CN110389181A

CN110389181A - 一种快速检测增液口服液中指标性成分含量的方法

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Publication number: CN110389181A
Application number: CN201810360789.XA
Authority: CN
Inventors: 林鹏飞; 张亚珊; 谢猛章; 冯凤桃; 谢丽玉; 王海燕; 刘秀珍; 孟书舫; 宋涵
Original assignee: FUJIAN MINDONG REJUVENATION PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: FUJIAN MINDONG REJUVENATION PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2019-10-29

Abstract

本发明涉及一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，尤其是一种快速检测中药复方制剂增液口服液指标性成分含量的方法。本发明方法，应用高效液相色谱法‑紫外检测法一次性同时测定中药复方制剂中的梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷四种成分的含量。解决了同时对玄参、地黄两味药材进行指标性成分含量检测的难题，避免了对四种指标性成分多次检测的时间和试剂耗费。本方法具有操作简便，灵敏度高，精密度好，重复性高，稳定可靠，工作效率高的优点。

Description

一种快速检测增液口服液中指标性成分含量的方法

技术领域

本发明涉及中药检测领域，涉及一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，尤其是一种快速检测中药复方制剂增液口服液中指标性成分含量的方法。

背景技术

增液口服液源出清·吴鞠通《温病条辨》之增液汤方，由玄参、地黄、山麦冬组成，治疗阳明温病，津液不足，伤津便秘，口渴，舌干红或病人阴虚体弱不耐攻下等。

增液汤药味少，用量大，味精而力宏。本方以苦甘咸寒之玄参为君，玄参入肺、胃、肾经，又善入营血分，凉营养阴生津，兼能散结解毒，利咽喉，通小便血滞；臣佐以山麦冬，甘、微苦，微寒，入肺、心、胃经，养阴润肺，益胃生津，清心除烦，滋肠通便；地黄，甘、寒，入心、肝、肾经，清热凉血，养阴生津，润肠，通经逐血痹。三药合用质润而多汁，以咸寒佐以甘寒为特点，不仅可滋上焦肺津，中焦胃津，而且可滋下焦肝肾之阴津，并能入营血分，凉营清心，散结解毒通络，以滋润之中兼以通散为特点。三味药配伍后的特殊功能为“妙在寓泻于补，以补药之体，作泻药之用，既可攻实，又可防虚”，将本方运用于治疗中焦阳明温病，依据中医整体观念与辨证论治究之，邪之所感，随处可传，在温病的辨证过程中，上、中、下三焦的病变往往不可截然划分，病机有时相互交错，增液汤凉营清热，并能滋养上、中、下三焦之阴津，据此，不论在温病或在杂病过程中，只要出现了阴液亏损，或阴伤兼营血分郁热，表现为增液汤证者，即可用增液汤化裁治之。

现有增液口服液的药品标准中，仅以玄参中的哈巴俄苷为检测指标，并不足以全面衡量增液口服液中的药品质量。

2015年《中华人民共和国药典》第一部第117页公开了药材玄参含量测定的指标性成分有哈巴苷(C₁₅H₂₄O₁₀)、哈巴俄苷(C₂₄H₃₀O₁₁)；2015年《中华人民共和国药典》第一部第124-125页公开了药材地黄含量测定的指标性成分有梓醇和毛蕊花糖苷。然而，上述四种指标性成分在检测时使用了三套不同的高效液相色谱条件。

即目前现有技术仅公开了对增液口服液单个药材中的某一种或两种成分分别采用高效液相色谱进行含量测定的方法，只能片面地反映增液口服液的质量，若对各指标性成分都进行检测，则极为耗时、繁琐。鉴于此，本申请的发明人拟建立一种检验效率高、定量准确的检测方法，以满足增液口服液多种指标性成分一次性快速检测其含量的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，尤其是一种快速检测中药复方制剂增液口服液指标性成分含量的方法。本检测方法能一次性地快速检测所述复方制剂中的4种指标性成分，高效、全面地衡量该复方制剂的质量，弥补现有技术的不足。

增液口服液由玄参、地黄、山麦冬组成，其药液的制备方法如下：山麦冬加水浸泡30分钟后煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.16(60℃)，备用；玄参、地黄加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约500ml，冷却后，加乙醇至含醇量达60％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至相对密度为1.03(60℃)，与上述山麦冬提取液合并，加入对羟基苯甲酸乙酯0.3g、苯甲酸0.5g，搅匀，煮沸，放冷，加水调整总量至1000ml，滤过，滤液静置48小时，取上清液分装，灭菌，即得。

本发明在对增液口服液组方进行研究分析的基础上，确定了需测定含量的该中药复方制剂的指标性成分，其中的玄参和地黄为方中首要的、针对疾病起主要治疗作用的药物，哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、毛蕊花糖苷在药材中含量较多，且为《中国药典》规定的检测指标，故选为指标性成分；山麦冬在《中国药典》中仅有定性检查皂苷C，故暂不列入指标性成分。

本发明提供一种检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，该方法中的指标性成分为梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷，使用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.03％磷酸溶液为流动相，按照下表梯度洗脱：

时间(min)	乙腈	0.03％磷酸	流速(ml/min)
				0.00	0.7	99.3	0.9
9.00	0.7	99.3	0.9
				13.00	4.0	96.0	1.0
25.00	4.0	96.0	1.0
				28.00	15.0	85.0	1.0
54.00	15.0	85.0	1.0
				57.00	24.0	76.0	1.0
79.00	24.0	76.0	1.0
				80.00	0.7	99.3	0.9
90.00	0.7	99.3	0.9

进一步地，本发明的方法，使用紫外检测法，在如下时间点和检测波长进行检测：

时间(min)	0.00	30.00	30.10	60.00	60.10	90.00
							波长(nm)	205	205	334	334	205	205

本发明的方法，还进一步包括制备对照品溶液的步骤，对照品溶液用乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3的溶液溶解。

优选的，制得的对照品溶液每1ml中含梓醇240μg、哈巴苷120μg、毛蕊花糖苷15μg、哈巴俄苷40μg。

本发明的方法，还进一步包括制备供试品药液的步骤，供试品药液用乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3的溶液溶解，并进行超声处理。优选的，超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

优选的，各指标性成分峰理论板数不低于3000。

优选的，本发明使用外标法测定各指标性组分的含量。

具体的，本发明的检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液：分别取梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷对照品适量，用乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液溶解并稀释制成每1ml中含梓醇240μg、哈巴苷120μg、毛蕊花糖苷15μg、哈巴俄苷40μg的溶液，即得；

(2)制备供试品药液：精密量取中药复方制剂5.0mL于25mL容量瓶中，加乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液15mL，用功率250W、频率40kHz的超声处理15分钟，取出，放至室温，加乙腈：0.03％磷酸＝0.7：99.3溶液定容、摇匀，经0.45μm有机滤膜滤过，即得；

(3)液相色谱仪测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，用外标法测定四种指标性成分的含量。

使用的高效液相色谱法的条件为，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.03％磷酸溶液为流动相，各指标性成分峰理论板数不低于3000，按下表梯度洗脱：

使用紫外检测法，并按如下时间点和波长进行检测：

本发明的检测方法尤其适用于包含玄参和地黄的中药复方制剂，且所述中药复方制剂可以是各种制剂形式，例如口服液、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂等。

进一步优选的，本发明所述的中药复方制剂为增液口服液。

本发明的检测方法可用于制定中药复方制剂质量控制的标准方法。

检测结果显示，本发明所采用的色谱分析条件其线性、精密度、重复性、稳定性和加样回收率均良好，且均符合2015版《中国药典》规定。

本发明建立的高效液相色谱-紫外检测法这一高效快速检测方法，能一次性检测增液口服液中的4种指标性成分含量，避免了对这4种成分必须多次进行检测所产生时间和试剂的耗费的缺陷。

本发明检测方法解决了测定梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷这4种成分干扰多的问题。

本发明检测方法本方法具有操作简便，灵敏度高，精密度好，重复性高，稳定可靠，工作效率高的优点。

本发明检测方法不但可以更加全面有效地控制增液口服液的质量，以及控制具有主要治疗作用的玄参、地黄药材的质量，也可进一步作为增液口服液及含有玄参、地黄的制剂质量控制的标准方法。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1：参考2015版《中国药典》方法测定增液口服液(160701)中哈巴苷和哈巴俄苷含量的色谱图。

图2：参考2015版《中国药典》方法测定增液口服液(160701)中哈巴苷和哈巴俄苷含量的方法专属性叠加图。

图3：参考2015版《中国药典》方法测定增液口服液(160701)中毛蕊花糖苷含量的色谱图。

图4：参考2015版《中国药典》方法测定增液口服液(160701)中毛蕊花糖苷含量的方法专属性叠加图。

图5：参考2015版《中国药典》方法测定增液口服液(160701)中梓醇含量的色谱图。

图6：方法A测定增液口服液(160701)中4种指标性成分含量的色谱图。

图7：方法A测定增液口服液(160701)中4种指标性成分含量的方法专属性叠加图。

图8：方法B测定对照品混合溶液中4种指标性成分含量的色谱图，其中1是梓醇，2是哈巴苷，3是毛蕊花糖苷，4是哈巴俄苷；

图9：方法B测定增液口服液(160701)中4种指标性成分含量的色谱图，其中1是梓醇，2是哈巴苷，3是毛蕊花糖苷，4是哈巴俄苷。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

本发明实施例中采用的仪器与试药如下：

Agilent1260高效液相色谱仪，G1315DDAD检测器，赛多利斯BAS224A电子分析天平，乙腈为HPLC级，其他试剂为分析纯，梓醇(由中国食品药品检定研究院，批号:110808-201210)、哈巴苷(由中国食品药品检定研究院，批号:111729-201506)、毛蕊花糖苷(由中国食品药品检定研究院，批号:111530-201512)、和哈巴俄苷(由中国食品药品检定研究院，批号:111730-201508)。

增液口服液药液制备：山麦冬加水浸泡30分钟后煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.16(60℃)，备用；玄参、地黄加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约500ml，冷却后，加乙醇至含醇量达60％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至相对密度为1.03(60℃)，与上述山麦冬提取液合并，加入对羟基苯甲酸乙酯0.3g、苯甲酸0.5g，搅匀，煮沸，放冷，加水调整总量至1000ml，滤过，滤液静置48小时，取上清液分装，灭菌，即得。

实施例1参考2015版《中国药典》对增液口服液中指标性成分的含量检测

参考2015版《中国药典》玄参、地黄药材含量检测方法，进行微调后建立如下方法：

1.1增液口服液中玄参药材中哈巴苷及哈巴俄苷含量测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.03％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm。理论板数按哈巴俄苷与哈巴苷峰计算均应不低于5000。

对照品溶液的制备取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加3 0％甲醇制成每1ml含哈巴苷60μg、哈巴俄苷20μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备精密吸取增液口服液样品溶液5ml于50ml容量瓶中，用3 0％甲醇定容，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液(弃去前3ml)，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

方法系统适用性

检测结果详见表1、图1、图2。

表1系统适用性

性能	理论塔板数	分离度/前	分离度/后
				哈巴苷	29359	1.69	2.28
哈巴俄苷	246298	2.82	1.99

结果显示，用该方法检测哈巴苷及哈巴俄苷含量，基本实验参数良好，初步认为可用作增液口服液中哈巴苷及哈巴俄苷含量测定。

1.2增液口服液中地黄药材中毛蕊花糖苷含量测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％醋酸溶液(16:84)为流动相；检测波长为334nm。理论板数按毛蕊花糠苷峰计算应不低于5000。

对照品溶液制备取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加流动相制成每lml含10μg的溶液，即得。

供试品溶液制备精密吸取增液口服液样品溶液10ml于50ml容量瓶中，用流动相定容，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液(弃去前3ml)，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

方法系统适用性

检测结果详见表2、图3、图4：

表2系统适用性

性能	理论塔板数	分离度/前	分离度/后
				哈巴苷	7122	2.63	1.85

结果显示，该方法系统适用性良好，初步认为可以用于增液口服液中毛蕊花糖苷含量测定。

1.3增液口服液中地黄药材中梓醇含量测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(1：99)为流动相；检测波长为210mn。理论板数按梓醇峰计算应不低于5000。

对照品溶液制备取梓醇对照品适量，精密称定，加流动相制成每lml含10μg的溶液，即得。

供试品溶液制备精密吸取样品溶液10ml于50ml容量瓶中，用流动相定容，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液(弃去前3ml)，即得。

方法系统适用性

检测结果见图5。

通过图5可知，采用2015版药典地黄药材梓醇含量测定方法来测定增液口服液中梓醇含量存在较大的干扰，难以分开，故参考药典方法很难实现增液口服液中梓醇含量的测定。

总结：参考2015版《中国药典》玄参、地黄药材含量检测方法进行方法建立，首先，虽然结果显示参考《中国药典》可以进行增液口服液中哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷的含量测定，但是测定需要采用多种方法及多次检测；其次，该方法也无法很好地进行增液口服液中梓醇含量的测定，故总体来说，药典方法的简单实用性和可实现性不好。

实施例2增液口服液指标性成分含量检测

考虑对以上药典方法进行拟合，同时在拟合方法中对梓醇指标成分测定条件进行摸索，以期可以同时进行增液口服液中梓醇、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷的含量测定，测试如下方法A：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(依利特C18，4.6×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.03％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm。各指标性成分理论板数均应不低于3000。

对照品溶液的制备分别取对照品梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷，精密称定，用乙腈：0.1％磷酸＝1:99溶液稀释，制成每1ml含约含梓醇60μg、哈巴苷60μg、毛蕊花糖苷10μg、哈巴俄苷20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备精密量取供试品(批号160701)约10ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释，定容，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液(弃去前3ml)，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

方法系统适用性

检测结果见表3、图6、图7。

表3系统适用性

性能	理论塔板数	纯度	分离度/前	分离度/后
					梓醇	12270	932	4.79	1.61
哈巴苷	239713	997	1.57	1.75
					毛蕊花糖苷	805564	998	1.85	1.99
哈巴俄苷	1081922	994	1.86	3.26

结果显示，该方法用于检测梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷量检测，基本实验参数可达到要求。

方法学验证结果显示，该方法专属性较差，在哈巴苷的位置上存在较为明显的干扰，并且通过摸索无法进行分离，详见图7。

实施例3增液口服液指标性成分含量检测

继续对药典方法进行拟合摸索，以保证可以同时进行增液口服液中梓醇、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷的含量测定，测试如下方法B：

按下述方法步骤快速检测中药复方制剂增液口服液中的指标性成分含量。

对照品溶液的制备：分别取梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷对照品适量，精密称定，置同一容量瓶中，用乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液溶解并稀释制成每1ml中约含梓醇240μg、哈巴苷120μg、毛蕊花糖苷15μg、哈巴俄苷40μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备:精密量取制得的增液口服液药液5.0mL于25mL容量瓶中，加乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液15mL，超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟，取出，放至室温，加乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液定容、摇匀，经0.45μm有机滤膜滤过，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，用外标法测定4种指标性成分的含量；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.03％磷酸溶液为流动相，按如下洗脱梯度表洗脱，按如下检测时间和波长检测，各指标性成分峰理论板数不得低于3000。

洗脱梯度表

检测波长设置表

对照品溶液与供试品溶液的色谱图请分别见图8和图9。

如下实施例4-8，未具体说明的方法步骤，均按照实施例1的方法进行。

实施例4线性试验

精密吸取不同浓度的混合对照品溶液各20μl进行测定，结果如表4所示。

表4各指标线性关系考察结果

结果表明，梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷分别在29.23μg/mL-935.48μg/mL、14.15μg/mL-452.65μg/mL、1.99μg/mL-63.53μg/mL、4.84μg/mL-154.83μg/mL范围内线性关系良好。

实施例5精密度试验

精密吸取对照品溶液20μL，重复进样6次，测定峰面积积分值，测定结果如表5所示。

表5各指标精密度考察结果

测定结果表明，各成分精密度均良好，能够满足测定需要。

实施例6重复性试验

精密量取增液口服液5.0mL各6份，按照供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，测定含量，测定结果如表6所示。

表6各指标重复性测定考察结果

测定结果表明，本方法的重复性良好。

实施例7稳定性试验

精密量取增液口服液5.0mL，按照供试品溶液制备方法制备1份供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液20μL，分别在0、9、19、32、47小时进样1次，测定峰面积积分值，结果如表7所示。

表7各指标稳定性试验考察结果

测定结果表明，供试品溶液在47小时内稳定性良好。

实施例8回收率试验

采用加样回收法，精密量取增液口服液2.5mL(共6份)，分置25mL容量瓶中，另分别加入梓醇960μg/mL、哈巴苷490μg/mL、毛蕊花糖苷60μg/mL、哈巴俄苷160μg/mL的溶液对照品溶液3.0mL加入容量瓶，加乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液定容至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液20μL，并按含量测定方法进行测定，计算回收率，结果如表8、表9、表10、表11所示。

表8梓醇加样回收率试验结果(n＝6)

表9哈巴苷加样回收率试验结果(n＝6)

表10毛蕊花糖苷加样回收率试验结果(n＝6)

表11哈巴俄苷加样回收率试验结果(n＝6)

测定结果表明，各成分加样回收率均良好。

总结：由实施例3-8可知，本发明建立的快速检测方法能一次性高效检测增液口服液中的4种指标性成分含量，具有操作简便、灵敏度高、精密度好、重复性高的特点，可作为增液口服液及同时或部分含有玄参、地黄的制剂质量控制的标准方法。

Claims

1.一种检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，其特征在于，该方法中的指标性成分为梓醇、哈巴苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷，使用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.03％磷酸溶液为流动相，按照下表梯度洗脱：

。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用紫外检测法，在如下时间点和检测波长进行检测：

。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，还包括制备对照品溶液的步骤，对照品溶液用乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3的溶液溶解。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，制得的对照品溶液每1ml中含梓醇240μg、哈巴苷120μg、毛蕊花糖苷15μg、哈巴俄苷40μg。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于，还包括制备供试品药液的步骤，供试品药液用乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3的溶液溶解，并进行超声处理，优选的，超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于，各指标性成分峰理论板数不低于3000。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于，使用外标法测定各指标性组分的含量。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)制备供试品药液:精密量取中药复方制剂5.0mL于25mL容量瓶中，加乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液15mL，用功率250W、频率40kHz的超声处理15分钟，取出，放至室温，加乙腈：0.03％磷酸＝0.7:99.3溶液定容、摇匀，经0.45μm有机滤膜滤过，即得；

(3)液相色谱仪测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，用外标法测定四种指标性成分的含量；

使用的高效液相色谱法的条件为，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.03％磷酸溶液为流动相，按下表梯度洗脱，各指标性成分峰理论板数不低于3000，

使用紫外检测法，并按如下时间点和波长进行检测：

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述的中药复方制剂包含玄参和地黄。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的中药复方制剂为增液口服液。