰胺和1xMEM非必需氨基酸(Invitrogen，#11140)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长。将细胞在75cm2烧瓶中培养，并在37℃和5％CO2环境中孵育直至80-90％汇合。Biocoat HTS Caco-2测定系统(Becton Dickson，#354802)用于转运研究。将细胞以3×105细胞/孔的密度接种，并使用制造商的方案分化成肠上皮细胞样细胞。该系统使用特殊的纤维状胶原蛋白插入物和用丁酸、激素、生长因子和代谢物增强的无血清分化培养基，在3天内建立分化的单层，而非通常在该过程中需要的21天。这涉及在接种后将细胞与含有10％FBS的基于DMEM的培养基在37℃、5％CO2孵育48小时以建立生长期。然后用限定的分化培养基替换培养基并再孵育48小时。此时，Caco-2细胞已准备好进一步研究。
通过Caco-2细胞生产乳糜微粒
将分化的Caco-2细胞使用Luchoomun和Hussain-1999(21)的方法用于产生乳糜微粒。该方法使用以1.6:1.0mM比率补充油酸(OA)和牛磺胆酸盐(TC)以实现乳糜微粒产生。OA:TC溶液在BIOCOAT分化方案中使用的基于DMEM的细胞生长培养基中通过将OA加入10mMTC溶液中并在37℃孵育直至澄清来制备。然后将其0.2u过滤并立即用于转运研究。处理加OA:TC以450ul体积加入到孔的顶侧并孵育24小时用于转运研究和乳糜微粒产生。将PBS加1mg/ml葡萄糖以1ml体积加入到基底外侧。使用100mM Lucifer Yellow(LifeTechnologies)评估Caco-2单层的紧密连接的完整性。用100ul/孔的裂解缓冲液裂解细胞单层，并在37℃孵育10分钟。将所有样品储存在4℃直至测量。使用LS45发光分光光度计(Perkin Elmer)测定顶端、基底外侧和细胞FITC-胰岛素的荧光水平。
使用人ApoB ELISA试剂盒(Cell Biolabs，#STA-368)评估乳糜微粒水平[16]。将人ApoB-100标准品等分并储存在-20摄氏度，同时将所有其他组分储存在4摄氏度。通过用去离子水将10X洗涤缓冲液浓缩物稀释至1X并搅拌至均匀来制备1X洗涤缓冲液。抗-ApoB抗体和二抗通过在使用前立即用测定稀释剂稀释抗ApoB抗体1:1000和二抗1:1000来制备。在测定稀释剂中制备人ApoB-100标准品的稀释系列，浓度范围为0至50ng/mL。第一个标准管含有2μL 50μL/mL人ApoB-100标准品和1998μL测定稀释剂。剩余的7个标准管用500μL先前标准品制备，加入500μL的测定稀释剂。收获基底外侧血清并在4摄氏度以1000g离心10分钟。在即将运行ELISA之前，血清需要用含有0.1％BSA的PBS稀释20,000倍。将100μL ApoB未知的采样器标准品加入到抗ApoB抗体涂覆的板中，每个ApoB未知样品、标准品和空白样品重复两次。然后将板在37摄氏度孵育2小时。每孔用250μL 1X洗涤缓冲液洗涤微孔条3次。然后将孔清空并在纸巾上轻敲微孔条以除去过量洗涤缓冲液。然后向每个孔中加入100μL稀释的抗ApoB抗体，并在轨道振荡器上在室温孵育1小时。然后如前所述将孔洗涤3次。然后将100μL稀释的第二抗体加入每个孔中，并再次在轨道振荡器上在室温孵育1小时。将孔再次洗涤3次。将底物溶液温热至室温，并向每个孔中加入100μL底物溶液，包括空白。再次，将板在轨道振荡器上在室温孵育直至反应完成。通过向每个孔(包括空白孔)中加入100μL终止溶液来终止反应。使用分光光度计以450nm作为主要波长读取每个孔的吸光度。
Transwell中的Caco-2研究和乳糜微粒的形成
图18显示了Transwell板的基本设置，其设计用于显示物质穿过单层Caco-2细胞。在胆固醇体胰岛素和其他胆固醇酯制剂的情况下，我们测试Caco-2细胞的摄取，然后将完整的胆固醇酯囊泡插入Caco-2细胞的乳糜微粒中。这是Caco-2细胞单层的新用途，但落入本领域范围内，因为已知Caco-2细胞在上述条件下产生乳糜微粒。
在本领域的实践中，我们使用12孔格式的Corning Transwell渗透支撑体，孔径为0.4μm。我们在Caco-2细胞在75cm2烧瓶中80-90％汇合后开始每个Transwell实验。如常进行胰蛋白酶消化，并使用血细胞计数器计数。用培养基将细胞浓度调节至2×105细胞/mL。Transwell板的孔用0.5mL细胞稀释液接种。将1.5ml体积的培养基加入基底外侧。如上孵育细胞，每隔一天更换培养基，历时19-20天。此时，Caco-2细胞分化并准备好进行处理。移除来自Transwell板的上室和下室的所有培养基，并用含有1mg/mL葡萄糖的PBS(PBSG)洗涤两个室3次。将PBSG加入板的上部和下部室中并孵育1小时。从两个室中取出所有PBSG，并向下室中加入1.5mL含有添加葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水(PBSG)。
上室(Caco-2细胞单层的顶侧)接受0.5mL适当的处理(仅PBSG，PBSG中的FITC胆固醇体或PBSG中的FITC-胰岛素胆固醇体)。所有孔的最终浓度为1.0mg/mL葡萄糖。然后将板孵育2小时。移除所有溶液并在Zeiss共聚焦LSM 510显微镜上观察。
将FITC胰岛素胆固醇体应用于顶侧2小时后的基底外侧液的成像，其显示在基底外侧液体样品中含有FITC-胰岛素的总体较大的乳糜微粒占优势。重要的是要注意，这种液体在收集基底外侧液体后成像，以及并不反映在整个制备中的显微镜检查。因此，这些含有FITC胰岛素的乳糜微粒由Caco-2细胞清楚地形成。
穿过Caco-2细胞的FITC-胰岛素与FITC-胆固醇体胰岛素
将FITC-胰岛素和FITC-胆固醇体胰岛素的FITC信号在放置在Caco-2细胞装置的顶侧24小时后进行比较，以追踪穿过顶膜并在基底外侧表面上作为乳糜微粒排出的过程。如图19所示，在24小时的时间段后，放置在transwell顶侧的近100％的未包封的FITC-胰岛素保留在那里。这是因为在图19中可以看出，在Caco-2细胞中仅发现约1％的FITC-胰岛素的FITC信号，以及在基底外侧层中记录了不到1％的FITC-胰岛素的FITC信号。同样，这一发现证实，游离胰岛素不能有效地通过Caco-2细胞。
图20显示了如果50％的在胆固醇体中的FITC-胰岛素保留在顶侧的计数，因为如果FITC-胰岛素-胆固醇体混合物仍含有游离胰岛素，则会发生这种情况。我们称这是通过Caco-2单层进入基底外侧液体的最坏情况。
图21显示了最佳情况，其中顶侧的所有FITC-胰岛素-胆固醇体都被包封在胆固醇体中，以及所有这些都穿过基底外侧液体。在本发明的实践和产品的测试中，聚集物的问题在我们的大多数FITC-胰岛素胆固醇体制剂中产生一些游离的FITC胰岛素。因此，实际情况可能是在最坏情况下Caco-2通过50％，在最佳情况下通过100％。这与后来在小鼠和大鼠中显示的生物利用度非常相似。游离胰岛素的存在使测量复杂化。基底外侧层的液体的最终分析显示来自FITC-胰岛素的几乎无法追踪的FITC信号，进一步证实了游离胰岛素不能绕过CaCo-2细胞的证据，而FITC-胆固醇体胰岛素具有运输通过所述细胞的能力。
总体而言，放置在顶侧的至少以及约50％的FITC-胰岛素胆固醇体在24小时后位于基底外侧。我们认为这是一个保守的估计，因为一些FITC-胰岛素-胆固醇体制剂(约81％)实际上是游离的FITC-胰岛素并且没有包封。显然，在穿过Caco-2细胞时，FITC-胆固醇体胰岛素被结合至乳糜微粒中。
该数据证实游离胰岛素不具有通过Caco-2细胞转运的能力，这与其在哺乳动物物种中的非常低的生物利用度一致。
然而，当胰岛素被包封在胆固醇体中时，它能够被运输穿过Caco-2层。这是重要的，因为它表明包封在胆固醇酯囊泡中的胰岛素具有被运输出消化系统并进入血流的潜在能力，在血流中胰岛素可以被运输到外周细胞。
MCF-7细胞的培养
含有和不含FITC的胰岛素胆固醇体制剂需要细胞系进行常规检测。我们选择MCF-7细胞用于此目的，因为它们易于生长并具有许多标准细胞系的特征。
从ATCC得到MCF-7上皮乳腺癌细胞。细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清、1nM丙酮酸钠、100U青霉素、100U链霉素、292μg/ml谷氨酰胺和10μg/ml庆大霉素的DMEM中生长。将细胞单层在潮湿的37℃、5％CO2环境中维持在75cm2烧瓶中。培养基每48-72小时更新一次，以提供最佳的生长条件。然后使用EVOS FL细胞成像系统(Life Technologies)分析细胞。
负载在MCF-7细胞上的胆固醇体FITC胰岛素
最初的MCF-7细胞研究通过以下方法进行：将FITC胰岛素胆固醇体负载到MCF-7细胞的细胞培养基中，并孵育以确定可以在细胞内运输的胰岛素的量，以及跟踪它的吸收的时间过程。
图22显示了负载FITC-胆固醇体胰岛素后24小时MCF-7细胞的相差和荧光图像。帧A显示暗视野图像，帧B显示荧光。FITC胰岛素胆固醇体在整个细胞中显著扩散，但也可在帧B中看到许多小的球形胞吐囊泡。这些中的至少一些含有仍然完整的FITC胰岛素，因为在口服给予FITC胰岛素胆固醇体后在小鼠血浆中长时间检测到FITC胰岛素。
MCF-7细胞的荧光(均匀的绿光)表明足够数量的FITC-胆固醇体胰岛素囊泡被转运到细胞中，以及有利于胆固醇基囊泡的膜转运蛋白。这是一个重要的发现，因为它表明胆固醇体胰岛素本身在24小时内有效地将胰岛素递送至细胞，以及即使没有乳糜微粒步骤也会在胆固醇体中摄取FITC胰岛素。此外，时间过程中的早期时间点不显示任何内吞作用囊泡。因此，有证据表明FITC胰岛素胆固醇体的细胞摄取很快导致在细胞质中游离的FITC胰岛素的释放，而没有任何内吞作用的证据。事实上，FITC标记的分布保持均匀，直到大约6小时，此时细胞胞吐作用开始。
时间过程研究表明，MCF-7细胞中的荧光峰值出现在18小时左右。然而，当口服递送时，胆固醇体胰岛素首先需要绕过肠壁，然后到达由MCF-7细胞模拟的外周细胞，以递送胰岛素。因此，该实验的下一步是将胆固醇体胰岛素置于Caco-2细胞上，其模拟肠上皮细胞吸收胆固醇酯囊泡并置于乳糜微粒中的过程。然后，当从乳糜微粒接受胆固醇酯时(胆固醇体的口服使用效果的模拟)，可以测试具有乳糜微粒负荷的基底外侧液体按照预期进入MCF-7细胞。
负载MCF-7细胞的FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒
如本发明所公开地制备含有包封的FITC-胰岛素的胆固醇体，使用商业上购买的FITC标记的常规胰岛素。Caco-2细胞被用于确保胆固醇体穿过肠上皮细胞转移完整的胰岛素(即，胰岛素保留在胆固醇体内)并进入乳糜微粒，然后在Caco-2膜的基底外侧检测到乳糜微粒。ELISA被用于证明酸保护的胰岛素不通过顶端Caco-2屏障(<5％)，以及基底外侧的所有胰岛素都在乳糜微粒内。在顶侧使用FITC-胰岛素以验证单独的胰岛素不通过肠上皮细胞屏障，但胆固醇体中的FITC胰岛素通过Caco2肠上皮细胞屏障。从这些实验中，吸收效率被确定为胰岛素的基底外侧和顶侧含量之间的差异。进一步的实验比较了改变的pH和胆汁盐对胆固醇体包封的胰岛素的影响。此外，对当含有负载到胆固醇体中的胰岛素时的乳糜微粒稳定性进行定量，并研究了从负载的胆固醇体中体内释放胰岛素所需的条件。
在图23中，将FITC胰岛素制剂置于与MCF-7细胞相邻的培养基中，以证明摄取到细胞中。在将构建体添加到培养基后2小时拍摄该图像。图22比较了未包封的FITC-胰岛素(A行)、FITC-胆固醇体胰岛素(B行)和在乳糜微粒中的FITC-胆固醇体胰岛素(C行)将FITC-胰岛素递送到MCF-7细胞中的能力。所有行首先具有暗视野图像，接着在中间具有荧光图像，最后一个图像是在暗视野上的荧光叠加。
在该实验中，与单独的FITC-胰岛素(A行)的负载相比，MCF-7细胞的FITC胰岛素胆固醇体乳糜微粒负载高了将近1000倍(C行)。在没有乳糜微粒步骤的情况下给予FITC胰岛素胆固醇体的B行中具有适度但可检测的负荷。在整个图23中，可以理解，在2小时时，没有可见的内体以及FITC胰岛素在整个细胞中的均匀分布。
在所有情况下，Caco-2细胞对FITC胰岛素胆固醇体在乳糜微粒中的体内处理产生了细胞内胰岛素量的强烈改善。这大于FITC胰岛素胆固醇体自身的负载(B行)，
不仅细胞膜在图像的C行中显著更集中FITC胰岛素，而且这些细胞的细胞质也负载有FITC胰岛素。这只是在暴露2小时后，证实乳糜微粒不仅大量负载，而且它们比胆固醇体自身负载更快。
然后将该特定制剂给予小鼠，以证实Caco-2模型具有高口服生物利用度的预测。在实施例4中公开了本发明的这个方面。
实施例4.体内-胆固醇体-胰岛素的鼠研究
设计实施例4中公开的实验以证实所预测的使用在胆固醇体中的胰岛素的高口服生物利用度。
胰岛素的Elisa分析
使用人胰岛素ELISA试剂盒(#EZHI-14K和#EZHI-14BK，Millipore，Darmstadt，Germany)按照制造商的说明书进行ELISA分析。通过将全部内容物与450mL去离子水混合来稀释10X浓缩的HRP洗涤缓冲液。将条从Microtiter Assay Plate取出，并用300μL稀释的HRP洗涤缓冲液填充孔。将板在室温孵育5分钟。用洗涤缓冲液洗涤孔，并将20μL测定缓冲液加入NSB(非特异性结合)孔和每个样品孔中。将20μL Matrix溶液加入NSB、标准孔和对照孔中。一式两份加入20μL人胰岛素标准品。将20μL QC1和20μL QC2加入适当的孔中。将20μL未知样品一式两份加入剩余的孔中。向所有孔中加入20μL检测抗体，然后用平板密封器覆盖，并在轨道平板振荡器上在室温孵育1小时。从平板中取出平板密封器并倾析溶液，将孔洗涤3次，每孔每次用300μL HRP洗涤缓冲液。向每个孔中加入100μL酶溶液，再用密封器覆盖该板，并在轨道振荡器上在室温孵育30分钟。除去密封器和倾析溶液，以相同方式洗涤孔5次。向每个孔中加入100μL底物溶液，将其再次密封并置于轨道振荡器上5-20分钟。在出现表明反应完成的蓝色后，向孔中加入100μL终止溶液。使用分光光度计以450nm作为波长读取每个孔的吸光度。测量结果记录为每毫升微量单位(micro Unit per ml)。
口服递送胆固醇体胰岛素至小鼠
该实施例提供了在口服或IV给予小鼠胆固醇体胰岛素后收集的数据。
胰岛素作为游离(未包封的)人重组胰岛素或作为胆固醇体包封的人重组胰岛素施用。在给予胰岛素-胆固醇体用于测量相对生物利用度(口服对IV，表示为AUC百分比)的小鼠中，一半被口服给药，而另一半使用31号针头静脉内给药至阴茎静脉。
所用小鼠的给药和处死遵循严格的人道程序。将剂量为1.0U/kg的人胰岛素重组体在0.05-0.1ml盐水中给予ND4 Swiss Webster小鼠(Harlan Laboratory，Indianapolis，IN)。给药前将小鼠禁食3小时，并在1小时后允许进食。始终向小鼠提供水。在阴茎静脉注射之前，小鼠通过吸入异氟烷进行麻醉。小鼠吸入3％mg/Kg体重的量以诱导放血，吸入2％mg/Kg进行维持。胰岛素给药后，在前6小时每30-60分钟监测一次小鼠，然后每12小时监测一次，严格记录行为和排尿。然后通过在CO2室中吸入在每个时间点处死两只小鼠。
处死小鼠的时间点为0(前)和后30分钟，1小时，3小时，6小时，12小时，24小时。在处死的小鼠中通过主动脉穿刺，放血收集血液样品。
图24和25显示了为比较生物利用度而口服和静脉内给予1.0U/kg胆固醇体胰岛素的小鼠的结果。图24绘制了胆固醇体胰岛素(总计，假设提取完成)，而图25绘制了在细胞内释放和胞吐后不含胆固醇体的胰岛素。使用相对AUC作为口服对IV生物利用度的量度，口服游离胰岛素是110％生物可利用的，以及当校正制剂中3％游离胰岛素时甚至更多。
在口服和IV给药后4至6小时之间注意到大的胞吐作用相关的胰岛素峰，表明进入细胞的一些完整的胆固醇体也被完整地运输回到外部而不打开它们，也并未在细胞内释放它们的内容物。
考虑到胆固醇体包封的胰岛素的曲线图如图25所示，总胆固醇体包封的AUC相关生物利用度平均为66％，再次与口服和IV给药后4小时仍然被包封的胰岛素胆固醇体的非常大的胞吐峰相关。预计胆固醇体都将释放细胞内游离胰岛素，而数据表明细胞只能在乳糜微粒对接后简单地排出进入它们的至少一部分胆固醇体。
鉴于对胆固醇体转运的初步了解，需要更多的研究来优化递送。此外，从小鼠到小鼠存在显著的差异。然而，图24和25中记录的信息是重要的，因为它验证了我们的模型和我们的体外数据，以及表明胆固醇体胰岛素具有以非常高的生物利用度口服递送到哺乳动物中的能力，其生物利用度实际上远远高于通常的5-25％(这是以前最好的值)。
作为关于口服和IV胆固醇体进入和离开细胞的机制的进一步说明，通过从小鼠收集血浆并使用Millipore试剂盒进行胰岛素ELISA来测定胰岛素浓度(μU/mL)。值得注意的是，通过ApoB ELISA测量的任何胰岛素都是以游离胰岛素或胆固醇体胰岛素递送的胰岛素，因为ApoB ELISA试剂盒对人重组胰岛素具有特异性。这很重要，因为研究中使用的小鼠不是糖尿病患者意味着他们也有自己天然产生的胰岛素，尽管用于人胰岛素测定的Millipore试剂盒宣称它们不会转换为小鼠胰岛素。如果无法确定胰岛素读数是来自小鼠还是来自胆固醇体胰岛素，那么结果将是不确定的。因为人类重组胰岛素具有与其连接的ApoB蛋白，而体内产生的正常胰岛素不具有与其连接的ApoB蛋白，ApoB ELISA试剂盒可以确定在乳糜微粒中由胆固醇体胰岛素特异性递送的胰岛素，其也含有ApoB作为其细胞对接机制的一部分。
组织对血浆比率的小鼠研究
如图26所示，胆固醇体包封的FITC胰岛素在口服使用后显示出组织内的高吸收，以及实际上口服给药后靶组织如脑、肝、肾和心脏中的浓度高于以相同剂量IV给予后的浓度。这是意料之中的，因为口服使用将FITC-胰岛素置于乳糜微粒中，以及乳糜微粒可比注射的胆固醇体更好地负载细胞。
这里的测定是根据应用于组织的FITC校准标准检测FITC。在给药后6小时采集组织样品，根据图24中的数据，此时胰岛素的血浆浓度低。因此，FITC的测定反映细胞内FITC，因为血液和可能的组织间质液污染不存在。脑组织浓度特别高，其中血浆与组织FITC的比率高于100比1。肾脏和心脏甚至更高，因为组织对血浆的比率超过200比1。肝脏较低，但仍高于50比1。总之，在血浆中FITC和重组人胰岛素几乎检测不到的时候，组织对血浆的比率仍然很高。由于胰岛素被细胞快速代谢，这些比率反映了细胞内FITC的保留，以及与我们的细胞实验中FITC的长期保留完全一致，其中在培养基中暴露于FITC胆固醇体胰岛素24小时后浓度仍然可很高。
实施例5.体内-胆固醇体-胰岛素的大鼠研究
口服生物利用度研究
进行这些实验以评估通过口服强饲法和皮下注射施用的胆固醇包封的胰岛素制剂(胆固醇体-胰岛素)之间的胰岛素的相对血浆和组织对血浆比率，两者与在健康雌性Wistar大鼠中皮下(sc)施用的相同胰岛素进行比较。
该研究设计用于比较来自所施用制剂的胰岛素生物利用度，其由曲线下面积(AUC)定义，计算为在制剂给药后历时24小时口服与IV的比率。
将体重为246.5至292.8g的16只健康雌性Wistar大鼠分为3个研究组。两个6只大鼠组口服和SC注射给予胆固醇体胰岛素，其余4只大鼠皮下给予常规胰岛素作为对照。每只大鼠被给予1.0ml/动物的由赞助者鉴定的仅具有笼编号和大鼠编号的溶液。两组雌性Wistar大鼠禁食，持续时间从给药前3小时到给药后1小时。大鼠在任何时候都可以自由饮水。在给药后1小时开始允许大鼠自由进食。每天监测大鼠的死亡率和发病率，包括低血糖症的迹象。在给药前30分钟收集基线血液后，在30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时和24小时收集500μl血样用于血浆制备。在给药后24小时通过过量CO2对所有大鼠实施安乐死。在安乐死之后，立即通过心脏穿刺收集最终血样用于血浆制备。将所有血浆样品在-80℃冷冻直至使用ELISA测定。
给动物提供商业啮齿动物饮食(5％7012 Teklad LM-485小鼠/大鼠可消毒饮食，Harlan)和无菌饮用水。在整个研究期间，所有动物都被限制在有限的通道设施中，并具有环境控制的住房条件。该设施保持在18-26℃，30-70％的空气湿度，12小时明暗周期(6点开灯，18点关灯)。在实验开始前，使动物在住房条件下适应至少3-5天。
所有动物在整个研究过程中表现正常，口服和SC给予胆固醇体包封的胰岛素和SC给予常规胰岛素都具有良好的耐受性。没有观察到药物毒性或严重低血糖的迹象。
结果。通过ELISA(Mercodia)一式三份测定血浆胰岛素，每个测定日具有完整的标准曲线和对照样品。将胰岛素浓度作为时间点的平均值绘制，以及得到的血液浓度和AUC值显示在图27中(胆固醇体口服，平均AUC 295)，图28中(SC常规胰岛素，平均AUC 344)和图29中(SC胆固醇体胰岛素，平均AUC 322)。对于给定的实际剂量(减去返回的残余物)校正所有AUC值，以及表示为剂量为0.25单位的AUC，其为约1单位/kg体重。口服胆固醇体胰岛素与SC胰岛素的AUC的比较被认为是相对口服生物利用度的准确估计。在该实验中，与SC注射相比，胆固醇体胰岛素的口服生物利用度为86％，以及与SC胆固醇体胰岛素相比，口服胆固醇体胰岛素的相对生物利用度为92％。
组织对血浆比率-大鼠研究
如图30所示，胆固醇体包封的FITC胰岛素在口服使用后显示出在大鼠组织中的高吸收，以及事实上口服给药后靶组织如脑、肝、肾和心脏中的浓度高于SC给予的相同剂量后的浓度。这是预期的，因为口服使用将FITC-胰岛素置于乳糜微粒中，以及乳糜微粒可比注射的胆固醇体更好地负载细胞。
这里的测定是根据应用于组织的FITC校准标准检测FITC。根据图26-28中的数据，在给药后6小时，在胰岛素的血浆浓度低时，取组织样品。因此，FITC的测定反映细胞内FITC，因为根据这些低值，血液和推测组织的间质液污染不太可能是一个因素。
大鼠中FITC的器官浓度与小鼠中的器官浓度相似。肾脏在物种之间是不同的，以及大鼠的肝脏比小鼠更高。然而，大鼠的总体组织对血浆比率低于小鼠。这反映了较高的血浆浓度，特别是在SC给药的大鼠中。大鼠中肝脏最高，肾脏最低。小鼠的脑分布比大鼠好。总之，在血浆中FITC和重组人胰岛素几乎检测不到的时候，组织对血浆的比率仍然非常高。由于胰岛素被细胞快速代谢，这些比率反映了细胞内FITC的保留，以及与我们的细胞实验中FITC的长期保留完全一致，其中在培养基中暴露于FITC胆固醇体胰岛素后24小时浓度仍然可以很高。
实施例6.添加到胆固醇体制剂中的蛋白酶抑制剂
该实施例公开了一种保护胆固醇体有效负荷在细胞膜内释放的肽和蛋白质免受细胞内代谢影响的方法。所述细胞内代谢的延迟用于延长它们的作用，从而引起效力的增加。任选地，所述肽代谢抑制剂可以促使细胞利用其自身的胞吐作用途径除去更大量的有效负荷。
进行了初步研究，其中将MG-132加入MCF-7细胞中，所述MCF-7细胞也暴露于1117胰岛素-胆固醇体。发现MG-132可引起更完整的胰岛素-胆固醇体的胞吐作用，表明对胆固醇酯水解酶的作用，否则其将其作用从胆固醇体释放胰岛素。
在本发明的该实施方案中，在本发明中产生并包封一种或多种肽的所述胆固醇酯囊泡另外和任选地结合一种或多种蛋白酶抑制剂物质，其减缓或完全阻止所述肽在所述哺乳动物或患者或受试者的细胞内的代谢或分解代谢。
在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶抑制剂，例如但不限于：利马豆胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)或卵类粘蛋白。
在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂包括：胱抑素(cystatin)、1型胱抑素(或stefins)、2型胱抑素、人胱抑素C、D、S、SN和SA、胱抑素E/M、胱抑素F、3型胱抑素或激肽原。
在另一个实施方案中，所述抑制剂是抗生素物质杆菌肽，其中所述物质的有效量低于在胆固醇体递送后对细胞造成毒性损伤的量。
在另一个实施方案中，所述抑制剂是DPP-IV抑制剂，例如但不限于西他列汀、沙格列汀或利格列汀，其各自可商购得到以延长GLP-1激动剂的作用。
在另一个实施方案中，所述抑制剂是胰岛素降解酶抑制剂(IDE抑制剂)，包括但不限于ML-345和先前公开的其他抑制剂(18)
在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是苏氨酸蛋白酶抑制剂，其中本发明的苏氨酸蛋白酶抑制剂包含：MLN-519，ER-807446，TMC-95A。
在另一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂如硼替佐米或伊沙佐米(Ixazomib)可用于延长使用本发明递送到细胞中的肽的作用。在正常细胞中，蛋白酶体通过泛素化蛋白质的降解调节蛋白质表达和功能，以及还清洁细胞中异常或错误折叠的蛋白质。
在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是天冬氨酸蛋白酶抑制剂，其中本发明的天冬氨酸蛋白酶抑制剂包含：胃酶抑素A、天冬氨酸蛋白酶抑制剂11、天冬氨酸蛋白酶抑制剂1、天冬氨酸蛋白酶抑制剂2、天冬氨酸蛋白酶抑制剂3、天冬氨酸蛋白酶抑制剂4、天冬氨酸蛋白酶抑制剂5、天冬氨酸蛋白酶抑制剂6、天冬氨酸蛋白酶抑制剂7、天冬氨酸蛋白酶抑制剂8、天冬氨酸蛋白酶抑制剂9、胃蛋白酶抑制剂Dit33、天冬氨酰蛋白酶抑制剂或蛋白酶A抑制剂3。
在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是金属蛋白酶抑制剂，其中本发明的金属蛋白酶抑制剂包括：血管紧张素-1转化酶抑制肽、抗出血因子BJ46a，β-酪蛋白，蛋白酶抑制剂CeKI，毒液金属蛋白酶抑制剂DM43，羧肽酶A抑制剂，smpI，IMPI，碱性蛋白酶，INH，Latexin，羧肽酶抑制剂，抗出血因子HSF，睾丸蛋白聚糖-3，SPOCK3，TIMP1，金属蛋白酶抑制剂1，金属蛋白酶抑制剂2，TIMP2，金属蛋白酶抑制剂3，TIMP3，金属蛋白酶抑制剂4，TIMP4，推定的金属蛋白酶抑制剂标签-225(Putative metalloproteinase inhibitor tag-225)，金属蛋白酶的组织抑制剂，WAP，kazal，免疫球蛋白或kunitz和含有NTR结构域的蛋白1。
在一些实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是自杀抑制剂、过渡态抑制剂或螯合剂。在一些实施方案中，本发明的所述蛋白酶抑制剂是：AEBSF-HCl、(ε)-氨基己酸、(α)-1-抗糜蛋白酶、抗痛剂、抗凝血酶III、(α)1-抗胰蛋白酶([α]1-蛋白酶抑制剂)、APMSF-HCl(4-脒基苯基-甲磺酰氟)、sprotinin、苯甲脒-HCl、抑糜酶素、DFP(氟磷酸二异丙基酯)、亮肽酶素、PEFABLOC.RTM、SC(4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸盐)、PMSF(苯基甲基磺酰氟)、TLCK(1-氯-3-甲苯磺酰氨基-7-氨基-2-庚酮HCl)、TPCK(1-氯-3-甲苯磺酰氨基-4-苯基-2-丁酮)、喷他脒羟乙基磺酸盐、胃酶抑素、胍、α2-巨球蛋白、锌的螯合剂，或碘乙酸盐、锌。在一些实施方案中，所述螯合剂是EDTA。
本发明公开的每种蛋白酶抑制剂物质，以有效量代表本发明的单独实施方案，条件是所述胆固醇体释放的蛋白质或肽的代谢被所述蛋白酶抑制剂延迟。对于本领域技术人员显而易见的是，在选择蛋白酶抑制剂的技术中优选任何延迟或阻止所述肽在细胞内代谢的蛋白酶抑制剂。
本发明的一个优选实施方案是使用蛋白酶抑制剂，其不会损伤从到达细胞质的胆固醇体释放所述蛋白酶抑制剂的细胞。
每种量的第一或第二蛋白酶抑制剂代表本发明的单独实施方案，以及对于本领域技术人员显而易见的是，所选蛋白酶抑制剂的量将延迟或阻止所述肽或蛋白质的代谢。
实施例7：口服曲妥珠单抗胆固醇体和IgG对照
介绍。乳腺癌在腺体(小叶癌)或乳管(导管癌)中发展，以及是由于不受控制的乳腺细胞分裂。人表皮生长因子受体2(HER2)基因负责HER2蛋白的产生。这些蛋白质作为正常健康乳腺细胞的受体，有助于这些细胞的生长、分裂和修复。曲妥珠单抗是一种IgG1单克隆抗体，已被证实可治疗HER2阳性乳腺癌患者。使用促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径的曲妥珠单抗干扰HER2受体的细胞内信号传导。
对于诸如癌症之类的疾病具有高治疗价值的许多单克隆抗体在暴露于包封的剪切应力时倾向于变性或形成聚集体。已证实曲妥珠单抗具有抗这些剪切应力的作用，使其包封将来有望用于治疗典型的耐曲妥珠单抗的HER2阳性乳腺癌患者。
使用胆固醇体作为将曲妥珠单抗递送到HER2阴性MCF-7人细胞中的方法用于评估毒性作用。HER2阳性癌细胞系的一些体外模型似乎对曲妥珠单抗有应答并且可以在未来的研究中进行评估，它们是SKBR3和MDA-MB-453。
在体外包封后，曲妥珠单抗在体内的口服和细胞内递送是最终目标。目前，曲妥珠单抗需要安全有效的口服制剂。胆固醇体技术显示了满足这一需求的潜力。作为一种新型药物传递系统，胆固醇体显示出在胃肠道的酸性环境中存活并通过肠道吸收进入循环系统的能力。在这项研究中，曲妥珠单抗已成功包封在胆固醇体中。
曲妥珠单抗储液的制备
用于注射的曲妥珠单抗的研究制剂(此后，曲妥珠单抗；～1mg/mL曲妥珠单抗、～5mM组氨酸、～50mMα-海藻糖、～0.01％20和～1％w/v苯甲醇、pH6.0；来自Kentucky Bioprocessing，Owensboro，KY的慷慨礼物)用作原料。保留等分试样用于后续分析。在去除去污剂后，需要在包封前浓缩曲妥珠单抗。使用DetergentOUTTM Medi,(GBiosciences,St.Louis,MO)从约250mL曲妥珠单抗中除去20。将得到的溶液在甘油中制成2％，通过冻干浓缩，并用4L 0.5X PBS透析2小时(100kD MWCO Spectra/CE膜；Spectrum，Rancho Dominguez，CA)。
将曲妥珠单抗柱后溶液收集在50ml锥形管中。将80％甘油加入曲妥珠单抗柱后溶液中，使得曲妥珠单抗柱后溶液中甘油的最终浓度为2％，然后将其冻干。冻干后曲妥珠单抗溶液的吸光度使用JENWAY分光光度计在2个波长：280nm和350nm处进行。吸光度测量结果如图31所示。然后使用SPECTRUM Spectra/Biotech纤维素酯(CE)透析膜对20％甘油曲妥珠单抗溶液针对4升0.5xPBS进行透析过程2小时，所述透析膜的分子量截止值为100,000，标称扁宽31mm。图32记录了曲妥珠单抗透析后溶液的吸光度测量结果。用于包封的最终曲妥珠单抗储液含有约12.52mg/ml曲妥珠单抗、0.18％苯甲醇pH 6.0、0.428mM盐酸组氨酸、0.346mM组氨酸和8.741mM二水合海藻糖。
曲妥珠单抗-胆固醇体的制备：
将5mL曲妥珠单抗储液加入15ml锥形管中并在40℃平衡。将80mg肉豆蔻酸胆固醇酯和75mg月桂酸胆固醇酯(NU Check Prep；Elysian，MN)加入100ml圆底烧瓶(RBF)中并用5ml乙醚溶解。然后将该溶液置于Buchi Rotovapor R-3上，在无真空下以速度设定4旋转10分钟，然后在40℃暴露于低真空10分钟。然后除去RBF，然后将40℃的5ml曲妥珠单抗储液加入RBF并在40℃超声处理20分钟。每隔5分钟在超声处理期间旋转RBF。然后将曲妥珠单抗胆固醇体通过无菌细胞过滤器40μm目篮(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)过滤以除去过量的脂质物质并在4℃储存。
未包封的曲妥珠单抗的分离
根据制造商的说明，使用Protein G-琼脂糖(Biovision Inc.；Milpita，CA)分离未包封的曲妥珠单抗。简而言之，用结合缓冲液洗涤蛋白G基质5次，负载曲妥珠单抗-胆固醇体并在室温孵育90分钟。然后将样品以5000×g旋转30秒。使用微量移液管除去上清液并保存用于进一步分析。然后将洗脱缓冲液加入到基质中，并如前所述离心样品。收集上清液并保存用于进一步分析。出乎意料的是，从用于去除未包封的曲妥珠单抗的蛋白质G-琼脂糖中回收曲妥珠单抗-胆固醇体时遇到了困难。经验证据(图33和未显示)表明这可与制剂中的脂质的量有关。正在努力寻找在分离过程中最大化胆固醇体回收的方法。
IgG-胆固醇体的制备：
使用上述方法，使用5mL的18.8mg/ml人IgG储液(0.02M Na2HPO4，0.15M NaCl；Innovative Research；Novi，MI)制备IgG-胆固醇体。如上文针对曲妥珠单抗-胆固醇体所述，使用蛋白G-琼脂糖将未包封的IgG与IgG-胆固醇体分离。
曲妥珠单抗胆固醇体和IgG胆固醇体的分析：
使用Nanobrooks-90Plus PALS进行CholestosomesTM的动态光散射(DLS)分析。脂质浓度的分析使用HPLC(Shimadzu 2020)得到。如上所述对CholestosomeTM溶液进行分光光度测定。
细胞处理：将MCF-7细胞在75cm2烧瓶中培养，并在37℃和5％CO2环境中孵育直至80-90％汇合。用各种处理和制剂孵育MCF-7细胞，以24孔格式进行。将细胞以1.5×105细胞/孔接种，并在处理前孵育24小时。然后将细胞孵育24小时，然后洗涤，胰蛋白酶消化并在血细胞计数器中计数。通过台盼蓝排除法确定存活率。
最初将粗制胆固醇体置于乳腺上皮细胞(184B5和MCF-7)上以测试对细胞生长的影响，图33和存活率图34。可溶性或胆固醇体配制的抗体均未对细胞的存活率产生任何影响。胆固醇体配制的曲妥珠单抗以及IgG(在较小程度上)影响184B5细胞生长，但它不影响MCF-7细胞。
结果和讨论
蛋白质生物制剂的典型临床制剂在溶液中具有较低的量，在进行胆固醇体包封之前需要浓缩蛋白质。在一些情况下，由于浓缩过程(例如冻干)中的聚集导致了大量损失。图35表明，对于曲妥珠单抗，这种损失模式是最小的，因为曲妥珠单抗在冻干或包封的应激下未显示任何降解或聚集。图35显示在胆固醇体中IgG和曲妥珠单抗的损失最小，因为两者均可在1000倍稀释下成功测量而没有任何脂质干扰。
包封IgG和曲妥珠单抗的胆固醇体制剂在脂质结合和尺寸方面具有差异，但在估计包封的量和抗体与脂质的质量比方面相似。曲妥珠单抗已成功包封在胆固醇体中，w/w负载比约为50％。包封的曲妥珠单抗和IgG均未显示出对MCF-7细胞或184B5细胞的任何毒性，这表明这些制剂可在动物模型中进行测试。
实施例8.MCF-7和ARPE19视网膜细胞的胆固醇体-FITC负载
还从肉豆蔻酸胆固醇酯(C14)和棕榈酸胆固醇酯(C16)的1:1摩尔混合物制备FITC胆固醇体。从该胆固醇体制剂中观察到令人惊讶的快速摄取FITC到MCF-7细胞中。
FITC储液的制备：在1x PBS中在中性pH制备1.0mg/ml FITC溶液。
使用肉豆蔻酸胆固醇酯/棕榈酸胆固醇酯制备胆固醇体：
在5ml氯仿中制备1:1摩尔的肉豆蔻酸胆固醇酯(75mg)和棕榈酸胆固醇酯(84mg)的溶液。将氯仿溶液加入连接到Buchi Rotoevaporator的圆底烧瓶中。将烧瓶置于设定在65℃的水浴中并旋转10分钟，此时施加真空以除去有机溶剂。一旦除去溶剂，加入5ml 1mg/ml FITC水溶液。将溶液移至达到57℃高温的超声波浴中。超声处理进行20分钟。然后过滤制剂以将制剂与未使用的脂质分离。
未包封的FITC的分离。将制剂通过0.22u过滤器重力过滤，确保除去的体积以规则的间隔用流体代替。
细胞研究-MCF-7
在该实验中，将22μg FITC制剂置于MCF-7细胞上。随时间进行荧光成像，在2、4、8和24小时拍摄图像。数据显示，与肉豆蔻酸酯和月桂酸酯制备的FITC胆固醇体相比，由肉豆蔻酸酯和棕榈酸酯制备的FITC胆固醇体的摄取更快，如图36所示。摄取速率的差异是出乎意料的并且在本发明中公开为胆固醇体构建体的特殊性质。在该特定实验中，还有FITC本身摄入MCF-7细胞，而显然胆固醇包封的FITC与单独的FITC相比有更大的荧光。
细胞研究-视网膜细胞ARPE19
图36中显示了使人视网膜上皮细胞负载FITC的由1:1摩尔比的肉豆蔻酸胆固醇酯和棕榈酸胆固醇酯制成的胆固醇体。在该实验中，将22μg FITC制剂置于ARPE19细胞上。随时间进行荧光成像，在2、4、8和24小时拍摄图像。图A显示用肉豆蔻酸酯/棕榈酸酯制备的FITC-胆固醇体处理2小时的ARPE-19细胞的图像。左上图是相差图像；右上是在2小时的绿色荧光通道图像；左下图是红色荧光通道图像；右下图是合并后的图像。数据表明，与肉豆蔻酸酯和月桂酸酯制备的FITC胆固醇体相比，肉豆蔻酸酯和棕榈酸酯制备的FITC胆固醇体的摄取更快。摄取速率的差异是出乎意料的，以及在本发明中公开为胆固醇体构建体的特殊性质。
实施例9.核酸胆固醇体：GFP质粒
荧光蛋白是遗传编码的工具，被生命科学家广泛使用。最初的绿色荧光蛋白(GFP)于1992年被克隆，从那时起，科学家已经设计了许多GFP变体和非GFP蛋白，其产生了多种颜色。绿色荧光质粒(GFP)的成功转染和转染细胞的绿色荧光的表达被广泛认为是成功的细胞内递送机制的确切证据。因此，进行这些实验是为了证明使用胆固醇体包封的核酸材料的细胞内递送。
从Himoudi-2002(22)描述的pgWizGFP质粒储液开始，GFP的生长和纯化步骤如下：
LB米勒肉汤的制备
1.将800mL H2O加入2L Erlenmeyer烧瓶中。
2.通过旋转溶解20g LB米勒肉汤(Sigma L3522)直至液体呈澄清的黄色并且所有粉末团块溶解。将步骤1和2再重复两次以得到3个烧瓶，每个烧瓶含有800mL LB米勒肉汤。
3.将烧瓶在液体介质设置下高压灭菌。
4.向灭菌的LB肉汤添加50μg/mL硫酸卡那霉素(GIBCO，100x，151600-054)，并用pgWizGFP质粒(Aldevron，Fargo，ND；5757bp)的甘油储液孵育。
5.将烧瓶在37℃振荡(200rpm)孵育过夜。
pgWizGFP的柱纯化：
1.根据制造商的说明书制备缓冲液P1、P2和P3(质粒Giga试剂盒，Qiagen Corp.，Germantown，MD)(缓冲液组成规格在表4中提供)。
2.孵育后约22-24小时，通过使用适当空白的分光光度计测量600nm处的光密度(OD)来监测培养物生长，直到培养物具有1.5E+9至3-4E+9细菌。
3.将细菌在6,000×g，15'，4℃(JLA 9.1000转子；J-E CentrifugeAvanti，Beckman-Coulter，Brea，CA)沉淀。弃去上清液。
4.当细菌沉淀时，将3个QIAGEN-tip 10000柱各自用75mL缓冲液QBT平衡。
5.将细菌沉淀重悬于125mL缓冲液P1中，合并所有沉淀。
6.缓慢加入125mL缓冲液P2以避免发泡，然后通过剧烈倒置6次彻底混合，最后在室温在benchtop上孵育5'。
7.将125mL冷缓冲液P3加入到重悬的沉淀混合物中，通过倒置6次剧烈混合并在冰上孵育30分钟。
8.将经处理的沉淀在瓶中在与步骤3相同的离心机中用JLA16.250转子在4℃以20,000xg旋转30分钟。
9.将上清液小心地倒入干净的250mL离心瓶中。
10.将上清液在4℃以20,000xg用JLA 16.250转子旋转15分钟以除去任何如果存在则会堵塞柱的其他颗粒。
11.将从步骤10得到的上清液应用于柱。平衡流通液(equilibration flowthrough)被丢弃。
12.用600mL缓冲液QC洗涤柱子。
13.用100mL缓冲液QF将质粒洗脱到清洁的250mL离心瓶中。
14.使质粒通过以下方法沉淀：向含有洗脱质粒的250mL离心瓶加入70mL RT异丙醇并充分混合。
15.使用JLA 16.250转子将该混合物在15,000xg’、4℃离心30'。弃去上清液。
16.将沉淀用10mL RT 70％乙醇冲洗并再次在15,000xg，10min，4℃，JLA 16.250转子的条件下旋转。弃去上清液。注意：沉淀看起来应该是纯白色。
17.通过在纸巾上以约45度角翻转离心瓶，将沉淀空气干燥约20分钟。向沉淀中加入2mL无核酸酶的水。在4℃孵育过夜后，将沉淀重新悬浮并转移至15mL锥形管中，然后在4℃储存。从每2.4L总培养物体积的收率应为10mg至15mg。
18.使用这些方法，制备了约100mg的pgWizGFP并用于制备pgWizGFP-CholestosomesTM。
从肉豆蔻酸胆固醇酯/月桂酸胆固醇酯制备pgWizGFP-CholestosomesTM)
将5mL 4mg/mL纯化的pgWizGFP储液加入15ml锥形管中并在55℃平衡。同时，将80mg肉豆蔻酸胆固醇酯和75mg月桂酸胆固醇酯(NU Check Prep；Elysian，MN)放入100ml圆底烧瓶(RBF)中并用5ml乙醚溶解。然后将具有溶解的酯的烧瓶放在Rotovapor R-3(Buchi，New Castle，DE)上以在没有真空的情况下在55℃以速度设定4旋转10分钟，然后另外暴露于低真空下10分钟。然后除去RBF，然后将预平衡的4mg/mL pgWizGFP储液加入到RBF中，并在Elmasonic P超声波仪(Tovatech，Maplewood，NJ)中在50℃超声处理20分钟(90％功率，35kHz)。在超声处理期间每隔5分钟旋转RBF。然后将得到的pgWizGFP-CholestosomesTM通过无菌40μm尼龙筛网过滤器(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)过滤。为了分离未包封的FITC，然后将制剂通过0.22u过滤器重力过滤，确保除去的体积以规则的间隔被流体替换。将制剂储存在4℃直至分析并用于细胞研究。
从肉豆蔻酸胆固醇酯/棕榈酸胆固醇酯制备pgWizGFP胆固醇体。
将5ml 3.6mg.ml纯化的pgWizGFP储液加入15ml锥形管中并在55℃平衡。同时将75.5mg肉豆蔻酸胆固醇酯和83.5mg棕榈酸胆固醇酯(NU Check Prep；Elysian，MN)放入100ml圆底烧瓶(RBF)中并用5ml氯仿溶解。然后将具有溶解的酯的烧瓶放在Rotovapor R-3(Buchi，New Castle，DE)上，在65℃在没有真空的情况下以速度设定4旋转10分钟，然后另外暴露于低真空下10分钟。然后除去RBF，然后将预平衡的3.6mg/mL pgWizGFP储液加入到RBF中，并在Elmasonic P超声波仪(Tovatech，Maplewood，NJ)中于57℃超声处理20分钟(90％功率，35kHz)。在超声处理期间每隔5分钟旋转RBF。然后将得到的pgWizGFP-CholestosomesTM通过无菌40μm尼龙筛网过滤器(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)过滤。为了分离未包封的FITC，然后将制剂通过0.22u过滤器重力过滤，确保除去的体积以规则的间隔被流体替换。将制剂储存在4℃直至分析并用于细胞研究。
pgWizGFP-CholestosomesTM分析：
使用Nanobrook 90Plus PALS(Brookhaven，Holtsville，NY)进行CholestosomesTM的动态光散射(DLS)分析。使用HPLC测定脂质浓度，并与适当的标准曲线(LCMS 2020，Shimadzu，Columbia，MD)比较。通过使用BioSpec-nano分光光度计(Shimadzu，Columbia，MD)测量260nm处的吸光度来确定DNA浓度。
细胞内递送研究和成像
为了测试pgWizGFP-CholestosomesTM的细胞内递送性质(将200ul胆固醇体包封的pgWizGFP制剂添加到MCF-7细胞的培养基中，并以Cheng 1996(23)的方式测试细胞中绿色荧光蛋白变体的存在，作为监测随时间推移哺乳动物细胞中基因转移和表达的手段。
图37显示用由肉豆蔻酸胆固醇酯/棕榈酸胆固醇酯制成的pgWizGFP胆固醇体(上图，在30小时)和由肉豆蔻酸胆固醇酯/月桂酸酯制成的pgWizGFP胆固醇体(下图，在24小时)处理的MCF7细胞的图像。在每个图中，最左边的图像是相差，下一个是绿色荧光通道，下一个是红色荧光通道，最右边是合并图像。图像显示两种制剂均用pgWizGFP质粒负载MCF7细胞，表达绿色荧光。培养基对照图(未显示)具有可忽略的荧光，与背景自发荧光一致。总体而言，图像显示出令人惊讶的强烈的pgWizGFP-CholestosomesTM细胞摄取，随后是GFP质粒在这些细胞内的明显复制行为。在这些GFP表达实验期间，细胞保持存活并且未显示完整性丧失。
在加入培养基后24小时，获取图38中肉豆蔻酸胆固醇酯/棕榈酸胆固醇酯GFP胆固醇体的读数。显示了用由肉豆蔻酸胆固醇酯/棕榈酸胆固醇酯制备的pgWizGFP胆固醇体(上图)和由肉豆蔻酸胆固醇酯/月桂酸胆固醇酯制备的pgWizGFP胆固醇体(中图)和添加至培养基的单独的pgWizGFP(下图)处理24小时的ARPE-19人视网膜细胞的图像。在每个图中，最左边的图是相差，下一个是绿色荧光通道，下一个是红色荧光通道，最右边是合并图像。图像显示两种制剂均用pgWizGFP质粒负载ARPE-19细胞，在24小时导致绿色荧光表达。单独的pgWizGFP在24小时显示可忽略的荧光，表明质粒很少自发进入细胞(未显示)。总体而言，图像显示出令人惊讶的强烈的pgWizGFP-CholestosomesTM细胞摄取，随后是GFP质粒在这些细胞内的明显复制行为。在这些GFP表达实验期间，细胞保持存活并且未显示完整性丧失。
实施例10.胆固醇体在癌症免疫疗法中的用途
该实施例描述了针对实体瘤患者的完全个性化的免疫疗法。当可以切除肿瘤并得到组织以加工成自体免疫治疗组合物时，可以实施本发明的全部范围，所述自体免疫治疗组合物被纯化然后包封在胆固醇体中，任选地与佐剂一起包封。在本发明的一个方面，所述构建体可以通过直接注射到所述患者的肿瘤中来施用。在另一个优选的方面，所述组合物可以装入胶囊中，然后将胶囊肠溶包衣以在口服给药后在pH 7.3-7.6下释放所述组合物。当以这种方式实施本发明时，所述组合物仅在回肠和潜在的阑尾处递送。应用于回肠的胆固醇体包封的免疫治疗组合物被Peyers Patches中的回肠内衬的树突细胞摄取，以及这些树突细胞调节CD4+和CD8+细胞以攻击在其身体位置表达靶向癌抗原的所述癌细胞。实例包括黑素瘤、所有类型的肺癌、结肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌和脑肿瘤如胶质母细胞瘤。
树突细胞暴露于抗原和佐剂
树突细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞。在过去十年中，DC在癌症患者免疫治疗中的使用已大大增加。高内吞能力以及启动初级T细胞应答的独特能力使DC成为此目的最有效的候选者。尽管通过注射给予DC接种偶尔会导致肿瘤消退，但对这种方法的应答是适度的。在第一方面，本发明通过将活性肿瘤组合物包封在胆固醇体中克服了这些限制，从而确保其可靠地进入树突细胞。在第二方面，待靶向的树突细胞是远端肠道回肠中的PeyersPatches的淋巴响应组织的那些。
已经使用多种方法将肿瘤相关抗原(TAA)与树突细胞(DC)一起作为细胞佐剂递送。衍生自单核细胞前体的DC已经使用多种策略用全肿瘤抗原刺激，以及已经证明诱导了CD4+和CD8+抗肿瘤应答。在本研究中，单核细胞衍生的DC已用来自同种异体黑素瘤细胞系A-375的裂解物刺激，并用于反复刺激T细胞。检查所得T细胞对A-375靶标以及HLA A2阳性黑素瘤细胞系DFW的细胞毒活性。通过DC摄取FITC标记的黑素瘤裂解物确定了黑素瘤细胞的裂解物被有效地内吞。用裂解物脉冲的DC刺激导致T细胞的强烈增殖应答，其可被针对MHC I类和II类的抗体抑制。
用裂解物刺激的DC在体外刺激的T细胞显示出针对黑素瘤靶标的有效细胞毒性，该毒性被针对MHC I类的抗体阻断。裂解物刺激的DC也在ELISPOT测定中测量时引发T细胞的IFNγ分泌。我们还研究了裂解物刺激的DC向T细胞呈现黑素瘤相关抗原的能力。使用黑素瘤相关抗原的合成肽(例如gp100、mage1、NY-ESO和MART-1)的ELISPOT测定显示，裂解物刺激的DC可以以抗原特异性方式刺激T细胞。结果表明，来自同种异体肿瘤细胞的裂解物可用作刺激黑素瘤中肿瘤特异性T细胞的抗原来源。(24)
自体肿瘤的采集和处理
在将患者肿瘤标本(自体样本)提交加工成胆固醇体的每种情况下，肿瘤处理的第一步将是形成“裂解物”
本说明书中使用的术语“裂解物”是指固化的肿瘤物质在水、生理盐水和缓冲溶液等水性介质中的分散状态，其程度使得肉眼无法观察到任何固体物质，以及在一定程度上，弥散体可被抗原呈递细胞吞噬。然而，该术语不应以任何限制方式解释。在本说明书的实施例中具体描述了固定肿瘤物质的制备、微粒制备和裂解物制备的细节。因此，本领域技术人员可以通过参考上述一般说明和实施例中的具体说明来制备所需的微粒或裂解物，以及如果需要，可以适当地修改或改变这些方法。
肿瘤裂解和裂解物中的抗原构建体的处理将在使用离心分离级份之前进行。收集的级份各自作为针对患者T细胞的抗原进行测试。在非限制性实例中，合适的佐剂是脂多糖(LPS)。为了分析外周血中的T细胞应答，将通过密度梯度离心分离PBMC，计数并通过添加肽和同源BMDC再刺激。应该增加IL-2和IFNγ作为检测应答性的方式。用MHC II类阻断抗体(20mg/ml克隆M5/114，BioXcell)进行T细胞应答的亚型分型。所有样品将一式两份或一式三份进行测试。
所述患者肿瘤裂解物的显示T细胞应答性的级份将通过包封到胆固醇体中来加工。加工成胆固醇体的这些活性级份将与LPS佐剂组合，并准备口服递送给作为所述肿瘤来源的患者。
在所有情况下，将在切除肿瘤的同时采集适合分离PBMC的血液样品。所述血液样品将用于测试在实验室中作为抗原加工的对完整肿瘤及其组分的体外应答。
同种异体肿瘤的得到和处理
对于没有可得到的肿瘤用于如本发明所述的制剂的患者，将使用从血液样本中收获的患者T细胞进行该程序，以及将针对抗原处理相同类型的同种异体肿瘤(以肿瘤裂解物开始，如对自体肿瘤所做的那样)，或者针对已知用于所述肿瘤类型的“常见抗原”测试患者T细胞，其可以由黑素瘤的gp100、卵巢癌或肝细胞癌的NY-ESO-1或本领域公开的其他物质组成。
用裂解物刺激的DC在体外刺激的T细胞显示出针对黑素瘤靶标的有效细胞毒性，所述黑素瘤靶标被针对MHC I类的抗体阻断。裂解物刺激的DC也在ELISPOT测定中测量时引发T细胞的IFNγ分泌。我们还研究了裂解物刺激的DC向T细胞呈现黑素瘤相关抗原的能力。使用黑素瘤相关抗原的合成肽(例如gp100、mage1、NY-ESO和MART-1)的ELISPOT测定显示，裂解物刺激的DC可以以抗原特异性方式刺激T细胞。结果表明，来自同种异体肿瘤细胞的裂解物可用作刺激黑素瘤中肿瘤特异性T细胞的抗原来源。(24)
出于本发明的目的，在该测试程序中被认为与患者自身T细胞反应的任何抗原可适合于制备于胆固醇体中，只要那些胆固醇体一旦制备成胆固醇体后将引发患者的T细胞的免疫应答。ELISPOT测定法可用于鉴定由患者T细胞的抗原识别产生的细胞因子。
ELISPOT测定实施例：IFN-γELISPOT试剂盒(Dakewei，China)用于测定用肽过夜活化后表达细胞因子的T细胞的频率。简而言之，将T细胞(每孔105个)和肽(50μg/ml)加入到一式两份孔中，并以1:5～1:10的比率(DC:T)加入DC，持续18～20h。在加入稀释的检测抗体(1:100稀释)之前洗涤板，然后在37℃孵育1小时。洗涤板后，加入链霉抗生物素蛋白-AP(1:100稀释)并在37℃再孵育1小时。然后将AEC溶液混合物加入每个孔中，并将板在室温在黑暗中放置约15-25分钟，然后加入去离子水以停止显影。通过Elispot CTL Reader(CellTechnology Inc，Columbia，MD)扫描板，并用Elispot软件(AID，Strassberg，Germany)分析结果。(25)
另外一种获取用于本发明的组织组合物的方法
对于没有可得到的肿瘤用于如本发明所述的制备的患者，使用从血液样本中收获的患者T细胞进行该过程，另外针对取自所述患者的血液的外泌体进行测试。这些癌症外泌体的来源可以是患者体外生长的肿瘤，然后收集上清液并分离外泌体。任选地，可以使用血液浓缩技术例如Aethlon Hemopurifier(Aethlon Medical，San Diego，CA)直接从患者的血液中收集外泌体。(26)
对于具有可得到肿瘤并且可快速得到全基因组测序的患者，该过程将用于衍生用于胆固醇体递送囊泡的聚-新表位mRNA癌症免疫治疗抗原构建体。肿瘤特异性突变是癌症免疫疗法的理想靶标，因为它们在健康组织中缺乏表达，以及可被成熟的T细胞谱系识别为新抗原。每个患者的肿瘤都有一组独特的突变('mutanome')，必须首先通过全基因组测序鉴定。将新抗原加工成可注射的疫苗构建体，其在小鼠中很好地起作用。该方法正在进行1期先导试验人体测试，以及被认为是基于单个患者疫苗/免疫疗法的“及时”生产的治疗进展。该方法的新颖方面是将构建体包封在胆固醇体中，添加佐剂，然后将该构建体递送至回肠，以便在Peyers Patches中直接编程所述患者的树突细胞。这种方法具有革命性，以及取决于包封所有类型的抗原的胆固醇体可被直接摄入监测远端肠道的抗原物质的树突细胞中的独特性质。
理想情况下，这里提出的方法从切除的自体肿瘤开始，并整合下一代测序、计算免疫学和合成基因组学领域的进展，以定义对该肿瘤特异的基于广谱的新表位靶标库。一次针对多个突变可在理论上为解决当前癌症药物开发中的关键问题铺平了道路，例如克隆异质性和抗原逃逸(27)
该构建体在当前的I期试验中注射。因此，发明人认为，通过口服递送至回肠，胆固醇体递送至树突细胞通过极大地扩展成功激活树突细胞的机会而在改善安全性方面将是完全新颖的并且最具有重要性。
尽管过去裂解物作为T细胞活化剂取得了微小的成功，但本发明仍继续依赖于使用自体肿瘤裂解物作为疫苗抗原。预期所述策略对肿瘤复发是有效的，因为肿瘤裂解物应含有可刺激CD4+辅助性T细胞(适应性免疫应答)和CD8+T细胞(先天性免疫应答)的所有相关表位。问题似乎在于树突细胞的无效调节，或针对抗原呈递细胞(APC)抗原的T细胞的活化无效。本发明通过将抗原呈递步骤靶向Peyer's Patches中的树突细胞克服了这些限制。本发明进一步通过使用佐剂和通过在胆固醇体中包封抗原和佐剂来确保所述树突细胞的活化，使得它们更容易被Peyer's Patches中的树突细胞吸收。本发明克服了过去通过外周注射肿瘤裂解物对树突细胞的无效活化。
就其本身而言，作为从自体肿瘤开始的过程，在胆固醇体中使用这些抗原并靶向Peyer's Patches将不太可能引发T细胞针对宿主的非癌组织和器官的自身免疫激活。同样地，患者的免疫系统不应该对新激活的T细胞发起攻击，因此如在CAR-T程序中一样使用免疫抑制剂也应该没有实际意义。在本发明中避免了当前T细胞活化方法的两个问题。
与先前使用皮下注射抗原作为癌症中的免疫激活剂不同，本发明依赖于口服给药。然而，有必要避免前胃肠道的降解，以便到达回肠中的免疫系统编程位点。因此，将抗原配制在本发明的外囊中，使得抗原和任选的佐剂完整递送至回肠并在Peyer's Patches中活化。口服使用的创造性步骤避免了对树突细胞的离体抗原编程的需要，以及当然避免了离体产生合适质量的活化T细胞的需要。本质上，本发明人首次使用来自所述患者肿瘤本身的组合物调节针对肿瘤的T细胞，以及所有激活和扩增步骤在它们通过体外细胞因子表达被证实具有活性后在体内进行。
接受的肿瘤的必要量应至少为1克，优选为5克或更多。一旦在发明人的实验室中接收，将新鲜肿瘤切碎，用PBS洗涤以除去血液，然后用胶原酶(0.5mg/ml，Cat#C5138，Sigma-Aldrich)在37℃消化至少1小时。然后将碎片通过100-mm细胞过滤器以得到单细胞悬浮液。
使用冷冻-解冻循环从细胞悬浮液制备肿瘤裂解物，最佳循环数为5，以确保抗原混合物中不存在活细胞。用于制备裂解物的冷冻解冻方法是本领域熟知的(28)。通过离心进一步分离抗原组合物以除去>10微米的大颗粒。此时可以将佐剂加入反应混合物中。
将粗过滤的和富含膜的肿瘤裂解物级份悬浮在PBS中，体积约为1.0ml，如本发明人先前所公开的(13,29)，将该混合物包封在胆固醇体中。
然后将胆固醇体包封的级份冻干，并将冻干的材料置于胶囊递送中用于回肠靶向。将这些胶囊口服给予切除肿瘤的患者，将所述组合物靶向递送至阑尾附近的回肠和/或升结肠。
为了克服胃肠道中抗原的降解，所述发明将所述肿瘤裂解物抗原包封在脂质囊泡中。当制剂在回肠处释放抗原组合物并且包封的囊泡到达Peyer's Patches时，载有抗原的囊泡优先进入树突细胞，因为这种性质通过包封在胆固醇体中传递。在进入树突细胞的胆固醇体组合物周围没有内体形成，因此当胆固醇体的外表面被细胞质中的胆固醇水解酶除去时，抗原和佐剂在细胞质中游离，以允许树突细胞识别和在激活期间包装以呈现给T–细胞。
这种方法第一次允许使用能够激活树突细胞或在一些情况下无害地通过肠道而不被吸收的组合物在回肠中激活树突细胞。除了口服施用肿瘤裂解物组合物的安全性优点之外，所述组合物在囊泡中的包封确保仅通过树突细胞摄取抗原和佐剂，所述树突细胞带有针对患者肿瘤的调节激活的T细胞。
此外，与目前可注射形式的制造相比，口服剂型的制造对患者的要求较低且当然更令人愉悦。如果对口服使用的应答不足以根除所述患者的肿瘤，也可以应用胆固醇体包封的构建体的替代递送，例如直接注射到肿瘤中。
肿瘤抗原颗粒的制备方法没有特别限制，可应用的方法包括，例如，研磨固化的肿瘤组织以制备细小碎片的微粒的方法，以及裂解肿瘤组织或肿瘤细胞的碎片以将裂解物固定在固体微粒上的方法，其是将可溶性肿瘤抗原如抗原肽和抗原蛋白固定至固体微粒等上的方法。作为固体微粒，可以使用例如直径约0.05-1,000μm的铁粉、碳粉、聚苯乙烯珠等。可用的微粒包括与脂质颗粒(例如脂质体)结合的研磨组织碎片、肿瘤细胞或可溶性肿瘤抗原，以便被抗原呈递细胞识别为微粒以允许吞噬作用，或通过结合可溶性肿瘤抗原得到的微粒本身，通过使用粘合剂或交联剂彼此相互连接。
含有肿瘤组分混合物的胆固醇体囊泡的尺寸不是特别限制，尽管需要允许通过体内受体介导的内吞作用容易地进入细胞的尺寸。没有必要研磨最初处于小单细胞状态的固定肿瘤细胞。然而，当固定操作期间细胞聚集时，希望应用研磨或分散处理。对于研磨或分散处理，可以使用均化器处理、超声处理、用消化酶部分消化等。微粒也可以通过孔径不大于1,000微米，优选不大于380微米的筛网来制备。这些微粒的制备是本领域技术人员公知的，以及技术人员可以通过单一适当的方法或多种方法的组合制备微粒。
作为从固化的肿瘤材料制备裂解物的方法，例如，可以应用使用蛋白水解酶的方法。蛋白水解酶的实例包括蛋白酶K。还可以使用采用了蛋白水解酶以外的酶、酸、碱等的适当组合的方法。可以使用任何可以实现固化的肿瘤材料裂解的方法，以及本领域技术人员可以选择合适的方法。裂解物可以固定至上述固体微粒。
口服回肠递送胆固醇体包封的免疫治疗剂
所述口服递送回肠靶向的胆固醇体包封的免疫治疗构建体和佐剂如胆固醇体包封的LPS，将使用本发明人先前公开的肠溶包衣的回肠靶向胶囊作为癌症疫苗的递送方式来完成。所公开的口服递送胶囊被特别包衣以在回肠处释放其外部内容物及在阑尾部位的右结肠中释放其内部内容物(30)。整个公开内容在此引入作为参考，因为先前未尝试将该递送应用于胆固醇体包封的构建体。
在本发明的具体实践中，含有胆固醇体包封的部分和LPS或其他佐剂的口服递送胶囊将被靶向以在回肠处释放这些部分，所述回肠是Peyer's Patches的位点，其是具有许多树突状T细胞的浓缩淋巴组织，用于监测和粘膜表面免疫防御。回肠是树突细胞介导的T细胞免疫的部位。任选地，内囊将在右结肠的阑尾处释放，用于刺激B细胞免疫。
与检查点抑制剂的组合治疗
接受这些口服胆固醇体级份治疗(或仅由含有填充剂的胶囊组成的相同安慰剂)的患者将任选地给予PD-1单克隆抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗)，PD-L1单克隆抗体(例如阿特珠单抗)和任选的CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)。患者还可任选地用IL-2或一般免疫系统激活剂如干扰素接受细胞因子刺激。根据各自制造商的说明，胃肠外给予这些后一种治疗中的一种或多种。白细胞介素2(IL-2)和伊匹单抗的非特异性免疫刺激可导致癌症持续消退，尽管每种药物的总体肿瘤应答率很小(高剂量IL-2为16％，伊匹单抗为11％)，完全应答(CR)率低于10％。用伊匹单抗联合大剂量IL-2治疗的36例黑色素瘤患者的先导性试验的总体应答(OR)率为25％，其中17％达到持续超过8年的CR；然而，这种IL-2加伊匹单抗组合尚未进一步测试以证实这些结果。最近报道抗PD1和抗PD-L1抗体在黑素瘤患者中的OR率分别高达38％和17％，与伊匹单抗联合使用时OR率高达40％，不过应答的长期耐久性尚不清楚。
尽管用肿瘤裂解物负载的树突状细胞(DC)进行免疫治疗是诱导抗肿瘤免疫应答的最有希望的策略之一，但细胞毒性T细胞的抗肿瘤活性可受其抑制性T细胞共受体细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)表达的抑制，这是一种检查点抑制剂途径。通过减轻这种限制，CTLA-4阻断抗体促进肿瘤排斥，但其最适合的应用的全部范围尚未完全确定。
其他人已经研究了与肿瘤裂解物联用的检查点抑制剂。作为在C3H小鼠骨肉瘤(LM8)模型中的临床前概念，CTLA-4阻断与原发肿瘤中冷冻处理的肿瘤裂解物刺激的DC的协同作用以防止肺转移的生长。为了评估免疫应答激活，作者建立了以下四组C3H小鼠(总共60只小鼠)：i)对照免疫球蛋白G(IgG)处理的小鼠；ii)肿瘤裂解物刺激的DC处理的小鼠；iii)抗-CTLA-4抗体处理的小鼠和iv)肿瘤裂解物刺激的DC-和抗-CTLA-4抗体处理的小鼠。接受肿瘤裂解物刺激DC和抗CTLA-4抗体的小鼠显示出调节性T淋巴细胞数量减少和转移性肿瘤内CD8+T淋巴细胞数量增加，转移性生长受抑制，寿命延长，脾脏中的调节性T淋巴细胞数量减少和高血清干扰素-γ水平。将抗-CTLA-4抗体与肿瘤裂解物刺激的DC组合可增强全身免疫应答。这些发现首次记录了肿瘤裂解物刺激的DC和CTLA-4阻断抗体的组合在骨肉瘤中的作用。作者提出，冷冻处理的肿瘤裂解物刺激DC虽然其本身不足以产生以下效果，但可在临床环境中与骨肉瘤患者中的CTLA-4阻断相结合时介导转移性病变的排斥并防止疾病复发。(31)
鉴于肿瘤裂解物的这些有希望的结果，检查点抑制剂可以作为单独的处理与裂解物组合，或者，可以将检查点抑制剂添加到胆固醇体中作为直接到达树突细胞、T细胞或癌细胞上的受体的方式。这些化合物通常是单克隆抗体，经受本发明提出的胆固醇体包封的单克隆抗体的实例显示出相似尺寸分子的良好包封，以及细胞模型中的细胞内递送。
因此，本发明的一个优选方面是在本发明的口服递送胶囊中包括肿瘤抗原和检查点抑制剂以及佐剂。
在设计用于克服肿瘤的高水平PD-1表达的另一个实施方案中，包封在胆固醇体中的抗原混合物将含有对PD-L1和PD-L2特异的siRNA寡核苷酸。siRNA介导的人T细胞上PD-1配体的敲低增强了这些细胞的功能，包括IFN-g产生和CTL活性。因此，本发明人将胆固醇体包封的siRNA的抗PD-1寡核苷酸加入递送至Peyer's Patches的组合物中，以减少活化T细胞表面上靶PD-1表达蛋白的细胞表面和mRNA表达。通过实时逆转录酶-PCR证实siRNA寡核苷酸降低的PD-1配体。当将所述siRNA添加到组合物中时，检查上清液中干扰素-g(IFNg)的存在，以及通过T细胞克隆的PD-L1或PD-L2表达的siRNA相关敲低将揭示IFN-g产生的增加。此外，siRNA转染的CD8+T细胞克隆对体外裂解物抗原表现出增加的裂解活性。
除了PD-1阻断剂之外，在胆固醇体包封的混合物中结合T细胞兴奋性细胞因子是另一种实施方案，以进一步活化针对肿瘤抗原的树突细胞。IL-2和IL-12适用于此目的，因为已经证明两种细胞因子在常规使用中激发针对肿瘤的T细胞。回肠递送的胆固醇体包封以包括肿瘤裂解物、PD-1抗体和细胞因子如IL-12的组合物都在本发明的范围内。
另一个实施方案是包括刺激物质，其激活抗原呈递细胞如树突细胞并改善T细胞引发。这种物质可以是TLR9激动剂，最近公开的IMO-2125等。目前，IMO-2125被注射到肿瘤微环境中，因此与检查点抑制剂如伊匹单抗或派姆单抗联合治疗。在临床前研究中，肿瘤内注射IMO-2125刺激的浆细胞样树突细胞以诱导大量干扰素α和辅助T细胞-1细胞因子，导致肿瘤微环境中免疫细胞浸润增加。此外，与单独的任一种药剂相比，肿瘤内IMO-2125与抗-CTLA-4或抗-PD-1抗体的组合导致改善的全身肿瘤控制。预期胆固醇体包封的IMO-2125的使用将强烈刺激树突细胞，从而当将该物质注射到肿瘤中时改善活化步骤。使用胆固醇体包封的IMO-2125递送至回肠中的树突细胞也在本发明的范围内。胆固醇体包封的IMO-2125将与有效量的全身注射的检查点抑制剂组合施用，或者与口服施用的胆固醇体包封的检查点抑制剂组合施用，以增强肿瘤对检查点抑制剂的应答性。
使用流式细胞术方法监测接受所述免疫疗法的所有患者的体内肿瘤应答性和CD4+和CD8+T细胞的活化。肿瘤溶解/消退将由RECIST记录，并通过重复活检机械地记录，以显示肿瘤的T细胞浸润以及溶解和消退。
流式细胞术方法。
在治疗前一天，将MCF-7细胞以每孔750,000个细胞接种在12孔板上。第二天，除去培养基，用温(37℃)林格缓冲液(pH7.4)洗涤板两次。将细胞在补充的无血清DMEM中血清饥饿1.0小时，然后将2.3μg/mL FITC-胆固醇体一式三份加入含有无血清DMEM的孔中。未处理三个孔用作未染色的对照。将板在37℃孵育图1中的指定时间。处理后，用冰冷的林格氏液洗涤孔4次。如前所述制备细胞用于流式细胞术。在这些研究中未使用DRAQ5(核染色)，因为我们之前发现在我们定义的单细胞门中>90％的事件对DRAQ5染色呈阳性。
对于4.5小时+FBS，如上所述处理细胞：洗涤孔并在处理前1小时饥饿细胞。使细胞与FITC-胆固醇体一起孵育4.5小时，然后将FBS结合至孔中，最终浓度为10％v/v。这些孔中的总体积增加50μL，将最初的FITC-胆固醇体浓度稀释至2.1ug/mL。使细胞与FITC-胆固醇体一起孵育总共24小时，然后制备用于流式细胞术。
FITC-胆固醇体在MCF-7细胞内显示出时间依赖性积累，在治疗前30分钟检测到可测量的摄取。我们无法实现稳态动力学，这可以是由于这些研究所用的浓度。值得注意的是，在加入FITC-胆固醇体后4.5小时接受FBS加标(spike)的细胞显示出显著的囊泡摄取。平均荧光强度显著低于血清饥饿细胞，以及可能是由于(1)样品稀释(来自FBS添加)以及(2)来自细胞生长的信号稀释(血清饥饿的细胞生长停滞)。我们提供了第一个流式细胞仪数据，以支持在FITC浓度为2.3ug/mL的MCF-7细胞中FITC-胆固醇体的时间依赖性摄取。这些结果将使用荧光显微镜和/或在细胞裂解后在荧光计上测量细胞内FITC浓度来确认。
工业适用性
如上所述，本发明所述的组合物和方法使得能够提供优异且充分表征的抗原性和任选佐剂化的组合物，用于增强特定患者中特定肿瘤的杀伤。一些普遍适用的抗原可以允许实施本发明而无需对肿瘤本身进行取样，但这些是应用而不一定是本发明的优选实施方案。所公开的个性化口服免疫疗法已准备好用于患者，但确实需要在商业化之前得到监管机构的批准。
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Claims (86)

1.用于给予患者或受试者的组合物，所述组合物为药物剂型，其包含一种或多种包封在脂质囊泡中的大分子，以提供完整负载的囊泡，其中所述负载的囊泡的外表面包衣包含至少一种由胆固醇和C6-C26脂肪酸得到的胆固醇酯，所述大分子在所述患者或受试者的细胞中得到的细胞内浓度，该细胞内浓度为所述大分子在不存在所述囊泡的情况下得到的浓度的至少10倍。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述负载的囊泡的所述外表面包衣在所述负载的囊泡通过所述患者或受试者的细胞膜期间保持完整而没有内体形成，以及其中通过胆固醇酯水解酶作用于所述囊泡上，所述囊泡任选地在所述细胞内部释放所述一种或多种大分子。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述大分子选自蛋白质、肽、核酸及其混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述大分子的细胞内浓度为所述大分子在不存在所述囊泡时所得到的浓度的至少250倍。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述完整囊泡结合至所述患者或受试者的细胞，所述细胞表达所述乳糜微粒的表面受体，且通过所述细胞中的胆固醇酯水解酶作用于所述囊泡上，所述完整囊泡在所述细胞中释放所述大分子。
6.根据权利要求5的组合物，其中大分子在表达表面乳糜微粒受体的细胞中的细胞内浓度为大分子在所述患者或受试者的不表达表面乳糜微粒受体的细胞中的细胞内浓度的至少10倍。
7.根据权利要求5的组合物，其中大分子在表达表面乳糜微粒受体的细胞中的细胞内浓度为大分子在不形成负载的乳糜微粒的囊泡中的细胞内浓度的至少10倍。
8.根据权利要求2或3的组合物，其中大分子在表达表面乳糜微粒受体的细胞中的细胞内浓度为大分子在不形成负载的乳糜微粒的囊泡中的细胞内浓度的至少250倍。
9.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述完整负载的囊泡进入所述患者或受试者的细胞，以及所述细胞使用胆固醇酯水解酶从所述囊泡释放大分子，其中所述细胞任选地从所述细胞中排出一部分所述完整囊泡进入所述细胞周围的细胞外液。
10.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述完整囊泡在所述细胞中被胆固醇酯水解酶打开，以及所述大分子作用于所述细胞中的组分。
11.根据权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述细胞代谢所述大分子和/或从所述细胞中排出所述大分子。
12.根据权利要求1-11中任一项的组合物，其中所述大分子在包封入所述完整囊泡期间和在所述细胞中通过胆固醇酯水解酶释放时未改变，以及与包封在所述囊泡中的所述大分子相同并具有相同的活性。
13.根据权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述大分子是胰岛素。
14.根据权利要求1-13所述的组合物，其为口服剂型，其任选为肠溶包衣的，其中当通过皮下或静脉内注射向所述患者或受试者施用所述胰岛素时，所述大分子以曲线下面积(AUC)血液浓度的至少50％-100％的浓度到达所述患者或受试者的血流。
15.根据权利要求1-14中任一项的组合物，其进一步在所述囊泡的芯中具有与所述大分子组合的蛋白酶抑制剂。
16.根据权利要求15的组合物，其中所述蛋白酶抑制剂抑制所述细胞代谢所述大分子，以及其中所述细胞比不存在所述蛋白酶抑制剂时更多地将所述大分子排出到周围的细胞外液。
17.根据权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述囊泡包含胰岛素和至少一种另外的大分子。
18.根据权利要求17的组合物，其中所述组合物还包含所述胰岛素和/或所述另外的大分子的细胞外代谢抑制剂。
19.根据权利要求18的组合物，其为口服剂型，其中所述完整囊泡通过肠的肠上皮细胞并进入所述肠上皮细胞中的乳糜微粒中，以及其中所述患者或受试者中的细胞表达所述乳糜微粒的受体，以及所述细胞与缺乏所述乳糜微粒的表面受体的细胞相比得到所述胰岛素和所述额外的大分子的更高的细胞内浓度并释放更大量的所述胰岛素和所述额外的大分子。
20.根据权利要求17-19中任一项的组合物，其中所述另外的大分子是杆菌肽。
21.根据权利要求13-20中任一项的组合物，其还包含IDE抑制剂、DPP-IV抑制剂或其混合物。
22.根据权利要求13-20中任一项的组合物，其进一步包含GLP-1拮抗剂。
23.根据权利要求1-16中任一项的组合物，其在所述囊泡芯中包含两种大分子。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述第一大分子是胰岛素，所述第二大分子是GLP-1激动剂。
25.根据权利要求1-24中任一项的组合物，其中所述囊泡任选地包含所述大分子的细胞代谢抑制剂。
26.根据权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述大分子是曲妥珠单抗，以及其中所述曲妥珠单抗在pH5.5-6.5、优选约pH6.0以负载负荷的囊泡的总重量的40-60重量％负载到所述囊泡中。
27.根据权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述大分子是艾塞那肽，以及所述囊泡还包含DPP-IV抑制剂。
28.根据权利要求27的组合物，其中所述DPP-IV抑制剂是西他列汀、沙格列汀、利格列汀或其混合物。
29.根据权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述大分子是GLP-1分子，其经过修饰以改善对DPP-IV酶促降解的稳定性或经过修饰以延长其在血液中的循环时间。
30.根据权利要求29的组合物，其中所述GLP-1分子是利拉鲁肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽、利西拉肽、阿必鲁泰或其衍生物，以及所述组合物任选地包含所述药剂的细胞内代谢抑制剂。
31.根据权利要求29-30的组合物，其中所述大分子是选自利拉鲁肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽、利西拉肽、阿必鲁泰或其衍生物的GLP-1分子，以及所述组合物还包含选自以下的胰岛素：重组胰岛素、NPH胰岛素、慢胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、novolog或德谷胰岛素，以及所述组合物任选地包含所述GLP-1分子和所述胰岛素中的一种或两种的细胞内代谢抑制剂。
32.根据权利要求31的组合物，其中所述GLP-1药剂是利西拉肽，所述胰岛素是甘精胰岛素，以及任选的细胞内代谢抑制剂是西他列汀。
33.根据权利要求31所述的组合物，其中所述胰岛素是赖脯胰岛素，以及所述GLP-1是杜拉鲁肽，以及所述任选的抑制剂是利格列汀。
34.根据权利要求31的组合物，其中所述胰岛素是德谷胰岛素，所述GLP-1是索马鲁肽，以及所述任选的抑制剂是西他列汀。
35.根据权利要求31的口服药物组合物，其中所述胰岛素是Novolog，所述GLP-1是利拉鲁肽，以及所述任选的抑制剂是西他列汀。
36.根据权利要求13的组合物，其中所述大分子的口服给药使所述大分子在所述患者或受试者中的生物利用度至少为50％。
37.根据权利要求36的组合物，其中所述生物利用度为约85-100％。
38.根据权利要求13的组合物，其中所述大分子的口服给药产生的组织浓度为所述药剂的血浆浓度的至少10倍。
39.根据权利要求13的组合物，其中所述大分子的口服给药产生的组织浓度为所述药剂的血浆浓度的至少20倍。
40.根据权利要求13的组合物，其中所述大分子的口服给药产生的组织浓度高达所述药剂血浆浓度的250倍。
41.根据权利要求1-40中任一项的组合物，其中所述胆固醇酯是两种不同胆固醇酯的混合物。
42.根据权利要求41的组合物，其中所述胆固醇酯组分由脂肪酸得到，所述脂肪酸的长度相差超过两个碳单元。
43.根据权利要求41或42的组合物，其中所述胆固醇酯组分由脂肪酸得到，所述脂肪酸的长度相差不超过两个碳单元。
44.根据权利要求41或42的组合物，其中所述胆固醇酯组分由脂肪酸得到，所述脂肪酸的长度相差两个碳单元。
45.根据权利要求1-44中任一项的组合物，其中所述囊泡还包含有效量的磷脂酰丝氨酸以靶向细胞用于凋亡。
46.根据权利要求1-12或14中任一项的组合物，其中所述大分子是核酸。
47.根据权利要求46的组合物，其中所述核酸是pgWizGFP质粒。
48.根据权利要求1-12或14中任一项的组合物，其中所述大分子是疫苗，以及所述囊泡还包含佐剂。
49.根据权利要求1-48的组合物，其为口服剂型，其中所述囊泡包封在具有肠溶包衣的胶囊中，以在7.0-7.8的pH释放所述囊泡。
50.根据权利要求49的组合物，其中所述囊泡在pH7.4从所述胶囊中释放出来。
51.根据权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述大分子是胰岛素，以及所述另外的分子是蛋白酶抑制剂。
52.根据权利要求15或51的组合物，其中所述蛋白酶抑制剂选自：抑肽酶、大豆胰蛋白酶(SBTI)及其混合物。
53.根据权利要求51或52的组合物，其中所述胰岛素是重组胰岛素。
54.根据权利要求1-12的组合物，其中所述囊泡包含化合物，其为N-[10-(2-羟基苯甲酰基)氨基]癸酸钠(SNAC)、N-[10-(2-羟基苯甲酰基)氨基]癸酸钠(SNAD)或其替代盐，以及所述盐选自单钠盐、二钠盐及其组合。
55.根据权利要求1-54中任一项的组合物，还包含ω-3脂肪酸。
56.据权利要求1-55中任一项的组合物，还包含EDTA或其盐。
57.根据权利要求1-56中任一项的组合物，其为口服剂型，其包含抑制所述组合物在受试者胃中消化的包衣。
58.根据权利要求57的组合物，其中所述包衣是肠溶包衣或明胶包衣。
59.根据权利要求1-58中任一项的组合物，其中所述脂肪酸选自肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、Sapienic acid、油酸、反油酸，异油酸，亚油酸，反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸或其混合物。
60.一种制备多个负载大分子的脂质囊泡的方法，其中所述囊泡的外表面包衣包含至少一种由胆固醇和C6-C26脂肪酸得到的胆固醇酯，包括以下步骤：
1.通过超声混合以下：
a)极性溶剂混合物，其含有一种或多种大分子和任选的至少一种所述大分子的表面改性剂，和
b)非极性溶剂混合物，其包含至少一种选自肉豆蔻酸胆固醇酯和月桂酸胆固醇酯的非离子脂肪酸胆固醇酯，
其中将所述溶剂混合物a)和所述溶剂混合物b)超声处理直至在所述混合后所述一种或多种大分子、所述表面改性剂、所述至少一种脂肪酸胆固醇酯、所述非极性溶剂和所述极性溶剂形成囊泡的均匀分散体；和
2.蒸发所述非极性溶剂，从而将所述囊泡留在所述极性溶剂中，
其中每个所述囊泡包含外层和中空腔室，所述外层包含多个非离子脂肪酸胆固醇酯分子，所述腔室包含所述一种或多种大分子。
61.根据权利要求60的方法，其中步骤1.a)中的所述极性溶剂包含在pH范围为2.5-3.5(优选3)的缓冲液中的胰岛素，所述缓冲液中胰岛素的初始浓度范围为7.5-8.5mg/ml，优选8mg/ml，所述缓冲液的温度为35-39℃(优选37℃)，并将所述缓冲液(a)和所述非极性溶剂组合物b)的混合物超声处理20分钟。
62.根据权利要求60或61的方法，包括在步骤1或步骤2期间和/或之后对多个负载芯的所述囊泡进行分散步骤以防止聚集。
63.根据权利要求62的方法，其中所述分散步骤使用十二烷基硫酸钠进行。
64.根据权利要求61-63中任一项的方法，包括在步骤1、步骤2或所述分散期间和/或之后使用明胶悬浮液使多个负载芯的所述囊泡经受稳定化步骤。
65.一种组合物，其包含包封在脂质囊泡中的肿瘤裂解物或来自所述肿瘤裂解物的一种或多种大分子，其中所述囊泡的外表面包衣包含一种或多种胆固醇酯，所述胆固醇酯得自胆固醇和C6-C26脂肪酸(优选(C6)C6-C22脂肪酸或C6-C14脂肪酸)，其中所述囊泡的所述外表面包衣在所述组合物穿过细胞膜期间保持完整，使得所述囊泡及其芯在没有内体形成的情况下进入淋巴细胞，包括树突细胞，并通过细胞胆固醇酯水解酶的作用在所述细胞中释放所述包封的裂解物或抗原，其中所述裂解物或抗原在所述细胞中的细胞内浓度与从递送至所述细胞的未包封在所述囊泡中的相同浓度的肿瘤裂解物或抗原得到的细胞内浓度相比为至少10倍，优选至少250倍。
66.根据权利要求65的组合物，其中所述肿瘤裂解物包含大分子，所述大分子选自蛋白质、肽、核酸或其混合物，以及所述组合物是抗原。
67.根据权利要求65或66的组合物，其为口服剂型，其包含靶向以在7.3至7.6的pH释放所述肿瘤裂解物的包衣，其中所述肿瘤裂解物抗原针对患者或受试者的回肠中的树突细胞。
68.根据权利要求65-67中任一项的组合物，其中所述肿瘤裂解物是自体的。
69.根据权利要求67或68的组合物，其中所述回肠释放的组合物另外含有胆固醇体包封的佐剂，其包含一种或多种被证明激活树突细胞的物质。
70.根据权利要求69的组合物，其中所述佐剂是脂多糖(LPS)。
71.根据权利要求65-70中任一项的组合物，其中有效量的一种或多种检查点抑制剂单克隆抗体被任选地包封在所述囊泡中，所述检查点抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗或其混合物，以及所述组合物任选地包含佐剂，其包含一种或多种被证明激活树突细胞的物质。
72.根据权利要求71的组合物，其中所述佐剂是脂多糖(LPS)。
73.根据权利要求67-72中任一项的组合物，其中所述回肠释放的组合物另外含有用于树突细胞的胆固醇体包封的刺激物质，优选IMO-2125，以及其中在将树突细胞暴露于所述组合物后所述物质对所述树突细胞的活化通过干扰素γ浓度的增加来证实。
74.权利要求65-67和69-74的组合物，其中肿瘤裂解物的来源是同种异体的或来自待给予该组合物的患者以外的患者。
75.根据权利要求65、67和69-73中任一项的组合物，其中所述囊泡包含肿瘤抗原，而非肿瘤裂解物。
76.根据权利要求75的组合物，其中所述肿瘤抗原是gp100黑素瘤肿瘤抗原。
77.根据权利要求65、67、69-73和75中任一项的组合物，其中所述抗原是自体的聚-新表位mRNA癌症免疫治疗抗原构建体，其中所述抗原来源于待治疗患者的癌细胞。
78.根据权利要求65、67、69-73和75中任一项的组合物，其中所述聚-新表位mRNA癌症免疫治疗抗原构建体是同种异体的，其中所述抗原来源于指定类型的但并非从被治疗患者得到的癌细胞。
79.根据权利要求65、67、69-73和75中任一项的组合物，其中所述抗原组合物构建体是自体的，因此衍生自待治疗的所述患者的癌细胞分泌的外泌体，以及所述外泌体从所述患者血液或所述患者肿瘤细胞分离，以及其中所述囊泡任选地含有佐剂，以及所述组合物激活所述患者中针对癌细胞的细胞免疫应答。
80.根据权利要求65-78中任一项的组合物，还包含至少一种另外的抗癌剂。
81.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，包括口服给予所述患者权利要求65-79中任一项的组合物，其中所述组合物激活所述患者中针对癌细胞的细胞免疫应答。
82.根据权利要求65-78中任一项的方法，其中所述组合物与至少一种另外的抗癌剂共同施用。
83.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，包括将有效量的权利要求65-79中任一项所述的组合物直接注射到所述患者的肿瘤中，其中所述组合物激活所述患者中针对癌细胞的细胞免疫应答。
84.根据权利要求82的方法，其中所述组合物与至少一种另外的抗癌剂共同施用。
85.根据权利要求81-83中任一项的方法，其中所述细胞免疫应答通过当所述组合物暴露于所述患者的T细胞时响应于所述组合物的刺激而释放的IL-2或IFNγ被体外检测。
86.根据权利要求65-81中任一项的组合物，其中所述胆固醇体包含月桂酸胆固醇酯或棕榈酸胆固醇酯中的一种或多种和肉豆蔻酸胆固醇酯。
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