CN110367244B - 乌药醚内酯用于制备外周血单个核细胞冻存保护剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乌药醚内酯用于制备外周血单个核细胞冻存保护剂的用途。冻存密度过高会明显降低PBMC细胞的冻存复苏率以及复苏后向CIK细胞诱导培养的扩增效率，一定程度影响了PBMC的复苏应用，而在冻存保护剂中添加适量乌药醚内酯可以支撑PBMC的高密度冻存，在冻存密度为常规冻存密度10倍的情况下，冻存复苏率以及复苏后向CIK细胞诱导培养的扩增效率不仅没有降低，还有较为明显的提高，这表明乌药醚内酯可以用于制备外周血单个核细胞高密度冻存保护剂，可以在不降低冻存效果的前提下降低冻存成本。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞领域，涉及外周血单个核细胞的冻存，具体涉及乌药醚内酯用于制备外周血单个核细胞高密度冻存保护剂的用途。
背景技术
外周血单个核细胞(PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、吞噬细胞和树突状细胞等。PBMC常用于自身免疫疾病、恶性肿瘤、器官移植和药物敏感试验等领域的研究，应用越来越成熟。
PBMC研究和应用过程中绕不开冻存步骤。冻存密度对细胞冻存复苏后的活性具有重要影响。目前，PBMC的冻存密度常选择1×107/mL。
但是，目前的冻存密度导致PBMC的冻存成本较高，但是，如果提高冻存密度，其复苏后的细胞活性又会有明显降低。
因此，需要寻找能够支持PBMC高密度冻存的保护剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供乌药醚内酯用于制备外周血单个核细胞高密度冻存保护剂的用途，以在不降低冻存效果的前提下降低冻存成本。
本发明目的通过以下方案实现：
乌药醚内酯用于制备外周血单个核细胞冻存保护剂的用途。
乌药醚内酯用于制备外周血单个核细胞高密度冻存保护剂的用途。
一种外周血单个核细胞的冻存保护剂，含有适量的乌药醚内酯。
一种外周血单个核细胞的高密度冻存保护剂，含有适量的乌药醚内酯。
有益效果：
冻存密度过高会明显降低PBMC细胞的冻存复苏率以及复苏后向CIK细胞诱导培养的扩增效率，一定程度影响了PBMC的复苏应用，而在冻存保护剂中添加适量乌药醚内酯可以支撑PBMC的高密度冻存，在冻存密度为常规冻存密度10倍的情况下，冻存复苏率以及复苏后向CIK细胞诱导培养的扩增效率不仅没有降低，还有较为明显的提高，这表明乌药醚内酯可以用于制备外周血单个核细胞高密度冻存保护剂，可以在不降低冻存效果的前提下降低冻存成本。
附图说明
图1为细胞存活率测定结果；
图2为CD3+CD56+细胞比例测定结果；
图3为CIK细胞对肿瘤杀伤活性测定结果。
具体实施方式
一、实验材料
外周血采集自健康志愿者，签署知情同意书仅用于科学研究。采集后两小时内提取人外周血淋巴细胞，并分离血浆作为自体血浆用于细胞冻存。
人外周血淋巴细胞分离液为Solarbio。
乌药醚内酯购于成都普瑞法，纯度≥95％。
程序降温盒购自上海易英生物科技有限公司。
GT-T551无血清培养基为TAKARA公司产品，低糖DMEM培养基为GIBCO产品。
人AB血清为上海梦泽生物科技有限公司产品，胎牛血清为GIBCO产品。
K562细胞从液氮中取出后，置于温水中快速复苏，接种于含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中，37℃，5％CO2环境培养，每2～3d半量换液，观察细胞生长情况、传代。
二、实验方法
1、PBMC的提取
取健康志愿者外周抗凝血，与生理盐水等体积混匀后，小心加于人外周血淋巴细胞分离液的液面上，以400g(约1500转/分，半径15cm水平转子)离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层：第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。收集第二层细胞用生理盐水充分混匀后，以400g(约1500转/分)离心20分钟，收集沉淀，沉淀重复洗涤2次后即得PBMC。
2、PBMC的分组和冻存
分为常规密度对照组、高密度对照组和高密度实验组。常规密度对照组的细胞冻存密度为1×107/mL，高密度对照组和高密度实验组的细胞冻存密度为1×108/mL；常规密度对照组和高密度对照组采用常规的冻存保护剂冻存，即GT-T551无血清培养基、自体血浆与DMSO体积比7:2:1的混合液，高密度实验组采用的冻存保护剂的配制方法为：在体积比7:2:1的GT-T551无血清培养基、自体血浆与DMSO混合液中添加100nM的乌药醚内酯，振荡使充分溶解。每组设3个平行。
冻存方法为：将PBMC用冻存保护剂稀释至对应的冻存密度，分装至冻存管中，每管1mL，贴上标签，放入程序降温盒，放入-80℃冰箱冻存6个月。
3、PBMC的复苏和CIK细胞诱导培养
取出冻存细胞管迅速放入37℃水浴锅中，充分振荡使2分钟内仅留有微小冰块，再用4℃预冷的生理盐水充分洗涤3次，按照1×106个/mL接种于含有3％人AB血清、1000U/mLIFN-γ的5mL GT-T551培养基中，24h后添加100U/mL IL-1α、500U/mL IL-2和50ng/mL CD3，于37℃、5％CO2饱和湿度条件培养，每2～3d取样计数，补加含有3％人AB血清、500U/mL IL-2和50ng/mL CD3的GT-T551培养基以维持细胞密度在1×106个/mL。
4、细胞存活率测定
采用常规的台盼蓝染色法测定冻存前后(生理盐水洗涤后即测)PBMC的存活率。
5、复苏后CIK细胞诱导培养扩增倍数的测定
采用常规的血球计数板进行计数，测定复苏后CIK细胞诱导培养15d的细胞数，计算诱导培养15d的扩增倍数。
6、CD3+CD56+细胞比例的测定
用FITC-CD3和PE-CD56单抗与培养前及诱导培养15d的CIK细胞孵育后按照常规的流式细胞术方法分析细胞表型，测定CD3+CD56+细胞比例。
7、对肿瘤杀伤活性的测定
分别取培养15d的CIK细胞和对数期的K562细胞，消化，PBS洗涤，分别用含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基配成细胞浓度为1×106个/mL和2×105个/mL的细胞悬液，分别吸取50μL加入96孔板，效靶比为5:1，同时设效应细胞组、靶细胞组和空白组，每组设3个复孔，置于37℃、5％CO2培养箱培养12h后，每孔加入10μL CCK-8，继续在培养箱中孵育4h，检测450nm处的OD值，按如下公式计算对肿瘤细胞的杀伤活性：杀伤活性(％)＝[1-(实验组OD值-效应组OD值)/(靶细胞组OD值-空白组OD值)]×100％。
8、统计分析
数据以均数±标准差表示，采用SPSS 17.0统计软件及Graphpad软件进行方差及显著性分析，检验水准(P)为0.05。
三、实验结果
1、细胞存活率测定
细胞存活率测定结果如表1和图1所示，与冻存前相比，常规密度对照组和高密度对照组冻存后的细胞存活率均显著下降，其中，高密度对照组下降更为显著；与高密度对照组相比，高密度实验组冻存后的细胞存活率显著上升，接近冻存前的细胞存活率。
表1细胞存活率测定结果
该结果表明，PBMC细胞冻存密度过高确实会降低其复苏后的存活率，而乌药醚内酯可以显著提高高密度PBMC冻存后的复苏存活率。
2、复苏后CIK细胞诱导培养扩增结果
复苏后CIK细胞诱导培养扩增结果如表2所示，常规密度对照组诱导培养15d细胞总数扩增了(125.7±13.4)倍，与常规密度对照组相比，高密度对照组诱导培养15d细胞总数扩增倍数显著降低，仅为(103.6±11.5)倍；与高密度对照组相比，高密度实验组诱导培养15d细胞总数扩增倍数显著升高，高达(138.5±14.7)倍，甚至优于常规密度对照组。
表2复苏后CIK细胞诱导培养扩增结果
该结果表明，PBMC细胞冻存密度过高确实会降低其复苏后向CIK细胞的诱导扩增效率，而冻存保护剂中添加适量乌药醚内酯可显著提高高密度PBMC冻存复苏后的诱导扩增效率。
3、CD3+CD56+细胞比例测定结果
测定结果如表3和图2所示，各组复苏诱导培养15后的CIK细胞纯度差别不大。
表3CD3+CD56+细胞比例
该结果表明，PBMC细胞冻存密度对其复苏后诱导培养的CIK细胞纯度差别不大，冻存保护剂中添加适量乌药醚内酯不会影响其复苏诱导培养的CIK细胞纯度。
4、对肿瘤杀伤活性的测定结果
测定结果如表4和图3所示，各组复苏诱导培养15后的CIK细胞杀瘤活性差别不大。
表4CIK细胞对肿瘤杀伤活性
| 组别 | 常规密度对照组 | 高密度对照组 | 高密度实验组 |
| 杀伤活性(％) | 21.4±2.3 | 19.8±2.1 | 23.9±2.7 |
该结果表明，PBMC细胞冻存密度对其复苏后诱导培养的CIK细胞杀瘤活性差别不大，冻存保护剂中添加适量乌药醚内酯不会影响其复苏诱导培养的CIK细胞杀瘤活性。
上述实验结果表明，冻存密度过高会明显降低PBMC细胞的冻存复苏率以及复苏后向CIK细胞诱导培养的扩增效率，一定程度影响了PBMC的复苏应用，而在冻存保护剂中添加适量乌药醚内酯可以支撑PBMC的高密度冻存，在冻存密度为常规冻存密度10倍的情况下，冻存复苏率以及复苏后向CIK细胞诱导培养的扩增效率不仅没有降低，还有较为明显的提高，这表明乌药醚内酯可以用于制备外周血单个核细胞高密度冻存保护剂，可以在不降低冻存效果的前提下降低冻存成本。
本领域技术人员应当知道，本发明保护范围不局限于上述具体实施例。
Claims (1)
1.乌药醚内酯用于制备外周血单个核细胞冻存保护剂的用途，以提高外周血单个核细胞的冻存复苏率和提高外周血单个核细胞复苏后向CIK细胞诱导培养的扩增效率。
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