CN110354277B - 双载药插层水滑石纳米粒的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制剂领域,具体涉及双载药插层水滑石纳米粒及其制备方法和应用。本发明纳米粒包含阿霉素、DDC、Cu‑Al LDH、PEG‑PLG,其中,阿霉素:DDC:Cu‑Al LDH:PEG‑PLG各成分的质量比为(5‑10):(3‑6):(30‑200):(1‑5)。本发明制备方法先进行共沉淀法制备Cu‑Al LDH,再制备双载药插层水滑石纳米粒。本发明主要用于在制备抗癌药物中的应用,具有血浆半衰期和平均滞留时间长的特点,能够显著的提高治疗效果。
Description
技术领域:
本发明涉及药物制剂领域,具体涉及一种双载药插层水滑石纳米粒的制备方法及应用。
背景技术:
肝癌是一种恶性程度高、预后差的疾病,原发性肝癌是肝癌中最常见的类型。目前肝癌的治疗方法包括手术切除、肝移植、局部消融、介入治疗、放疗、靶向治疗、免疫生物治疗等,但是具体要根据癌症处在的时期决定合适的治疗方式。由于肝癌临床表现早期起病周期长,无明显的症状和体征,所以大多数患者被确诊为肝癌时已经是后期或者晚期。因此临床上,相比于手术治疗,化学药物治疗是一个不错的选择,能延长患者的寿命,提高患者的生活质量。
双硫仑(DSF)是一种醛脱氢酶(ALDH)抑制剂,由于其安全性和较少的副作用,已在欧洲和美国被广泛用作酒精戒断药物半个多世纪。近年来,随着细胞生物学和分子生物学的发展,已经发现双硫仑可以靶向多种信号通路并对抗肿瘤具有积极作用。2017年,Skrott等证实铜离子是一种增强DSF抗肿瘤作用的金属,并揭示了双硫仑的肿瘤抑制的分子靶点。一般来说,体内Cu2+在肿瘤组织中选择性蓄积,并与到达癌症部位的DSF形成药理活性成分,为二乙基二硫代氨基甲酸铜(Cu(DDC)2)。Cu(DDC)2的抗肿瘤活性主要通过以下途径实现:1)同时激活ROS-JNK/p38通路和抑制NFκB通路;2)与抑制泛素-蛋白酶体系统有关;3)抑制拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性;4)抑制金属蛋白酶(MMPs)MMP-2和MMP-9的作用。然而,DSF的血浆半衰期仅为4分钟,在胃酸中极不稳定,这限制了其进一步应用。Cu(DDC)2在体外可以由双硫仑和铜反应生成,也可以由DDC与铜反应生成。Cu(DDC)2水溶性极差,溶解度小于1μg/mL,表面活性剂对其增溶作用也不显著。另外Cu(DDC)2脂溶性也较差导致在一定程度上给药的困难。
层状双氢氧化物(LDH)作为一种层状纳米粒子,在无机材料载体领域占有一定的地位。LDH一般由阳离子水镁石层组成,可表示为[M2+ 1-xM3+ x(OH)2]x+[An-]x/n·mH2O,其中M2+=Mg2+,Ni2+,Co2+,Zn2+,三价金属阳离子M3+=Al3+,Fe3+,Gd3+,和非骨架阴离子An-=Cl-,CO3 2-等。与聚合物纳米粒子不同,它们具有大的表面积,更好的载药量,更高的生物利用度和更精确的药物控制释放和独特的阴离子快速交换。此外,它们可以承受大多数有机溶剂。据报道,当pH小于5.0时,LDH的主体层溶解,这使得LDH成为pH控制药物释放的优良载体。
阿霉素(DOX)是一种蒽环类抗生素,是肝癌最重要的化疗药物之一。DOX通过插入DNA链来阻断DNA合成,从而可以杀死各种生长周期的肿瘤细胞。
目前并没有一种有效治疗肝癌的化学药物,也没有利用Cu-Al LDH水滑石作为载体材料载入药物,靶向肿瘤细胞以达到抑制肿瘤生长的相关研究及相关的报道。
发明内容:
发明目的:
本发明的目的在于提供双载药插层水滑石纳米粒的制备方法及应用。以Cu-AlLDH为载体材料,通过溶剂扩散、阴离子交换等方式制备共载阿霉素和Cu(DDC)2的插层水滑石纳米粒,它具有血浆半衰期和平均滞留时间长的特点,能够显著的提高治疗效果。
技术方案:
双载药插层水滑石纳米粒,纳米粒包含阿霉素、DDC、Cu-Al LDH、PEG-PLG,其中,阿霉素:DDC:Cu-Al LDH:PEG-PLG各成分的质量比为(5-10):(3-6):(30-200):(1-5)。
进一步的,双载药插层水滑石纳米粒为阿霉素:DDC:Cu-Al LDH:PEG-PLG各成分的质量比为6.4:4.8:64:1。
双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
(1)共沉淀法制备Cu-Al LDH;
(2)制备双载药插层水滑石纳米粒:将盐酸阿霉素脱去盐酸盐后溶解于甲醇,再滴入Cu-Al LDH混悬液中混匀,水浴避光搅拌,然后将DDC水溶液缓慢滴入,旋蒸除去甲醇,离心收集上清液、超声;再缓慢滴加PEG-PLG溶液、超声,得到双载药插层水滑石纳米粒。
所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,步骤(1)的具体制备方法包括:将Cu(NO3)2·3H2O,Al(NO3)3·9H2O和NaNO3按一定摩尔比溶解在含有F68的除CO2的蒸馏水中,第一次在氮气流下剧烈搅拌;NaOH溶液逐滴滴入硝酸盐溶液中,调节pH为9-10,常温下搅拌反应;将反应后的溶液取出,离心;用除CO2的蒸馏水洗涤,离心,连续洗三次;将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌;收集反应后的混悬液,水浴超声,即得Cu-Al LDH。
所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,步骤(1)中Cu(NO3)2·3H2O,Al(NO3)3·9H2O和NaNO3投料比摩尔比为2:1:2;F68的含量为0.1%-0.5%(m/v),第一次氮气下剧烈搅拌反应时间为12-20h,NaOH溶液的浓度为1M-3M;离心转速为2000-4000r/min,离心时间8-12min;调节pH后搅拌12-20h;第二次氮气流下反应搅拌6-12h,水浴超声是室温下搅拌20-40min。
所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,步骤(2)中的阿霉素是用三乙胺将盐酸阿霉素中的盐酸脱去;二氯甲烷萃取后,旋蒸除去二氯甲烷,得到阿霉素。
所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,阿霉素:DDC:Cu-Al LDH的质量比为(5-10):(3-6):(30-200);水浴避光搅拌的条件是水浴温度为35-45℃,搅拌速度为300-1000r/min,搅拌时间为20-40min。
所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,:35-45℃旋蒸条件下除去甲醇,离心收集上清液、超声,其中低速离心转速为2000-4000r/min,离心时间2-5min,超声功率为200-300W,超声时间1-5min。
所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,PEG-PLG的加入量与Cu-Al LDH比例为(1-5):(30-200),滴加PEG-PLG溶液时的超声时间为1-5min,超声功率为200-300W。
双载药插层水滑石纳米粒在制备抗癌药物中的应用。
优点及效果:
本发明制备的共载阿霉素和Cu(DDC)2的双载药插层水滑石纳米粒,借助生物相容性和药物负载率良好的无机金属材料Cu-Al LDH作为载体负载阿霉素,通过外部加入DDC使之与LDH中Cu2+特异性结合,产生最终发挥药效的Cu(DDC)2,直接解决了Cu(DDC)2的递药问题。外层则利用静电作用进行包衣,利用大分子材料增强纳米粒的稳定性。利用肿瘤细胞内的酸性环境使得载体材料降解,从而实现药物在胞质内的有效释放,提高药物的输送效率。
本发明由Cu-Al LDH制备的多边形纳米颗粒,在癌症协同治疗中是一个非常有前景的应用。
附图说明:
图1为本发明制备的PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的粒径分布图。
图2为各实验组对肝癌细胞Hep G2的生长抑制作用。
图3为各实验组对肝癌荷瘤小鼠的十四天内肿瘤体积变化。
图4为各实验组对肝癌荷瘤小鼠第十四天肿瘤重量。
图5为各实验组对肝癌荷瘤小鼠的十四天内体重变化。
图6为双载药插层水滑石纳米粒的制备流程示意图。
图7为Cu-Al LDH、Cu-Al LDH@DDC、Cu-Al LDH@DOX和PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的透射电镜对照图。
图8为药物代谢动力学血药浓度与时间曲线。
具体实施方式:
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明先合成Cu-Al LDH纳米粒子,在阴离子交换特性的前提下,将DDC与Cu2+结合在一起形成活性药物Cu(DDC)2。通过控制DOX和DDC添加的顺序和浓度,可以达到理想的载药量和载药量。由于静电作用,将聚乙二醇接枝聚谷氨酸(PEG-PLG)包被到外层,以达到稳定纳米粒子的作用
如图1所示,双载药插层水滑石纳米粒,纳米粒包含阿霉素、DDC、Cu-Al LDH、PEG-PLG,其中,阿霉素:DDC:Cu-Al LDH:PEG-PLG各成分的质量比为(5-10):(3-6):(30-200):(1-5)。
本发明采用LDH具有大的表面积,更好的载药量,更高的生物利用度和更精确的药物控制释放和独特的阴离子快速交换。本发明药物为阿霉素和Cu(DDC)2,均为化学药物,能发挥最优的抗肿瘤作用,二者存在协同作用。
本发明充分利用LDH插层载药的特点,层间具有可交换的阴离子,高价的阴离子容易进入LDH内部,低价阴离子易于被交换出来。通过对层间阴离子的种类和数量进行设计和组装,可以将各种阴离子如无机、有机、配合物阴离子引入LDH层间,从而改变层间距,以获得理想的性能和效果。
如图6所示,双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
(1)共沉淀法制备Cu-Al LDH;
(2)制备双载药插层水滑石纳米粒:将阿霉素溶解于甲醛,再滴入Cu-Al LDH混悬液中混匀,水浴避光搅拌,然后将DDC水溶液缓慢滴入,35-45℃下旋蒸除去甲醇,离心收集上清液、超声;再缓慢滴加PEG-PLG溶液、超声,得到双载药插层水滑石纳米粒。
本发明首次将Cu-Al LDH应用在药学方向中,发现其与现有技术相比作为载体材料更好,DDC与Cu2+形成Cu(DDC)2,而其他离子不能与DDC形成络合物。
步骤(1)的具体制备方法包括:
将Cu(NO3)2·3H2O,Al(NO3)3·9H2O和NaNO3按一定摩尔比溶解在含有F68的除CO2的蒸馏水中,第一次氮气下剧烈搅拌,得到硝酸盐溶液;NaOH溶液逐滴滴入硝酸盐溶液中,调节pH 9-10,常温下搅拌反应;将反应后的溶液取出,离心;用除CO2的蒸馏水洗涤,离心,连续洗三次;将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌;收集反应后的混悬液,水浴超声,即得Cu-Al LDH。
步骤(1)中Cu(NO3)2·3H2O,Al(NO3)3·9H2O和NaNO3投料比摩尔比为2:1:2;F68的含量为0.1%-0.5%(m/v),F68主要作用是使得水滑石不容易聚集,从而达到降低水滑石粒径的作用。第一次氮气下剧烈搅拌反应时间为12-20h,NaOH溶液的浓度为1-3M;离心转速为2000-4000r/min,第二次氮气流下反应搅拌4-12h,水浴超声是室温下搅拌20-40min。
步骤(2)中的阿霉素是用三乙胺将盐酸阿霉素中的盐酸脱去;二氯甲烷萃取后,旋蒸除去二氯甲烷,用甲醇复溶,得到阿霉素的甲醇溶液。
阿霉素:Cu-Al LDH的质量比为(5-10):(30-200);水浴避光搅拌的条件是水浴温度为35-45℃,搅拌速度为300-1000r/min,搅拌时间为20-40min;DDC与Cu-Al LDH的投量比为(3-6):(30-200)。
旋蒸除去甲醇的条件是离心收集上清液、超声中低速离心转速为2000-4000r/min,离心时间2-5min,超声功率为200-300W,超声时间1-5min。
PEG-PLG的加入量与Cu-Al LDH比例为(1-5):(30-200),滴加PEG-PLG溶液时的超声时间为1-5min,超声功率为200-300W。
双载药插层水滑石纳米粒在制备抗癌药物中的应用。
实施例1:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法;
将Cu(NO3)2·3H2O(0.006mol),Al(NO3)3·9H2O(0.003mol)和NaNO3(0.006mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例2:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.005mol),Al(NO3)3·9H2O(0.0025mol)和NaNO3(0.005mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例3:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.005mol),Al(NO3)3·9H2O(0.0025mol)和NaNO3(0.005mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的100mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例4:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.003mol),Al(NO3)3·9H2O(0.0015mol)和NaNO3(0.003mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的100mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例5:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.0025mol),Al(NO3)3·9H2O(0.00125mol)和
NaNO3(0.0025mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的100mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例6:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.0025mol),Al(NO3)3·9H2O(0.00125mol)和NaNO3(0.0025mol)溶解在含有0.1%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取1mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应12h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,2000r/min离心20min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌4h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声20min,即得Cu-Al LDH。
实施例7:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.0005mol),Al(NO3)3·9H2O(0.00025mol)和NaNO3_(0.0005mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌12-20h。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例8:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.001mol),Al(NO3)3·9H2O(0.0005mol)和NaNO3(0.001mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
通过实施例1~实施例8的制备方法,表1列出不同硝酸盐浓度制备的Cu-Al LDH纳米粒,粒径结果如下:
表1硝酸盐浓度对Cu-Al LDH的粒径的影响
由表1可以看出实施例1、2、4粒径相差不大,但是实施例1的浓度更高,更有利于后续进一步载药,综合考虑采用实施例1结果较好。
实施例9:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.0025mol),Al(NO3)3·9H2O(0.00125mol)和NaNO3(0.0025mol)溶解在含有1.0%(m/v)吐温80的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例10:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.0025mol),Al(NO3)3·9H2O(0.00125mol)和NaNO3(0.0025mol)溶解在含有1.0%(m/v)PVP的除CO2的100mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例11:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.001mol),Al(NO3)3·9H2O(0.0005mol)和NaNO3(0.001mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例12:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.002mol),Al(NO3)3·9H2O(0.001mol)和NaNO3(0.002mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
实施例13:
(1)一种Cu-Al LDH的制备方法
将Cu(NO3)2·3H2O(0.0015mol),Al(NO3)3·9H2O(0.00075mol)和NaNO3(0.0015mol)溶解在含有0.2%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌。用注射器吸取2mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心10min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声30min,即得Cu-Al LDH。
通过实施例9~实施例13的制备方法,表2列出不同硝酸盐浓度制备的Cu-Al LDH纳米粒,粒径结果如下:
表2不同表面活性剂对Cu-Al LDH粒径的影响
考虑到合成的Cu-Al LDH的粒径过大,而表面活性剂有减小粒径的作用,所以实验中主要考察了吐温80、聚维酮(PVP)、泊洛沙姆188(F68)对Cu-Al LDH纳米流粒径的影响。实验结果见表2。综合实验结果,当加入0.2%F68(w/v)时,Cu-Al LDH的粒径及PDI值最小。
从实施例9~13中,得出最优实施例为实施例13,后续实施例14、15和16均采用实施例13制备的Cu-Al LDH。
实施例14:
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含1.6mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入8mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),20℃水浴加热搅拌30min,转速为500r/min,再滴入0.6mL DDC溶液(2mg/mL),40℃旋蒸除去甲醇,3000r/min离心5min,300W超声1min,常温下加入1mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),200W超声3min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
实施例15:
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含1.6mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入8mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),40℃水浴加热搅拌30min,转速为500r/min,再滴入0.6mL DDC溶液(2mg/mL),40℃旋蒸除去甲醇,3000r/min离心5min,300W超声1min,常温下加入1mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),200W超声3min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
实施例16:
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含1.6mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入8mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),60℃水浴加热搅拌30min,转速为500r/min,再滴入0.6mL DDC溶液(2mg/mL),40℃旋蒸除去甲醇,3000r/min离心5min,300W超声1min,常温下加入1mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),200W超声3min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
实施例14、实施例15和实施例16,表3列出避光搅拌载药时的体系温度,制备的PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒粒径结果如下:
表3PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX在不同制备温度下的粒度结果
如表3所示,实施例15可以达到粒径小,分散指数低,且均匀的体系,其Cu(DDC)2载药量好。主要探究了20℃、40℃、60℃条件下制备纳米粒的情况,结果如表3。在40℃下能承载的投药量大,并且粒径及PDI值都比较好。而在60℃时是无法满足载药量的要求,20℃的载药量较低,因此,本发明选定温度在35~45℃之间较好,而在40℃最优。
实施例17:
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含1.3mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入8mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),40℃水浴加热搅拌30min,转速为500r/min,再滴入0.6mL DDC溶液(2mg/mL),40℃旋蒸除去甲醇,3000r/min离心5min,300W超声1min,常温下加入1mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),200W超声3min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
实施例18:
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含1.6mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入8mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),40℃水浴加热搅拌30min,转速为500r/min,再滴入0.6mL DDC溶液(2mg/mL),40℃旋蒸除去甲醇,3000r/min离心5min,300W超声1min,常温下加入1mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),200W超声3min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
实施例19:
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含2.0mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入8mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),40℃水浴加热搅拌30min,转速为500r/min,再滴入0.6mL DDC溶液(2mg/mL),40℃旋蒸除去甲醇,3000r/min离心5min,300W超声1min,常温下加入1mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),200W超声3min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
实施例17、实施例18和实施例19制备的PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒粒径结果如下:
表4 PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的粒度结果
如表4所示,实例17可以达到粒径小,分散指数低,且均匀的体系,但是实例18显然载药量更高。
实施例20:
如图2所示,Cu(DDC)2纳米核脂质体在肝癌Hep G2外毒性研究
使用实施例4所制备的Cu-Al LDH,实施例15制备的纳米粒。
实验原理:MTT法测定细胞毒性实验原理:MTT(噻唑蓝)是一种黄色生物活性染料,能够接受氢离子,在活细胞内可被线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物——甲瓒,并沉积在细胞中;而在死细胞中不被还原。甲瓒的生成量和细胞释放出的琥珀酸脱氢酶活性成正比,而琥珀酸脱氢酶活性与活细胞的数量和活力成正比,因此活细胞的数量和状态可通过测定甲瓒的量而得到。甲瓒可溶解在DMSO中,在492nm处有最大吸收,可使用酶标仪在492nm波长处测定吸光度值,从而反映活细胞数量和状态。细胞存活率(Viability)通过如下公式计算,其中Asample为样品孔的吸光度值,Acontrol为对照孔的吸光度值。
MTT法测定细胞毒性实验步骤:
(1)接种细胞:取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶将细胞消化,用相应的培养液稀释,吹打均匀后加入96孔细胞板中,细胞悬浮液100μL/well。细胞板于37℃培养箱中培养24h。
(2)加药:弃去培养液,将一系列不同浓度的受试溶液加入96孔细胞板中,100μL/well,每个浓度平行三次操作。每张板设空白对照组。将细胞于37℃培养箱中培养48h和72h;
(3)显色和比色:细胞加药培养相应时间后,向各孔中加入MTT溶液10μL/well,再放回培养箱继续培养4h,取出培养板弃去所有培养液和MTT溶液。然后向所有孔中加入DMSO100μL/well,震荡5-10min,使结晶充分溶解。使用酶标仪测定其在492nm处的吸光度值。
表5不同药物制剂对Hep G2细胞孵育72小时的IC50
从表5看出,共载阿霉素和Cu(DDC)2的双载药插层水滑石纳米粒的IC50值小于双药溶液组,毒性相比于游离药物显著提高,能更好地发挥抗肿瘤作用,具备明显的协同作用。
如图7所示,单纯的LDH电镜图是一个完整的六边形,LDH@DDC也是一个完整六边形,小分子量DDC由于其强大的结合能力,可以很容易地进入LDH的内部并与Cu2+紧密结合,从而使外部形状的变化最小。而随着DOX插入,LDH@DOX有了很明显的变化。包衣PEG-PLG之后,变化更大,PEG-PLG长链部分吸附在外层上以形成分叉结构。
实施例21:
一种共载阿霉素和Cu(DDC)2的双载药插层水滑石纳米粒小鼠体内药效学研究。
如图3、图4和图5所示,实验用鼠为雄性BALB/c小鼠(BALB/c-nu,18-22g)购自北京华富康生物技术有限公司。为了建立肿瘤模型,每只裸鼠皮下注射Hep G2细胞,密度为3×106个细胞。根据下式计算肿瘤体积:肿瘤体积(mm3)=1/2×a×b2(其中a是垂直长直径,b是垂直短直径)。当肿瘤体积达到约80mm3时,该实验已准备好实施。将小鼠随机分成4组(n=5),每2天静脉注射一次生理盐水,DOX(0.15mg/kg)+Cu(DDC)2(0.3mg/kg)溶液,PEG-PLG@LDH@DDC/DOX总共5次。每隔一天记录荷瘤小鼠的体重和肿瘤大小直至第14天。在实验结束时,使小鼠安乐死并收集肿瘤组织用于进一步研究。使用以下公式计算肿瘤抑制率(TIR):TIR(%)=(1-Wtest/Wcontrol)×100%,其中Wtest和Wcontrol是测试组和对照组的平均肿瘤重量。
肿瘤体积生长的图3、图4、图5显示,与生理盐水组相比,共载阿霉素和Cu(DDC)2的双载药插层水滑石纳米粒组实现显著的肿瘤生长抑制。实验结束时,PEG-PLG@LDH@DDC/DOX处理组肿瘤体积和肿瘤重量分别减少60.32%和60.39%.载药纳米颗粒组和生理盐水组之间的体重变化曲线没有明显差异,这表明没有严重的全身毒性。**和***代表统计学中有明显差异。
表6药物代谢动力学参数
图8显示了静脉内给予PEG-PLG@LDH@DDC/DOX与DOX和Cu(DDC)2的药物后的平均DOX和Cu(DDC)2血浆浓度-时间曲线,主要药代动力学参数列于上表。DOX浓度随时间显著下降,1小时后无法检测到。与游离DOX相比,PEG-PLG@LDH@DDC/DOX显著改善了DOX药代动力学参数。平均消除半衰期(t1/2),曲线下面积(AUC0-t)和PEG-PLG@LDH@DDC/DOX的Cmax分别是游离DOX的1.5倍,2倍和2.2倍。此外,与游离DOX相比,PEG-PLG@LDH@DDC/DOX的清除率(CL)降低约2.2倍,这意味着DOX在血液循环中的保留增加。就Cu(DDC)2而言,PEG-PLG@LDH@DDC/DOX的半衰期为5.668±1.170h,远高于游离Cu(DDC)2的2.733±0.269h。HA/PEG-PLG@LDH@DDC/DOX的AUC0-t和Cmax分别增加至游离Cu(DDC)2的1.2倍和1.5倍。相反,血浆清除率从6.702±0.456L/h/kg降至4.616±0.43L/h/kg。PEG-PLG@LDH@DDC/DOX的长循环时间和缓慢的血浆消除速率可能是由于其在血液中的良好稳定性及其缓慢释放,这也通过体外释放曲线证实。
实施例22:
(1)Cu-Al LDH的制备方法;
将Cu(NO3)2·3H2O(0.006mol),Al(NO3)3·9H2O(0.003mol)和NaNO3(0.006mol)溶解在含有0.5%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌,用注射器吸取3mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应20h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,4000r/min离心8min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌8h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声40min,即得Cu-Al LDH。
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含1.0mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入5mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),35℃水浴加热1000r/min搅拌20min,再滴入1.5mL DDC溶液(2mg/mL),35℃旋蒸除去甲醇,2000r/min离心5min,300W超声5min,常温下加入0.5mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),300W超声1min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
实施例23:
(1)Cu-Al LDH的制备方法;
将Cu(NO3)2·3H2O(0.006mol),Al(NO3)3·9H2O(0.003mol)和NaNO3(0.006mol)溶解在含有0.35%(m/v)F68的除CO2的50mL蒸馏水中,转移至三颈瓶中,加入搅拌子,封口后抽真空,第一次氮气下剧烈搅拌,用注射器吸取1.5mol/L NaOH溶液,逐滴滴入上述硝酸盐溶液中,使得体系内pH达到9-10,常温下搅拌反应16h。
将反应后的溶液取出,转移至离心管中,3000r/min离心12min,弃去上清液。用除CO2的蒸馏水洗涤,3000r/min离心5min,连续洗三次,测得最后一次上清液pH约为7即可。
将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌4h。收集反应后的混悬液,40kHz下水浴超声40min,即得Cu-Al LDH。
(2)一种PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX的制备方法
取含1.0mg的DOX甲醇溶液(4mL),缓慢滴入20mL Cu-Al LDH混悬液(约2mg/mL),45℃水浴加热3000r/min搅拌40min,再滴入1.0mL DDC溶液(2mg/mL),45℃旋蒸除去甲醇,4000r/min离心2min,200W超声5min,常温下加入0.5mL PEG-PLG溶液(0.25mg/mL),300W超声2min,即得PEG-PLG@Cu-Al LDH@DDC/DOX纳米粒。
Claims (10)
1.双载药插层水滑石纳米粒,其特征在于:纳米粒包含阿霉素、二乙基二硫代氨基甲酸的钠盐DDC、Cu-Al LDH、PEG-PLG,其中,阿霉素:二乙基二硫代氨基甲酸的钠盐DDC:Cu-AlLDH:PEG-PLG各成分的质量比为(5-10):(3-6):(30-200):(1-5);
所述纳米粒的制备方法如下:
(1)共沉淀法制备Cu-Al LDH:将Cu(NO3)2·3H2O,Al(NO3)3·9H2O和NaNO3按一定摩尔比溶解在含有F68的除CO2的蒸馏水中,第一次在氮气流下剧烈搅拌;NaOH溶液逐滴滴入硝酸盐溶液中,调节pH为9-10,常温下搅拌反应;将反应后的溶液取出,离心;用除CO2的蒸馏水洗涤,离心,连续洗三次;将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌;收集反应后的混悬液,水浴超声,即得Cu-Al LDH;
(2)制备双载药插层水滑石纳米粒:将盐酸阿霉素脱去盐酸盐后溶解于甲醇,再滴入Cu-Al LDH混悬液中混匀,水浴避光搅拌,然后将二乙基二硫代氨基甲酸钠盐DDC的水溶液缓慢滴入,旋蒸除去甲醇,离心收集上清液、超声;再缓慢滴加PEG-PLG溶液、超声,得到双载药插层水滑石纳米粒。
2. 根据权利要求1所述的双载药插层水滑石纳米粒,其特征在于:双载药插层水滑石纳米粒为阿霉素:DDC:Cu-Al LDH:PEG-PLG各成分的质量比为6.4:4.8:64:1。
3.根据权利要求1所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,其特征在于:该制备方法包括如下步骤:
(1)共沉淀法制备Cu-Al LDH;
(2)制备双载药插层水滑石纳米粒:将盐酸阿霉素脱去盐酸盐后溶解于甲醇,再滴入Cu-Al LDH混悬液中混匀,水浴避光搅拌,然后将二乙基二硫代氨基甲酸钠盐的水溶液缓慢滴入,旋蒸除去甲醇,离心收集上清液、超声;再缓慢滴加PEG-PLG溶液、超声,得到双载药插层水滑石纳米粒。
4.根据权利要求3所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,其特征在于:步骤(1)的具体制备方法包括:
将Cu(NO3)2·3H2O,Al(NO3)3·9H2O和NaNO3按一定摩尔比溶解在含有F68的除CO2的蒸馏水中,第一次在氮气流下剧烈搅拌;NaOH溶液逐滴滴入硝酸盐溶液中,调节pH为9-10,常温下搅拌反应;将反应后的溶液取出,离心;用除CO2的蒸馏水洗涤,离心,连续洗三次;将离心后下层用水分散,然后第二次氮气流下搅拌;收集反应后的混悬液,水浴超声,即得Cu-AlLDH。
5.根据权利要求4所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,其特征在于:步骤(1)中Cu(NO3)2·3H2O,Al(NO3)3·9H2O和NaNO3投料比摩尔比为2:1:2; F68的含量为0.1%-0.5%m/v,第一次氮气下剧烈搅拌反应时间为12-20 h,NaOH溶液的浓度为1 M-3 M;离心转速为2000-4000 r/min,离心时间8-12min;调节pH后搅拌12-20 h;第二次氮气流下反应搅拌6-12 h,水浴超声是室温下超声20-40 min。
6.根据权利要求3或4所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,其特征在于:步骤(2)中的阿霉素是用三乙胺将盐酸阿霉素中的盐酸脱去;二氯甲烷萃取后,旋蒸除去二氯甲烷,得到阿霉素。
7. 根据权利要求3或4所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,其特征在于:阿霉素:DDC:Cu-Al LDH的质量比为(5-10):(3-6):(30-200);水浴避光搅拌的条件是水浴温度为35-45℃,搅拌速度为300-1000 r/min,搅拌时间为20-40 min。
8. 根据权利要求3或4所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,其特征在于:35-45℃旋蒸条件下除去甲醇,离心收集上清液、超声,其中低速离心转速为2000-4000 r/min,离心时间2-5 min,超声功率为200-300 W,超声时间1-5min。
9. 根据权利要求3或4所述的双载药插层水滑石纳米粒的制备方法,其特征在于:PEG-PLG的加入量与Cu-Al LDH比例为(1-5):(30-200),滴加PEG-PLG溶液时的超声时间为1-5min,超声功率为200-300 W。
10.权利要求1~2中的任意一项所述的双载药插层水滑石纳米粒在制备抗癌药物中的应用。
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