CN110339192A - 一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,包括以下步骤:S1、选择40只品系为ICR的SPF级雄鼠,小鼠的年龄为6‑8周,然后将40只小鼠分为四组每组10只,分别是:A:空白对照组(No treatment,NT);B:单加PA组(Pa);C:ALI模型组(LPS);D:ALI模型组+PA治疗组(LPS+Pa);S2、提前将50μg的LPS溶解于20μL的PBS溶液中,小鼠经过乙醚麻醉后,通过鼻内给药的方式建立ALI模型。该掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,通过体内外实验分别检测了RAW264.7细胞和小鼠肺脏组织的促炎介质表达和分泌水平,利用分子生物学技术全面评估了掌叶防己碱对急性肺损伤的治疗效果,掌叶防己碱能够有效的减少细胞和肺脏组织中促炎介质的表达和分泌,从而缓解急性肺损伤。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体为一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法。
背景技术
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种严重的呼吸系统疾病,其发病迅速,病死率较高可达40%以上,严重的威胁着人类健康。多种因素均可以导致急性肺损伤的发生,如细菌感染、外伤、休克、急性胰腺炎、败血症、误吸等。当急性肺损伤发生时,肺组织积水,大量的炎性细胞聚集到肺泡组织内并释放促炎细胞因子,加剧炎症反应过程,破坏肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞进而引起低氧血症,若病情进一步发展可导致更为严重的急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)的发生,最终导致肺的顺应性降低,肺脏气体交换受阻,进一步增加病死率。目前尚未有效果显著的治疗急性肺损伤的药物,因此寻找一种安全、高效的治疗ALI的药物显得迫在眉睫。
急性肺损伤的特征之一是患者血液中含有大量的内毒素,主要以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)为主。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁表面的主要毒力因子。已经报道研究表明巨噬细胞触LPS后可引起炎症反应。LPS被广泛用于诱导动物的急性炎症模型,用于候选抗炎药物的临床前评估。小鼠鼻内注射LPS是建立ALI的经典方法,并且人的急性肺损伤与小鼠的急性肺损伤模型的症状较为相似。因此以LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型科学合理。
掌叶防己碱(palrnatine,Pa)别名巴马汀,是中药黄藤中的有效成分之一,也是卫生保健食品的常见成分之一,具有良好的杀灭细菌、滴虫等药理作用,但到目前为止关于Pa用于急性肺损伤治疗的研究不够成熟。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足,本发明提供了一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,具备来源广泛、效果显著、不会产生耐药性等优点,有利于解决治疗急性肺损伤备选药物不足的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,包括以下步骤:
S1、选择40只品系为ICR的SPF级雄鼠,小鼠的年龄为6-8周,然后将40只小鼠分为四组每组10只,分别是:A:空白对照组(No treatment,NT);B:单加Pa组(Pa);C:ALI模型组(LPS);D:ALI模型组+Pa治疗组(LPS+Pa);
S2、提前将50μg的LPS溶解于20μL的PBS溶液中,小鼠经过乙醚麻醉后,通过鼻内给药的方式建立ALI模型;
S3、在构建ALI模型的前6天以口服灌胃的方式进行给药,给药浓度为100mg/kg,给药体积为100μL;
S4、将小鼠经过LPS处理12h后,取出5只小鼠的完整左叶肺脏制成5份样本,获取小鼠肺脏并拍照片,用干净的滤纸仔细将其表面的液体蘸干净,然后记录肺脏组织的重量,获得湿重;然后将其储存在恒温干燥器中,在80℃下保持48h,获得干重,计算湿重/干重(w/d)比,评价肺的含水量;
S5、使用S4中的5只小鼠取出右叶肺脏,将每只小鼠的右叶肺脏均切成两块,然后将5只小鼠的右叶肺脏制成5份相同的石蜡切片;
S6、取出部分右叶肺脏用于肺脏髓过氧化物酶(MPO)的测定;
S7、小鼠经过LPS处理12h后,取5只小鼠的支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavage fluid,BALF),在转速为12000r/min的条件下离心5min,然后取上清液转移至新的1.5mL离心管中,应用酶联免疫吸附实验检测炎性细胞因子TNFα、IL-6;
S8、CCK8实验
在96孔板中均匀接种细胞,当细胞生长至底壁面积的70%时,用不同药物浓度的掌叶防己碱处理细胞5h,5h后每孔加入10μL的CCK8,在37℃细胞培养箱中继续放置1h,然后测定450nm处的吸光度;
S9、RAW264.7细胞产生炎性基因的检测实验
将细胞接种到60cm2的细胞培养皿中,含2mL培养基,待细胞密度长至底壁面积的70%时,加入LPS使其工作浓度为1μg/mL,利用LPS刺激细胞4h,在加入LPS前1h加入100μM的Pa,5h后提取总RNA,反转录进行荧光定量实验,检测Pa对RAW264.7细胞炎性基因TNF-α和IL-6的表达所产生的影响。
优选的,所述石蜡切片的制作方法为:将新鲜的小鼠肺脏浸泡在4%的甲醛溶液中24h,然后按照石蜡切片的步骤获取石蜡切片。
优选的,步骤S6中的测定方法为:将肺脏组织放置在2mL离心管中,按照100mg的组织加入400μL的比例加入HEPES溶液,在50HZ的条件下研磨5min,然后在转速为12000r/min的条件下离心5min。
(三)有益效果
与现有技术相比,本发明提供了一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,具备以下有益效果:
1、该掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,通过体内外实验分别检测了RAW264.7细胞和小鼠肺脏组织的促炎介质表达和分泌水平,利用分子生物学技术全面评估了掌叶防己碱对急性肺损伤的治疗效果,掌叶防己碱能够有效的减少细胞和肺脏组织中促炎介质的表达和分泌,从而缓解急性肺损伤。
2、该掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,通过利用肺脏湿重与肺脏干重作比的方法检测了急性肺损伤小鼠的肺脏水肿情况,从另一个角度评估了掌叶防己碱对急性肺损伤的治疗效果,掌叶防己碱能够有效的缓解肺部组织水肿,从而缓解急性肺损伤。
3、该掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,在本发明中掌叶防己碱以口服的方式给药,方便急性肺损伤的治疗,有利于药物的有效成分充分发挥治疗作用,具有携带方便、不易产生耐药性、不会产生抗生素污染等优点,有利于急性肺损伤的治疗。
附图说明
图1为本发明中掌叶防己碱对RAW264.7细胞活力的影响示意图;
图2为本发明中掌叶防己碱在LPS诱导的RAW264.7细胞中对炎性细胞因子TNF-α产生的影响示意图;
图3为本发明中掌叶防己碱在LPS诱导的RAW264.7细胞中对炎性细胞因子IL-6产生的影响示意图;
图4为Pa在LPS诱导的急性肺损伤模型中对肺脏病理学损伤的影响示意图;
图5为急性肺损伤模型中肺脏病理组织学评分示意图;
图6为掌叶防己碱在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中对炎性细胞因子TNF-α产生的影响示意图;
图7为掌叶防己碱在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中对炎性细胞因子IL-6产生的影响示意图;
图8为掌叶防己碱在LPS诱导的急性肺损伤模型中对肺脏组织内髓过氧化物酶(MPO)活性的影响示意图;
图9为掌叶防己碱对LPS诱导的急性肺损伤模型中肺脏水肿程度的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,包括以下步骤:
S1、选择40只品系为ICR的SPF级雄鼠,小鼠的年龄为6-8周,然后将40只小鼠分为四组每组10只,分别是:A:空白对照组(No treatment,NT);B:单加Pa组(Pa);C:ALI模型组(LPS);D:ALI模型组+Pa治疗组(LPS+Pa);
S2、提前将50μg的LPS溶解于20μL的PBS溶液中,小鼠经过乙醚麻醉后,通过鼻内给药的方式建立ALI模型;
S3、在构建ALI模型的前6天以口服灌胃的方式进行给药,给药浓度为100mg/kg,给药体积为100μL;
S4、将小鼠经过LPS处理12h后,取出5只小鼠的完整左叶肺脏制成5份样本,获取小鼠肺脏并拍照片,用干净的滤纸仔细将其表面的液体蘸干净,然后记录肺脏组织的重量,获得湿重;然后将其储存在恒温干燥器中,在80℃下保持48h,获得干重,计算湿重/干重(w/d)比,评价肺的含水量;
S5、使用S4中的5只小鼠取出右叶肺脏,将每只小鼠的右叶肺脏均切成两块,然后将5只小鼠的右叶肺脏制成5份相同的石蜡切片;
所述石蜡切片的制作方法为:将新鲜的小鼠肺脏浸泡在4%的甲醛溶液中24h,然后按照石蜡切片的步骤获取石蜡切片。
S6、取出部分右叶肺脏用于肺脏髓过氧化物酶(MPO)的测定;
步骤S6中的测定方法为:将肺脏组织放置在2mL离心管中,按照100mg的组织加入400μL的比例加入HEPES溶液,在50HZ的条件下研磨5min,然后在转速为12000r/min的条件下离心5min。
S7、小鼠经过LPS处理12h后,取剩下5只小鼠的支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF),在转速为12000r/min的条件下离心5min,然后取上清液转移至新的1.5mL离心管中,应用酶联免疫吸附实验检测炎性细胞因子TNFα、IL-6;
S8、CCK8实验
在96孔板中均匀接种细胞,当细胞生长至底壁面积的70%时,用不同药物浓度的掌叶防己碱处理细胞5h,5h后每孔加入10μL的CCK8,在37℃细胞培养箱中继续放置1h,然后测定450nm处的吸光度;
S9、RAW264.7细胞产生炎性基因的检测实验
将细胞接种到60cm2的细胞培养皿中,含2mL培养基,待细胞密度长至底壁面积的70%时,加入LPS使其工作浓度为1μg/mL,利用LPS刺激细胞4h,在加入LPS前1h加入100μm的Pa,5h后提取总RNA,反转录进行荧光定量实验,检测PA对RAW264.7细胞炎性基因TNF-α和IL-6的表达所产生的影响。
为配合上述实验方法,现提供如下数据统计:
由图1中可以得知在500μM以内的掌叶防己碱对RAW264.7细胞的活力几乎不产生影响,1500μM的掌叶防己碱对细胞产生毒性作用(*p<0.05,n=5)。
由图2可以得知单独加入Pa组不会刺激TNF-α基因水平的升高,LPS会显著的刺激TNF-α基因水平的升高(#p<0.01),Pa预处理后显著的抑制了炎性细胞因子TNF-α基因水平的升高(**p<0.01),Pa通过抑制TNF-α基因水平的升高来减轻炎症反应(n=3)。
由图3可以得知单独加入Pa组不会刺激IL-6基因水平的升高,LPS会显著的刺激IL-6基因水平的升高(#p<0.01),Pa预处理后显著的抑制了炎性细胞因子IL-6基因水平的升高(**p<0.01),Pa通过抑制IL-6基因水平的升高来减轻炎症反应(n=3)。
由图4可以得知LPS显著的增加了肺脏的病理组织学损伤,如图中箭头所示肺泡间的基质增厚、肺泡萎缩、肺泡内有大量的炎性细胞浸润,这表明肺脏的受到了严重损伤,表明急性肺损伤模型构建成功,如图D所示,Pa预处理后这些症状得到了显著的缓解,证明Pa对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有治疗作用。
由图5可以得知LPS组与NT组和单独加Pa组相比,损伤评分较高肺脏组织损伤严重(#p<0.01),Pa预处理后显著的降低了肺脏的损伤评分(**p<0.01)。评分标准为:无损伤为0分,轻度损伤为1分,中度损伤为2分,重度损伤为3分,极度损伤为4分,三位病理评分人员对其进行分别评分。
由图6可以得知与NT组和Pa组相比LPS组中有大量的TNF-α分泌(#p<0.01),Pa预处理后TNF-α的分泌情况得到显著的抑制(**p<0.01),该结果表明Pa通过抑制肺脏中TNF-α的分泌来发挥对ALI的治疗作用(n=5)。
由图7可以得知与NT组和Pa组相比LPS组中有大量的IL-6分泌(#p<0.01),Pa预处理后IL-6的分泌情况得到显著的抑制(**p<0.01),该结果表明Pa通过抑制肺脏中IL-6的分泌来发挥对ALI的治疗作用(n=5)。
由图8可以得出,LPS组与NT和Pa组相比其MPO活性显著升高(#p<0.01),这表明LPS组的肺脏组织内有大量的中性粒细胞聚集,耗氧量增加,加剧炎症反应,进一步造成肺脏组织的损伤,Pa预处理后这一症状得到显著的缓解(**p<0.01),该结果表明Pa通过抑制MPO活性来发挥对急性肺损伤的治疗作用(n=5)。
由图9可以得知,LPS组与NT和单加Pa组相比其肺脏组织组织液渗出严重,发生严重的水肿(#p<0.01)水肿情况得到有效的缓解,该实验结果表明Pa通过减轻肺脏组织的水肿情况(**p<0.01),来发挥治疗作用(n=5)。
上述材料中n为样本数。
综上所述,该掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,一方面通过体内外实验分别检测了RAW264.7细胞和小鼠肺脏组织的促炎介质表达和分泌水平,利用分子生物学技术全面评估了掌叶防己碱对急性肺损伤的治疗效果,掌叶防己碱能够有效的减少细胞和肺脏组织中促炎介质的表达和分泌,从而缓解急性肺损伤,另一方面利用肺脏湿重与肺脏干重作比的方法检测了急性肺损伤小鼠的肺脏水肿情况,从另一个角度评估了掌叶防己碱对急性肺损伤的治疗效果,掌叶防己碱能够有效的缓解肺部组织水肿,从而缓解急性肺损伤,而且在本发明中掌叶防己碱以口服的方式给药,方便急性肺损伤的治疗,有利于药物的有效成分充分发挥治疗作用,具有携带方便、不易产生耐药性、不会产生抗生素污染等优点,有利于急性肺损伤的治疗。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、选择40只品系为ICR的SPF级雄鼠,小鼠的年龄为6-8周,然后将40只小鼠分为四组每组10只,分别是:A:空白对照组(No treatment,NT);B:单加Pa组(Pa);C:ALI模型组(LPS);D:ALI模型组+Pa治疗组(LPS+Pa);
S2、提前将50μg的LPS溶解于20μL的PBS溶液中,小鼠经过乙醚麻醉后,通过鼻内给药的方式建立ALI模型;
S3、在构建ALI模型的前6天以口服灌胃的方式进行给药,给药浓度为100mg/kg,给药体积为100μL;
S4、将小鼠经过LPS处理12h后,取出5只小鼠的完整左叶肺脏制成5份样本,获取小鼠肺脏并拍照片,用干净的滤纸仔细将其表面的液体蘸干净,然后记录肺脏组织的重量,获得湿重;然后将其储存在恒温干燥器中,在80℃下保持48h,获得干重,计算湿重/干重(w/d)比,评价肺的含水量;
S5、使用S4中的5只小鼠取出右叶肺脏,将每只小鼠的右叶肺脏均切成两块,然后将5只小鼠的右叶肺脏制成5份相同的石蜡切片;
S6、取出部分右叶肺脏用于肺脏髓过氧化物酶(MPO)的测定;
S7、小鼠经过LPS处理12h后,取剩下5只小鼠的支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavage fluid,BALF),在转速为12000r/min的条件下离心5min,然后取上清液转移至新的1.5mL离心管中,应用酶联免疫吸附实验检测炎性细胞因子TNFα、IL-6;
S8、CCK8实验
在96孔板中均匀接种细胞,当细胞生长至底壁面积的70%时,用不同药物浓度的掌叶防己碱处理细胞5h,5h后每孔加入10μL的CCK8,在37℃细胞培养箱中继续放置1h,然后测定450nm处的吸光度;
S9、RAW264.7细胞产生炎性基因的检测实验
将细胞接种到60cm2的细胞培养皿中,含2mL培养基,待细胞密度长至底壁面积的70%时,加入LPS使其工作浓度为1μg/mL,利用LPS刺激细胞4h,在加入LPS前1h加入100μM的Pa,5h后提取总RNA,反转录进行荧光定量实验,检测Pa对RAW264.7细胞炎性基因TNF-α和IL-6的表达所产生的影响。
2.根据权利要求1所述的一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,其特征在于:所述石蜡切片的制作方法为:将新鲜的小鼠肺脏浸泡在4%的甲醛溶液中24h,然后按照石蜡切片的步骤获取石蜡切片。
3.根据权利要求1所述的一种掌叶防己碱用于治疗急性肺损伤的实验方法,其特征在于:步骤S6中的测定方法为:将肺脏组织放置在2mL离心管中,按照100mg的组织加入400μL的比例加入HEPES溶液,在50HZ的条件下研磨5min,然后在转速为12000r/min的条件下离心5min。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191018 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |