CN107827848B - 一种氧化穿心莲内酯、制备方法及增强cik细胞体内杀伤力的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氧化穿心莲内酯、制备方法及增强CIK细胞体内杀伤力的用途，该氧化穿心莲内酯为穿心莲内酯C18位羟基氧化的产物，制备方法包括如下步骤：步骤S1，菌种培养；步骤S2，微生物转化；步骤S3，转化产物提取；步骤S4，高速逆流纯化；其中，步骤S1中的发酵培养基中添加有有效浓度的离子液体。因此，本发明发现一种穿心莲内酯衍生物，该衍生物为穿心莲内酯的氧化产物，可以通过微生物转化法制备。该氧化穿心莲内酯可以增强CIK细胞体内对肿瘤的杀伤力。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，涉及一种氧化穿心莲内酯、制备方法及增强CIK细胞体内杀伤力的用途。
背景技术
申请人采用生物法制备脱水穿心莲内酯时(已提交专利2017109643698、2017109607475、201710964407X)，在微生物转化产物中分离得到一种氧化穿心莲内酯，该氧化穿心莲内酯可以增强CIK细胞体内对肿瘤细胞的杀伤力。
该氧化穿心莲内酯的化学结构、制备方法及药理作用均未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种氧化穿心莲内酯、制备方法及增强CIK细胞体内杀伤力的用途。
本发明由如下技术方案得以实现：
一种如下化学结构的氧化穿心莲内酯：
一种上述氧化穿心莲内酯的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
所述发酵培养基为在上述液体培养基中再添加40-60μM季膦离子液体，阳离子结构如下：
或添加20-40μM苯并三氮唑类离子液体，阳离子结构如下：
或添加30-50μM咪唑类离子液体，阳离子结构如下：
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯0.5-1.5g/L，振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
优选地，所述离子液体的阴离子为溴或氯离子。
优选地，振荡培养条件为25℃、135r/min。
优选地，所述溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，四者体积比为4:1:5:0.05。
优选地，高速逆流色谱的仪器的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min。
优选地，所述高速逆流色谱的流动相流速为1.3mL/min，分离温度为35℃。
氧化穿心莲内酯用于增强CIK细胞体内杀伤力的用途。
本发明的优点：
本发明发现一种穿心莲内酯衍生物，该衍生物为穿心莲内酯的氧化产物，可以通过微生物转化法制备。该氧化穿心莲内酯可以增强CIK细胞体内对肿瘤的杀伤力。
附图说明
图1为转化产物的高速逆流纯化色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例详细介绍本发明的实质性技术方案。
由于篇幅限制，每一类离子液体仅列举3-4个离子液体，它们的化学结构和编号如下：
上述离子液体均可以委托外包公司定制或自主合成，本领域技术人员可以获得。在本发明实施例中，这些离子液体由申请人按照文献方法合成。
短刺小克银汉霉Cunninghamella blakesleeana Lendner CGMCC 3.970，购自中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1氧化穿心莲内酯的制备(季膦-1)
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
所述发酵培养基为在上述液体培养基中再添加50μM编号为季膦-1的季膦离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，色谱图如图1所示，纯度大于98％。
化学结构解析：首先根据高分辨质谱可知分子式为C20H28O5；13C NMR(CDCl3,500MHz)：δ37.1(C-1),27.4(C-2),71.6(C-3),53.0(C-4),55.8(C-5),25.6(C-6),38.2(C-7),148.0(C-8),56.2(C-9),39.7(C-10),23.8(C-11),146.4(C-12),129.2(C-13),64.8(C-14),74.3(C-15),170.0(C-16),108.2(C-17),209.2(C-18),10.2(C-19),14.6(C-20)。
将上述碳谱信号与穿心莲内酯进行比较，并结合氢谱中的醛基氢可确证上述实施例分离得到的新化合物为穿心莲内酯C18位羟基氧化的产物，结构如下：
实施例2氧化穿心莲内酯的制备(季膦-2)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用季膦-2替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
所述发酵培养基为在上述液体培养基中再添加40μM编号为季膦-2的季膦离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例3氧化穿心莲内酯的制备(季膦-3)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用季膦-3替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
所述发酵培养基为在上述液体培养基中再添加60μM编号为季膦-3的季膦离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例4氧化穿心莲内酯的制备(季膦-4)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用季膦-4替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
所述发酵培养基为在上述液体培养基中再添加50μM编号为季膦-4的季膦离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例5氧化穿心莲内酯的制备(苯并-1)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用苯并-1替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
发酵培养基为在上述液体培养基中再添加30μM编号为苯并-1的苯并三氮唑类离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例6氧化穿心莲内酯的制备(苯并-2)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用苯并-2替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
发酵培养基为在上述液体培养基中再添加20μM编号为苯并-2的苯并三氮唑类离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例7氧化穿心莲内酯的制备(苯并-3)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用苯并-3替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
发酵培养基为在上述液体培养基中再添加40μM编号为苯并-3的苯并三氮唑类离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例8氧化穿心莲内酯的制备(咪唑-1)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用咪唑-1替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
发酵培养基为在上述液体培养基中再添加40μM编号为咪唑-1的咪唑类离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例9氧化穿心莲内酯的制备(咪唑-2)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用咪唑-2替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
发酵培养基为在上述液体培养基中再添加30μM编号为咪唑-2的咪唑类离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例10氧化穿心莲内酯的制备(咪唑-3)
该实施例与实施例1的区别仅在于，使用咪唑-3替代季膦-1。具体包括如下步骤：
步骤S1，菌种培养：
将短刺小克银汉霉菌株接种于新鲜斜面培养基上，25℃恒温培养3d；将菌体从斜面培养基转接至装有液体培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为种子液；吸取种子液转接至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、135r/min振荡培养2d后成为培养液；
其中，所述液体培养基的配方为：去皮煮沸的土豆泥，200g/L；磷酸二氢钾，3g/L；硫酸镁，0.75g/L；葡萄糖，20g/L；维生素B1，0.15g/L；调节pH值至6.0；
发酵培养基为在上述液体培养基中再添加50μM编号为咪唑-3的咪唑类离子液体；
步骤S2，微生物转化：
向上述发酵培养液中投入穿心莲内酯1g/L，25℃、135r/min振荡培养3d进行转化。
步骤S3，转化产物提取：
转化终止后将转化液的pH值调节至5.2，静置过夜，抽滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，蒸发回收乙酸乙酯即得转化产物；
步骤S4，高速逆流纯化：
高速逆流色谱仪的分离管为β值0.5-0.8的多层聚四氟乙烯螺旋管，螺旋管直径2.3mm，工作转速为750r/min；配备8823B-紫外检测器；
用高速逆流色谱分离纯化转化产物中的氧化穿心莲内酯，溶剂系统为乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸，将该溶剂系统剧烈震荡后静置分层，将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，根据色谱图收集氧化穿心莲内酯对应流份，浓缩干燥即得。
分离前12小时配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(体积比4:1:5:0.05)溶剂系统，具体配制方法为：将四种溶剂按比例混合，剧烈震荡后，静置12小时使其完全分层，在漏斗中将上、下相分离，上相用作固定相，下相用作流动相，用前超声半小时。分别取上相5mL和下相5mL，混合后将上述转化产物超声溶解在该混合溶剂中，作为高速逆流的样品溶液。
将两相溶剂体系中已超声脱气的上相(固定相)以20mL/min的流速泵入HSCCC分离管中(分离温度35℃)，待上相充满整个分离管后，调节主机转速达750r/min，顺时针旋转，待转速稳定后，以1.3mL/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为225nm。当流动相从主机口流出时，说明体系已达到流体动力学平衡，此时将已准备好的10mL样品溶液注入HSCCC仪，同时开始采集数据，根据色谱图收集目标成分，纯度大于98％。
实施例11氧化穿心莲内酯对CIK细胞的体内杀伤力增强活性
1、CIK的诱导和培养
将来源于健康志愿者的外周血用淋巴细胞分离液(Ficoll)采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞。用RPMI1640培养液调节细胞密度为5×106/ml，置于37℃、5％CO2培养箱中培养2h。收集非贴壁细胞调整细胞密度至1×106/ml，加入1000U/mlγ-干扰素(IFN-γ)继续培养，24h后加入50ng/ml抗人CD3及1000U/ml白细胞介素(IL)-2，每3天换液1次，并补充IL-2。在培养14d收集CIK细胞备用。
2、CIK细胞体内杀瘤试验
取60只患黑色素瘤鼠的肿瘤组织8mm3，皮下移植到免疫缺陷的NOD/SCID鼠体内，分成3组，每组20只。肿瘤移植1w后，一组尾静脉注射PBS作为对照，一组尾静脉注射培养的人CIK细胞，一组尾静脉注射培养的人CIK细胞和实施例1制备的氧化穿心莲内酯，细胞数为1×107/只，氧化穿心莲内酯为0.02mg/kg/只，每周注射一次，连续6w。
6w后计算各组小鼠存活率，统计CIK细胞组和CIK细胞加氧化穿心莲内酯组存活小鼠肿瘤平均重量占对照组的百分比，结果如下：
| 存活率(％) | 占对照组肿瘤重量百分比(％) | |
| 对照组 | 20 | / |
| CIK细胞组 | 65 | 58.8 |
| CIK细胞加氧化穿心莲内酯组 | 95 | 25.7 |
可见，本发明发现一种穿心莲内酯衍生物，该衍生物为穿心莲内酯的氧化产物，可以通过微生物转化法制备。该氧化穿心莲内酯可以增强CIK细胞体内对肿瘤的杀伤力。
Claims (1)
1.一种如下化学结构的化合物在制备增强CIK细胞体内杀伤力的药物中的应用：
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