CN110373433A - 一种避免co抑制产乙酸菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使含CO的气态底物发酵的方法。通过在发酵期间控制CO浓度和使高或低CO浓度的影响最大限度地减小，所述方法有效减少迟滞时间，并使培养物保持在稳定态。所述方法包括将合成气提供到第一发酵区域，使合成气发酵，并测定第一发酵区域内发酵培养基中的CO浓度。如果第一发酵区域内发酵培养基中的CO浓度具有约0.12mM或更大计算值，则将提供到第一发酵区域的合成气的至少一部分提供到一个或多个后续发酵区域，其量有效提供在任何后续发酵区域中约0.12mM或更小的计算CO浓度。

Description

一种避免CO抑制产乙酸菌的方法
本申请是申请日为2013年9月18日，申请号为201380060089.4，发明名称为“一种避免CO抑制产乙酸菌的方法”的发明专利的分案申请。
本申请要求均在2012年9月19日提交的美国临时申请61/702,824、61/702,826、61/702,832和61/702,837的权益，所有申请均通过引用以全文并入本文。
本发明提供一种使含CO的气态底物发酵的方法。更具体地讲，所述方法包括测定第一发酵区域内第一发酵培养基中的CO浓度。如果第一发酵培养基中的CO浓度具有约0.12mM或更大计算值，则将提供到第一发酵区域的合成气的至少一部分提供到一个或多个后续发酵区域，其量有效提供在任何后续发酵区域中约0.12mM或更小的计算CO浓度。
背景
产乙酸微生物可从一氧化碳(CO)通过气态底物发酵产生乙醇。用厌氧微生物从梭菌属(Clostridium)发酵产生乙醇和其它有用产物。例如，美国专利5,173,429描述杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 49587，一种从合成气产生乙醇和乙酸盐的厌氧微生物。美国专利5,807,722描述用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 55380使废气转化成有机酸和醇的方法和装置。美国专利6,136,577描述用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ATCC No. 55988和55989使废气转化成乙醇的方法和装置。
很多产乙酸微生物不适用于工业规模生物处理，因此，未显示用于这种用途的工业可行性。这些微生物具有慢倍增时间和低总生产率。另外，用于基因操作的很多技术(敲除、转基因通过整合过表达或游离基因质粒传播)低效、费时、费力或不存在。
可使产乙酸微生物生长，以从一氧化碳产生乙醇。生长过程可包括基于随时间增加的CO量培养产乙酸菌。可使产乙酸微生物从包含一氧化碳的合成气生长以产生乙醇。生长过程可包括基于随时间增加的CO量培养产乙酸菌。发酵中高或低CO水平可导致较低生产率。
概述
一种有效用于在合成气发酵期间保持高乙醇生产率水平的方法。通过在发酵期间控制CO浓度和使高或低CO浓度的影响最大限度地减小，所述方法有效减少迟滞时间，并使培养物保持在稳定态。
合成气发酵方法包括将合成气提供到第一发酵区域，使合成气发酵，并测定第一发酵区域内发酵培养基中的CO浓度。根据该方法，如果第一发酵区域内发酵培养基中的CO浓度具有约0.12mM或更大计算值，则将提供到第一发酵区域的合成气的至少一部分提供到一个或多个后续发酵区域，其量有效提供在任何后续发酵区域中约0.12mM或更小的计算CO浓度。
在另一个方面，合成气发酵方法包括将合成气提供到第一发酵器，使合成气发酵，并测定第一发酵器内发酵培养基中的CO浓度。根据该方法，如果第一发酵器内发酵培养基中的CO浓度具有约0.12mM或更大计算值，则将提供到第一发酵器的合成气的至少一部分提供到一个或多个后续发酵器，其量有效提供在任何后续发酵器中约0.12mM或更小的计算CO浓度。
在另一个方面，发酵方法包括将合成气提供到发酵培养基，其量有效提供在发酵培养基中约0.15mM至约0.70mM的初始计算CO浓度。与初始细胞密度比较，该方法有效提高细胞密度。
附图简述
由以下附图，本方法的以上和其它方面、数个方面的特征和优点将更显而易见。
图1为具有多个发酵区域的发酵器的透视图。
图2为一系列发酵器的透视图。
图3图示说明使用高CO进料气体，通过保持顶部空间CO分压控制溶解CO浓度对杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)细胞质量的影响。
图4图示说明使用高CO进料气体，通过保持顶部空间CO分压控制溶解CO浓度对嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)细胞质量的影响。
图5图示说明使用低CO进料气体，CO浓度对杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)细胞质量的影响。
图6图示说明使用低CO进料气体，CO浓度对嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)细胞质量的影响。
图7显示CO进料速率对乙醇生产率、细胞质量、CO转化率和特异性CO摄取的影响。
图8图示说明在1x生长培养基和25ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图9图示说明在1x生长培养基和35ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图10图示说明在1x生长培养基和40ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图11图示说明在1x生长培养基和45ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图12图示说明在1x生长培养基和50ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图13图示说明利用较高初始接种物，在1x生长培养基和50ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图14图示说明利用较高初始接种物，在1.5x生长培养基和45ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图15图示说明利用较高初始接种物，在1.5x生长培养基和35ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图16图示说明利用较高初始接种物，在1.5x生长培养基和30ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
图17图示说明利用较高初始接种物，在1.5x生长培养基和20ml/min合成气进料速率下，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的生长。
在附图的数个视图中，由始至终，相应的附图标记表示相应组件。技术人员应了解，为简单和清楚起见说明附图中的元件，不一定按比例绘制。例如，附图中一些元件的尺寸可能相对于其它元件放大，以帮助增进了解本发明方法和装置的不同方面。同样，为了便于这些不同方面的较少阻挡的视图，通常未描绘在商业可行方面有用或必要的普通但众所周知的元件。
详述
以下描述不应以限制意义理解，而只为了描述示例性实施方案的一般原理作出。本发明的范围应参照权利要求确定。
本文所述利用培养基和产乙酸菌在生物反应器中进行的合成气发酵有效用于提供合成气中的CO至醇和其它产物的转化。通过测定发酵培养基中CO浓度对发酵中CO浓度的控制有效提供高生产率水平。在此方面，生产率可表示为STY(空时产率，表示为g乙醇/(L·天))。在此方面，所述方法有效用于提供至少约10g乙醇/(L·天)的STY(空时产率)。可能的STY值包括约10g乙醇/(L·天)至约200g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约10g乙醇/(L·天)至约160g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约10g乙醇/(L·天)至约120g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约10g乙醇/(L·天)至约80g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约20g乙醇/(L·天)至约140g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约20g乙醇/(L·天)至约100g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约40g乙醇/(L·天)至约140g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约40g乙醇/(L·天)至约100g乙醇/(L·天)。
定义
除非另外定义，否则在整个本说明书关于本公开使用的以下术语限定如下，且可包括以下限定定义的单数或复数形式：
修饰任何量的术语“约”是指在真实世界条件遇到的该量的变化，例如，在实验室、中试装置或生产设施。例如，在由“约”修饰时，在混合物或量中利用的成分或测量的量包括在生产设备或实验室内在试验条件测量中通常利用的变化和关注程度。例如，在由“约”修饰时，产物的组分的量包括在设备或实验室在多个试验中批料之间的变化，和在分析方法中固有的变化。无论是否由“约”修饰，所述量包括这些量的等效量。本文所述和由“约”修饰的任何量也可作为未由“约”修饰的量用于本公开。
术语“合成气”或“合成气体”是指合成气体，它是对包含不同量一氧化碳和氢的气体混合物给予的名称。制备方法的实例包括天然气或烃蒸汽重整以产生氢，煤的气化，和一些类型的废物至能量气化设备。这一名称来自其作为产生合成天然气(SNG)和制备氨或甲醇的中间体的用途。合成气易燃，且通常用作燃料源或用作制备其它化学品的中间体。
术语“发酵器”包括由一个或多个容器和/或塔或管布置组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、泡罩塔、气升发酵器、膜反应器(例如，中空纤维膜生物反应器(HFMBR))、静态混合器或适用于气体-液体接触的其它容器或其它装置。
术语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等旨在包括过程的生长阶段和产物生物合成阶段二者。在一个方面，发酵指CO转化成醇。
术语“细胞密度”指微生物细胞质量/单位体积发酵培养液，例如克/升。
在与发酵过程相关使用时，术语“提高效率”、“提高的效率”等包括提高发酵中一种或多种微生物生长速率、消耗的每体积或质量底物(例如，一氧化碳)产生的所需产物(例如，醇)的体积或质量、所需产物的生产速率或生产水平和与其它发酵副产物比较产生的所需产物的相对比例。
合成气
合成气可从任何已知源提供。在一个方面，合成气可源自含碳物质气化。气化包括在限制氧供应中生物质的部分燃烧。所得气体主要包含CO和H2。在此方面，合成气包含至少约10%摩尔CO，在一个方面，至少约20%摩尔，在一个方面，约10至约100%摩尔，在另一个方面，约20至约100%摩尔CO，在另一个方面，约30至约90%摩尔CO，在另一个方面，约40至约80%摩尔CO，在另一个方面，约50至约70%摩尔CO。适合的气化方法和装置的一些实例提供于美国专利序列号61/516,667、61/516,704和61/516,646，所有这些专利均提交于2011年4月6日；和美国专利序列号13/427,144、13/427,193和13/427,247，所有这些专利均提交于2012年3月22日，所有这些专利均通过引用结合到本文中。
根据合成气组成，合成气可直接提供到发酵过程，或者可进一步改变以包括适合的H2:CO摩尔比。在一个方面，提供到发酵器的合成气具有约0.2或更大的H2:CO摩尔比，在另一个方面，约0.25或更大，在另一个方面，约0.5或更大。在另一个方面，提供到发酵器的合成气可包含约40%摩尔或更多的CO+H2和约30%摩尔或更少的CO，在另一个方面，约50%摩尔或更多的CO+H2和约35%摩尔或更少的CO，在另一个方面，约80%摩尔或更多的CO+H2和约20%摩尔或更少的CO。
在另一个方面，该方法具有支持从气态底物制备醇的应用性，例如，高体积含CO的工业烟道气。在一些方面，包含CO的气体从含碳废物得到，例如工业废气，或从其它废物气化得到。因此，这些方法代表用于捕集原本会排入环境的碳的有效过程。工业烟道气的实例包括在铁类金属产品生产、非铁产品生产、炼油过程、煤的气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦生产期间产生的气体。
在一个方面，气体分离器构造成基本分离至少一部分气流，其中该部分包含一种或多种组分。例如，气体分离器可从包含以下组分CO、CO2和H2的气流分离CO2，其中可使CO2通到CO2去除器，其余气流(包含CO和H2)可通到生物反应器。可利用在本领域已知的任何气体分离器。在此方面，提供到发酵器的合成气具有约10%摩尔或更少CO2，在另一个方面，约1%摩尔或更少CO2，在另一个方面，约0.1%摩尔或更少CO2。
某些气流可包含高浓度CO和低浓度H2。在一个方面，为了达到较高的醇制备和/或总碳捕集效率，可期望优化底物流的组成。例如，在物流通到生物反应器之前，可提高底物流中H2的浓度。
根据本发明的特定方面，可组合和/或混合来自两种或更多种源的物流，以产生合乎需要和/或优化的底物流。例如，包含高浓度CO的物流，例如，来自钢厂转炉的排气，可与包含高浓度H2的物流混合，例如，来自钢厂焦炉的排气。
根据含CO的气态底物的组成，也可期望在引入发酵之前将其处理，以去除任何不合需要的杂质，例如尘粒。例如，可用已知方法过滤或洗涤气态底物。
生物反应器设计和操作
在一个方面，发酵器设计可包括相同发酵器中不同的发酵区域。例如，大发酵器或泡罩塔类型反应器可包括不同的发酵区域。发酵器设计的说明描述于美国专利序列号13/471,827和13/471,858，二者提交于2012年5月15日；和美国专利序列号13/473,167，提交于2012年5月16日，所述专利全部通过引用结合到本文中。
如图1中所示，发酵器100包括多个发酵区域200。如图所示，发酵器100包括第一发酵区域200和4个另外的发酵区域201, 202, 203, 204。在另一个方面，发酵器100可包括两个或更多个发酵区域，并且可包括2至10个发酵区域。发酵区域限定为高于气体入口/分布器122且低于下一个气体入口/分布器122，或高于气体入口/分布器122和发酵器100的顶部的空间。发酵器100中的培养基、微生物和气体305可在发酵区域之间流动。发酵器100也可包括泵124。泵124可用于产物222去除和样品210去除。
在一个方面，合成气通过合成气供应120进入发酵器100。合成气供应120将合成气提供到气体入口/分布器122。培养基和营养物可通过培养基/营养物供应250提供。排气可通过排气口270离开发酵器100。排气可提供到排气锅炉。可用排气锅炉提供用于能源生产的蒸汽。
根据一个方面，通过向反应器容器加入培养基开始发酵过程。培养基组合物的一些实例描述于美国专利序列号61/650,098和61/650,093，提交于2012年5月22日；和美国专利7,285,402，提交于2001年7月23日，所述专利均通过引用结合到本文中。可使培养基灭菌，以去除不合需要的微生物，并用所需的微生物接种反应器。可能不总是需要灭菌。
在一个方面，所用微生物包括产乙酸菌。可用产乙酸菌的实例包括梭菌属(Clostridium)产乙酸菌，例如杨氏梭菌(lostridium ljungdahlii)菌株，包括WO 2000/68407、EP 117309、美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 1998/00558和WO2002/08438中所述的那些菌株；自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSMZ的DSM 10061和DSM 19630, 德国)菌株，包括WO 2007/117157和WO 2009/151342中所述的那些菌株；和拉格利梭菌(Clostridium ragsdali) (P11, ATCC BAA-622)及巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi)(CP11, ATCC BAA-1772)，包括分别描述于美国专利7,704,723和“Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”(来自生物质产生的合成气的生物燃料和生物产物), Hasan Atiyeh, 提出于Oklahoma EPSCoR AnnualState Conference, 2010年4月29日的那些菌株；及食羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans) (ATCC PTA-7827)，描述于美国专利申请2007/0276447。其它适用的微生物包括穆尔菌(Moorella)属，包括穆尔菌种(Moorella sp. ) HUC22-1；和羧基嗜热菌(Carboxydothermus)属。这些文献分别通过引用结合到本文中。可使用两种或更多种微生物的混合培养物。
可用细菌的一些实例包括凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi) CP11(ATCC BAA-1772)、产生性布洛提菌(Blautia producta)、嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous)、太平洋地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、产氢羧基嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸杆菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)P262 (DSM 19630 of DSMZ 德国)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 19630, DSMZ 德国)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 10061, DSMZ 德国)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 23693, DSMZ 德国)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(DSM 24138, DSMZ 德国)、食羧基梭菌(Clostridium carboxidivorans) P7(ATCC PTA-7827)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)(ATCC PTA-10522)、德可氏梭菌(Clostridium drakei)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) PETC(ATCC 49587)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) ERI2(ATCC 55380)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) C-01(ATCC 55988)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) O-52(ATCC 55889)、大梭菌(Clostridium magnum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum (DSM 525, DSMZ Germany)、拉格利梭菌(Clostridium ragsdali) P11(ATCC BAA-622)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热醋酸梭状芽胞杆菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridiumultunense)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热乙酸穆尔氏菌(Morrella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Morrella thermoautotrophica)、芬妮产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)及它们的混合物。
在接种时，确立初始进料气体供应速率以有效提供初始微生物种群。分析流出气体，以确定流出气体含量。用气体分析结果控制进料气体速率。在此方面，该过程提供约0.5至约0.9的计算CO浓度:初始细胞密度比，在另一个方面，约0.6至约0.8，在另一个方面，约0.5至约0.7，在另一个方面，约0.5至约0.6。
在达到所需水平时，从反应器抽取液相和细胞物质，并用培养基补充。该方法有效使细胞密度提高到约2.0克/升或更大，在另一个方面，约2至约25克/升，在另一个方面，约2至约20克/升，在另一个方面，约2至约10克/升，在另一个方面，约2至约8克/升，在另一个方面，约3至约6克/升，在另一个方面，约4至约5克/升。
在另一个方面，发酵过程包括将合成气提供到发酵培养基，其量有效提供在发酵培养基中约0.15mM至约0.70mM的初始计算CO浓度，在另一个方面，约0.15mM至约0.50mM，在另一个方面，约0.15mM至约0.35mM，在另一个方面，约0.20mM至约0.30mM，在另一个方面，约0.23mM至约0.27mM。与初始细胞密度比较，方法有效提高细胞密度。
在另一个方面，方法有效保持约0.001至约1.0的计算CO浓度(mM):细胞密度(克/升)比。在另一个方面，计算CO浓度:细胞密度比为约0.01至约0.9，在另一个方面，约0.01至约0.8，在另一个方面，约0.02至约0.8，在另一个方面，约0.02至约0.75，在另一个方面，约0.03至约0.75，在另一个方面，约0.03至约0.5。
在一个方面，将合成气提供到第一发酵区域200。如果第一发酵区域200中的计算CO浓度为约0.12mM或更大，则将提供到第一发酵区域200的合成气的至少一部分通过气体入口/分布器122提供到一个或多个后续发酵区域。提供到一个或多个后续发酵区域的合成气部分提供在任何后续发酵区域中约0.12mM或更小的计算CO浓度，在另一个方面，约0.10mM或更小，在另一个方面，约0.08mM或更小，在另一个方面，约0.06mM或更小，在另一个方面，约0.04mM或更小，在另一个方面，约0.02mM或更小。
合成气可每次一个地提供到各发酵区域，或者，可同时提供到一个或多个发酵区域。在此方面，进入发酵区域的合成气具有约20%摩尔或更多CO，在另一个方面，约30%摩尔或更多，在另一个方面，约40%摩尔或更多，在另一个方面，约50%摩尔或更多。
在另一个方面，提供到任何发酵区域的合成气具有约0.2或更大的H2:CO摩尔比，和约4%摩尔至约99.9%摩尔CO。在另一个方面，进入任何后续发酵区域的合成气具有约0.5或更大的H2:CO摩尔比，在另一个方面，约1.0或更大，在另一个方面，约3.5或更大。
发酵器设计的另一个方面显示于图2中。在此方面，设计包括第一发酵器100，第一发酵器100串联连接到后续发酵器，例如第二发酵器102、第三发酵器104和第四发酵器106。设计可包括1至约10的任何个数的后续发酵器(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个后续发酵器)。
在一个方面，合成气通过气体入口/分布器120进入第一发酵器100。合成气分散和进一步混合用连接到传动轴200的至少一个气体分散叶轮225和至少一个混合叶轮220完成。
合成气150可输送到一个或多个后续生物反应器。合成气150可每次一个地提供到串联的各后续发酵器，或者，可同时提供到并联的一个或多个后续发酵器。在此方面，进入任何后续发酵器的合成气具有约20%摩尔或更多CO，在另一个方面，约30%摩尔或更多，在另一个方面，约40%摩尔或更多，在另一个方面，约50%摩尔或更多。
在另一个方面，提供到任何后续发酵器的合成气具有约0.2或更大的H2:CO摩尔比，和约4%摩尔至约99.9%摩尔CO。在另一个方面，进入任何后续发酵器的合成气具有约0.5或更大的H2:CO摩尔比，在另一个方面，约1.0或更大，在另一个方面，约3.5或更大。
在另一个方面，来自第一或任何后续发酵器的排气可提供到排气锅炉。可用排气锅炉提供用于能源生产的蒸汽。
醇生产率
H2:CO和/或CO2:CO的特定比率有效用于提供提高的STY。在此方面，所述方法有效用于提供约1g或更大总醇/(L·天)的STY(空时产率)。在另一个方面，所述方法有效用于提供至少约10g总醇/(L·天)的STY。可能的STY值包括约10g总醇/(L·天)至约300g/(L·天)，在另一个方面，约10g总醇/(L·天)至约200g总醇/(L·天)，在另一个方面，约10g总醇/(L·天)至约160g总醇/(L·天)，在另一个方面，约10g总醇/(L·天)至约120g总醇/(L·天)，在另一个方面，约10g总醇/(L·天)至约80g总醇/(L·天)，在另一个方面，约20g总醇/(L·天)至约140g总醇/(L·天)，在另一个方面，约20g总醇/(L·天)至约100g总醇/(L·天)，在另一个方面，约40g总醇/(L·天)至约140g总醇/(L·天)，在另一个方面，约40g总醇/(L·天)至约100g总醇/(L·天)。
本文所用“总醇”包括乙醇、丁醇、丙醇和甲醇。在一个方面，总醇可包含至少约80%重量或更多乙醇。在另一个方面，总醇可包含至少约25%重量或更少丁醇。
在一个相关方面，生产率可表示为STY(空时产率，表示为g乙醇/(L·天))。在此方面，所述方法有效用于提供至少约10g乙醇/(L·天)的STY(空时产率)。可能的STY值包括约10g乙醇/(L·天)至约200g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约10g乙醇/(L·天)至约160g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约10g乙醇/(L·天)至约120g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约10g乙醇/(L·天)至约80g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约20g乙醇/(L·天)至约140g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约20g乙醇/(L·天)至约100g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约40g乙醇/(L·天)至约140g乙醇/(L·天)，在另一个方面，约40g乙醇/(L·天)至约100g乙醇/(L·天)。
测定CO浓度–计算值
为了计算溶解CO，需要测定系统的传质系数(KLa)。KLa值取决于多种因素，例如反应器的结构、表面气体流速、未唤起体积、温度和搅拌功率。因此，KLa值因反应器条件而异。
亨利定律：P=KHC
亨利常数= KH = p/c (L (psi)/mol)
在38℃， KH = 17640 (L (psi)/mol)
在包含CO消耗菌的CSTR中，可用以下公式估计溶解CO。
KLa ((PCO (顶部空间)/KH) - (PCO (液体)/KH)) = COU
COU = 一氧化碳摄取(mol/L/min)
KLa = 传质系数(min-1)
(PCO (液体)/KH) = 溶解CO (mol/L)
在溶解CO = 0时
KLa = COU/ (PCO (顶部空间)/KH)
KLa ((PCO (顶部空间)/KH) - (PCO (液体)/KH)) = COU
KH = L(psi)/mol
通过计算测定CO浓度进一步在实施例中说明。
实施例
实施例1：使用高CO进料气体，利用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，用顶部空间分压作为引导将进料气体提供到培养物，以避免CO抑制
用1.28g/l活性生长(在合成气中)杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)接种包含改性1x乙醇培养基的New Brunswick和CelliGen 310生物反应器。在接种前，将反应器的搅拌速率设定到800rpm。分析以每1至4小时间隔从反应器所取的气体和液体样品的不同气体组分的消耗或产量、培养液乙酸浓度、培养液乙醇浓度和培养物的光学密度。还每日测定进料气体的组成，并通过调节到反应器的进料气体的质量流量控制器实时测定到反应器的流量。利用95% CO/5% N2的高CO组合物进料气体。
用以下方法调节到反应器的供气速率：
X = (顶部空间CO%/100) x (测量反应器压力(psig) + 大气压力/大气压力(14.7))
如果x为0.08或以下，则使到反应器的气流增加通往反应器的气体流速的当前mol值的7.6%
如果x为0.12或更高，则使到反应器的气流减小通往反应器的气体流速的当前mol值的7.6%
该方法有效用于使培养液中的溶解CO在约37至38℃保持低于0.12mmol/L。如图3中所示，细胞质量随时间增加，并在反应器接种后41.4小时内达到8.24g/L细胞质量。在此时，培养物正产生超过12g/L乙醇。
用Shimadzu GC-2014气相色谱测定培养液乙醇和乙酸浓度。用SRI 8610c气相色谱测定进料气体组分。
实施例2：使用高CO进料气体，利用嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)，用顶部空间分压作为引导将进料气体提供到培养物，以避免CO抑制。
用0.92g/l活性生长(在合成气中)嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)接种包含改性1x乙醇培养基的New Brunswick和CelliGen 310反应器。在接种前，将反应器的搅拌速率设定到800rpm。分析以每1至4小时间隔从反应器所取的气体和液体样品的不同气体组分的消耗或产量、培养液乙酸浓度、培养液乙醇浓度和培养物的光学密度。还每日测定进料气体的组成，并通过调节到反应器的进料气体的质量流量控制器实时测定到反应器的流量。利用95% CO/5% N2的高CO组合物进料气体。
用实施例1中所述的方法调节到反应器的供气速率。
如图4中所示，细胞质量随时间增加，并在反应器接种后68小时内达到7.88g/L细胞质量。在此时，培养物正产生5g/L乙醇。
用Shimadzu GC-2014气相色谱测定培养液乙醇和乙酸浓度。用SRI 8610c气相色谱测定进料气体组分。
实施例3：使用低CO进料气体，利用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，用低CO进料气体到培养物，以避免CO抑制。
用0.38g/l活性生长(在合成气中)杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)接种包含改性1x乙醇培养基的New Brunswick和CelliGen 310反应器。在接种前，将反应器的搅拌速率设定到800rpm。分析以每1至4小时间隔从反应器所取的气体和液体样品的不同气体组分的消耗或产量、培养液乙酸浓度、培养液乙醇浓度和培养物的光学密度。还每日测定进料气体的组成，并通过调节到反应器的进料气体的质量流量控制器实时测定到反应器的流量。
利用9.5% CO/90.5% N2的CO组合物进料气体，将流速设定到534ml/min。全部试验始终均未调节到反应器的进料气体速率。
用所述方法使培养液中的溶解CO在约37至38℃保持低于0.12mmol/L。根据亨利定律，可通过送入含9.5% CO的气体达到的最大溶解CO浓度为0.079mmol。
如图5中所示，细胞质量随时间增加，并在反应器接种后90.6小时内达到6.21g/L细胞质量。在此时，培养物正产生超过5g/L乙醇。
用Shimadzu GC-2014气相色谱测定培养液乙醇和乙酸浓度。用SRI 8610c气相色谱测定进料气体组分。
实施例4：使用低CO进料气体，利用嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)，用低CO进料气体避免CO抑制。
用0.86g/l活性生长(在5% CO/95% N2中)嗜甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)接种包含改性1x乙醇培养基的New Brunswick和CelliGen 310反应器。在实验开始时，将反应器的搅拌速率设定到800rpm。分析以每1至4小时间隔从反应器所取的气体和液体样品的不同气体组分的消耗或产量、培养液乙酸浓度、培养液乙醇浓度和培养物的光学密度。还每日测定进料气体的组成，并通过调节到反应器的进料气体的质量流量控制器实时测定到反应器的流量。
利用9.5% CO/90.5% N2的CO组合物进料气体，将流速设定到534ml/min。全部试验始终均未调节到反应器的进料气体速率。
用这种方法使培养液中的溶解CO在约37至38℃保持低于0.12mmol/L。根据亨利定律，可通过送入含9.5% CO的气体达到的最大溶解CO浓度为0.079mmol。
如图6中所示，细胞质量随时间增加，并在反应器接种后44.4小时内达到3.32g/L细胞质量。在此时，培养物正产生3.7g/L乙醇。
用Shimadzu GC-2014气相色谱测定培养液乙醇和乙酸浓度。用SRI 8610c气相色谱测定进料气体组分。
实施例5：CO进料速率对CO转化率的影响
在生物反应器(New Brunswick BioFlo I或IIc)中，只用CO和N2(进料气体)生长和保持杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)。在试验期间改变进料气体速率，以达到期望的培养物转化率。利用较低培养物转化率将过量溶解CO提供到杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)。
用低CO培养物转化率作为一种方法将过量溶解CO提供到培养物。例如，在反应器中的培养物能够在指定搅拌和指定流速下转化X量CO时，可通过提高流速增加溶解CO，以便培养物转化率低于X。
在约80% CO转化率，通过乙醇和乙酸产量、特异性CO摄取(SCU)、细胞质量的量和细胞形态测定，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)不显示抑制迹象。在增加进料气体以保持CO转化率低于约70%时，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)受到抑制。使培养物在低乙酸水平(< 0.4g/L)保持至少8天。在CO转化率返回到约80%时，乙醇产量、细胞质量和典型形态返回到健康培养水平。结果图示于图7中。
实施例6：抑制性CO进料速率
在生物反应器(New Brunswick BioFlo I或IIc)中生长杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)。
为了达到9mS/cm的电导率，除了维生素外，用1.5X所有组分制备培养基。如下使用四阶段规程：
阶段1：使用合成气在2L生物反应器中生长培养物。利用2.9g/L细胞密度，使气体源从合成气混合物切换到包含95%CO和5%N2的CO/N2混合物。
阶段2：在T=26小时，将CO目标转化率设定在>90%。
阶段3：在T=70小时，使CO目标转化率从90%减小到85%。
阶段4：在T=97小时，使CO目标转化率从85%减小到80%。
对于特定气体流速，用代表性KLa值计算各气体样品的溶解CO。然后将这些值平均，以发现各阶段的代表值。为了定性研究随时间的形态变化，在整个实验期间照相。
提供到培养物的维生素混合液的组成和浓度(µM)如下：
生物素：0.081863
泛酸钙：0.115176
硫胺素：0.148249
将这种维生素混合液以约0.12µl/min/克在培养物中的细胞的速率提供到培养物。
CO浓度如下：
在各阶段开始后到各阶段结束，计算经18小时时间的平均细胞保留时间(CRT)。
在阶段1使培养物达到稳定态。第2阶段的目的是通过保持高(>90%)转化率保持低溶解CO水平。虽然在此阶段中的平均溶解CO为0.0428mmol/L，但在到该阶段下一半的时间里，溶解CO高达0.14至0.17mmol/L。高溶解CO的这些峰与到反应器的气体流速增量一致。
阶段3的目的是通过保持较低水平的细菌CO转化率在反应器中得到溶解CO的步骤增量。在此阶段，调节到反应器的气体流速，以使培养物转化率保持在约85%。利用对气体流速的以上调节，使反应器的平均溶解CO在反应器中增加到0.1221mmol。在整个此阶段检测到约40至50%的损毁菌。
在阶段4，通过调节到反应器的气体流速，以使细菌转化率保持在约80%，得到另外的平均溶解CO增量。在此阶段中的平均溶解CO为0.2892mmol。然而，在此阶段在反应器中的溶解CO包括浓度梯度。一旦转化率开始下降到80%，反应器中的溶解CO就升至约0.2mmol。在此时，细菌特异性CO摄取(代谢)以向下趋势进行。代谢的这种向下趋势表示细菌进入负反馈阶段。例如，在一定阈限点后，细菌代谢开始受到抑制，这种初始抑制可使阈限抑制性溶解CO浓度进一步下降，并在细菌代谢中产生进一步抑制。
实施例7：CO浓度对生长的影响
在生物反应器(New Brunswick BioFlo I或IIc)中生长杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)。进行以下调节：
通过调节生长培养基的浓度来调节培养物的电导率，例如，生长培养基中所有组分的浓度(除了维生素)增加1.5倍，以使培养物的电导率从约7mS增加到约9.5mS。
所有实验从0.38(+/-0.02)或0.48g/L的初始细胞密度开始。
在整个实验中，各实验的初始气体流速保持不变。在成功启动后CO转化率值达到平台时，用反应器参数计算相关条件的KLa。
合成气组成为30% CO、15% H2、10% CO2和45% N2。
生物反应器试验#1：在本实验中使用1x生长培养基和25ml/min合成气进料速率。如图8中所示，在约20小时初始迟滞期后，细菌开始以约20小时倍增时间倍增。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.08mmol。(D CO：反应器培养液中的溶解CO浓度，CD：细胞密度，SCU特异性CO摄取)。
生物反应器试验#2：在本实验中使用1x生长培养基和35ml/min合成气进料速率。如图9中所示，在约36小时初始迟滞期后，细菌开始以约20小时倍增时间倍增。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.22mmol。在接种后约51小时，细胞变得细长且弯曲。
生物反应器试验#3：在本实验中使用1x生长培养基和40ml/min合成气进料速率。如图10中所示，在约45小时初始迟滞期后，细菌开始以约20小时倍增时间倍增。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.22mmol。在接种后约51小时，细胞变得细长且弯曲。
生物反应器试验#4：在本试验中使用1x生长培养基和45ml/min合成气进料速率。如图11中所示，在约50小时初始迟滞期后，细菌开始以约20小时倍增时间倍增。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.17mmol。在接种后约55小时，细胞变得细长且弯曲。
生物反应器试验#5：在本实验中使用1x生长培养基和50ml/min合成气进料速率。如图12中所示，甚至在接种后约70小时，培养物仍继续迟滞。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.23mmol。
生物反应器试验#6：在本实验中使用1x生长培养基和50ml/min合成气进料速率。与所有以上试验(4.8 vs 3.8g/L细胞)比较，本实验从较高细菌接种物开始。如图13中所示，在约10小时初始迟滞期后，细菌开始以约20小时倍增时间倍增。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.12mmol。在接种后约20小时，细胞形态短且性质一致。
生物反应器试验#7：在本实验中使用1.5x生长培养基和45ml/min合成气进料速率。本实验从3.8g/L细菌接种物开始。如图14中所示，细菌细胞密度随时间下降。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.25mmol。
生物反应器试验#8：在本实验中使用1.5x生长培养基和35ml/min合成气进料速率。本实验从3.8g/L细菌接种物开始。如图15中所示，细菌细胞密度随时间下降。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.22mmol。
生物反应器试验#9：在本实验中使用1.5x生长培养基和30ml/min合成气进料速率。本实验从3.8g/L细菌接种物开始。如图16中所示，细菌细胞密度随时间下降。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.22mmol。
生物反应器试验#10：在本实验中使用1.5x生长培养基和20ml/min合成气进料速率。本实验从3.8g/L细菌接种物开始。如图17中所示，细菌细胞密度随时间下降，并达到20小时倍增时间。最大计算溶解CO为在反应器培养液中约0.022mmol。
虽然已通过具体实施方案、实施例及其应用描述了本文公开的发明，但本领域的技术人员可在不脱离权利要求所阐述的本发明范围的情况下对其作出很多修改和变化。

Claims (1)

1.一种发酵方法，包括将合成气提供到发酵培养基，其量有效提供在发酵培养基中约0.15mM至约0.70mM的初始计算CO浓度，与其中CO浓度不受控制的相同方法比较，所述方法有效提高微生物的细胞密度。
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