CN110325653B - 用于信息存储的方法、组合物和装置 - Google Patents
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Abstract
用于读取存储在聚合物(例如DNA)中的数据和用于验证在基于纳米孔的芯片中原位合成的聚合物的序列的方法、系统和装置包括提供具有电感器和单元的谐振器，该单元具有纳米孔和可以穿过纳米孔的聚合物，谐振器响应于探测频率下的AC输入电压在探测频率下具有AC输出电压频率响应，提供至少具有探测频率的AC输入电压，并且监测至少在探测频率下的AC输出电压，探测频率下的AC输出电压指示在监测时存储在聚合物中的数据，其中聚合物包括至少两种具有引起不同的谐振频率响应的不同性质的单体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年8月29日提交的美国申请号15/690,189，2017年2月28日提交的国际申请号PCT/US2017/020044和2016年10月31日提交的美国临时专利申请号62/415,430的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及使用纳米孔装置合成和测序聚合物，例如核酸，用于信息存储和检索的新方法、组合物和装置。
背景技术
不断需要在物理介质上或在物理介质中存储更多数据，随着容量变大，存储装置变得越来越小。据报道，每两年存储的数据量增加一倍，并且根据一项研究，到2020年，每年创建和复制的数据量将达到44泽字节，即44万亿吉字节。此外，诸如硬盘驱动器、光学介质和磁带之类的现有数据存储介质相对不稳定并且在长时间存储之后会被破坏。
迫切需要在诸如几十年或几个世纪的长时间内存储大量数据的备选方法。
有些人建议使用DNA来存储数据。DNA非常稳定并且理论上可以编码大量数据并将数据存储很长时间。参见，例如，Bancroft，C.，等人，Long-Term Storage of Informationin DNA，Science(2001)293：1763-1765。另外，作为存储介质的DNA不易受传统数字存储介质的安全风险的影响。但并没有实际的方法来实施这一想法。
例如，WO2014/014991描述了一种在DNA寡核苷酸上存储数据的方法，其中信息以二进制格式编码，每个核苷酸一位，96位(96个核苷酸)数据块，19个核苷酸的地址序列和用于扩增和测序的侧翼序列。然后通过使用PCR来扩增序列和使用高速测序仪如IIIuminaHiSeq机器测序来读取代码。然后使用地址标签以正确的顺序排列数据块序列，过滤掉地址和侧翼序列，并将序列数据转换成二进制代码。这种方法有很大的局限性。例如，96位数据块只能编码12个字母(使用传统的一个字节或每个字母或空格8位)。相对于“管家”信息存储的有用信息的比率低-大约40％的序列信息被地址和侧翼DNA占据。该说明书描述了使用54,698个寡核苷酸编码书籍。用于合成寡核苷酸的喷墨印刷的高保真DNA微芯片限制了寡核苷酸的大小(描述的159聚体处于上限)。此外，读取寡核苷酸需要扩增和分离，这引入了额外的错误可能性。还参见WO 2004/088585A2；WO 03/025123A2；C.BANCROFT：“Long-TermStorage of Information in DNA",Science(2001)293(5536):1763c-1765；COX J P L:"Long-term data storage in DNA",Trends in Biotechnology(2001)19(7):247-250。
DNA测序装置包括来自Oxford Nanopore，Genia等的基于纳米孔的装置。在许多这些装置中，通常在充满流体的单元中使用纳米孔，通过测量DNA穿过纳米孔时的电流变化来读取DNA数据，所述电流通常在纳安级范围内。已经提出了基于电容变化的测量，但不是商业性的；变化在皮/飞/阿托法拉第的范围内。因此，很难可靠地和可重复地检测这种小的变化，因为它们难以与典型的背景噪声区分。该困难进一步增强，因为DNA可以以大约每秒一百万个碱基的速率移动通过纳米孔，这太快而不能使用现有手段精确读取，需要使用蛋白质纳米孔，蛋白质纳米孔减缓了DNA穿过纳米孔，并且对于阅读大量数据是不切实际的。
现有的基于纳米孔的DNA数据读取器不能克服这些问题，因此不能提供高度精确、可重复、可靠、自动化且稳健的DNA数据读取结果。因此，期望具有提供高质量、可靠的DNA数据读取结果，并且还提供可扩展的方法以可靠地同时读取存储在多个DNA分子上的数据的装置。
虽然潜在的信息密度和DNA的稳定性使其成为数据存储的有吸引力的工具，但已经认识超过二十五年，仍然没有实际的方法来以这种形式编写和读取大量数据。
发明内容
我们开发了一种新的核酸存储方法，使用纳米流体系统来合成核酸序列和纳米孔读取器来读取序列。我们的方法允许合成、存储和读取数百、数千甚至数百万个碱基长的DNA链。因为序列很长，所以只有相对较小比例的序列被识别信息占用，因此信息密度远高于上述方法中的信息密度。此外，在一些实施方案中，合成的核酸将在纳米芯片上具有特定位置，因此即使没有识别信息也可以鉴定序列。在纳米容器中进行的测序非常快，并且通过纳米孔读取序列可以非常快速，每秒高达一百万个碱基量级。由于仅需要两种碱基类型，因此测序可以比必须区分四种核苷酸碱基类型(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤)的测序程序更快且更准确。在特定的实施方案中，两个碱基不会彼此配对并形成二级结构，并且也具有不同的尺寸。例如，腺嘌呤和胞嘧啶对于此目的将优于倾向于杂交的腺嘌呤和胸腺嘧啶，或腺具有相似大小的腺嘌呤和鸟嘌呤。
在一些实施方案中，该系统可用于合成编码数据的长聚合物，其可被扩增和/或释放，然后在不同的测序仪上测序。在其他实施方案中，该系统可用于提供定制的DNA序列。在其他实施方案中，该系统可用于读取DNA序列。
在一个实施方案中使用的纳米芯片包含至少两个通过至少一个纳米孔连接的独立反应隔室，所述纳米孔防止至少一些组分混合，但允许少至单个DNA分子或其他带电聚合物，例如RNA或肽核酸(PNA)以可控方式从一个反应隔室进入另一个反应隔室。聚合物(或至少聚合物的加入单体的末端)从一个隔室转移到另一个隔室允许使用酶来顺序操作/反应聚合物，例如添加碱基，所述酶不能穿过纳米孔例如，因为它们太大或者因为它们被束缚在基质或大块部分上。纳米孔传感器报告聚合物的移动或位置及其状态，例如其序列以及尝试的反应是否成功。这允许写入、存储和读取数据，例如其中碱基序列对应于机器可读代码，例如二进制代码，其中每个碱基或碱基组对应于1或0。
因此，本发明尤其包括以下实施方案，
·用于合成带电聚合物(例如DNA)的纳米芯片，包含至少两个不同的单体，所述纳米芯片包含由一个或多个纳米孔分开的两个或更多个反应室，其中每个反应室包含电解液，将带电聚合物吸入室中的一个或多个电极，和促进单体或寡聚体加入聚合物的一种或多种试剂。纳米芯片可以任选地配置有功能元件以指导、引导和/或控制DNA，它可以任选地用材料涂布或制造，所述材料被选择为允许DNA的平滑流动或附着DNA，并且纳米芯片可以包括纳米电路元件以提供和控制电极靠近纳米孔。例如，一个或多个纳米孔可任选地各自与电极相关联，所述电极可控制聚合物通过纳米孔的移动和/或检测纳米孔和聚合物的界面处的电势、电流、电阻或电容的变化，从而在聚合物通过一个或多个纳米孔时检测聚合物的序列。在特定实施方案中，使用聚合酶或位点特异性重组酶合成寡聚体。在一些实施方案中，在合成过程中对聚合物进行测序，以允许检测和任选地纠正错误。在一些实施方案中，如此获得的聚合物存储在纳米芯片上，并且当需要访问聚合物序列中编码的信息时可以对其进行测序。
·如通过DC偏压将DNA吸引通过纳米孔时，通过测量谐振RF电路中的电容变化来确定纳米孔芯片中聚合物(例如DNA)的序列的方法和装置。
·使用所述纳米芯片合成聚合物(例如DNA)的方法。
·单链DNA分子，其中序列基本上仅由非杂交核苷酸，例如腺嘌呤和胞嘧啶核苷酸(As和Cs)组成，它们按顺序排列以对应于二进制代码，例如用于数据存储方法。
·双链DNA，包含对应于二进制代码的一系列核苷酸序列，其中双链DNA还包含
·一种读取DNA中编码的二进制代码的方法，包括使用纳米孔测序仪。
·一种数据存储方法及其装置，使用上述纳米芯片制备包含至少两个不同单体的带电聚合物，例如DNA，其中所述单体按顺序排列以对应于二进制代码。
·用于在基于纳米孔的芯片中原位存储和读取存储串(例如DNA或聚合物)上的数据的方法和系统，包括提供具有至少三个室的单元，具有加“1”室，其被布置为向聚合物加“1”位和加“0”室，用于向聚合物加“0”位，“解封闭”室，其被布置为当聚合物分别进入加“1”或加“0”室时，使聚合物接收“1”位和“0”位，基于预定的数字数据模式依次将聚合物从“解封闭”室通过纳米孔引导至加“1”室或加“0”室以在聚合物上产生数字数据模式，并利用芯片上纳米孔-聚合物谐振器(NPR)的谐振频率响应读取聚合物在通过纳米孔时存储在聚合物上的数字数据。
·用于读取存储在聚合物中的数据的方法和系统包括提供具有电感器和单元的谐振器，该单元具有纳米孔和可以横穿纳米孔的聚合物，该谐振器响应探测频率下的AC输入电压，具有在探测频率下的AC输出电压频率响应，提供至少具有探测频率的AC输入电压，并至少在探测频率监测AC输出电压，探测频率下的AC输出电压指示在监测时存储在聚合物中的数据，其中聚合物包括至少两种具有引起不同的谐振频率响应的不同性质的单体。
根据下文提供的详细描述，本发明的其他方面和适用领域将变得显而易见。应当理解，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。
附图说明
从详细说明和附图中将更全面地理解本发明，其中：
图1示出了简单的双室纳米芯片设计图，其中分隔膜由纳米孔穿孔，并且在膜的任一侧上具有电极。
图2和图3示出了带电聚合物，例如DNA如何被吸向阳极。
图4和图5示出了聚合物可以通过反转电极的极性而向后移动。
图6示出了用于DNA合成的双室纳米芯片设计，其中聚合酶位于一个室中，解封酶位于另一个室中，并且两者都不能通过纳米孔。
图7示出了当3’-封闭的dATP(A)流过左室时添加腺嘌呤核苷酸，并且将电流设置为“向前”以将DNA带入室中。
图8示出了寡核苷酸的去保护，因此可以添加额外的核苷酸。例如，通过将电流设置为“反向”，在将DNA移动到室中之后发生去保护。
图9示出了添加3’-封闭的dCTP(C)。在某些实施方案中，使用流体流来交换该室的内容物，例如，如图所示，之前在该室中存在“A”。
图10示出了如何在流动室变成单个泳道以提供试剂的同时提供多个单独的储备室。
图11示出了通过附着到室(图中的上部DNA片段)或通过偶联到不能通过纳米孔的庞大基团(图中的下部DNA片段)来保持DNA与其室关联的方法。在该系统中，DNA的末端仍然可以移动到流动室中并接收额外的核苷酸，但另一端保留在储备室中。
图12示出了DNA附着到室壁并由多个电极控制的结构。
图13示出了在需要时如何仅仅通过控制电极的极性将DNA保留在室中。
图14示出了具有通过两侧的自由流动试剂的阵列，其中DNA结合到室的表面。
图15示出了另一种设计，其中电极位于与分隔膜相邻的侧面上，这允许更便宜的制造。
图16示出了三隔室布置，其中DNA可以通过电极从隔室移动到隔室。该系统在合成期间不需要显著的试剂流。
图17示出了如何以三隔室布置配置试剂的实例。
图18描绘了与纳米孔相邻而束缚的寡核苷酸，其中纳米孔在膜的任一侧上具有电极元件。
图19描绘了沿着包含纳米孔的膜附着的一系列DNA分子，每个膜分子在邻近纳米孔的电极的控制下，在膜的任一侧具有流动泳道。例如，如图所示，左流动泳道提供连续不断的缓冲液洗涤/3’-封闭的dATP(A)/缓冲液洗涤/3’-封闭的dCTP(C)/缓冲液洗涤流，其中只有当存在所需的核苷酸时，DNA分子才被带入流动室中。右泳道提供解封闭剂以使核苷酸的3’端去保护并允许添加另一个核苷酸。在一个实施方案中，当用缓冲液洗涤左泳道时，解封闭剂流动。在另一个实施方案中，去保护剂太大而不能通过纳米孔进入左泳道。
图20-22示意性地描绘了概念实验证据，其中用于编码数据的位是使用拓扑异构酶附着的短寡聚体。
图23描绘了纳米孔测序仪的形式，其中使用电容变化读取聚合物序列。在该电容性读出方案中，电极形成电容器的顶板和底板，由包括纳米孔的膜隔开。电容器嵌入在谐振电路中，其中脉冲直流电流可以吸引带电荷的聚合物通过纳米孔。在聚合物，例如DNA通过纳米孔时，使用高频阻抗光谱测量电容的变化。这种方法的主要优点(特别是对于DNA)在于测量频率可以非常高(有效地测量每个周期，因此100MHz频率对应于每秒1亿次测量)，并且远大于单体通过纳米孔的传输速率(例如，DNA，除非以某种方式受到限制，否则将以每秒1百万个核苷酸级别的速度响应电流通过纳米孔)。
图24描绘了双添加室布局，适用于添加两种不同类型的单体或寡聚体，例如用于2位或二进制编码。图的上半部分示出了俯视图。下部示出了侧视截面。该实施方案中的完整装置可以由多达3个独立制造的层组装并通过晶片键合连接，或者可以通过蚀刻单个基片形成。该芯片包括电控制层(1)，流体层(2)，其包含位于储备室顶部的两个添加室，带电聚合物(例如DNA)锚定在第一和第二添加室的纳米孔入口与电接地层(3)之间。
图25描绘了图24的双添加室布局的操作。将观察到，在每个添加室的底部，存在纳米孔(4)。纳米孔例如通过用FIB，TEM，湿法或干法蚀刻或通过介电击穿进行钻孔来制造。包含纳米孔的膜(5)例如为1原子层至几十nm厚。它由例如SiN，BN，SiOx，石墨烯，过渡金属二硫属化物，例如，WS2或MoS2制成。在纳米孔膜(5)下面有储备室或解封闭室(6)，其含有在一个添加室中加入单体或寡聚体后用于聚合物去保护的试剂(可以回想起以端保护形式添加了单体或寡聚体，以便一次仅加入单一单体或寡聚体)。通过改变电控制层(1)中的电极的极性，可以将聚合物(7)吸入或吸出添加室。
图26描绘了与图24和图25类似布局的顶视图，但是这里有四个添加室，它们共用一个共同的储备室或解封闭室，聚合物系在一个位置(9)处，该位置具有向四个室中的每一个的通路。该布局的横截面将如图24和图25所示，并且通过操作电控制层(图24中的1)中的电极，可以将带电聚合物移动到四个添加室中的每一个中。
图27描绘了具有多组双添加室的纳米孔芯片的顶视图，如图24和图25所示，允许多种聚合物平行合成。单体(这里是表示为A和G的dATP和dGTP核苷酸)通过连续流动路径加载到每个室中。一个或多个常见的去封闭剂流动池允许在一个添加室中加入单体或寡聚体后使聚合物去保护。这也允许聚合物根据需要分离(例如在DNA的情况下使用限制性酶，或从邻近纳米孔的表面化学分离，并从外部收集。在该特定实施方案中，解封闭剂流动池是垂直于用于填充添加室的流体加载通道。
图28描绘了双加法室布局的布线的进一步细节。电控制层(1)包括由金属或多晶硅制成的布线。通过3D堆叠增加布线密度，通过电介质沉积(例如，通过PECVD，溅射，ALD等)提供电隔离。在一个实施方案中，通过添加室中的顶部电极的触点(11)是使用通过深反应离子蚀刻(DRI E)的穿透硅通孔(TSV)(低温或BOSCH工艺)制成。单独的电压控制(12)允许每个添加室被单独寻址，允许并行地精确控制多个聚合物的序列。该图的右侧描绘了顶视图，说明了到多个添加单元的布线。电接地层(3)可以是共用的(如图所示)或分开以减少单元之间的交叉耦合。
图29描绘了另一种配置，其中用于添加室的控制电极(13)可以以环绕方式在室的侧面上而不是在室顶部沉积。
图30描绘了SDS-PAGE凝胶，证实如实施例3中所述的拓扑异构酶添加方案起作用，其中对应于预期的A5和B5产物的条带清晰可见。
图31描绘了琼脂糖凝胶，证实实施例5的PCR产物是正确的大小。泳道0是25个碱基对序列梯；泳道1是实验产物，线对应于预期分子量；泳道2是阴性对照#1；泳道3是阴性对照#2；泳道4是阴性对照#4。
图32描绘了琼脂糖凝胶，证实如实施例5中所述的限制性酶产生预期产物。左侧的梯度是100个碱基对序列梯。泳道1是未消化的NAT1/NAT9c，泳道2是消化的NAT1/NAT9c。泳道3是未消化的NAT1/NAT9cI，泳道4是消化的NAT1/NAT9cI。
图33描绘了在纳米孔附近的DNA的固定化。小图(1)示出了在左室中一端具有折纸结构的DNA(在实际的纳米芯片中，左室中最初有许多这样的折纸结构)。小图(2)示出了右侧具有阳极的系统，其将DNA驱动至纳米孔。虽然DNA链能够通过纳米孔，但折纸结构太大而无法通过，因此DNA被“卡住”。关闭电流(图3)允许DNA扩散。通过合适的化学方法，DNA链的末端在与纳米孔附近的表面接触时能够结合。在小图(4)中，添加限制性酶，其从DNA切割折纸结构。洗涤室以除去酶和残留的DNA。最终结果是附着在纳米孔附近的单个DNA分子，能够通过纳米孔来回移动。
图34描绘了基本功能纳米孔。在每个小图中，y轴是电流(nA)并且x轴是时间(s)。左图“RF噪声的筛选”说明了法拉第笼的效用。将没有纳米孔的芯片放置在流动池中并施加300mV。当法拉第笼的盖子关闭时(第一个箭头)，可以看到降噪。当闩锁闭合时(第二箭头)发生小的锋电位。注意电流是0nA。在孔制造(中间图)之后，施加300mV(箭头)导致～3.5nA的电流。当将DNA应用于接地室并施加+300mV时，可以观察到DNA迁移(右图)作为电流的瞬时降低。(注意，在这种情况下使用TS缓冲液：50mM Tris，pH 8,1M NaCl)。Lambda DNA用于该DNA迁移实验。
图35描绘了说明DNA折纸结构的主要特征的简化图：大的单链区域，立方折纸结构，以及在折纸结构附近存在2个限制位点(SwaI和AlwN1)。
图36描绘了所制造的DNA折纸结构的电子显微镜图像，并展示了预期的拓扑结构。折纸由5mM Tris碱，1mM EDTA，5mM NaCl，5mM MgCl2制成。为了保持折纸结构，优选Mg++浓度为约5mM或Na+/K+浓度约1M。折纸结构以500nM存储在
图37描绘了DNA折纸的限制性消化以确认正确的组装和功能。最左边的泳道提供MW标准。通过用AlwN1和Swa1消化折纸来测试限制位点。四个测试泳道包含如下试剂(单位为微升)：
测试泳道(1)是阴性对照；(2)用Swa1消化；(3)用AlwN1消化；(4)用Swa1/AlwN1进行双重消化。消化在室温下进行60分钟，然后在37℃下进行90分钟。琼脂糖凝胶1/2x TBE-Mg(1/2x TBE，含5mM MgCl2)，用溴化乙锭染色显现。用任一种酶进行的单独消化在凝胶中没有显示出迁移效应，但是用两种酶一起消化(泳道4)导致两个不同长度的片段，如预期的那样。
图38描绘了生物素标记的寡核苷酸与链霉亲和素包被的珠子的结合对比对照BSA包被的珠子的结合。y轴是荧光单位，’结合前’是在结合珠子之前来自测试溶液的寡核苷酸荧光，(-)对照是在结合两个不同批次的BSA-缀合的珠子后看到的荧光，SA-1和SA-2是结合2个不同批次的链霉亲和素缀合的珠子后看到的荧光。用BSA-缀合的珠子观察到小的表观量的结合，但是用链霉亲和素缀合的珠子观察到更大的结合。
图39描绘了在不同缓冲系统：MPBS和HK缓冲液中生物素标记的寡核苷酸与链霉亲和素包被的珠子的结合对比对照BSA包被的珠子的结合。左栏“阴性对照”是在结合珠子之前来自测试溶液的寡核苷酸荧光。分别在与BSA或链霉亲和素珠结合后在中间列显示’BSA珠’和在右列显示’SA珠’的荧光。在两种缓冲系统中，相对于对照，链霉亲和素珠子减少了荧光，表明生物素标记的寡核苷酸在不同缓冲系统中与链霉亲和素包被的珠子结合良好。
图40描绘了功能性缀合的SiO2纳米孔，其中表面在一侧包被链霉亲和素，在另一侧包被BSA。x轴是时间并且y轴是电流。圆点表示电流反转的点。当电流反转时会出现短暂的过冲，然后电流稳定在大致相同的绝对值。纳米孔在200mV下显示+3nA的电流，在-200mV下显示～-3nA的电流。
图41示出了插入纳米孔中的折纸DNA结构的表示。
图42示出了单链DNA与邻近纳米孔的链霉亲和素包被的表面的连接的表示。
图43示出了附着在纳米孔附近表面的折纸DNA的实验结果。两个方向上的电流为+或-～2.5nA，小于+/-3nA的原始电流，反映了折纸结构的部分阻碍。x轴是时间(s)，y轴是电流(nA)，圆圈表示电压开关点。
图44示出了折纸DNA的插入，导致电流略微下降。当电流释放时，折纸立即离开纳米孔。x轴是时间(s)，y轴是电流(nA)，圆圈表示电压开关点。
图45示出了DNA链通过施加电流来回受控地移动通过纳米孔的表示。在左侧，DNA位于孔中，因此观察到的电流将低于孔中没有DNA的情况。当电流反转时(右侧)，孔中没有DNA，因此电流将保持不变。
图46示出了证实该表示的实验结果。当施加正电压时，电流为～3nA，与通常在孔打开时观察到的电流相当。当电压反转时，电流为-2.5nA。这低于当孔打开时通常看到的电流，并且对应于当孔被DNA链阻断时通常观察到的电流。几个顺序电压开关显示一致的结果，表明DNA在配置上交替，如图45所示。
图47示出了将DNA连接到与纳米孔相邻的表面的不同缀合化学方法。
图48A，48B和48C是根据本发明实施方案的聚合物和纳米孔以及等效电路的三个视图。
图49A是根据本发明实施方案的用纳米孔单元制造的谐振器的等效电路。
图49B是根据本发明实施方案的图49A的谐振器的输出响应的幅度和相位的曲线图。
图50是一系列曲线，示出了根据本发明实施方案的图49A的谐振器的输出响应的幅度和相位范围。
图51是示出了根据本发明实施方案的通过纳米孔的聚合物以及在探测频率下产生的谐振器幅度和输出响应的相位的时间序列。
图52是示出了根据本发明的实施方案，通过纳米孔的聚合物以及在第二探测频率下产生的谐振器幅度和输出响应的相位的时间序列。
图53是根据本发明实施方案的多个并行纳米孔-聚合物谐振器和信号处理的等效电路。
图54是根据本发明实施方案的若干谐振频率带宽的频率图。
图55A是根据本发明实施方案的AC输入电压Vin的频率图。
图55B是根据本发明实施方案的替代AC输入电压Vin的时间和频率图。
图56是根据本发明实施方案的三个探测频率下的幅度和相位频率图。
图57是根据本发明实施方案的纳米孔-聚合物谐振器的2D阵列的框图。
图58是根据本发明实施方案的纳米孔存储器芯片的横截面视图。
图59是根据本发明实施方案的图58的芯片中使用的电感器的顶视图。
图60是根据本发明实施方案的用于连接AC和DC信号的“偏置器”结构的等效电路图。
图61是根据本发明实施方案的图60的“偏置器”结构的一部分的图。
图62是根据本发明实施方案的具有两个电感器的纳米孔存储器芯片的另一实施方案的侧剖视图，每个电感器在顶部添加室中的每一个上。
图63是根据本发明实施方案的纳米孔存储器芯片的另一实施方案的侧剖视图，该纳米孔存储器芯片具有顶部添加室中之一上的一个电感器。
图63A是根据本发明的实施方案的多个并行纳米孔-聚合物谐振器和信号处理的等效电路，其具有连接到谐振器的顶电极的单个公共电感器和每个谐振器单元中的固定电容。
图63B是根据本发明实施方案的具有图63A的构造的纳米孔存储器芯片的另一实施方案的侧剖视图。
图64是根据本发明实施方案的在解封闭室底部上具有电感器的纳米孔存储器芯片的另一实施方案的侧剖视图。
图64A是根据本发明实施方案的用于连接图64的构造的AC和DC信号的“偏置器”配置的等效电路图。
图64B是根据本发明实施方案的多个并联纳米孔-聚合物谐振器和信号处理的等效电路，其在每个谐振器单元中具有单个公共电感器和固定电容。
图64C是根据本发明实施方案的具有图64B的结构的纳米孔存储器芯片的另一实施方案的侧剖视图。
图65是根据本发明实施方案的一组连接的3室单元纳米孔装置的局部透视图，所述装置具有透明顶部和电极。
图66是根据本发明实施方案的一组连接的3室单元纳米孔装置的替代实施方案的局部透视图，所述3室单元纳米孔装置具有透明顶部和电极。
图67是根据本发明的实施方案的根据图65连接的纳米孔单元阵列的电路框图。
图68是根据本发明实施方案的读/写存储器控制器和纳米孔存储器芯片的框图。
图68A是根据本发明实施方案的计算机系统的框图。
图69是根据本发明实施方案的执行循环所需的存储器添加循环和转向电压的表格和曲线图。
图70是示出根据本发明实施方案的如何使用交替写周期为各种数据输入填充存储器的图和数据图。
图70A是根据本发明实施方案的用于执行图70中所示的写周期的控制器逻辑的流程图。
图70B是示出了根据本发明的实施方案，用于如图66中所示配置的纳米孔芯片写入“1”和“0”的步骤的表格。
图71示出了根据本发明实施方案的存储串上的位的三种不同数据格式列表。
图72示出了根据本发明实施方案的行中每个单元的存储串上的位的数据格式列表。
图73示出了根据本发明实施方案的行中每个单元的存储串上的位的备选数据格式列表。
图74示出了根据本发明实施方案的替代并行数据存储格式，其列出了用于行中的单元的存储串上的位。
图75是示出了根据本发明实施方案的纳米孔存储器系统的框图，其示出了读/写存储器控制器和用于流体/试剂的仪器。
图76是凝胶电泳制备，示出了拓扑异构酶介导的寡核苷酸盒(“位”)向DNA分子的添加。
具体实施方式
以下对优选实施方案的描述本质上仅是示例性的，决不旨在限制本发明、其应用或用途。
如在全文中所使用的，范围用作描述该范围内的每个值的速记。可以选择范围内的任何值作为范围的终点。另外，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。如果本公开中的定义与引用的参考文献中的定义发生冲突，则以本公开为准。
除非另有说明，否则本文和说明书中其他地方表述的所有百分比和量应理解为指重量百分比。给出的量基于材料的活性重量。
如本文所用的“纳米芯片”是指纳米流体装置，包括含有流体的多个室和任选允许流体流动的通道，其中纳米芯片的特征的临界尺寸，例如将室彼此分开的元件的宽度是，例如，厚度为1个原子至10微米，例如，小于1微米，例如，0.01-1微米。纳米芯片中的材料流可以通过电极来调节。例如，当DNA和RNA带负电时，它们将被吸引到带正电的电极上。参见，例如，Gershow，M等人，Recapsuring and Trapping Single Molecules with a Solid StateNanopore，Nat Nanotechnol.(2007)2(12)：775-779，通过引用并入本文。在一些情况下，流体流动也可以通过门元件，以及通过冲洗、注入和/或抽吸流体进入或离开纳米芯片来调节。该系统能够对核酸(DNA/RNA)进行精确的多重分析。在某些实施方案中，纳米芯片可以由硅材料制成，例如二氧化硅或氮化硅。氮化硅(例如，Si3N4)对于该目的是特别理想的，因为它在化学上是相对惰性的，并且即使在仅几纳米厚的情况下也提供防止水和离子扩散的有效屏障。二氧化硅(如本文实施例中所用)也是有用的，因为它是化学修饰的良好表面。或者，在某些实施方案中，纳米芯片可以全部或部分由材料制成，所述材料可以形成与单个分子一样薄的片材(有时称为单层材料)，例如石墨烯，例如，如描述于Heerema，SJ，等人，Graphene nanodevices for DNA sequencing，Nature Nanotechnology(2016)11：127-136；Garaj S等人，Graphene as subnanometre trans-electrode membrane，Nature(2010)467(7312)，190-193，其内容通过引用并入本文，或过渡金属二硫属化物，例如二硫化钼(MoS2)，如描述于Feng等人，Identification of single nucleotides in MoS2nanopores,Nat Nanotechnol.(2015)10(12):1070-1076，其内容通过引用并入本文，或氮化硼，如描述于Gilbert等人，Fabrication of Atomically Precise Nanopores inHexagonal Boron Nitride,eprint arXiv:1702.01220(2017)。
在一些实施方案中，纳米芯片包含这样的单层材料，其相对硬且惰性，例如至少与石墨烯一样惰性和硬，如MoS2。单层材料可以例如用作包含纳米孔的膜的全部或一部分。纳米芯片可以部分用金属衬里，例如，壁可以是层状的(例如金属-氮化硅-金属)，然后可以配置金属以在纳米孔附近提供可控制的电极对，从而使核酸可以通过电动势来回移动通过纳米孔，并且还可以通过测量核酸通过纳米孔时的电势变化来测序。
用于测序DNA的纳米芯片纳米流体装置通常是已知的，例如描述于Li，J等人，Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers,Methods Mol Biol.(2009)544:81-93；Smeets RM,等人，Noise in solid-state nanopores,PNAS(2008)105(2):417-21；Venta K,等人，Differentiation of short,single-stranded DNAhomopolymers in solid-state nanopores,ACS Nano.(2013)7(5):4629-36；Briggs K,等人，Automated fabrication of 2-nm solid-state nanopores for nucleic acidanalysis,Small(2014)10(10):2077-86；和Chen Z,DNA translocation through anarray of kinked nanopores,Nat Mater.(2010)9(8):667-75；各篇的全部内容通过引用并入本文，例如，他们在设计和制造包含纳米孔的纳米芯片方面的教导。
如本文所用的“纳米孔”是直径小于1微米，例如2-20nm直径的孔，例如约2-5nm的孔。单链DNA可以通过2nm纳米孔；单链或双链DNA可以通过4nm纳米孔。具有非常小的纳米孔(例如2-5nm)允许DNA通过但不允许较大的蛋白质酶，从而允许DNA(或其他带电聚合物)的受控合成。在使用较大的纳米孔(或较小的蛋白质酶)的情况下，蛋白质酶可以与以防止其穿过纳米孔的基质缀合，例如，缀合到较大的分子，如较大的蛋白质，珠子，或室中的表面。已知不同类型的纳米孔。例如，通过在膜(例如脂质双层)中组装成孔蛋白来形成生物纳米孔。例如，α-溶血素和类似的蛋白质孔在细胞膜中天然存在，它们作为离子或分子进出细胞的通道，并且这些蛋白质可以重新用作纳米通道。固态纳米孔由合成材料如氮化硅或石墨烯形成，例如通过在合成膜中配置孔，例如，使用反馈控制的低能离子束雕刻(IBS)或高能电子束照明。可以通过将成孔蛋白质嵌入合成材料中来制备杂化纳米孔。在纳米孔的任一端或任一侧存在金属表面或电极的情况下，可以经电解质介质通过纳米孔建立穿过纳米孔的电流。电极可以由任何导电材料制成，例如银，金，铂，铜，二氧化钛，例如涂覆氯化银的银。
用于配置固态纳米孔(例如氮化硅，膜)的方法是已知的。在一种方法中，硅基片涂覆有膜材料，例如氮化硅，并且使用光刻和湿化学蚀刻产生膜的整体结构，以提供所需尺寸的氮化硅膜用于结合到纳米芯片中，例如，约25×25微米的纳米芯片。使用聚焦离子束(FIB)在氮化硅膜中冲压初始0.1微米直径的孔或腔。离子束雕刻可以通过收缩较大的孔来配置纳米孔，例如通过膜表面上的离子束诱导的横向质量传递，或者通过离子束溅射从包含来自相对的两侧腔的膜的平坦侧逐层地去除膜材料，从而当最终到达腔时，存在锐边纳米孔。离子束暴露熄灭，然后通过孔传输的离子电流适合于所需的孔径。参见，例如Li，J.，etal.，Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers,Methods MolBiol.(2009)544:81-93。或者，可以使用TEM中的高能量(200-300keV)电子束照射来配置纳米孔。使用半导体处理技术，电子束光刻，SiO2掩模层的反应离子蚀刻和Si的各向异性KOH蚀刻，在40nm厚的膜中制造锥形的20×20nm和更大的孔。TEM中的电子束用于将较大的20nm孔缩小为较小的孔。TEM允许实时观察收缩过程。使用较薄的膜(例如，<10nm厚)，可以在TEM中用高能聚焦电子束钻孔纳米孔。一般来说，参见Storm AJ等人，Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision.Nature Materials(2003)2:537-540；Storm AJ,等人，Translocation of double-stranded DNA through a siliconoxide nanopore.Phys.Rev.E(2005)71:051903；Heng JB,等人，Sizing DNA Using aNanometer-Diameter Pore.Biophys.J(2004)87(4):2905-11；各自的内容在此通过引入并入本文。
在其他实施方案中，使用介电击穿，使用跨膜的相对高电压电势制备纳米孔，其中升高电压直到检测到电流，例如，描述于Kwok等人，“Nanopore Fabrication byControlled Dielectric Breakdown”，“PLOS ONE(2014)9(3)：e92880，其内容通过引用并入本文。
使用这些技术，并且取决于所使用的确切技术以及膜的厚度和精确组成，固体材料(例如氮化硅)中纳米孔的整体形状可大致类似于两个漏斗，其顶点在最窄点(即实际的纳米孔)聚集在一起。这种双锥形状有助于使聚合物通过纳米孔并返回。成像技术，例如原子力显微术(AFM)或透射电子显微术(TEM)，特别是TEM，可用于验证和测量纳米膜，FIB孔或腔以及最终纳米孔的尺寸、位置和结构。
在一些实施方案中，聚合物(例如DNA)的一端束缚系在纳米孔附近或在通向纳米孔的漏斗的内壁上。由于聚合物最初通过扩散接近纳米孔，然后由电梯度驱动，梯度驱动的移动最大化并且扩散移动最小化，并且如果聚合物的一端被系在纳米孔附近则速度和效率由此增强。参见，例如Wanunu M,Electrostatic focusing of unlabelled DNA intonanoscale pores using a salt gradient,Nat Nanotechnol.(2010)5(2):160-5；Gershow M.,Recapturing and trapping single molecules with a solid-statenanopore.Nat Nanotechnol.(2007)2(12):775-9；Gershow,M.,Recapturing andTrapping Single Molecules with a Solid State Nanopore.Nat Nanotechnol.(2007)2(12):775-779。
在一个实施方案中，聚合物(例如DNA)的一端附接到珠子，并且聚合物被驱动通过孔。与珠子的附接将阻止聚合物一直移动通过相邻室中分隔膜的相对侧上的纳米孔。然后关闭电流，并且聚合物(例如DNA)附着在分隔膜另一侧上室中与纳米孔相邻的表面上。例如，在一个实施方案中，ssDNA的一端共价连接至50nm珠，并且另一端被生物素化。链霉亲和素结合到分隔膜另一侧的室中所需的连接点处的区域。通过电势将DNA拉过纳米孔，并且生物素附着于链霉亲和素。对珠子和/或与纳米孔相邻的表面的附着可以是共价键或强的非共价键(如生物素-链霉亲和素键)。然后用酶切下珠子并冲洗掉。在一些实施方案中，单链DNA用限制性酶切割，所述限制性酶切割单链DNA，例如，如K.Nishigaki,Type IIrestriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general.NucleicAcids Res.(1985)13(16):5747-5760所述，在此通过引入并入本文。在其他实施方案中，提供互补的寡核苷酸以产生双链限制位点，然后可以用相应的限制性酶切割。
当聚合物通过纳米孔时，可以检测到聚合物通过时由纳米孔部分阻塞引起的经纳米孔电势、电容或电流的变化，并用于鉴定聚合物中的单体序列，因为不同的单体可以通过它们的不同尺寸和静电势来区分。
如本文所述，在本领域中没有公开在DNA制造方法中使用包含纳米孔的纳米芯片，但是这种芯片是众所周知的并且可商购获得用于DNA的快速测序。例如，MinION(OxfordNanopore Technologies，Oxford，UK)小并且可以连接到笔记本电脑上。当单链DNA以每秒30个碱基通过蛋白质纳米孔时，MinION测量电流。孔中的DNA链破坏离子流，导致对应于序列中核苷酸的电流变化。Mikheyev，AS，等人。A first look at the Oxford NanoporeMinION sequencer,Mol.Ecol.Resour.(2014)14,1097-1102。尽管MinION的准确性差，但是需要重复重新测序，但如果被读取的DNA仅包含两个容易区分的碱基，例如A和C，使用本发明的纳米芯片的测序的速度和准确度可以大大提高。
在一些实施方案中，包含纳米孔的膜可具有三层构造，在绝缘芯材料(例如氮化硅膜)的任一侧上具有金属表面。在该实施方案中，金属表面例如通过光刻装置配置，以提供具有成对电极的微电路，在每个纳米孔的每个端一个，例如，使得可以在电极之间建立流过纳米孔的电流并经电解质介质通过纳米孔，所述电流可以通过纳米孔吸收聚合物并通过反转极性，可以将其吸回。当聚合物通过纳米孔时，电极可以测量穿过纳米孔的电势变化，以便识别聚合物中单体的序列。
在一些实施方案中，聚合物的序列被设计用于存储数据。在一些实施方案中，数据存储在二进制代码(1和0)中。在一些实施方案中，每个碱基对应于1或0。在其他实施方案中，两个或更多个碱基的容易识别的序列对应于1，并且两个或更多个碱基中另一个容易识别的序列对应于0。在其他实施方案中，数据可以存储在三元，四元或其他代码中。在一个具体实施方案中，聚合物是DNA，例如单链DNA，其中DNA仅含有两种碱基类型，并且不含任何能够自身杂交的碱基，例如，其中DNA包含腺嘌呤和鸟嘌呤，腺嘌呤和胞嘧啶，胸腺嘧啶和鸟嘌呤，或胸苷和胞嘧啶。在一些实施方案中，两个碱基可以散布有一个或多个另外的碱基，例如A和C可以含有T以“标点化”序列，例如通过以不导致显著的自我杂交的频率指示编码序列中的中断。在其他实施方案中，例如，在核酸是双链的情况下，可以使用一些或所有可用的碱基。
核苷酸碱基可以是天然的，或者在一些实施方案中可以由非天然碱基组成或包括非天然碱基，如Malyshev，D等人，“A semi-synthetic organism with an expandedgenetic alphabet”,Nature(2014)509:385-388所述，将其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，通过向聚合物中添加单个单体(例如，在DNA的情况下为单个核苷酸)来存储数据。在一个实施方案中，聚合物是DNA并且单体是腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)残基。A和C残基具有优势，因为(i)A和C具有较大的尺寸差异，因此应促进通过纳米孔的分化，(ii)A和C彼此不相互配对，因此不形成会使纳米孔信号的解释复杂化的显著的二级结构，和(iii)由于同样的原因，G’不太优选，因为它们已知形成鸟嘌呤四联体。通过末端转移酶(或多核苷酸磷酸化酶)添加核苷酸，但核苷酸被3’封闭，使得一次仅添加单个核苷酸。在加入下一个核苷酸之前除去该封闭。
在一些实施方案中，DNA留在纳米芯片中。在其他实施方案中，将其除去，并任选地转化为双链DNA和/或任选地转化为结晶形式，例如以提高长期稳定性。在又其他实施方案中，可以扩增DNA并且移除扩增的DNA用于长期存储，而原始模板DNA，例如结合到纳米芯片中的室壁的DNA，可以留在纳米芯片中，在那里它可以被读取和/或用作模板以制作额外的DNA。
在一些实施方案中，DNA或其他聚合物在合成期间锚定在靠近纳米孔的表面上。例如，在一个实施方案中，单链DNA分子各自在5’端连接到接近纳米孔的表面，其中每个纳米孔处的电流可以通过该纳米孔的电极独立调节，使得DNA分子3’端可以从储备室通过纳米孔向前拉入含有3’保护的dNTP流和聚合酶或末端转移酶的流动室中，以添加3’保护的dNTP，或保留在其中纳米孔排除了所述酶的储备室中，因此不添加dNTP。参见，例如，图12-16以及图18和图19的描述。在其他实施方案中，使用拓扑异构酶，通过添加到5’端(附着3’端)构建单链DNA，如下文更全面描述的。通过控制每个DNA分子是否参与每个循环，可以精确控制每个DNA分子的序列，例如，如下：
流A＝3’保护的dATP
流C＝3’保护的dCTP
该示意图中的纳米孔1和纳米孔2与不同的DNA链相关联，并且其位置(在流动室内或从流动室外)是可单独控制的。DNA可以通过储备室中的特定酶去保护，或者通过改变流动室中的流动以通过酶促、化学、光催化或其他方式提供去保护。在一个实施方案中，去封闭剂在流A和流C的循环之间流动，例如，当用缓冲液洗涤流动室时，使得去封闭剂不使核苷酸构建块去保护。在其他实施方案中，去保护剂太大而不能通过纳米孔穿过进入流动室。
上述实施例的最终结果是在纳米孔1处将A和C添加到DNA中，并且在纳米孔2处将C和C添加到DNA中。
在另一个实施方案中，室配置是类似的，但是双链DNA锚定在靠近纳米孔的表面上，并且例如将两个或更多个类型的寡核苷酸片段(每个对应于二进制代码)顺序添加，例如，使用位点特异性重组酶，即在称为位点特异性重组序列的序列区段内自发识别和切割核酸双链的至少一条链的酶，例如使用如下所述的负荷拓扑异构酶的寡核苷酸。
在某些实施方案中，可能需要在合成之后使带电聚合物(例如DNA)保持在凝缩状态。有几个原因：
·聚合物应该以这种形式更稳定，
·凝缩聚合物可以减少拥挤，允许使用较小体积的较长聚合物，
·有序凝缩可降低聚合物形成结或缠结的可能性，
·如果任何室相互连接，它将有助于防止聚合物变得太长使得它穿过与假设在施加电流时不同的孔，
·凝缩有助于聚合物远离电极，电化学可能会损坏聚合物。
人类细胞约10微米但含有80亿个碱基对的DNA。伸展它将超过一米长。DNA容纳到细胞中，因为它缠绕在组蛋白上。在某些实施方案中，组蛋白或类似蛋白质在本发明的纳米芯片中提供类似的功能。在一些实施方案中，纳米芯片的内表面略带正电荷，使得带电聚合物(例如DNA)倾向于弱粘附于它们。
在某些实施方案中，带电聚合物，例如单链或双链DNA，结合到接近纳米孔的表面。这可以通过各种方式实现。通常，通过将聚合物附着到相对大体积结构(例如，珠子，蛋白质或DNA折纸结构(下文描述)，其具有太大直径而不能穿过纳米孔，例如>10nm，例如，约20-50nm)，使聚合物定位于纳米孔，使用电流将带电聚合物拉过纳米孔，将聚合物端远离大体积结构锚定到邻近纳米孔的表面，例如其中表面被修饰以接受附接到聚合物链的远端的接头基团，从而附接聚合物链，并切割出大体积结构。
将聚合物端远离大体积结构锚定到邻近纳米孔的表面的步骤可以以各种方式完成。在一个实施方案中，聚合物是单链DNA，并且存在预连接的DNA链(约50bp)，其与单链DNA的一部分互补，使得单链DNA和预连接的DNA链可以通过碱基配对连接。如果配对足够强，即使在操作时也足够保持DNA锚定。这种连接方法的优点是，如果需要长期存储DNA，它允许从纳米孔芯片中除去DNA。或者，使用缀合化学，例如如下文实施例1中所述的链霉亲和素-生物素缀合，或“点击”化学，将链共价连接至表面(参见Kolb等人，Angew.Chem.Int.Ed。(2001)40：2004-2021，通过引用并入本文，和/或使用酶促附着，例如通过将寡核苷酸共价预先连接到远端表面，然后使用DNA连接酶连接它们。
一旦链的远端附着于邻近纳米孔的表面，就可以例如使用在大体积结构附近的限制酶位点处切割的内切核酸酶切割大体积结构。
大体积结构可以是珠子，大体积分子，例如可逆地与DNA链结合的蛋白质，或DNA折纸结构。DNA折纸涉及使用碱基配对来创建三维DNA结构。DNA折纸技术一般描述于Bell等人，Nano Lett.(2012)12：512-517，通过引用并入本文。例如，在本发明中，DNA折纸可用于将单个DNA分子附着到与纳米孔相邻的表面。在一个实施方案中，该结构是“蜂巢状立方体”，例如每侧约20nm。这防止了这部分DNA通过纳米孔(就像在附着的纸中一样)。在折纸结构上有一长链DNA(单链或双链)。DNA链穿过纳米孔，直到折纸立方体与纳米孔相遇并阻止进一步的进展。然后关闭电流并将链连接到与纳米孔相邻的表面。
在另一个实施方案中，具有折纸结构的带电聚合物(例如DNA)位于三室配置的中间室中。折纸将防止DNA完全进入其他2个室(或2室实例中的其他一个室)。因此，在该实例中，聚合物不需要锚定在表面上。这降低了聚合物打结的风险，并且避免了将聚合物的一端结合到表面并且切掉另一端的大体积部分的步骤的需要。具有折纸的室的体积应保持尽可能小，以使聚合物保持相对靠近孔，这将有助于确保在施加电流时其快速易位。应该指出的是，虽然含有聚合物的折纸部分的中间室不能与其他中间室相互连接(或者不同的聚合物将混合起来)，但是其他室(或3室实例中的室组)可以相互连接。如果需要，这些其他室可以具有更大的体积，因为当DNA移动到该室时，聚合物必然接近孔(其中一些将实际上在孔中)。
在一些实施方案中，装置包括三个线内室，其中添加室是邻接的以允许流动，并且具有共同的电极，而“去保护”室除了通过纳米孔的流以外是流体隔离的，并且具有独特的电极。
在其他实施方案中，DNA或其他带电聚合物不是锚定的，而是可以在室内电极的控制下在合成室和去保护室之间移动，同时聚合酶和去保护剂被限制在室之间移动。因为它们太大而不能通过连接室和/或固定在室中的表面上的纳米孔。参见，例如，图1-9和图16-17。
使带电聚合物移动通过纳米孔所需的电流取决于例如聚合物的性质、纳米孔的尺寸、含有纳米孔的膜的材料和盐浓度，因此将根据需要针对特定的系统进行优化。在本文实施例中使用的DNA的情况下，电压和电流的实例可以是例如50-500mV，通常100-200mV和1-10nA，例如约4nA，盐浓度约为100mM至1M级别。
带电聚合物(例如DNA)通过纳米孔的移动通常非常快，例如每个碱基1至5μs，因此大约每秒一百万个碱基(如果采用频率命名法，则为1MHz)，其对于获得与系统中的噪声不同的准确读数提出了挑战。使用目前的方法，(i)需要在序列中重复的核苷酸，例如大约连续100次，以产生可测量的特征变化，或(ii)使用蛋白质孔，例如α溶血素(αHL)或耻垢分枝杆菌孔蛋白A(Mycobacterium smegmatis porin，MspA)，其提供相对长的孔，其在碱基移动通过聚合物时具有多次读取的可能性，并且在一些情况下，可以适于一次一个碱基通过孔提供受控的DNA进料，在一些情况下使用外切核酸酶在每个碱基通过时将其切割。各种方法都是可能的，例如，
·减慢聚合物的速度，从大约1MHz到大约100-200Hz，例如使用包含电流变流体的介质，其中当施加电压时其变得更粘稠，从而减慢聚合物通过纳米孔或等离子体流体系统的速度，其中介质的粘度可以是受光控制；或分子马达或棘轮；
·在聚合物中提供序列，例如，在单链DNA中，其将形成庞大的二级结构，例如“发夹”、“锤头”或“哑铃”构型，其必须线性化以适合通过纳米孔，从而使信息密度降低并提供持续时间更长的信号；
·提供相同序列的多次读取，例如，通过使用快速交流电，允许对同一序列帧进行多次读取，并结合短暂的直流突发将分子拉到下一个序列帧，通过多次读取整个序列，或通过并行读取多个相同序列，在每种情况下校对读数以提供扩增信号的共有读数；
·测量当单体(例如，核苷酸)通过纳米孔时由电容变化引起的高频信号中的阻抗变化，而不是直接测量电流或电阻的变化；
·增强不同碱基之间的电流、电阻或电容的差异，例如，通过使用具有较大尺寸差异的非天然碱基或以其他方式修饰以产生不同的信号，或通过在DNA内形成更大的二级结构，例如“发夹”、“锤头”或“哑铃”配置，由于它们较大的尺寸，可提供增强的信号；
·使用光学读取系统，例如使用与纳米孔相邻的集成光学天线，其用作光学换能器(或光学信号增强器)以补充或替代标准离子电流测量，例如，如Nam等人，“GrapheneNanopore with a Self-Integrated Optical Antenna”,Nano Lett.(2014)14:5584-5589所述，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，单体例如DNA核苷酸用荧光染料标记，使得每个不同的单体在通过纳米孔和其光学天线的连接处时以标记强度发荧光。在一些实施方案中，当聚合物以高速通过纳米孔时，固态纳米孔剥离荧光标记，导致一系列可检测的光子突发。如描述于McNally等人，“Optical recognition of converted DNAnucleotides for single molecule DNA sequencing using nanopore arrays”,NanoLett.(2010)10(6):2237-2244，和Meller A.,“Towards Optical DNA Sequencing UsingNanopore Arrays”,J Biomol Tech.(2011)22(Suppl):S8-S9，其各自的内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，带电聚合物是核酸，例如单链DNA，其中序列提供二级结构。Bell等人，Nat Nanotechnol.(2016)11(7)：645-51(通过引用并入本文)描述了使用以固态纳米孔形式可检测的相对短的哑铃构型序列，以在免疫测定中标记抗原。Bell等人使用的纳米孔相对较大，因此整个哑铃结构可以穿过孔，但是使用小于哑铃构造直径的纳米孔，DNA将“解压缩”并变得线性化。可以使用更复杂的构造，例如，其中每个位对应于类似于tRNA的序列(参见，例如，Henley等人，Nano Lett.(2016)16：138-144，通过引用并入本文)。因此，本发明提供带电聚合物，例如单链DNA，具有至少两种类型的二级结构，其中二级结构编码数据(例如二进位数据，其中一个二级结构类型是1，第二个是0)。在其他实施方案中，二级结构用于减慢DNA通过纳米孔的速度或提供序列中的中断，以便于读取序列。
在另一个实施方案中，本发明利用包含一系列至少两种不同DNA基序的DNA分子，其中每个基序特异性结合特定配体，例如双链DNA的基因调节蛋白或单链DNA的tRNA，其中至少两个不同的DNA基序编码信息，例如以二进制代码，其中一个基序是1并且第二个是0，例如，其中当DNA穿过纳米孔时，配体增强穿过纳米孔的信号差异(例如电流或电容的变化)。
如上所述，当不同的单体通过纳米孔时，它们主要通过物理封闭纳米孔并改变穿过纳米孔的电导来影响通过纳米孔的电流。在现有的纳米孔系统中，直接测量电流的这种变化。电流读取系统的问题在于系统中存在相当大的噪声，并且在DNA的情况下，例如，当不同核苷酸单元通过纳米孔时测量电流波动时，需要相对长的积分时间，大约为百分之一秒级别，来准确地检测不同单体之间的差异，例如，在不同碱基之间的差异。最近，已经表明阻抗和电容的变化可用于研究细胞和生物系统，尽管与盐和生物分子可能发生复杂的相互作用。例如，Laborde等人，Nat Nano.(2015)10(9):791-5(通过引用并入本文)证明了高频阻抗谱可用于检测生理盐条件下的电容的微小变化以及超过德拜极限的图像微粒和活细胞。
因此，在本发明的一个实施方案中，我们测量电容变化而不是直接测量电流变化，例如，其中通过测量单体(例如，核苷酸)通过纳米孔时的电容变化引发的射频信号的相变来识别带电聚合物的序列。
简单地说，在一个电导体与另一个电导体之间存在间隙的任何电路中都存在电容。虽然电流直接随电容变化，但它不会随电容同时变化。例如，如果我们绘制在具有交流电流的电容电路中随时间变化的电流和电压，将看到虽然电流和电压都形成正弦波，但是波是异相的。当电流发生变化时，电容会发生变化，这反映在信号相位的变化中。射频交流电提供具有固定频率和幅度的信号，而信号的相位将随电路的电容而变化。在此系统中，我们使用脉冲直流电而不是交流电(即，电压在两个值之间交替，但电压不会越过“零”线，这样保持极性并且一个电极保持正电压而另一个电极保持负电压)，使得带电的聚合物可以通过纳米孔(在DNA的情况下朝向正极)被吸引。当纳米孔中没有任何东西时，电容具有一个值，其随着聚合物的不同单体通过纳米孔而改变。合适的频率范围在射频范围内，例如，1MHz至1GHz，例如50-200MHz，例如大约100MHz，例如低于可能导致介质的显著介电加热的较高的微波频率。为了减少干扰的可能性，可以在不同的纳米孔上应用不同的频率以便可以用单一射频输入线同时测量多个纳米孔。
在高频下测量阻抗变化(由于例如电容的变化)增加了在一定时间跨度内可用的信噪比，因为它减少了1/f噪声或电子测量电路中固有的“粉红”噪声的影响。使用高频信号增强了信噪比，因为在给定的时间跨度内进行了许多测量，从而提供更稳定的信号，该信号可以容易地与由于环境或装置变化和波动引起的阻抗变化区分开。
将这些原理应用于本发明，在一个实施方案中，本发明提供了一种测量当单体(例如，核苷酸)通过纳米孔时由电容变化引起的高频信号中的阻抗变化的方法，例如，一种读取包含至少两种不同类型单体(例如DNA分子)的带电聚合物的单体序列的方法，包括跨越纳米孔施加射频脉冲直流电，例如，以例如1MHz至1GHz频率，例如50-200MHz，例如约100MHz的频率施加，其中脉冲直流电流通过纳米孔吸引带电聚合物，并且当带电聚合物通过纳米孔时通过测量经纳米孔的电容变化来读取单体序列。
例如，参见图48A，48B，48C，示出了基于纳米孔的单元4800，其具有上部(或顶部)室4802和下部(或底部)室4804和膜4806，膜4806将两个室4802，4804分开。膜由如本文上面所述的材料制成。同样在单元中是通过膜的纳米孔4808(或纳米尺寸的孔)，其具有如本文所述的形状和尺寸，允许室4802，4804之间的流体连通。
单元4800内部是聚合物分子，例如单链DNA分子4810(或ssDNA)，例如上文所述的聚合物分子。在该实例中，DNA 4810具有三个单元或碱基，上部碱基4812，中部碱基4814和下部碱基4816。DNA 4810中的每个碱基4812-4816或碱基集合可以被称为作为用于表示或存储数据的信息的“位”，也如本文所讨论的那样。如果需要，可以使用任何其他聚合物或DNA分子(单链或双链)，如上所述。
单元4800的室4802，4804可以填充有流体，例如本文所述的流体，其允许DNA 4810漂浮并在室4802，4804之间移动。单元4800还具有一对电极4818，4820，连接到输入电压Vin的上(或顶)电极4818，以及连接到地(或GND或0伏)的下(或底)电极4820。在一些实施方案中，下电极4820还可以连接到非零DC电压，但是通过使用连接到电极的AC耦合电容器，可以仍然处于AC(或rf或射频)“接地”，具有通过AC电压的电容值(在下文中更详细地讨论)。施加到电极4818，4820的电压确定DNA 4810在单元4800中的移动。特别是，当DNA链4810存在电场或电压或电荷差异时，DNA 4810将被吸引到正电荷或电压，因为DNA分子4810具有净负电荷，如前面图1-5所述。
在这种情况下，当顶电极4818具有相对于底电极4820(此处示出为接地或0伏特)的正电压时，DNA 4810将移动通过纳米孔4808(如果它在下室4804中)朝向顶电极4818并且进入上室4802。相反，当顶电极4818相对于底电极4820具有负电压时，DNA 4810将通过纳米孔4808朝向底电极4818移动，并且进入下室4804。图48A，48B和48C示出了从上室4802移动通过纳米孔4808到下室4804的DNA 4810。
参见图48A-48C所示，单元4800(或纳米孔和DNA系统)可以电模型化为等效电路图4830，示为并联的电容器C1和电阻器R1。特别地，顶电极4818看到电容C1和接地电阻R1，所述地由其局部环境设定，其中电容器C1表示由两个电极4818，4820(即，电容器板)的性质和其间的介电材料的性质确定的单元4800的电容，其至少由单元4800内的流体和具有纳米孔4808的膜4806限定。电阻器R1表示与单元4800相关的DC电阻，其至少由与上述单元的介电材料相关的损耗限定，其表现为两个电极之间的DC漏电流。
当DNA 4810穿过纳米孔4808时，单元电容和电阻(或单元阻抗，Zcell)都改变。不同的DNA碱基具有不同的大小，因此对电容和电阻具有不同的影响，导致不同的等效电路模型，如图48A-48C所示。特别地，在图48A中，DNA 4810在纳米孔4808外部，产生一组值C1，R1(或Zcell1)。在图48B中，DNA 4810的碱基4814在纳米孔中，产生另一组值C2，R2(或Zcell2)。类似地，在图48C中，DNA 4810的碱基4812在纳米孔中，产生另一组值C3，R3(或Zcell3)。
参见图49A和49B，单元4800(纳米孔和DNA系统)的电容C和电阻R可以与电感器L组合以产生如电路4900所示的“电感器-单元”或“单元-电感器”RLC谐振电路或谐振器或滤波器(或带阻、陷波或带阻滤波器)(图49A)，具有由曲线图4952所示的幅度频率响应，以及由曲线图4954所示的相位频率响应。电路4900的中心或谐振频率fres由下式给出：
ωres＝2πfres＝Sqrt(1/LC)xSqrt(1-(L/C)/R2) Eq.1
其中C和R分别是给定时间的单元的电容和电阻，L是电感器的值(相对于单元中DNA的位置是恒定的)。还可以存在与电感器L串联的等效线圈电阻器(未示出)，表示电感器线圈绕组的DC电阻。但是，如果线圈电阻可以忽略不计，则无需在电路图或谐振频率fres方程中显示。
当单元电阻R的值大时，等式1变为：
ωres＝2πfres＝Sqrt(1/LC) Eq.2
参见图49B，谐振电路4900的幅度响应4952(对于给定的C和R值)在谐振频率fres处具有最大衰减(最小阻抗)，并且在谐振频率fres周围的窄的频带(或阻带)Δfstp上具有陡峭的幅度衰减响应，阻带是幅度响应(Vout/Vin)低于标准阈值例如3dB(或20Log[SQRT(2)])的频率范围。对于所有其他频率，输出幅度基本上是恒定的并且是非衰减的。谐振电路4900的相应相移响应曲线4954在谐振频率fres处具有45度的相移(当复阻抗的电抗或虚部等于零时)，并且在在谐振频率fres的每一侧上的窄的阻带Δfstp上具有陡峭的相位响应，使得在高于fres并且在频带Δfstp之外的频率处，相移处于或接近180度，并且在低于fres且在频带Δfstp之外的频率处，相移是在0度或接近0度。否则，相位响应输出基本上是恒定的，并且在所有其他频率上不移位。
参见图50，响应于DNA(或沿其长度具有不同尺寸的其他聚合物或分子)通过纳米孔并改变测量的接地(例如，0伏)电容(或阻抗)，从而改变谐振频率fres，如幅度响应曲线5010-5018和相应的相位响应曲线5020-5028所示，示出了谐振电路(或滤波器)的一系列谐振频率响应幅度曲线5002和相位曲线5003。特别是，如上面的等式2所示，增加对地测量的电容，降低了谐振频率fres。此外，增加DNA“碱基”大小(更多地阻断纳米孔)可以增加单元电容(取决于DNA的介电常数)，这将降低谐振频率fres。相反，降低DNA碱基大小(更多地解除阻断纳米孔)可以降低单元电容(取决于DNA的介电常数)，这将增加谐振频率fres。使用标准DNA碱基(G，C，A，T)，大小顺序将为：G(最大)，A，T，C(最小)。因此，假设DNA的介电常数随着DNA碱基适当地改变，当DNA在纳米孔中时，当最大碱基(例如碱基G)在纳米孔中时fres将是最低的，并且当最小的碱基例如，碱基C在纳米孔中时fres将是最高的。而且，当纳米孔是开放的(未封闭的)，即纳米孔中没有DNA或聚合物时，fres将是最高频率。该谐振频率的范围或频带在图50中示为Δfres。此外，对于幅度的谐振器响应曲线5010-5018和图50中所示的相位的5020-5028，谐振器的总带宽(在其上的幅度和相位受到谐振器的实质影响)在图50中示为ΔfBW。
此外，假设影响阻抗的所有其他单元条件保持固定，给定的单元-电感器谐振电路(或谐振器或滤波器)的总谐振频带Δfres，当纳米孔开放(或未被聚合物阻挡)时，将具有最大谐振频率fres-max。当纳米孔闭合(或被聚合物封闭)时将具有最小谐振频率fres-min，并且在给定时间在纳米孔中，单元谐振频率fres根据聚合物的大小变化(或调整或改变)，因此在本文中可称为纳米孔-聚合物谐振器(或NPR)。而且，谐振器的总带宽ΔfBW(其幅度和相位受到谐振器的实质影响)将类似地基于谐振频带Δfres确定。
当存在施加到谐振器的AC电压并且以固定频率f探测(例如，在所示DNA碱基的谐振频率范围的中心附近，以虚线垂直线5004所示，不一定与中心(或谐振)频率fres之一对准)观察(或监测)谐振器的输出电压信号(Vout)时，谐振器在该频率f探测处提供四种不同的可能输出信号(或幅度衰减或相移量)，这取决于穿过纳米孔的特定DNA碱基(大小)，以及当DNA不在纳米孔中时的第五输出电压状态(“开孔”条件)。这五个输出信号由响应曲线族5002，5003与对应于监视频率f探测的线5004相交，即幅度V1-V5和相位Ph1-Ph5所示。
或者，如果以不同的频率f探测2监视输出电压，例如，在最低频率响应曲线5010的谐振频率附近，如虚线垂直线5006所示，其例如频率低于f探测，在频率f探测2的输出电压将为五个幅度输出电压V6-V10(与f探测处的输出电压V1-V5不同)和五个输出相移Ph6-Ph10(不同于f探测处所见的输出电压Ph1-Ph5)。特别地，这些不同的五个输出信号由响应曲线族5002，5004与对应于监视频率f探测2的线5006相交，即幅度V6-V10和相位Ph6-Ph10所示。V1-V10和Ph1-Ph10的值是任意名称，并且仅用于识别或标记目的。可以基于期望的响应值来设置探测或监视频率f探测，f探测2的值或位置，如下所述。如下所示，使用探测的值或在聚合物处于纳米孔中时所见的谐振频率范围内的监测频率，可以提供有用的输出值范围。如果需要，可以使用其他测量或探测频率，只要它满足所需的功能和性能要求即可。
特别地，如果四个碱基按尺寸顺序(即，G，A，T，C)依次穿过纳米孔，则当最大碱基(例如，碱基G)穿过纳米孔时，谐振频率fres将是最低的(电容最高)，并且相应的响应分别由(最左侧)幅度和相位曲线5010，5020示出。在那种情况下，曲线5010，5020与线5004相交的频率f探测处的输出电压将分别对应于输出电压V2和输出相位Ph1。或者，如果以监视频率f探测2监视输出电压，则曲线5010，5020与线5006相交的频率f探测2处的输出电压将分别对应于输出电压V10和输出相位Ph6。
类似地，当下一个较小的碱基(例如，碱基A)穿过纳米孔时，谐振频率fres将略高于先前碱基的谐振频率fres，并且响应分别由幅度和相位曲线5012，5022示出。在那种情况下，曲线5012，5022与线5004相交的频率f探测处的输出电压将分别对应于输出电压V5和输出相位Ph2。或者，如果以监视频率f探测2监视输出电压，则曲线5012，5022与线5006相交的频率f探测2处的输出电压将分别对应于输出电压V9和输出相位Ph7。
类似地，当下一个较小的碱基(例如，碱基T)穿过纳米孔时，谐振频率fres将略高于先前碱基的谐振频率fres，并且响应分别由幅度和相位曲线5014，5024示出。在那种情况下，曲线5014，5024与线5004相交的频率f探测处的输出电压将分别对应于输出电压V4和输出相位Ph3。或者，如果以监视频率f探测2监视输出电压，则曲线5014，5024与线5006相交的频率f探测2处的输出电压将分别对应于输出电压V8和输出相位Ph8。
当最小碱基(例如，碱基C)穿过纳米孔时，谐振频率fres将略高于先前碱基的谐振频率fres，并且响应分别由幅度和相位曲线5016，5026示出。在那种情况下，曲线5016，5026与线5004相交的频率f探测处的输出电压将分别对应于输出电压V3和输出相位Ph4。或者，如果以监视频率f探测2监视输出电压，则曲线5016，5026与线5006相交的频率f探测2处的输出电压将分别对应于输出电压V7和输出相位Ph9。
最后，当纳米孔中没有DNA时，谐振频率fres将是最高的(电容最低)，并且响应分别由幅度和相位曲线5018，5028示出。在那种情况下，曲线5018，5028与线5004相交的频率f探测处的输出电压将分别对应于输出电压V1和输出相位Ph5。或者，如果以监视频率f探测2监视输出电压，则曲线5018，5028与线5006相交的频率f探测2处的输出电压将分别对应于输出电压V6和输出相位Ph10。
参见图51，显示了根据本公开内容的实施方案的DNA读取时间序列5100的概述实例，用于通过在固定探测(或监测器)频率f探测下测量的本公开的“电感器-单元”谐振器或“电容-谐振”DNA数据读取技术，使用DNA链4810中的两位(例如，两个碱基)读取存储在DNA中的数据。DNA读取时间序列具有5个时间阶段或阶段T1-T5，显示为5列5102至5110，并且时间阶段之间的进展由虚线5111示出。对于时间阶段T1-T5中每个，存在在该时间阶段显示DNA 4810(图48)及其相对于纳米孔4808的位置的图像，对于时间阶段T1-T5也分别存在幅度和相位响应曲线5112-5120，显示在监视频率f探测处下的响应曲线的相交点(对应于图50中所示的曲线族的曲线)，以及两个输出值图5130，5132，分别示出了在每个时间阶段T1-T5的监视频率f探测处的幅度和相位响应的相应输出信号(例如，电压值)。曲线5130，5132的值V1-V5和Ph1-PH5可以是指示具有适当范围和缩放的参数的输出值的任何电压值，以提供本文所述的功能。
关于DNA 4810在图51的实例中的五个时间状态T1-T5中的每一个的位置和移动，在时间阶段T1(5102)＝在纳米孔中没有DNA(开孔)，在时间阶段T2(5104)＝碱基A在纳米孔中，在时间阶段T3(5106)＝碱基G在纳米孔中，在时间阶段T4(5108)＝碱基A在纳米孔中，并且在时间阶段T5(5110)＝纳米孔中没有DNA(开孔)。
参见图50和51，从时间阶段T1开始，DNA 4810在孔4808之外，对地电容低(如本文所讨论的)，谐振频率fres高，并且在监测频率f探测处测量的幅度输出信号高且相位值非常低(例如，大约0度)，其对应于图50中所示的响应曲线5018，5028，其具有在f探测处的输出值，其中曲线5018，5028与线5004相交，分别对应于输出电压V1和输出相位Ph5。在时间T2，DNA碱基4816(在该实施例中为碱基A)进入孔4808，对地电容增加，谐振频率fres转移到较低的中心频率，并且在f探测处测量的幅度输出信号低并且相位值是中间值(例如，大约90度)，其对应于图50中所示的响应曲线5012，5022，其具有在f探测处的输出值，其中曲线5012，5022与线5004相交，并分别对应于输出电压V5和输出相位Ph2。在时间T3，DNA碱基4814(在该实施例中为碱基G，最大碱基)进入孔4808，对地电容极高，并且谐振频率fres降低，但在f探测处的幅度输出信号是中间输出值的中上(例如，大约135度)，其对应于图50中所示的响应曲线5010，5020，其具有f探测处的输出值，其中曲线5010，5020与线5004相交，分别对应于输出电压V2和输出相位Ph1。
在时间T4，DNA碱基4812(在该实施例中为碱基A)(再次)进入孔4808，对地电容减小(从T3处的值)，谐振频率fres转变为中心频率，并且在f探测处测量的幅度输出信号是低的并且相位值是中间的(例如，大约90度)，其对应于图50中所示的响应曲线5012，5022，具有在f探测处的输出值，其中曲线5012，5022与线5004相交，分别对应于输出电压V5和输出相位Ph2。在时间T5，DNA 4810在孔4808之外(再次)，对地电容低，谐振频率fres(再次)移动到高频，并且在f探测处测量的幅度输出信号高，其对应于图50中所示的响应曲线5018，5028，具有f探测处的输出值，其中曲线5018，5028与线5004相交，分别对应于输出电压V1和输出相位Ph5。
参见图52，示出了时间序列(T1-T5)的另一个概述示例5200，用于通过使用不同的固定探测(或监视器)频率f探测2的本公开的电容-谐振DNA数据读取技术，使用DNA链中的两位(例如，两个碱基)读取存储在DNA中的数据。该序列具有5个时间阶段或阶段T1-T5，显示为5列5202-5210，并且时间阶段之间的进展由虚线5211示出。对于时间阶段T1-T5中每个，存在显示DNA4810的图像(图48)和对于该时间阶段相对于纳米孔4808的位置，还有分别针对时间阶段T1-T5的幅度和相位响应曲线5212-5220，示出了在监测频率f探测2下响应曲线的交点(对应于图50中所示的曲线族的曲线)，以及两个值曲线图5230，5232，其分别示出了每个时间阶段T1-T5在监视频率f探测2处的幅度和相位响应的相应输出信号(例如，电压值)。曲线图5130，5132的值V1-V5和Ph1-PH5可以是指示具有适当范围和缩放以提供本文所述的功能的参数的输出值的任何电压值。
关于DNA 4810在图52的实例中的五个时间状态T1-T5中的每一个的位置和移动，更具体地，在时间阶段T1(5202)＝纳米孔中没有DNA(开孔)，在时间阶段T2(5204)＝碱基A在纳米孔中，在时间阶段T3(5206)＝碱基G在纳米孔中，在时间阶段T4(5208)＝碱基A在纳米孔中，并且在时间阶段T5(5210)＝纳米孔中无DNA(开孔)。
参见图50和52所示，从时间阶段T1开始，DNA 4810在孔4808之外，对地电容低(如本文所讨论的)，谐振频率fres高，并且测量的幅度输出信号高且相位移位值非常低(例如，大约0度)，其对应于图50中所示的响应曲线5018，5028，其具有在f探测2处的输出值，其中曲线5018，5028与线5006相交，分别对应于输出电压V6和输出相Ph10。在时间T2，DNA碱基4816(在该实施例中为碱基A)进入孔4808，对地电容增加，谐振频率fres转移到较低的中心频率，并且在f探测2处测量的幅度输出信号是中间值并且相位值是中低值(例如，约45度)，其对应于图50中所示的响应曲线5012，5022，其具有f探测2处的输出值，其中曲线5012，5022与线5006相交，分别对应于输出电压V9和输出相Ph7。
在时间T3，DNA碱基4814(在该实施例中为碱基G，最大碱基)进入孔4808，对地电容极高，并且谐振频率fres降低，并且在f探测2处的幅度输出信号是低输出值并且输出相位处于大约中间值或中值(例如，大约90度)，其对应于图50中所示的响应曲线5010，5020，其具有在f探测2处的输出值，其中曲线5010，5020与线5006相交，分别对应于输出电压V10和输出相位Ph6。在时间T4，DNA碱基4812(在该实施例中为碱基A)(再次)进入孔4808，对地电容减小(从T3处的值)，谐振频率fres转变为中心频率，并且在f探测2处测量的幅度输出信号是中间的并且相位是低的，其对应于图50中所示的响应曲线5012，5022，其具有在f探测2处的输出值，其中曲线5012，5022与线5006相交，分别对应于输出电压V9和输出相位Ph7。在时间T5，DNA4810在孔4808之外，对地电容低，谐振频率fres转移到更高频率，并且在f探测2处测量的幅度输出信号高并且相位信号非常低(例如，约0度)，其对应于图50中所示的响应曲线5018，5028，其具有在f探测2处的输出值，其中曲线5018，5028与线5006相交，分别对应于输出电压V6和输出相Ph10。
参见图51和52的两个实例，并且比较输出图形5130，5132和5230，5232，可以看出，可以基于测量或监视频率f探测，f探测2来选择期望的输出值。
虽然上面已经描述了使用表示要读取的数据的两位和四位(或碱基)的DNA，但是如果数据存储聚合物需要，可以使用任何数量的“位”(或单体或碱基)，条件是单元电容或阻抗的改变(以及相应的谐振频率或频率响应)足以产生每个位的输出幅度和/或相位，其可在每个其他位上区分。尽管可以通过改变碱基的物理分子大小(例如，直径)来实现这种电容变化，但是如果需要，可以使用在通过纳米孔时产生单元的独特电容值的碱基的任何性质。例如，可以使用具有不同介电性质、不同离子(或电荷)性质和/或不同量子力学/电学性质的碱基，条件是它们满足所需的功能和性能要求。
参见图53，示出了本公开的DNA数据读取网络阵列的等效电路和框图5300，其具有并联阵列的谐振电路或纳米孔聚合物谐振器(NPR)5302-5306(NPR1-NPR3)，通过各个耦合电容器CCPL(下文中讨论)并联连接到公共AC输入电压源5308，其提供对于每个谐振电路NPR1-NPR3(在下文中更详细地讨论)具有至少包括期望测量频率(f探测)的频率的AC电压Vin。每个谐振器NPR1-NPR3分别具有独特的电感值L1-L3，与相应单元的等效电路5312-5316串联连接(类似于图48A-48C中描述的单元4800，类似于图49A中描述的等效电路4900)，具有可变电容器C和可变电阻器R，其基于单元4800中的聚合物(或DNA)4810(图48A)相对于单元4800中的纳米孔4808(如上所述)的位置而变化。每个独特的电感器值L1-L3设置唯一的谐振频带Δfres(图50)和相应的整体谐振器带宽ΔfBW(图50)，下面将参见图54进行更详细的讨论。因此，多个谐振器NPR1-NPR3以频率复用(或频分复用)布置并联连接，产生谐振器阵列NPR1-NPR3，全部由单个AC输入电压5308驱动，并且每个响应其自己的探测输入频率。
参见图53，可以在连接到谐振器NPR1-NPR3的并联阵列之前与AC输入源5308串联地提供可选的AC RF衰减器5310，以提供与谐振器NPR1-NPR3匹配的分压器或阻抗和/或基于感兴趣的工作频率范围内的谐振器的阻抗值范围来调节AC输出电压Vout范围。衰减器5310可以是恒定或开关或可变类型RF衰减器，这取决于所使用的频率范围、阵列和负载的阻抗，和/或期望的功能和性能特征。
参见图53，来自谐振器NPR1-NPR3的并联阵列的AC输出电压Vout可以被提供给放大器(或前置放大器)5320，其对输出信号Vout执行信号调节，例如去除噪声，围绕感兴趣的测量频率进行滤波，将谐振器阵列的阻抗与下游装置或组件隔离，提高测量灵敏度，放大或衰减Vout信号，和/或根据需要执行AC输出电压信号Vout的其他所需信号调节以提供所需的功能和/或性能。在一些实施方案中，放大器还可以是有源滤波器，其在一个或多个探测频率附近过滤AC输出电压信号。放大器5320在线路5322上向A/D转换器5324(例如，集成电路或芯片)提供模拟AC调节输出电压Vout信号，其对经调节的AC输出电压Vout进行数字采样并在指示采样的调节的AC输出电压Vout信号的线路5326上提供数字输出数据。A/D转换器的采样率可以是提供输出信号的充分采样以保持在期望的测量频率(例如，探测频率)下执行频率分析的能力的任何速率。AC输出电压也可以下转换为较低的中频或DC，例如，如果基本探测频率太高(或太快)而不能由A/D转换器直接采样(或者出于其他设计或性能原因)，通过将具有相同(或类似)频率的AC输出信号混合，例如零差或外差解调，或任何其他类型或解调或频率转换采样，只要它保留准确测量所需参数需要的幅度和/或相位分量。A/D转换器5324可以具有存储采样的输出数据的板上存储器和/或可以连接到单独的存储器装置(未示出)或与其通信，该存储器装置可以存储全部或部分采样的输出数据。数字采样输出数据在线5326上提供给数字信号处理频率分析(或分解)逻辑5328，例如FFT(或快速傅里叶变换)逻辑或芯片，其对数字采样数据执行数字信号处理(DSP)并在线5330上提供数字数据，该线指示存在于采样的AC输出信号Vout中的频率分量(或谐波)的幅度和/或相位。如果需要，可以使用任何其他频率分析硬件，固件和/或软件代替FFT逻辑5328，只要它提供本文所述的功能和性能并充分测量感兴趣的(例如，至少在期望的探测或测量频率下)所需频率的输出信号的幅度和/或相位。
放大器5320，A/D转换器5324和FFT逻辑5329都是已知的硬件或固件组件(其可具有计算机可编程部分)，其可从集成电路提供商(例如Texas Instruments,Inc，AnalogDevices,Inc.，National Instruments Corp.，Intel Corp或其他类似制造商)获得。可以使用的用于数字化的组件的一个实例包括：Xilinx FFT LogiCORE，部件号4DSP FMC103，1126，Alazartec9360，9370。如果需要，可以使用其他组件，只要它们提供本文所述的功能和性能。而且，FFT逻辑可以由现场可编程门阵列(FPGA)执行。
此外，代替利用A/D转换器对输出电压进行采样并执行数字信号处理以确定频率分量，可以将输出信号Vout提供给调谐到期望频率的一个或多个模拟滤波器(未示出)以识别所需频率分量的幅度和/或相位，并提供表示相同频率分量的模拟输出电压信号。
参见图54，频率曲线5400示出了本公开的图53的多个谐振器NPR1-NPR3的采样频率分离。特别地，如上面参见图53所讨论的，谐振器NPR1-NPR3中的每一个具有唯一的谐振器带宽ΔfBW1，ΔfBW2，ΔfBW3，它们分别由独特的电感器值L1-L3设置或确定。谐振器NPR1-NPR3的带宽ΔfBW1，ΔfBW2，ΔfBW3可以分别与相邻的谐振器带宽分开频率间隔或间隙Δfgap，使得相邻谐振器的谐振器带宽ΔfBW不重叠并在相邻的谐振器之间引起干扰或串扰。在一些实施方案中，如果每个碱基的频率响应不同，则带宽可以重叠，因此，它们不影响识别每个谐振器的响应的能力。
类似地，在图54中，示出了分别对应于谐振器NPR1-NPR3的带宽ΔfBW1，ΔfBW2，ΔfBW3的一组探测器或监视器频率fp1，fp2，fp3，其可以是在每个谐振器带宽ΔfBW1，ΔfBW2，ΔfBW3内的频率，其提供如本文所述的所需输出信号，例如在聚合物处于纳米孔中时所见的谐振频率范围内(如上文结合图50-52所讨论的)。如果需要，可以使用其他测量或探测频率，只要它满足所需的功能和性能要求即可。
虽然间隙频率主要通过电感器L值的选择来确定，但是也可以通过多种因素确定在系统操作条件下可能发生的系统参数变化引起的操作期间避免不期望的重叠所需的相邻频带之间的分离量，所述多种因素包括但不限于单元设计参数容差(例如，电极，电感器，电容器，流体，单元壁，膜，材料，尺寸，以及可能因单元而异的任何其他单元设计参数)，环境操作范围，例如，温度，压力，湿度等，电磁干扰或噪声参数/效果，任何单元与单元(或室与室间)相互作用，和/或任何其他设计实践，安全性或法规要求或容许量，或可能影响所需功能或性能的任何其他因素。这些因素可能引起给定谐振器的带宽从其理想条件发生变化，因此应考虑随时间和环境的频率分离的总体设计容差参数。
参见图55A和55B，本公开的AC输入电压Vin包括至少期望的测量或探测频率，在该频率处将对输出AC电压Vout进行频率分析(例如，通过FFT逻辑5330-图53)。参见图55A，AC输入电压Vin可以是由曲线5502所示的连续宽带AC频率信号，曲线5502具有从最小可能测量频率fMIN到最小可能测量频率fMAX，或者从第一探测频率fp1到最后一个探测频率fpN的所有频率。在那种情况下，所有谐振器NPR1-NPR3都被宽带频率信号激发，并且将在输出信号的频率分量中表现出响应。或者，AC输入电压Vin可以是由曲线5510所示的宽带AC频率信号，该曲线5510仅具有所需的探测器或监视器频率fp1，fp2，fp3，fpN f，分别如各个频率分量5512，5514，5516，5518所示。而且，阵列中所有谐振器的AC输入电压Vin的总频率范围可以从大约1.0MHz到1GHz。如果需要，可以使用其他频率，只要它满足本文所述的功能和性能即可。AC输入电压Vin可以由已知的振荡器芯片(其可以是可调节的和/或可编程的)提供，其为期望的设计配置和激发提供期望的AC频率分量，例如FMC 2850，TIDAC900或XilinxDS558。对于Vin包含多个单独的探测频率的情况，可以通过电子地将单独的AC频率组合在一起，或者在数学上直接合成并编程到振荡器中(通过硬连线或由连接到其上的微处理器编程)来创建Vin。
参见图55B，AC输入电压Vin可以是由曲线5550示出的时间扫描AC频率信号，将输入频率从最小可能测量频率fMIN扫描到最小可能测量频率fMAX，或者从第一探测频率fp1扫描到最后探测频率fpN，然后重复，具有重复周期时间T。在这种情况下，输入电压Vin的频率在任何给定时间仅为一个频率，并且所有谐振器NPR1-NPR3响应该单个输入频率，并将在输出信号处显示对该频率的响应。此外，在这种情况下，因为系统一次只响应一个频率，并且系统知晓输入电压Vin的频率扫描定时，所以不需要频率分析，因为系统可以在与所需探测频率相关的时间对幅度和/或相位进行采样并直接确定该值。
备选地，AC输入电压Vin可以是曲线5570所示的时间步进AC频率信号，其中输入频率从第一探测频率fp1步进到最后探测频率fpN，并在每个频率处等待预定的停留时间TD，然后重复，具有重复周期时间T。在这种情况下，类似于扫描频率曲线5550，输入电压Vin的频率在任何给定时间仅在一个频率，所有谐振器NPR1-NPR3响应该单个输入频率，并且将在那时对输出信号处的该频率表现出响应。停留时间TD允许系统有更多时间在每个探测频率下对输出信号进行采样。此外，在这种情况下，因为系统一次只响应一个频率，并且系统知晓定时，所以不需要频率分析(或分解)，因为系统可以在与所需的探测频率相关的时间对幅度和/或相位进行采样并直接确定该值。
此外，阵列中的所有谐振器(以及探测测量频率)的AC输入电压Vin的总频率范围可以从大约1.0MHz到1GHz。如果需要，可以使用其他频率，条件时它们满足本文所述的功能和性能要求。AC输入频率应设置为能够使输入频率有足够数量的周期(或周期)的值，以允许对单元的阻抗进行充分采样。这将部分基于DNA(或其他聚合物)移动通过纳米孔的速度。例如，如果DNA以约1MHz的速率(即每秒一百万个碱基)移动通过纳米孔，并且如果AC输入频率是100MHz，则对每个碱基，单元阻抗将接收(或经历)100个循环的输入频率，对应于100：1“样本”速率。如果需要，可以使用其他输入频率和采样率，条件是它们提供所需的功能和性能。例如，数字分辨给定输入频率所需的最小采样频率是奈奎斯特采样频率，它是输入频率的2倍。在这种情况下，对于1MHz输入信号(DNA通过纳米孔的速率)，最小(或奈奎斯特)采样率将是2MHz。
参见图56，针对本公开的一些实施方案，分别示出了AC输出电压Vout幅度和相位5600，5620的频谱图的示例。特别地，对于AC输出电压信号Vout，示出了三个幅度线5602，5604，5606，分别对应于NPR1，NPR2，NPR3的频率响应。对于这个例子，使用的探测频率是f探测2，并且只有两个位，如图52所示的例子。在这个例子中获得该输出时，NPR1在时间T3具有列5206中所示的情景(图52)，并且相应的频率响应线5602表示V10的幅度和Ph6的相位。同时，NPR2在时间T2(图52)具有列5204中所示的情景，并且相应的频率响应线5604表示V9的幅度和Ph7的相位。同时，NPR3在时间T5具有列5210所示的情景(图52)，并且相应的频率响应线5606(图56)表示V6的幅度和Ph10的相位。
在一些实施方案中，所使用的探测或测量频率可以基于谐振器频率响应，聚合物属性和其他因素诸如可能影响输出信号质量的系统噪声而变化。在一些实施方案中，系统可以实时地在测量频率之间切换以确保获得最佳质量的输出信号，或者可以使用多个不同的测量频率来执行数据读取的错误检查或验证。在这种情况下，Vin的AC输入频率应包括测量频率，例如，通过相应地改变或调整(与测量同步)或使测量频率为所提供的连续AC输入频率分量的一部分。
参见图57，示出了用于本公开的实施方案的顶部水平框图5700。特别是，当谐振器阵列(或NPR)布置在芯片上时，它可以配置在M×N谐振器的二维阵列中，其中有M行5702-5708并且每行具有N个谐振器，所有并联连接(如线5716所示)并且所有NPR由线路5710上的相同AC输入电压Vin 5308(图53)驱动且所有NPR对线路5712上的公频分复用AC输出电压Vout有贡献的，其可以馈送到放大器(或前置放大器)5320(图53)。在那种情况下，行5702-5708中的每一个可以对应于频带，诸如100MHz-199Mhz(对于行5702)，200MHz-299MHz(对于行5704)，300Mz-399MHz(对于行5706)，以及对于其他行类似。在行5702-5708中的每一行内，可以存在多个谐振器(或NPR)，每个谐振器被示为具有标记f行，列的框5714。给定行中的每个NPR在与该行相关的频带内具有谐振器带宽ΔfBW，并且在频率上与相邻NPR隔开间隙频带Δfgap，以避免相邻谐振器之间的干扰或串扰，如上文与图54所讨论的那样。
例如，如果顶部5702处的第一行被指定为具有100MHz-199Mhz的频带，则该行5702中的NPRs f1,1至f1,N将在该频带内并且通过间隙频带彼此分开，如上所述和图54所讨论的。因此，在这种格式中，读取系统可以被视为数据元素的2D阵列，其可以用单个输入和输出线单独读取。如果需要，可以使用其他频带和范围。
参见图58，示出了多层芯片结构5800的横截面图，包括单元4800(图48A)，电感器L(图49A，53)和耦合电容器CCPL，并且包括顶部触点5802，其中输入(和输出)I/O电压线可以连接，其在本文中可以统称为纳米孔-聚合物谐振器(NPR)。单元4800(图48A)的匹配部件在图58中标记相同。在上电极4818上方是到芯片电感器5808(见图59)L的中心的垂直连接5806并且芯片电感器5808另一端连接到耦合芯片电容器5812。芯片电容器5812的上侧连接到I/O触点5802。多层的3-D堆叠允许增加单元4800和电路元件的封装，这允许密封填充单元5804。具体地，参见图48A和58，单元4800。还可以存在将每个功能电路元件分开的介电层5804。谐振器或NPR结构5800的多个副本可以在一维或二维阵列中连接在一起，以产生具有上文讨论的NPR阵列的“芯片”，例如，图53和57。此外，放大器5320(图53)，例如通过“倒装芯片”粘合或任何其他提供所需功能和性能的技术，CMOS放大器或前置放大器，可以在适当的位置集成到输出线接触层5802中的芯片结构中，例如，在阵列中的最后一个NPR 5800之后。而且，参见图59，示出了可以在芯片5800中使用的电感器L的顶视图，其可以使用已知的芯片-电感器制造技术(例如光刻制造或其他制造技术)来制造。如本文所讨论的，还可以存在施加到电极的DC电压，以将漂浮在室中的DNA或聚合物移动或转向到特定的所需室。如本文所讨论的，AC电压经由I/O触点施加到所有NPR 5800，I/O触点可以是所有NPR共用的并且由线路5812上的AC输入电压馈电，并且DC电压可以单独施加到线5810上的每个电极，每个NPR具有其自己的单独的DC电压输入线5810，以唯一地控制电极4818。
参见图60和61，为了允许AC和DC电压驱动相同的单元，可以使用“偏置器”连接将AC和DC线连接到结构5800，具有图60中所示的电路6000和图61中所示的样品物理芯片实现6100。参见图60，AC RF(高频)输入信号Vin通过耦合电容器CCPL(如本文前面所述)耦合到电感器L，并且DC输入可以通过高电阻线Rw连接到电感器L的同一侧，其具有足够的自感以“阻止”高频AC信号通过DC输入源路径离开电路。或者，如果需要，电阻线Rw可以连接到电感器L的另一侧(电极侧)。然而，在那种情况下，电阻线Rw的值将用于抑制谐振(作为与AC接地的单元电容并联的另一电阻器)。
参见图61，示出了“偏置器”连接的物理实现6100的示例，其示出了“偏置器”连接的放大视图。高频AC输入信号Vin经由传输线(例如，顶部I/O触点5802-图58)电容性地耦合到电感器L，具有到第二板6102的间隙以产生耦合AC并阻止直流(DC)电压的耦合电容器CCPL。此外，DC输入电压(或DC“转向”电压)可以通过高电阻线Rw连接到电感器L的同一侧，其具有足够的自感以“阻止”高频AC信号通过DC输入源路径离开电路，也如上面参见图60所讨论的。“偏置器”连接的结果是施加到电感器L的电压是具有由DC输入电压确定的DC偏置的AC输入电压。
参见图62，示出了多层芯片结构6200的横截面图，包括具有三个类似于图24，25，28和29中所示的和本文描述的室的单元，并且具有两个集成电感器L1A，L1B。在那种情况下，存在上部(或顶部)左室6202，其具有左上电极6210(用于添加位，例如“0”)，右上室6204，其具有右上电极6212(用于添加位，例如，“1”)和下部“解封闭”室6206，对于左上6002和右上6004室共用，具有对应的电极6214，其可以连接到地(例如，0伏)。对于三室单元，它可以被视为具有两个并联的电容器，每个电容器具有随时间变化的自身阻抗。在这种情况下，左电感器L1A连接到左上电极6210，右电感器L1B连接到右上电极6212。其余部件和元件可以与前面讨论的两室单元设计相同。AC RF I/O输入线可以电容耦合到电感器，其中每个DC输入线6220，6222通过电阻器或电阻线耦合，使用如上所述的“偏置器”连接。如果电感器L1A，L1B具有不同的值，则左室和右室将具有不同的谐振频率和不同的谐振带宽。在那种情况下，每个三室单元将有两个具有两个谐振带宽的谐振器，其可以位于频率空间中以被询问或监测以读取聚合物(或DNA)上的数据，如上所述。如果电感器L1A，L1B具有相同的值，则仍然可以为每个室读取DNA，因为系统一次只能读取一个室，因为每个单元只有一个聚合物(或DNA)链。因此它本质上是时间顺序或时间相关的，因此它们不需要在频率上分开以完成数据读取。然而，可能需要将它们分开以确保(或验证)实际上正在读取的正确室。
参见图63，示出了多层芯片结构6300的横截面图，包括具有类似于图62中所示的三室单元，具有单个集成电感器L1A。在一些实施方案中，取决于数据读取和写入方案，可能期望仅使用一个单元(例如，左上单元6002)来读取聚合物数据，而另一个单元(例如，6004)可以不被配置用于读取，因此没有电感器并且不形成谐振器。在那种情况下，AC输入电压Vin和DC转向电压可以使用“偏置器”连接耦合到电感器L1A，如上文中关于其他实施方案所述，以驱动左上电极6210，DC转向电压在线6302进入，并且对于右上电极6212，DC转向输入电压可以直接连接，如线6304所示。其余的部件和元件可以与前面用图62所讨论的三室单元设计相同。
参见图64和64A，代替使电感器附着到一个或两个顶电极，单个集成电感器L1可以连接到底电极6214并且顶电极6210，6212单独连接到线6410，6412上的该电极的相应DC转向电压。在那种情况下，在电路的顶部和底部将存在“偏置器”型连接(参见图64A)。在那种情况下，AC RF输入电压可以提供给底电极，底电极可以经由耦合电容器CCPL AC耦合到电感器L1，并且顶部的耦合电容器将AC耦合到AC RF接地。DC线6410，6412(图64)各自通过Rw(图64A)耦合到它们各自的电极，DC通过单元和电感器并通过底部Rw到DC接地。底部触点可以用作AC rf I/O线，顶部触点4610可以用作DC I/O线。此外，DC接地也可以是DC输入线，唯一的要求是定义顶电极和底电极之间的DC电位差。使用公共电感器L1，仍然可以为每个室读取DNA，因为系统一次只能读取一个室，因为每个单元只有一个聚合物(或DNA)链(或如本文所述的存储串)(如上所述)。因此，它本质上是时间顺序或时间依赖性的。参见图63，63A和63B，在一些实施方案中，代替使用用于每个谐振器的独特电感器L(例如图63中所示)来设置独特的谐振频率和频率带宽，可以为阵列中的所有谐振器使用单个公共电感器Lcommon并且独特的电容器CR可以与每个单元并联地提供，每个单元具有设定每个谐振器的谐振频率的值。在这种情况下，对于每个被测量的室，存储器芯片可以具有从顶电极到底电极的内置固定芯片谐振器电容器CR，以便为每个单元设置公共电感器的谐振频率。当聚合物移动通过纳米孔并且单元的电容改变时，该电容变化将调整整个并联电容组合并相应地调整谐振频率。与具有独特电感器L的情况一样，固定谐振电容器CR的值将被设置为对谐振器阵列中的每个谐振器提供唯一的谐振频率响应。如上文针对电感器实施方案所讨论的，可能仅需要一个电容器(一个谐振器)执行测量，或者如果使用两个电容器，则它们可以是相同的值(由于如上所述的固有时间序列)，或者如果需要用于验证，冗余或其他目的，则可以是不同的值。图63A示出了具有固定谐振电容器CR1，CR2，CR3和公共电感器Lcommon的若干单元的等效电路图的示例。
参见图64，64B，64C，在一些实施方案中，代替在每个谐振器的底部使用独特的电感器L(例如图64中所示)来设置独特的谐振频率和频率带宽，可以使用单个公共底部电感器Lcommon，用于阵列中的所有谐振器，并且可以与每个单元并联地提供独特的电容器CR，其具有设定每个谐振器的谐振频率的值。可以对底部的电感器进行使用固定的类似变化，其中可以使用谐振电容器CR1，CR2，CR3和公共电感器Lcommon。在这种情况下，对于每个被测量的室，存储器芯片可以具有从顶电极到底电极的内置固定芯片谐振器电容器CR(图64C)，以针对每个单元利用公共电感器Lcommon设置谐振频率。
本公开不要求单元可单独寻址以读取每个单元中的数据。而且，本公开允许使用频分复用，通过使用单个源输入线和单个输出线来读取存储在位于每个单元中的聚合物上的数据。此外，本发明的数据读取技术可用于任何类型的纳米孔，例如固态，基于蛋白质的纳米孔或任何其他类型的纳米孔。此外，本公开的系统和方法使用高射频频率来读取存储串(或DNA或聚合物)，例如，大约1MH-1GHz，这基本上消除了1/f噪声，因此系统可具有比不使用这种高频测量方法的系统具有更高的灵敏度(或粒度或保真度)。另外，使用这种高频方法还提供了用于在存储串通过纳米孔时读取(或采样)存储串的快速时间尺度，从而不需要为了采样或测量目的而故意减慢该串。
在一些实施方案中，本发明提供用于对带电聚合物(例如DNA)进行测序的纳米芯片，所述带电聚合物包含至少两种不同的单体，所述纳米芯片包含至少第一和第二反应室，每个反应室包含电解质，并且通过包含一个或多个纳米孔的膜隔开，其中在电路中连接的一对电极(例如以相对板的形式)设置在包括一个或多个纳米孔的膜的任一侧上，电极间隔1-30微米的距离，例如，大约10微米，使得当例如将1MHz至1GHz射频脉冲直流电施加到电极时，电极之间的间隙具有电容，以便吸引带电聚合物通过纳米孔，例如，从一个室到下一个室，并且使得脉冲直接射频电流的相位随着带电聚合物通过纳米孔的电容的变化而变化，从而允许检测带电聚合物的单体序列。在某些实施方案中，纳米芯片包括多组反应室，其中一组内的反应室由具有一个或多个纳米孔的膜隔开，并且这组反应室由屏蔽层隔开以最小化反应室组之间的电干扰和/或分离多个线性聚合物并允许它们平行测序。
例如，在一个实施方案中，电极形成嵌入谐振电路中的电容器的顶板和底板，并且当DNA穿过板之间的孔时测量电容的变化。
在某些实施方案中，纳米芯片还包含用于合成聚合物例如DNA的试剂，例如，根据以下Nanochip 1等中的任何一个。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于合成带电聚合物[例如，核酸(例如，DNA或RNA)]的方法(方法1)，所述聚合物包含纳米芯片(例如基于纳米孔的装置，例如，纳米芯片1等)中的至少两个不同单体，所述纳米芯片包含
一个或多个添加室，其含有用于向在缓冲溶液中的带电聚合物以端保护形式添加一种或多种单体[例如，核苷酸]或寡聚体[例如，寡核苷酸]的试剂，使得在一个反应循环中仅可加入单一单体或寡聚体；和
一个或多个存储室，含有缓冲溶液但不是添加一种或多种单体或寡聚体所需的所有试剂，
其中所述室由一个或多个包含一个或多个纳米孔的膜隔开，和
其中带电聚合物可以通过纳米孔但是用于添加一种或多种单体或寡聚体的至少一种试剂不能，
该方法包括
a)通过电吸引将具有第一端和第二端的带电聚合物的第一端移动到添加室中，由此将单体或寡聚体以保护形式添加到所述第一端，
b)用加入的单体或寡聚体以保护形式将带电聚合物的第一端移动到储备室中，
c)解封闭加入的单体或寡聚体，和
d)重复步骤a-c直至获得所需的聚合物序列，其中步骤a)中加入的单体或寡聚体相同或不同。
例如，本发明提供
1.1.方法1，其中聚合物是核酸，例如，其中聚合物是DNA或RNA，例如，其中它是DNA，例如dsDNA或ssDNA。
1.2.任何前述方法，其中聚合物例如，核酸的第二端，被保护或结合到与纳米孔相邻的基质上。
1.3.任何前述方法，其中通过在每个室中的电极之间施加电势来提供电吸引，其中可以控制电极之间的极性和电流流动，例如使得核酸被吸引到正电极。
1.4.任何前述方法，其中聚合物是核酸和
(i)核酸的所述第一端是3’端，核苷酸的添加是在5’至3’方向并且由聚合酶催化，例如，其中聚合酶被阻止(例如由于其尺寸或由于被束缚在第一室中的基质)而通过纳米孔，所述核苷酸在加入时被3’保护，并且在核酸的3’端添加3’保护的核苷酸之后，例如，在储备室中除去所述核酸上的3’-保护基团；或
(ii)核酸的所述第一端是5’端，核苷酸的添加是3’至5’方向，加入时核苷酸是5’保护的，并且在添加5’保护的核苷酸到所述核酸的5’端后，所述5’保护的基团被除去，例如，在第二室中；(例如，其中5’保护的核苷酸上的磷酸酯是通过5’-保护基团偶联到不能通过纳米孔的大基团的核苷亚磷酰胺，从而在与核酸偶联后，未反应的核苷酸被洗去，将大的5’-保护基团从核酸上切下，冲洗掉，并将核酸的5’端移入储备室中；
其中通过核酸的第一端移入和移出一个或多个添加室来控制向核酸中添加核苷酸，并且继续循环直至获得所需的序列。
1.5.任何前述方法，其中由此合成的聚合物中的单体或寡聚体序列[例如，核酸中的核苷酸序列]对应于二进制代码。
1.6.任何前述方法，其中由此合成的聚合物是单链DNA。
1.7.任何前述方法，其中聚合物[例如，核酸]的序列在过程中或合成期间通过对单体或寡聚体[例如核苷酸碱基]通过纳米孔时进行测序来检查，以鉴定测序中的错误。
1.8.任何前述方法，其中由此合成的聚合物是单链DNA，其中序列中至少95％，例如至少99％，例如，基本上所有碱基选自不与链中其他碱基杂交的两个碱基，例如选自腺嘌呤和胞嘧啶的碱基。
1.9.任何前述方法，其中多种聚合物[例如寡核苷酸]独立地平行合成，使得通过分别控制具有不同序列的聚合物[寡核苷酸]是否存在于一个或多个添加室或一个或多个储备室中而获得它们。
1.10.任何前述方法，其中至少有两个添加室，其含有适于加入不同单体或寡聚体例如，不同的核苷酸的试剂，例如，其中存在含有适于添加第一单体或寡聚体的试剂的一个或多个添加室，和含有适于添加第二种不同单体或寡聚体的试剂的一个或多个添加室，例如其中存在含有适于加入腺嘌呤核苷酸的试剂的一个或多个添加室和含有适于加入胞嘧啶核苷酸的试剂的一个或多个添加室。
1.11.任何前述方法，其中至少一个加料室添加室是流动室，提供流动循环，包括(i)向流动室提供适于添加第一单体或寡聚体的试剂，(ii)冲洗，(iii)向流动室提供适于加入第二种不同单体或寡聚体的试剂，和(iv)冲洗，并重复该循环，直到合成完成，其中聚合物中单体或寡聚体的序列通过在每个循环中，在步骤(i)或(iii)期间从流动室引入或排除聚合物的第一端来控制；
1.12.任何前述方法，其中聚合物是DNA并且至少一个添加室是流动室，提供流动循环，包括(i)向流动室提供适于添加第一类型核苷酸的试剂，(ii)冲洗，(iii)向流动室提供适于添加第二类核苷酸的试剂，和(iv)冲洗，并重复该循环直至合成完成，其中通过控制流动室中DNA的第一端(例如3’端)的存在或不存在来控制序列。
1.13.任何前述方法，其中聚合物是DNA并且至少一个添加室是流动室，提供流动循环，包括(i)向流动室提供适于添加第一类型核苷酸的试剂，(ii)冲洗，(iii)向流动室提供适于添加第二类核苷酸的试剂，和(iv)冲洗，(i)向流动室提供适于添加第三类核苷酸的试剂，(ii)冲洗，(iii)向流动室提供适于添加第四种类型的核苷酸的试剂，和(iv)冲洗，并重复该循环直至合成完成，其中当存在适于添加不同类型核苷酸的试剂时，通过控制流动室中的DNA的第一端(例如3’端)的存在或不存在来控制序列。
1.14.任何前述方法，其中聚合物是DNA并且纳米芯片包括两个作为流动室的添加室，(a)第一流动室提供流动循环，包括(i)向第一流动室提供适于添加第一类型核苷酸的试剂，(ii)冲洗，(iii)向第一流动室提供适于添加第二种不同类型核苷酸的试剂，和(iv)冲洗，并重复该循环直至合成完成，和(b)第二流动室提供流动循环，包括(i)向第二流动室提供适于添加第三类核苷酸的试剂，(ii)冲洗，(iii)向第二流动室提供适于添加第四种不同类型核苷酸的试剂，和(iv)冲洗，并重复该循环直至合成完成，其中核苷酸选自dATP，dTTP，dCTP和dGTP，并且其中通过指导DNA的第一端(例如3’端)到提供下一个所需的核苷酸到流动室中来控制序列。
1.15.任何前述方法，其中聚合物是DNA，并且纳米孔芯片包括一个或多个用于添加dATP的添加室，一个或多个用于添加dTTP的添加室，一个或多个用于添加dCTP的添加室，以及一个或多个用于添加dGTP的添加室。
1.16.任何前述方法，其中合成的聚合物[例如核酸]各自通过其第二端结合到接近纳米孔的表面。
1.17.任何前述方法，其中通过在聚合物通过纳米孔时检测电势、电流、电阻、电容和/或阻抗的变化，在每个循环后确定聚合物[例如核酸]的序列。
1.18.任何前述方法，其中聚合物是核酸，并且核酸的合成在缓冲溶液中进行，例如包含pH7-8.5例如p约pH8的缓冲液的溶液，例如，包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，合适的酸和任选的螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液，例如含有Tris碱，乙酸和EDTA的混合物的TAE缓冲液，或包含Tris碱，硼酸和EDTA的混合物的TBE缓冲液；例如，包含10mMTris pH 8,1mM EDTA，150mM KCl，或例如50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，pH7.9@25℃的溶液。
1.19.任何前述方法，其中聚合物是单链DNA，还包括将合成的单链DNA转化为双链DNA。
1.20.任何前述方法，还包括在聚合物合成完成后，从纳米芯片除去聚合物[例如核酸]。
1.21.任何前述方法，其中聚合物是核酸，还包括使用合适的引物和聚合酶(例如Phi29)扩增和回收合成的核酸的拷贝。
1.22.任何前述方法，其中聚合物是核酸，还包括用限制性酶切割合成的核酸并从纳米芯片中除去核酸。
1.23.任何前述方法，其中聚合物是核酸，还包括扩增由此合成的核酸。
1.24.任何前述方法，还包括从纳米芯片中除去聚合物[例如核酸]并使聚合物结晶。
1.25.任何前述方法，其中聚合物是核酸，还包括稳定核酸，例如通过将包含核酸的溶液与一种或多种缓冲液(例如硼酸盐缓冲液)，抗氧化剂，保湿剂，例如多元醇和任选的螯合剂，例如US 8283165 B2中所述(其引入并入本文)的螯合剂一起干燥；或者通过在核酸和聚合物，例如聚(乙二醇)-聚(1-赖氨酸)(PEG-PLL)AB型嵌段共聚物之间形成基质；或通过添加互补核酸链或结合DNA的蛋白质。
1.26.任何上述方法，包括：
(i)在聚合酶存在下，使核酸与3’保护的核苷酸在添加室中反应，所述聚合酶催化3’保护的核苷酸添加到核酸的3’端；
(ii)将由此获得的3’保护的核酸的至少3’端从添加室通过至少一个纳米孔吸入储备室，其中聚合酶受阻(例如由于其大小或由于被束缚在第一室中的基质上)而不能通过纳米孔；
(iii)使3’-保护的核酸去保护，例如化学或酶促去保护；和
(iv)如果需要向寡核苷酸添加另外的3’保护的dNTP，那么将寡核苷酸的3’端吸到相同或不同的添加室中，以便重复步骤(i)-(iii)，或者如果不是这样，则允许核酸的3’端保留在储备室中，直到进一步的循环，其中将所需的3’保护的dNTP提供给添加室；和
(v)重复步骤(i)-(iv)的循环，直至获得所需的核酸序列。
1.27.任何前述方法，其中聚合物是核酸单链DNA(ssDNA)，并且一个或多个纳米孔具有允许ssDNA通过而不是双链DNA(dsDNA)通过的直径，例如约2nm的直径。
1.28.任何前述方法，其中单体是3’-保护的核苷酸，例如三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，例如选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)，脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)，脱氧胞苷三磷酸(dCTP)，脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，例如dATP或dCTP。
1.29.任何前述方法，其中聚合物是核酸并且核苷酸添加到核酸中由聚合酶催化，例如，模板独立的聚合酶，例如端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，或多核苷酸磷酸化酶，例如，其中聚合酶催化在DNA的3’-羟基端掺入脱氧核苷酸。
1.30.任何前述方法，其中膜含有多个纳米孔和多个聚合物，每个聚合物结合到接近纳米孔的表面，例如多个核酸，每个核酸通过它们的5’端结合到接近纳米孔的表面。
1.31.任何前述方法，其中各自结合到接近纳米孔的表面的多种聚合物，例如各自在5’端结合到接近纳米孔的表面的多种核酸，是独立地合成的，其中每个纳米孔具有相关的一对电极，其中该对中的一个电极位于纳米孔的一端附近，并且另一个电极位于纳米孔的另一端附近，使得每个聚合物可以通过这对电极提供的电流在第一和第二室之间独立地移动。
1.32.任何前述方法，其中聚合物是3’保护的核酸，其在5’端结合到靠近纳米孔的表面，并且3’保护的核酸的3’端通过使用电力被吸引通过纳米孔，例如，通过使用从相邻室中的电极施加的电力。
1.33.方法1.20，其中新的3’-保护的dNTP与第一个3’-保护的dNTP相同或不同。
1.34.方法1.20，其中在该循环的步骤(i)中使用的3’-保护的dNTP与3’-保护的dATP和3’-保护的dCTP之间的每个循环交替。
1.35.任何前述方法，其中聚合物是核酸并且核酸的去保护是通过酶来进行的，所述酶去除ssDNA上的而不是3’保护的dNTP上的3’-保护基团。
1.36.任何前述方法，还包括在聚合物通过纳米孔时检测聚合物的序列以确认合成所需序列的步骤。
1.37.任何前述方法，包括当聚合物通过纳米孔时检测聚合物序列的步骤，以通过测量当DNA被拉过纳米孔时测量谐振RF电路中的电容变化来确认所需序列已被合成。
1.38.任何前述方法，其中用于将一种或多种单体或寡聚体加入到带电的聚合物中的试剂包括选自拓扑异构酶，DNA聚合酶或其组合的试剂。
1.39.任何前述方法，其中向带电聚合物中加入一种或多种单体或寡聚体是按照方法2等，以及方法A等中的任何一种方法进行的。
例如，本发明提供了用于合成纳米芯片中的核酸的方法，其包括至少第一室和第二室，所述第一室和第二室由包含至少一个纳米孔的膜隔开，所述合成在缓冲溶液中通过以下方式进行：核苷酸添加到具有第一端和第二端的核酸的第一端的循环，其中核酸的第一端通过一个或多个添加室(其包含能够添加核苷酸的试剂)和一个或多个储备室(其不含有添加核苷酸所必需的试剂)之间的电吸引而移动，所述室由一个或多个膜隔开，每个膜包含一个或多个纳米孔，其中纳米孔足够大以允许核酸通过但也是太小而不允许通过至少一种对添加核苷酸必需的试剂例如，其中所述方法对应于方法1中的任何一种，等。
例如，方法1A，其是例如根据方法1等中任一项的方法，用于在基于纳米孔的装置中合成包含至少两种不同单体或寡聚体的带电聚合物，该基于纳米孔的装置包括
一个或多个添加室或通道，含有缓冲溶液和用于将一种或多种单体或寡聚体以封端形式加入到带电聚合物中的试剂，这样在一个反应循环中只能添加一种单体或寡聚体；和
一个或多个解封闭室或通道，包含缓冲溶液和用于从以保护形式添加到带电聚合物中的一种或多种单体或寡聚体中去除封端基团的解封闭试剂，
其中所述添加室或通道通过一个或多个包含一个或多个纳米孔的膜与所述解封闭室分离，和其中带电聚合物可以通过纳米孔，并且用于添加一种或多种单体或寡聚体的至少一种试剂不能通过纳米孔，并且至少一种解封闭试剂不能通过纳米孔，
该方法包括
a.通过电吸引将具有第一端和第二端的带电聚合物的第一端移动到添加室或通道中，由此将单体或寡聚体以保护形式添加到所述第一端，
b.用保护形式的添加的单体或寡聚体将带电聚合物的第一端移动到储备室中，由此去除添加的单体或寡聚体上的保护基团，和
c.重复步骤a和b，其中步骤a)中添加的单体或寡聚体相同或不同，直至得到所需的聚合物序列；
例如，其中所述装置包括一个或多个第一添加室或通道，其包含适于添加第一类单体或寡聚体的试剂，和一个或多个第二添加室，其包含适于添加第二种不同类型的单体或寡聚体的试剂，并且其中步骤a中，根据是否需要加入第一种单体或寡聚体或第二种不同类型的单体或寡聚体，将带电聚合物的第一端移入第一添加室或第二添加室。
在某些实施方案中，聚合物的序列对应于二进制代码，例如其中聚合物是核酸并且序列对应于二进制代码，其中每个位(0或1)由碱基表示，例如A或C。
在某些实施方案中，聚合物是DNA。
在某些其他实施方案中，每个位由短序列单体而不是单个单体表示。例如，在一个这样的实施方案中，合成DNA块(block)，其中每个块通过纳米孔产生独特信号并且对应于0或1。该实施方案具有某些优点，因为单核苷酸更难以在纳米孔中检测，尤其是固态纳米孔，因此使用块不易于读取错误，尽管聚合物中的信息密度相应地降低。
例如，可以使用位点特异性重组酶，即在称为位点-特异性重组序列的序列区段内自发识别和切割核酸双链的至少一条链的酶，添加(双链)核苷酸的嵌端(block)。在一个这样的实施方案中，位点特异性重组酶是拓扑异构酶，用于将拓扑缀合的dsDNA寡核苷酸嵌端与序列连接。这些寡核苷酸在被限制性酶切割之前本身不具有与进一步连接相容的结构。痘苗病毒拓扑异构酶I特异性识别DNA序列5’-(C/T)CCTT-3’。拓扑异构酶结合双链DNA并在5’-(C/T)CCTT-3’切割位点切割它。指出的是，切割是不完整完全的，因为拓扑异构酶仅切割一条链上的DNA(尽管在另一条链上具有附近的切口确实导致双链断裂)，并且当它切割时，拓扑异构酶共价连接到3’核苷酸的3’磷酸。然后酶保持与DNA的3’端共价结合，并且可以在与最初切割的相同键处重新连接共价保持的链(如在DNA松弛期间发生的)，或者它可以重新连接成到具有相容突出端的异源受体DNA，创造产生重组分子。在该实施方案中，我们产生dsDNA供体寡核苷酸(例如，包含至少两种不同序列之一，一种用于’0’，另一种用于’1’)，侧翼为拓扑异构酶重组位点和产生拓扑异构酶连接位点的限制位点。盒是带Topo带拓扑的；也就是说，它们与拓扑异构酶共价结合，拓扑异构酶将它们与接收体寡核苷酸上的拓扑异构酶连接位点结合。当用限制性酶切割接收体的生长DNA链时，它变得能够连接到带Topo拓扑的盒子上。因此，只需要将生长中的DNA从限制性酶连续循环到带Topo拓扑的盒中，每个循环添加另一个供体寡核苷酸。已经描述了用于克隆的相关方法，参见例如ShumanS.,Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis usingvaccinia DNA topoisomerase.J Biol Chem.(1994)；269(51):32678-84，其内容通过引用并入本文。
可以使用类似的策略添加单碱基。在存在合适的单链“去保护的”‘受体’DNA的情况下，带拓扑的DNA通过拓扑异构酶酶促和共价连接(‘添加’)到受体，在该过程中拓扑异构酶从DNA中除去。然后，IIS型限制性酶可以切割所有添加的DNA，除了单个碱基(正在’添加’的碱基)。可以重复这种去保护-添加过程以添加额外的碱基(位)。如本文实施例中所证明的，使用Topo/TypeIIS限制性酶组合将单个核苷酸添加到靶单链DNA的5’端是可行的。使用TypeIIS限制性酶可以在不同于识别序列的位置切割DNA(其他TypeIIS限制性酶可见于https://www.neb.com/tools-and-resources/selectioncharts/type-iis-restriction-enzymes)。在该系统中使用肌苷(其作为“通用碱基”并与任何其他碱基配对)允许该反应在靶DNA中没有任何特定序列要求的情况下发生。添加到单链靶DNA中的核苷酸的身份是痘苗拓扑异构酶通过3’磷酸缀合的3’核苷酸。由于痘苗拓扑异构酶的识别序列是(C/T)CCTT，我们使用该系统向靶DNA添加‘T’。存在相关的拓扑异构酶SVF，其可以使用识别序列CCCTG(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446)。因此，SVF可用于添加“G”而不是“T”。与痘苗topo配对，二进制数据可以用T和G编码。
在单碱基添加的另一种方法中，5’-磷酸盐提供了保护基团以在3’至5’方向上提供单碱基添加。负荷反应用具有5’磷酸基团的单个T(或G，或所需的其他核苷酸)负荷拓扑异构酶。当被负荷的拓扑异构酶“看到”游离的5’未封闭的(未磷酸化的)单链DNA链时，它会将T添加到该链上，从而为DNA提供添加到5’的T’。通过具有拓扑异构酶和单链受体DNA可以结合的序列的衔接头DNA的存在促进了这种添加。(指出的是，衔接头DNA是催化性的-它可以在重复反应中作为模板重复使用。)添加的核苷酸上有5’磷酸，因此它不会成为进一步添加的底物，直到它暴露于磷酸酶，该磷酸酶去除5’磷酸盐。重复该过程，使用痘苗拓扑异构酶向靶单链DNA的5’端添加单个“T”以及使用SVF拓扑异构酶添加单个‘G’，从而允许构建用T和G编码二元信息的序列。其他拓扑异构酶可用于添加A或C，尽管这种反应效率较低。
当拓扑异构酶负荷时，存在负荷和不负荷产物的混合物，其表示两种物质之间的平衡。拓扑异构酶离开的“突出端”可以以多种方式设计，以优化反应效率。富含GC的突出端倾向于具有更快的负荷反应，但具有倾向于产生较低的产物产率的负荷平衡。我们发现，使用一些碱基错配(或使用肌苷)代替“正确”对可以减少“逆”反应并提高产量。此外，在多核苷酸激酶(加上ATP)存在下进行反应通过磷酸化反应“副产物”来提高产率，这降低了逆反应速率。在某些实施方案中，拓扑异构酶可以通过添加不损害功能的额外氨基酸序列而“膨胀”，以确保它们足够大以至于它们不能通过纳米孔。
使用拓扑异构酶介导的策略的一个优点是单体与拓扑异构酶共价连接，因此不能“逃逸”以干扰其他反应。当使用聚合酶时，单体可以扩散，因此聚合酶和/或解封闭剂应该是特异性的(例如，对A与C的选择性)，或者，单体由流提供，因此它们没有机会混合。
在一个方面，本发明提供了负荷单核苷酸的拓扑异构酶，即与单个核苷酸缀合的拓扑异构酶，例如，其中拓扑异构酶通过核苷酸的3’-磷酸缀合，并且核苷酸受到保护，例如，在5’-位被磷酸化。
在另一方面，本发明提供了一种合成DNA分子的方法(方法A)，其使用拓扑异构酶介导的连接，通过将单个核苷酸或寡聚体以3’至5’方向添加至DNA链实现，所述方法包括(i)DNA分子与负荷所需的核苷酸或寡聚体的拓扑异构酶反应，其中核苷酸或寡聚体在5’端被封闭而不会进一步添加，然后(ii)解封闭由此形成的DNA的5’端，并重复步骤(i)和(ii)直到获得所需的核苷酸序列，例如，
A1.1.方法A，其是通过以3’至5’方向添加单个核苷酸来合成DNA分子的方法，包括(i)使DNA分子与带有5’保护形式(例如5’磷酸化形式)的所需核苷酸的拓扑异构酶反应，使得5’保护形式的所需核苷酸加到DNA的5’端，然后(ii)通过使用磷酸酶使由此形成的DNA的5’端去保护，并重复步骤(i)和(ii)直到获得所需的核苷酸序列；或
A1.2.方法A，其是通过以3’至5’方向添加寡聚体来合成DNA分子的方法，包括(i)使DNA分子与带有所需寡聚体的拓扑异构酶反应，从而将寡聚体连接至DNA分子，然后(ii)使用限制性酶为拓扑异构酶介导的另一种寡聚体的连接提供5’位点，并重复步骤(i)和(ii)直至获得所需的寡聚体序列。
A1.3.任何前述方法，包括提供连接酶和ATP以密封DNA中的切口[NB：拓扑异构酶连接仅连接一条链]。
A1.4.任何前述方法，其中负荷拓扑异构酶的供体寡核苷酸包含在与带有拓扑异构酶的链互补的链上的5’突出端，包含聚肌苷序列[NB：肌苷充当’通用碱基’并与任何其他碱基配对]。
A1.5.任何前述方法，其中限制性酶是IIS型限制性酶，除了单个碱基(正在“添加”的碱基)外，它可以切割所有添加的DNA。
A1.6.任何前述方法，其中拓扑异构酶选自痘苗拓扑异构酶和SVF拓扑异构酶I。
A1.7.任何前述方法，其中痘苗拓扑异构酶(其识别(C/T)CCTT)用于添加dTTP核苷酸和SVF拓扑异构酶I(其识别CCCTG)用于添加dGTP核苷酸，例如，以提供二进制代码。
A1.8.任何前述方法，其中DNA是双链的并且储备室还包含连接酶和ATP，以修复未被拓扑异构酶连接的DNA链。
A1.9.任何前述方法，包括使用拓扑异构酶抑制剂来抑制游离拓扑异构酶与DNA寡聚体的结合和活性，例如，其中抑制剂选自新生霉素和香豆霉素。
A1.10.任何前述方法，其中由此提供的DNA链具有包含胸苷(T)核苷和脱氧鸟苷(G)核苷的序列。
A1.11.任何前述方法，其中拓扑异构酶添加单碱基，但限制性酶在从拓扑异构酶添加的碱基的5’方向上的一个核苷酸的位置处切割。
A1.12.任何前述方法，其中由此提供的DNA链具有包含’TT’和’TG’二核苷酸序列的序列。
A1.13.任何前述方法，其中DNA是单链的，
A1.14.任何前述方法，其中DNA是双链的。
A1.15.任何前述方法，其中DNA在基质或磁珠上，其中所述DNA可以根据需要选择性地暴露于试剂或从试剂中除去以提供所需的序列。
A1.16.任何前述方法，其中用于添加或解封闭DNA的一些或所有试剂通过流动提供并通过冲洗除去。
A1.17.任何前述方法，其中单核苷酸或寡聚体与单链DNA的连接通过具有拓扑异构酶和单链受体DNA可结合的序列的衔接头DNA的存在而得到促进。
A1.18.在系统中进行的任何前述方法，其中纳米孔将包含拓扑异构酶的室与包含磷酸酶或限制性酶的室分开，其中纳米孔允许通过电吸引移动DNA，但不允许酶，例如如方法2等等中任何一个所述的酶移动。
一个可能的问题是poly-G序列可能形成G四联体二级结构。通过将限制性酶移回一个碱基(到拓扑序列的5’)并遵循类似的Topo/IIS策略，可以添加’TT’或’TG’，每个可以代表不同的位。虽然这需要2个碱基来编码一位，但它具有避免poly-G序列的优点。在其他实施方案中，拓扑识别序列的3’端中的其他碱基-尽管比(C/T)CCTT效率低，但可以允许使用痘病毒拓扑异构酶与(C/T)CCTA，(C/T)CCTC和(C/T)CCTG的缀合(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17462694)。蛋白质工程/选择技术也可用于提高这些反应的效率，并且类似的方法可用于添加非经典碱基。
在某些实施方案中，通过该方法合成DNA的方法包括用连接酶和ATP处理DNA。拓扑异构酶仅将DNA的一侧(另一侧基本上是有切口的)连接在一起。连接酶将修复切口并确保拓扑异构酶本身不会重新切开反应产物并切割它。
在某些实施方案中，该方法包括使用拓扑异构酶抑制剂来抑制游离拓扑异构酶与DNA寡聚体的结合和活性。合适的抑制剂包括新生霉素和香豆霉素。指出的是，完全抑制是不期望的，因为低水平的拓扑异构酶活性可以帮助“松弛”卷曲的DNA，这在合成长DNA链时尤其有用。
因此，在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于合成纳米芯片中的DNA的方法(方法2)，所述纳米芯片包含一个或多个含有负荷拓扑异构酶的寡核苷酸(即，在拓扑异构酶的3’端结合的寡核苷酸)的添加室和一个或多个包含限制性酶或解封闭剂(例如磷酸酶)的储备室，所述室还含有相容的缓冲溶液并被包含至少一个纳米孔的膜分开，其中拓扑异构酶和限制性酶被阻止通过纳米孔(例如因为它们太大和/或因为它们分别与第一和第二室中的基质连接)，合成通过将单个核苷酸或短寡核苷酸嵌端添加到具有第一端和第二端的核酸的第一端的循环来进行，其中核酸的第一端通过在添加室和储备室之间的电吸引而移动例如，在一个实施方案中如下：
(i)借助于电力将接收体DNA(例如，双链DNA)的5’端移动到第一添加室中，
(ii)在第一添加室中提供负荷拓扑异构酶的供体寡核苷酸，其中供体寡核苷酸包含拓扑异构酶结合位点，信息序列(例如，选自至少两种不同的核苷酸或序列，例如，其中一个序列对应于二进制代码中的’0’和另一个对应于’1’，和限制位点，其在限制性酶切割时将产生拓扑异构酶连接位点；
(iii)允许有足够的时间使供体寡核苷酸连接并从而延伸接受体DNA；
(iv)通过电力将接收体DNA的5’端移动到储备室中，例如，使得限制性酶切割接收体DNA以提供拓扑异构酶连接位点，或者在单个核苷酸添加的情况下，去封闭剂，例如磷酸酶，在单链DNA上产生5’未封闭的核苷酸；和
(v)重复步骤(i)-(iv)的循环，加入具有相同或不同信息序列的寡核苷酸，直至获得所需的DNA序列。
例如，本发明提供
2.1.方法2，其中接收体DNA的3’端附着于纳米孔附近，并且接收体寡核苷酸的5’端包含拓扑异构酶连接位点，并且包括在步骤(iv)之后通过冲洗第一添加室并向第一添加室提供新的负荷拓扑异构酶的供体寡核苷酸，来向接收体DNA的5’端添加另外的寡核苷酸的步骤，其中新供体寡核苷酸具有与先前供体寡核苷酸不同的信息序列；如果需要，将新的供体寡核苷酸添加到接收体DNA中，将接收体核酸的5’端拉回第一室，并重复步骤(i)-(iii)，或者如果不需要这样，则允许接收体DNA保留在第二室中，直到将所需的供体寡核苷酸提供给第一室。
2.2.任何前述方法，其中多个接收体DNA分子独立地平行合成，使得通过分别控制它们是否存在于第一室中而获得具有不同序列的DNA分子。
2.3.任何前述方法，其中各自在3’端结合到接近纳米孔的表面的多个接收体DNA分子独立地合成，其中每个纳米孔具有相关的一对电极，其中该对中的一个电极位于纳米孔一端附近和另一个电极位于纳米孔的另一端附近，使得每个接收体DNA分子可以通过由该对电极提供的电流在第一和第二室之间独立地移动。
2.4.任何前述方法，其中在该循环的步骤(i)中使用的供体寡核苷酸与包含第一信息序列的供体寡核苷酸和包含第二信息序列的供体寡核苷酸之间的每个循环交替。
2.5.方法2，其包括通过将接收体DNA的5’端返回到第一添加室以添加具有相同信息序列的寡核苷酸，或移动接收体DNA的5’端到第二添加室，使供体寡核苷酸在3’端与拓扑异构酶结合，向接收体DNA的5’端添加另外的寡核苷酸的步骤，其中第二添加室中的供体寡核苷酸与第一添加室中的供体寡核苷酸具有不同的信息序列。
2.6.任何前述方法，其中供体寡核苷酸包含如下结构：
5’CGAAGGG<信息序列A或B>GTCGACNNNNN
3’GCTTCCC<--------互补-------->CAGCTGNNNNN
其中N是指任何核苷酸，并且限制性酶是Acc1，它可以切割DNA(例如上述序列中的GTCGAC)，以便提供合适的突出端。
2.7.任何前述方法，其中供体寡核苷酸具有发夹结构，例如2.6，其中顶部和底部链上的NNNNN基团连接在一起。
2.8.任何前述方法，其中至少一种负荷拓扑异构酶的寡核苷酸具有如下结构：
5’CGAAGGG<信息序列A或B>GTCGACNNNNN
3’*TTCCC<-------互补-------->CAGCTGNNNNN
(*＝拓扑异构酶)
2.9.任何前述方法，其中至少一种负荷拓扑异构酶的寡核苷酸具有如下结构：
5’pCACGTCAGGCGTATCCATCCCTT*
3’GTGCAGTCCGCATAGGTAGGGAAGCGC
2.10.前述方法，其中负荷拓扑异构酶的寡核苷酸
2.11.任何前述方法，其中通过在寡核苷酸通过纳米孔时检测电势、电流、电阻、电容和/或阻抗的变化，在每个循环后确定合成的DNA的序列。
2.12.任何前述方法，其中DNA的合成在缓冲溶液中进行，例如包含pH7-8.5，例如约pH8的缓冲液的溶液，例如，包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，合适的酸和任选的螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液，例如含有Tris碱，乙酸和EDTA的混合物的TAE缓冲液，或包含Tris碱，硼酸和EDTA的混合物的TBE缓冲液；例如，包含10mM Tris pH 8,1mM EDTA，150mM KCl，或例如50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，pH7.9@25℃的溶液。
2.13.任何前述方法，还包括从纳米芯片中除去DNA。
2.14.任何前述方法，还包括扩增由此合成的DNA。
2.15.任何前述方法，还包括从纳米芯片中除去DNA并使DNA结晶。
2.16.任何前述方法，还包括稳定DNA，例如，通过将包含DNA的溶液与一种或多种缓冲液(例如硼酸盐缓冲液)，抗氧化剂，保湿剂，例如多元醇和任选的螯合剂(例如US8283165 B2中所述，通过引用并入本文)一起干燥，或通过在核酸和聚合物，例如聚(乙二醇)-聚(1-赖氨酸)(PEG-PLL)AB型嵌段共聚物之间形成基质。
2.17.任何前述方法，包括提供连接酶和ATP以密封DNA中的切口[NB：拓扑异构酶连接仅连接一条链]。
2.18.任何前述方法，其中负荷拓扑异构酶的供体寡核苷酸在与带有拓扑异构酶的链(包含聚肌苷序列[NB：肌苷充当’通用碱基’并与任何其他碱基配对])互补的链上包含5’突出端。
2.19.任何前述方法，其中限制性酶是IIS型限制性酶，除了单一碱基(正在“加入”的碱基)外，它可以切割所有添加的DNA。
2.20.任何前述方法，其中拓扑异构酶选自痘苗拓扑异构酶和SVF拓扑异构酶I。
2.21.任何前述方法，其中痘苗拓扑异构酶(其识别(C/T)CCTT)用于添加dTTP核苷酸和SVF拓扑异构酶I(其识别CCCTG)用于添加dGTP核苷酸，例如以提供二进制代码信息。
2.22.任何前述方法，其中储备室还包含连接酶和ATP，以修复未被拓扑异构酶连接的DNA链。
2.23.任何前述方法，包括使用拓扑异构酶抑制剂来抑制游离拓扑异构酶与DNA寡聚体的结合和活性，例如，其中抑制剂选自新生霉素和香豆霉素。
2.24.任何前述方法，其中由此提供的DNA链具有包含胸苷(T)核苷和脱氧鸟嘌呤(G)核苷的序列。
2.25.任何前述方法，其中拓扑异构酶添加单碱基，但限制性酶在从拓扑异构酶添加的碱基的5’方向上的一个核苷酸的位置切割。
2.26.任何前述方法，其中由此提供的DNA链具有包含’TT’和’TG’二核苷酸序列的序列。
2.27.任何前述方法，其是通过以3’至5’方向添加单个核苷酸来合成DNA分子的方法，包括(i)使DNA分子与带有5’保护形式(例如5’磷酸化形式)的所需核苷酸的拓扑异构酶反应，使得5’保护形式的所需核苷酸加到DNA的5’端，然后(ii)通过使用磷酸酶，使由此形成的DNA的5’端去保护，并重复步骤(i)和(ii)直至获得所需的核苷酸序列。
2.28.任何前述方法，其是通过以3’至5’方向添加寡聚体来合成DNA分子的方法，包括(i)使DNA分子与带有所需寡聚体的拓扑异构酶反应，从而将寡聚体连接至DNA分子，然后(ii)使用限制性酶为另一种寡聚体的拓扑异构酶介导的连接提供5’位点，并重复步骤(i)和(ii)直至获得所需的核苷酸序列。
2.29.任何前述方法，其是根据方法A等等任一个的方法。
可以为质量控制目的检测、检查合成反应的产物，并读取以提取聚合物上编码的数据。例如，可以通过常规手段扩增和测序DNA，以确认纳米孔测序是稳健的。
在另一个实施方案中，本发明提供了寡核苷酸，包含拓扑异构酶结合位点，信息序列(例如，选自至少两个不同的序列，例如，其中一个序列对应于二进制代码中的‘0’而另一个序列对应于‘1’)，和限制位点，其当被限制性酶切割时，将产生拓扑异构酶连接位点，例如，包含以下序列：
5’CGAAGGG<信息序列A或B>GTCGAC
3’GCTTCCC<-----互补------>CAGCTG
其中信息序列A或B是3-12，例如约8个核苷酸的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供负荷拓扑异构酶的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含拓扑异构酶结合位点，信息序列(例如，选自至少两个不同的序列，例如，其中一个序列对应于二进制代码中的’0’而另一个序列对应于’1’)，和限制位点，其当被限制性酶切割时将产生拓扑异构酶连接位点；例如，具有如下结构的负荷拓扑异构酶的寡核苷酸：
5’CGAAGGG<信息序列A或B>GTCGACNNNNN
3’*TTCCC<-----互补----->CAGCTGNNNNN
其中信息序列A或B是3-12，例如约8个核苷酸的序列，并且*是与寡核苷酸共价结合的拓扑异构酶；例如，其中拓扑异构酶是痘苗病毒拓扑异构酶I。
在某些实施方案中，使用计算机化的芯片控制器，控制纳米孔芯片以实施合成和/或读取聚合物的方法，例如，根据方法1，以及方法A等或方法2等中任一个。
例如，参见图65，示出了本公开的一些实施方案的具有选择性透明的表面的局部透视图，所述透明表面是纳米孔存储器芯片的一组基于3室纳米孔的单元6500(每个单元类似于上文讨论的单元)。特别地，一组四个3室单元6506，6508，6510，6512连接在一起，使得每个连接单元6506-6512的上(或顶部)左室6502(加“0”室)流体连接在一起以形成加“0”流动通道或加“0”室6502。此外，每个连接的单元6506-6512的上(或顶部)右室6504(加“1”室)也是流体连接在一起以形成单独的加“1”流动通道或加“1”室6504。此外，加“0”室(或通道)6502具有公共电极6520和加“1”室(或通道)具有不同的公共电极6522。在一些实施方案中，可以存在为每个添加通道提供公共电极的单个金属或导电条，并且在一些实施方案中，可以存在通过芯片内布线连接的单独电极。
在集合的添加通道6502，6504下方，是类似于上文讨论的单独的“解封闭”室6530-6536，其与其他室流体且电隔离。在每个解封闭室6530-6536的底部是对应的可单独控制的“解封闭”电极，例如，图65中可见的解封闭电极6514，6516分别对应于解封闭室6534，6536。而且，单元6506-6512的上室各自具有穿过膜6529的相应纳米孔6528。此外，在该示例中，流体单元6512具有左上部加“0”室6537和右上部加“1”室6539。用于流体单元6502-6512的加“0”室通过流体通道6502流体连接，而用于流体单元6502-6512的加“1”室通过流体通道6504流体连接，流体单元6506-6512的每一个具有独立的存储器存储串(例如，DNA或聚合物)6550，其一端穿过纳米孔6550以进入加“1”或加“0”室，并返回其相应的解封闭室6530-6536，解封闭室6530-6536与其他室(在该实例中)流体和电隔离。因此，3室流体单元6506-6512中的每一个代表独立的存储器存储单元或存储器单元(在下文中更详细地讨论)。
由于图65的配置具有连接在一起的所有加“0”电极，以及单独地连接在一起的所有加“1”电极，并且单独控制解封闭电极，所以可以在写入(或添加)“循环”中发生写入(或添加)，例如加”0”循环，此时所有需要写入“0”的单元可以同时写入，接着是”1”循环，此时所有需要写“1”的单元可以同时写入。如果需要，可以使用其他数据写循环或方法。
另外，加“0”和加“1”通道6502，6504可以从前面或后面填充流体(或漂洗，或洗涤或清空)，分别如箭头6503-6505所示，解封闭室6530-6536可以从侧面填充流体(或漂洗，或洗涤或清空)，分别如箭头6540-6546所示。不要求每个加“1”室都是流体和电连接的，或者每个加“0”室都是流体和电连接的。如果它们中的大量连接如此，则可以提供效率；通常，连接的单元越多，可实现的效率越高。
此外，可以通过将聚合物6550的一端结合(或栓系或附着)到中央解封闭室6536表面(例如，在解封闭室6536中显示为点6552)来防止整个聚合物(或DNA)或“串”或存储串6550完全离开中央解封闭室。解封闭室6536中的其他位置可用于束缚聚合物，条件是其满足所需的功能和性能要求。在一些实施方案中，结构6554(例如，珠，颗粒或折纸或其他结构)可以附着到聚合物6550的一端并且防止聚合物通过纳米孔6550离开解封闭室6536。类似的标准适用于其他解封闭室6530-6534中的聚合物存储串6550。
用于存储数据的聚合物6550可以是如本文所述的DNA，或者它可以是具有本文所述性质的任何其他聚合物或其他材料。用于存储数据的聚合物6550在本文中也可称为“记忆聚合物”或“存储串”(由于其串样的外观)。
参见图66，示出了本公开一些实施方案的具有纳米孔存储器芯片的一组基于3室纳米孔的单元6600(每个单元类似于上文所讨论的)的选择性透明表面的局部透视图。特别地，类似于图65，一组四个3室单元6606，6608，6610，6612连接在一起，使得每个室的上(或顶部)左室6602(加“0”室)流体连接在一起以形成加“0”流动通道6602。此外，每个连接的单元6606-6612的上(或顶部)右室6604(加“1”室)也是流体连接在一起以形成单独的加“1”流动通道6604。然而，在该实施方案中，与单元6606-6612相关联的加“0”室具有单独的电极6620-6626，并且与单元6606-6612相关联的加“1”室也具有单独的电极6630-6636。该流体和电极布置类似于上文中使用图27描述和示出的布置。在一些实施方案中，上室(加“0”和加“1”)可以彼此流体分离或隔离，以避免在试图控制DNA的路径时相邻的添加室之间的潜在电串扰。
此外，对于图65，即使电极被单独控制，也可以流体连接解封闭室。在那种情况下，通道之间可能存在串扰，例如，附近的DNA被相邻单元看到的电场和/或电流吸引。
在一些实施方案中，电极可以具有3D形状，例如从单元的底部上升或向下突出到单元中的三角形或金字塔形。在那种情况下，电极可以被构造成为该单元的纳米孔产生更定向的、聚焦的或更接近的电场，这可以减少流体连接但电分离的相邻单元之间的串扰。
如果存储串(或DNA或聚合物)变得如此长，则它可以从一个添加室卷绕和穿过另一个添加室的顶部。为了避免这个问题，可以沿着流动通道在相邻单元之间设置部分壁，以使相邻纳米孔之间的距离对于长DNA而言更长。
在添加室下方是公共的“解封闭”室6640，其对于所有上部添加室是共用的，类似于上文所讨论的。在公共解封闭室6540的底部是公共的解封闭电极6642。此外，单元6606-6612的上室可以各自具有纳米孔6528，类似于上文讨论的，通过膜6529。
另外，解封闭室6540可以从侧面填充流体(取决于单元的结构配置)。在一些实施方案中，它可以从左侧(或右侧)填充，如箭头6650所示。在其他实施方案中，它可以从前(或后)侧填充，如箭头6652所示。
此外，通过将聚合物6550的一端结合(或束缚)到中央解封闭室6640的表面(例如，对于单元6612显示为点6552)，可以防止整个DNA或聚合物“串”(或存储串)6550完全离开中央解封闭室。类似的布置将适用于其他单元6606-6610。如果聚合物满足所需的功能和性能要求，则可以使用其他位置来束缚聚合物。
参见图67，示出了用于本公开的实施方案的基于纳米孔的“存储器芯片”6700的示意性电路框图。具体地，存储器芯片6700可以具有多个基于纳米孔的“存储器单元”6702(或“存储器单元”或“数据存储器单元”)，每个“存储器单元”具有存储数据的能力。每个“存储器单元”6702具有基于多室纳米孔的流体单元6704，其具有与上文讨论的类似的单元结构(例如，具有带纳米孔的膜和“存储串”6550(例如，DNA或其他聚合物，如本文讨论的)。“存储器单元”6702还可以包括任何固态或半导体无源或有源电路或芯片层或组件，其与流体单元6704连接以提供本文描述的数据存储(或写入或添加)和/或数据检索(或读取或排序)功能。
存储器单元6702可以连接在一起(电地和流体地)，例如具有公共流体“添加”通道和公共“添加”电极的3室单元，以及独立的“解封闭”室，例如图65所示和所述的。如果需要，可以使用任何数量的室和本文所述的任何单元配置。
“存储器单元”6702可以被配置为M×N阵列，具有M行和N列，每个单元6702被标记为CM,N。更具体地，第一行中的单元6702标记为C1,1-C1,N，并且最后一行中的单元6702标记为CM,1-CM,N。M和N可以是提供所需功能和性能的任何值，并且M，N可以各自小到1，大到100万，1000万，1亿，10亿或1万亿或更大，具体取决于存储器芯片的所需的占位面积和每个存储器单元的尺寸。
存储器芯片6700在线6710上具有加“0”输入DC电压，其与每个加“0”电极电连接(直接或通过如本文所述的芯片上电路或部件)。线6710上的加“0”输入DC电压将加“0”电极驱动到期望的电压状态(在此讨论)，以帮助定位(或移动或操纵)存储串6550(DNA或其他聚合物，如所讨论的)到流体单元6704的期望室。在这种配置中，每个存储器单元的所有加“0”电极是共享的或共用的，或电连接的，如图65所示。
存储器芯片6700还在线6712上具有加“1”输入DC电压，线6712与每个“1”电极电连接(直接或通过如本文所述的芯片上电路或部件)。线6710上的加“1”输入DC电压将加“1”电极驱动到期望的电压状态(在此讨论)，以帮助定位(或移动或操纵)存储串6550(DNA或其他聚合物，如所讨论的)到流体单元6704的期望室。在这种配置中，每个存储器单元的所有加“1”电极6522是共享的或共用的，如图65所示。
存储器芯片6700还在多个线(或总线)6714上具有“解封闭”输入DC电压，每个线电连接(直接地或通过如本文所述的芯片上电路或部件)到每个单元6702中的相应的“解封闭”电极。解封闭输入DC电压将给定单元的相应解封闭电极驱动到期望的电压状态(在此讨论)，以帮助定位(或移动或操纵)存储串6550(DNA或其他聚合物，如本文讨论)到流体单元6704的期望室。在这种配置中，每个解封闭电极被独立驱动，如图65所示，因此需要多个电连接或总线(或解封闭总线)6714。每行存储器单元6702将具有提供的相应数量的解封闭输入DC电压线。例如，第一行存在一组N个解封闭线6716，用于对该行中的N个单元6702馈电，并且在最后一行M中，存在一组单独的N个解封闭线6718，用于对行M中的N个单元6702馈电。
分别在线6710，6712，6714上的DC输入电压加“0”，加“1”和解封闭可以在本文中称为DC“转向”电压VST(或聚合物或DNA转向电压或存储串转向电压)，因为它们用于在适当的时间将聚合物存储串“转向”到流体单元6704的适当室以实现期望的结果，例如在存储串上写入或加“0”或“1”，或什么都不做，或将存储串移动到特定的室以使得能够写入或读取数据，或执行验证测试等。分别在线6710，6712，6714上的DC输入电压加“0”，加“1”和解封闭，可以从基于计算机的控制器电路或逻辑或装置提供，如本文所述，其具有适当的用于执行本文描述的功能的逻辑。
存储器芯片6700还分别在线6720，6722上具有AC输入电压Vin和AC输出电压Vout。如本文所述，线6720上的AC输入电压Vin并联地电连接到每个存储器单元6702。AC Vin在线6720上向每个存储器单元6702提供AC信号，例如rf或射频信号，并且存储器单元被配置为谐振器或纳米孔聚合物谐振器(NPR)，其各具有响应于输入AC Vin的不同的频率，如本文所讨论的。线6720可以将存储器单元6702和/或芯片上的电子部件，电极和流体单元6704连接在其中，与图67中所示的不同，这取决于用于纳米孔聚合物谐振器的电路配置(NPR)，流体池配置，电极配置或其他因素，如本文所述。线路6720上的AC输入电压Vin可以从基于计算机的控制器电路或逻辑或装置提供，如本文所述，其具有适当的逻辑以提供适当的AC输入电压Vin并执行本文所述的功能。
来自每个存储器单元6702的组合频率响应可以被提供给芯片上放大器(或前置放大器)5320(图53)，其在线6722上提供指示组合频率响应的AC输出电压Vout。线6722上的AC输出电压Vout可以提供给基于计算机的处理电路或逻辑或装置，其具有适当的逻辑，例如模数(A/D)转换和数字信号处理(DSP)逻辑，如本文所述，其读取存储在存储串6550上的数据，并且可以执行如本文所述的其他功能。
参见图68，示出了根据本公开的实施方案，具有基于纳米孔的存储器芯片6700(图67)和存储器读取/写入控制器6802的读/写存储器存储系统6800的顶部水平硬件框图。具体地，存储器读取/写入控制器6802可以具有写入控制器逻辑6804，其接收要在线上写入存储器芯片6700的输入数据和用于在线6808上存储数据(或标签或指针等)的地址，并且分别在线6710，6712，6714上向纳米孔存储器芯片6700提供DC转向电压加“0”，加“1”和解封闭。写入控制器6804具有适当的硬件、软件和固件(包括任何基于微处理器或微计算机的处理器芯片或装置和/或存储器)根据需要提供本文所述的功能，如框6810所示。
另外，写入控制器6804还可以提供写入(或添加)循环时钟6812(或振荡器)，其确定存储器芯片6700何时写入(或添加或存储)“0”或“1”位。具体地，写入控制器芯片6804基于写循环时钟6812提供DC转向电压(加“0”，加“1”，解封闭)，以使存储器芯片6700向存储器单元写入“1”或“0”。如上面参见图65所讨论的，在某些单元配置中，例如当所有加“0”电极连接在一起时，并且单独地，所有加“1”电极连接在一起，并且解封闭电极被单独控制(例如，如图65所示)，写入(或添加)数据位可以在写入(或添加)“循环”中发生，例如加”0”循环，此时需要写入“0”的所有单元可以同时写入，然后是添加”1”循环，此时需要写入“1”的所有单元可以全部同时写入。写循环时钟在线6814上提供写循环信号，以使写请求装置或平台或计算机总线能够确定存储芯片的写状态。如果需要，可以使用其他数据写循环，定时或方法。
在一些实施方案中，写入控制器6802还可以从线路6820接收来自系统或计算机总线的控制信号，例如写请求(W-REQ)信号，以请求将某些数据写入存储器芯片6700，并且写入控制器6802还可以在线6822上提供写入(或添加)完成(W-COM)信号，以指示何时所请求的数据已被写入存储器芯片6700。
存储器读取/写入控制器6802还可以具有存储器读取控制器逻辑6850，其可以在线6852上接收读取地址(或标签或指针等)，所述读取地址对应于期望从存储器芯片6700中读取的数据的存储位置，并且在线6854上提供从存储器芯片6700读取的所请求的数据。读取控制器6850还可以具有必要的逻辑和部件，以将AC输入电压信号Vin提供给线路6720上的存储器芯片6700。如本文所述，AC输入电压Vin是AC rf(射频)信号，其具有与存储器芯片6700中的纳米孔谐振器(NPR)的带宽相对应的频率分量。为了提供Vin信号，读取控制器6850可以具有频率振荡器逻辑6858(可编程或不可编程的)，其提供必要的频率分量(在此讨论)以使读取控制器逻辑能够从纳米孔存储器芯片6700读取所请求的数据。如本文所讨论的，AC Vin信号可以直接合成，组合多个探测频率，并且可以是单个宽带信号，或时间扫描或步进频率信号，或提供本文所述功能的任何其他AC信号。
读取控制器6850还从线路6722上的存储器芯片6700接收输出AC Vout电压，并对Vout信号执行A/D转换和数字信号处理(例如，使用板载A/D转换逻辑6862和FFT逻辑6864，如本文所讨论的)以确定指定读地址处的所需数据的值，并在线6854上提供读数据输出的输出数据。
读取控制器6850具有适当的硬件、软件和固件(包括任何基于微处理器或微计算机的处理器芯片或装置和/或存储器存储器)，以提供本文所述的功能，如框6856所示。
此外，读取控制器6850还可以在线路6814上从写循环时钟6812(或振荡器)接收写入(或添加)循环时钟信号，如上所述，其确定存储器芯片6700何时将写入(或添加或存储)“0”或“1”位。具体地，控制器芯片6804将基于写循环时钟6812提供DC转向电压(加“0”，加“1”，解封闭)，以使存储器芯片6700向存储器单元写入“1”或“0”。因为利用本公开内容的写入行为需要DNA(或聚合物或存储串)穿过纳米孔进入所需的室以添加位并且还在返回时穿过纳米孔到解封闭室，读取控制器6850也可以使用写循环时钟信号来确定何时是读取数据的最佳时间，下面将参见图69进行更详细的讨论。
在一些实施方案中，读取控制器可以向写入控制器6804提供读取信号6860，以请求控制器6804在线路6710-6714上提供必要的转向电压(加“0”，加“1”，解封闭)，使存储串通过纳米孔以能够进行存储串的读取。
在一些实施方案中，读取控制器6850还可以在线6870上接收读取请求(RD-REQ)信号以请求从存储器芯片6700读取某些数据，并且读取控制器6850还可以在线路6822上提供读取完成(RD-COM)信号，以指示何时从存储器芯片6700读取所请求的数据。存储器控制器6802可以仅执行一个功能，例如，如果需要，读取或写入纳米孔芯片，或者如果需要，可以执行这两个功能(读和写)。
参见图68A，纳米孔存储器系统6800可以是更大的计算机系统的一部分，其可以与地址/数据/控制总线6870交互，并且还可以与单独的存储器控制器6876交互，所有这些存储器控制器与一个或多个CPU/处理器6874交互。例如，一个或多个读/写地址和/或数据输入，输出和/或控制线，例如图68中所示的数字6820，6822，6806，6808，6814，6852，6854，6872，6870可以从总线6872或存储器控制器6876接收或提供至总线6872或存储器控制器6876。计算机系统8670可以与用户6878和显示屏6880交互。
参见图69，根据本公开的实施方案，示出了图65中所示配置的样本DC转向电压(VST)的表6900和用于转向电压VST的相应时间图6902以及存储器芯片6700上的相关结果。特别地，表6900示出了要提供给存储器单元的相应电极的DC转向电压VST(例如，分别为加“0”，加“1”，解封闭或VST0，VST1，VSTDB)6904，基于写循环时间使得存储器芯片6700向存储器单元写入“1”或“0”，例如加“0”循环，此时可以同时写入需要写入“0”的所有单元，接着是添加“1”循环，此时需要写入“1”的所有单元可以全部同时写入。
参见图69和图65，在列6906(图69)中示出了添加“1”循环的样本转向电压，并且在列6908中示出了加”0”循环的转向电压。更具体地，在添加“1”循环期间，期望使存储串(DNA或聚合物)6550穿过纳米孔6528到达流体单元6512的加“1”室6539(图65)。可以通过使加“1”电极电压VST1接地(GND)或0伏，加“0”电极电压VST0处于负电压(相对于加“1”电压)和解封闭电极电压VSTDB处于负电压(相对于加“1”电压)，直到将“1”位写入(或添加)到串6550来完成。在写入“1”位之后，串6550可以是通过使解封闭电压变为正电压(相对于加“1”电压和加“0”电压)来拉回到解封闭室6536(为下一个写入命令做好准备)，如果它有净负电荷，将吸引存储串，如DNA。
时间曲线6902示出了加“1”和加“0”写循环的转向电压的值。在这种情况下，对于曲线6910，对于添加”1”循环，示出了对于整个添加”1”循环，加“1”电压值被保持在GND的恒定值(0伏)，曲线6912示出了对于整个添加”1”循环，加“0”电压值被保持在负电压的恒定值(例如，-1.0伏)。用于“解封闭”电压的曲线6914示出了具有两个部分6916和6920的方波，其以负电压值(如上所述)开始以从解封闭室6536(图65)释放存储串并允许存储串6550的一端从解封闭室6536穿过纳米孔6528到达加“1”室6539，其中发生加“1”位反应，如图6914所示，也用“W1”表示写入“1”位。图部分6918的第一部分(标记为“T1”)是存储串(DNA或聚合物)穿过纳米孔6528进入加“1”室6539所花费的时间，之后是在“W1”期间发生“加”化学反应。应将时间量W1设定得足够长以使“1”位加反应完成，其可具有例如约0.01-100Hz，或约10秒至100毫秒的反应时间。如果需要，可以使用添加反应的其他添加反应时间，这取决于所用的化学方法，如本文所讨论的。
接下来在解封闭时间图部分6920中，解封闭电压相对于加“1”电压变为正，其将存储串6550通过纳米孔6528拉回到解封闭室中，之后将其保持足够长以使解封闭反应发生的保持(HOLD)时间期间TH1，如本文所讨论(类似于加反应时间)。由标号6922指示的时间“T2”是存储串6550穿过纳米孔6528所花费的时间。对于该循环的该部分1920中的剩余时间(保持时间，TH1)，该串保持在解封闭中室，等待下一个写请求。因此，除了解封闭反应之外，在该保持时间期间在串上没有发生活动(NA)。
接下来，写循环重复，这次是对于加“0”循环，列6908。参见图69和图65，在列6908中示出了加“0”循环的样本转向电压。更具体地说，在加”0”循环期间，希望使存储串(DNA或聚合物)6550穿过纳米孔6528到达流体单元6512的加“0”室6537(图65)。这可能是通过将加“0”电极电压VST0接地(GND)或0伏，加“1”电极电压VST1处于负电压(相对于加“0”电压)和解封闭电极电压VSTDB处于负电压(相对于加“0”电压)，直到将“0”位写入(或添加)到串6550来完成。在写入“0”位之后，可以通过使解封闭电压变为正电压(相对于加“1”电压和加“0”电压两者)将串6550拉回到解封闭室6536(为下一个写入命令做好准备)，如果串具有净负电荷，如DNA，则会吸引存储串。
类似地，对于加”0”循环，加”0”循环的曲线6912示出了对于整个加“0”循环，加“0”电压值被保持在GND的恒定值(0伏)，图6910示出了对于整个加”0”循环，加“0”电压的值被保持在负电压的恒定值(例如，-1.0伏)。用于加”0”循环的“解封闭”电压的曲线6914示出了具有两个部分6926和6930的方波，其以负电压值(如上文所讨论的)开始以从解封闭室6536释放存储串(图65)并且允许存储串6550的一端从解封闭室6536穿过纳米孔6528到达加“0”室6537，其中发生加“0”位反应，如图6914所示，也用“W0”表示写入位“0”。图部分6924的第一部分(标记为“T3”)是存储串(DNA或聚合物)穿过纳米孔6528进入加“0”室6537所花费的时间，之后是在“W0”期间发生“添加”“0”位化学反应。应将时间量W0设定得足够长以使加反应完成，其可具有例如约10-100Hz，或约10-100毫秒的反应时间。如果需要，可以使用其他添加的添加反应时间，这取决于所用的化学方法，如本文所讨论的。
接下来在解封闭时间图部分6930中，解封闭电压相对于加“0”电压变为正，其将存储串6550通过纳米孔6528拉回到解封闭室6536中，之后将其保持足够长以使解封闭反应发生的保持(HOLD)时间期间TH2，如本文所讨论(类似于添加反应时间)。由标号6928表示的时间“T4”是存储串6550穿过纳米孔6528并重新进入解封闭室所花费的时间。对于写循环的该部分1930中的剩余时间(保持时间，TH2)，在串上发生解封闭反应(如本文所讨论的)并且将串保持在解封闭室中，等待下一个写请求。因此，除了解封闭反应之外，在该保持时间期间在串上没有发生活动(NA)。
因此，对于所描述的实施方案，解封闭电压可以控制写入“1”或“0”，释放存储串以进入相应的添加室，以及在解封闭室中写入和保持串后从室中移除存储串。因此，如果对于给定的写循环或其部分所需要，通过在循环期间调整“保持”时间，解封闭电压可以产生无活动(NA)状态或不做任何事情的状态。它还可以通过在循环期间调整写入时间W1，W0来确定写入(或添加)时间开始和结束的时间。此外，根据遍历时间T1-T4，将存储串完全穿过纳米孔，可能需要调整写入时间W1(加“1”)，W0(加“0”)以确保足够时间在添加室中执行所需的写入(或添加)反应。因此，上文讨论的读取/写入控制器6802(图68)可具有针对这些条件实时测量和调整的逻辑，用于本文或其他地方所述的流体、电极或其他配置的任何配置和实施方案。此外，遍历时间将取决于碱基数，碱基数越多，时间越长。例如，对于100K碱基，以每秒1百万个碱基(通过纳米孔的DNA的典型平均速度)穿过纳米孔，将花费约100毫秒来穿过纳米孔。进入孔也可能存在延迟，例如约100毫秒，但是可以使用其他值。
另外，在图6914上所示的遍历时间T1-T4期间，当存储串(或DNA或聚合物)穿过纳米孔时，读取/写入控制器6802可以在穿过纳米孔时读取(或排序)该位的值，如本文所讨论的。因此，对于每个写循环(加“1”循环或加“0”循环)，当系统可以读取存储在存储串上的数据时，分别有两个时间循环T1，T2或T3，T4。连续读取数据对于验证数据，提供数据的多次读取，标记数据中的错误以及其他原因可能是有用的。
关于从本公开的存储串读取数据，有许多可能的方法和因素要考虑，包括定时(例如，读取的时间和频率)，流体和电极以及其他相关配置(例如，如何提供转向信号以执行读取)和其他因素，其可以基于本文的公开内容和整个存储器系统的设计、功能和性能要求来确定。
在一些实施方案中，可以仅在没有发生写入时读取存储串(或DNA或聚合物)并且已经漂洗添加室并且移除了化学“添加”能力(例如，添加酶等)。在那种情况下，存储串可以通过读取控制器和由读取控制器存储的信息被引导进出所需的纳米孔以供以后使用。在那种情况下，读取控制器可以与另一个存储器存储装置通信，用于保存检索到的数据以供以后使用。
遍历(或传输)时间T1，T2，T3，T4使得存储串(或DNA或聚合物)穿过纳米孔(进入或离开添加室)，其可以基于存储串的长度(串上的位越多，它将花费的时间越长)和通过纳米孔的串传输速度(串移动通过纳米孔越慢，它将花费的时间越长)而变化。传输速度可以基于许多因素而变化，包括串接近纳米孔的角度，纳米孔的几何形状(锥形，圆柱形等)，与串的直径相比的纳米孔的直径(它可以沿着它的长度变化)，串中的缠结或缠绕或盘绕的数量，速度如何沿着串的长度变化，流体动力效应，与室壁的摩擦/吸引/结合，粘性效应，在液体中的声波和其他因素。
如果未准确知晓速度，则系统可能无法准确地确定具有相同位状态的长串的字中的位数，例如000000或1111111。然而，可以通过在存储串(或DNA或聚合物)上为单元写入预定的“速度校准序列”数据，例如交替1和0，即101010101010，并将其放入串中存储数据的已知或可确定的位置，例如在串的开头附近或在写入一定数量的字之后，或者在检测到具有特殊属性的“特殊”位之后，例如特别大，如以下再详细讨论，用本发明的系统或方法确定或者校准速度。当系统读取交替的“1010”模式时，它可以确定串的速度，因为它知晓模式。如果需要，这种速度校准序列可沿着存储串放置在许多位置，以实现速度的多个实时校准。
在一些实施方案中，如果在位之间存在“基线分辨率”，即，如果位信号在下一位之前返回到基线值，则可能不必校准速度。但是，如果存在长度等于或长于一位的纳米孔，则不会预期基线分辨率。在那种情况下，系统将同时读取几个位并评估该变化如何随时间变化，例如，对于序列1101110，如110011至100111至001110等。为了有效地解释该场景，期望每单位时间具有尽可能多的测量值。此外，系统可以执行相同DNA的多次读取以平均时域的至少一些可变性，其中大部分是随机的。
图69中所示的转向电压VST的样本电压值用于具有净(或总或平均)负电荷的存储串，诸如DNA的带负电的聚合物或其他带负电的聚合物。如果存储串具有净正电荷，则此处显示的值将相反。如果需要，可以基于电子电路部件和其他因素使用本文所示的存储串(或DNA或聚合物)转向电压的其他值(和极性(+/-))，条件是相对电压差足以实现期望结果。而且，转向电压VST不必具有负值和正值。仅需要由转向电压产生的相对电压差使得它们产生必要的电场力以将存储串移动通过纳米孔6528到达期望的室。
参见图70，示出了一系列时间图7000，其具有写循环图7002和对应的位时间图集7004-7012，其示出了5-位字将如何填充对应的五个不同位模式。特别地，写(或加)循环图显示方波7002，其表示加“0”循环，加“1”循环，加“0”循环等的交替重复写循环。时间图7004-7012示出了左侧的五个5位二进制数据字7020(11100，00011，01010，1111，0000)的示例，以及对应时间图7004-7012，其示出了何时使用交替写循环7002(加“1”，加“0”)方法将5位数据字7020的每个位写入单个单元中。具有“X”的单元表示何时每个数据字7020将被完全写入单元，如箭头7014所示。对于数据11100，它用9个循环写入，数据00011用8个循环写入，数据01010用5个循环写入，1111用10个循环写入，以及数据0000用9个循环写入。因此，如果将每个字写入给定单元，写入相同数量的位的写循环数(或时间)可以根据字中1和0的模式而变化。在这个例子中，写循环的数量从5个循环到10个循环不同(即，从位数到该位数的两倍)。
然而，如果并行写入(或添加)单元，即，将每个位分配给不同的单元并同时写入，则写循环的最大数量将为2，并且最小数量将为1，与位数或位模式无关。因此，如果写入速度很重要并且使用具有交替写循环的实施方案，则将要写入并行单元的数据格式化而不是将数据字串行写入单个单元可能是有利的。因此，对于一些实施方案，在写循环管理和数据存储器单元格式之间可能存在折衷。
参见图70A，根据本公开的实施方案示出了用于写入位的读/写存储控制器6802(图68)的写/Vst CNTRL逻辑6804的流程图7030。过程/逻辑7030在框7032开始，检查写循环是否为加“0”循环。如果不是，则该过程进入框7034，其检查写循环是否为加“0”循环。如果不是，则退出该过程。如果框7034的结果为是，则框7036将转向电压VST设定为图69所示的值，例如VST1＝GND；VST0＝负。接下来，框7038检查要写入的下一位数据是否为“1”。如果为否，则该过程退出。如果是，则框7040设置VSTDB＝负，以将存储串(或DNA或聚合物)释放到加“1”室中，持续时间t＝T1+W1，如图69所示。然后，这个时间过去后，逻辑设置VSTDB＝正，将存储串从添加室拉出到解封闭室，然后过程退出。
如果框7032的结果为是，则写循环处于加“0”循环，并且框7042将VST设置为图69中所示的值，例如，VST1＝负；VST0＝GND。接下来，框7044检查要写入的下一位数据是否为“0”。如果否，则该过程退出。如果是，则框7046设置VSTDB＝负，以将存储串(或DNA或聚合物)释放到加“0”室中，持续时间t＝T3+W0，如图69所示。然后，这个时间过去后，逻辑设置VSTDB＝正，将存储串从添加室拉出到解封闭室，然后该过程退出。过程7030连续重复以寻找下一个写循环并相应地做出响应。
参见图70B，示出了针对图66中所示的纳米孔存储装置单元配置写入“1”和“0”的步骤的表，具体地，在解封闭室底部具有公共电极和在顶部添加室的独立可控电极的单元。对于每种类型的写入，列7082中示出了四个步骤，对于写入控制器，在列7084中示出了相应的控制器动作，并且在列7076中示出了相应结果，解释了对该特定步骤在芯片内部发生的事情。
参见图71，数据如何被存储的格式可以基于各种因素和设计标准而变化。特别地，存储串(或DNA或聚合物)6550可以示为线7102，其上是一系列椭圆，指示在给定存储器单元中的存储串6550上写入(或添加)的各个“位”。在一些实施方案中，可以一个接一个地写入位7104以构建“存储字”。第一示例数据格式7110示出了存储字7112的三个组件，地址部分7106，数据部分7108和错误检查部分7110。地址部分7106是存储器系统用于定位所需数据的标签或指针。与其中计算机存储总线上的硬件地址线将寻址唯一的存储器位置的传统的半导体存储器存储不同，本公开的存储器芯片和系统要求地址(或标签)是存储的数据的一部分并指示想要检索的数据的位置。在图71所示的示例中，地址位于数据附近或紧接该数据，以及错误检查数据，例如奇偶校验，校验和，纠错码(ECC)，循环冗余校验(CRC)或任何其他形式的错误检查和/或安全信息，包括加密信息。在存储字7112中，组件地址7106，数据7108，错误检查7110中的每一个在存储串中彼此相继定位。由于每个组件具有已知长度(位数)，例如地址＝32位，数据＝16位，错误检查＝8位，每个存储字7112及其组件可以通过计数位数来确定。
另一示例数据格式7120示出了相同的三个组件，地址部分7106，数据部分7108和错误检查部分7110。然而，在每个部分之间存在“特殊位或序列”部分S1，S2，S3，分别表示为数字7122，7124，7126。这些特殊位S1，S2，S3可以是指示接下来将进入哪个部分的预定系列位或代码，例如，1001001001可以指示接下来是地址，其中10101010可以指示接下来是数据，并且1100110011可以指示接下来是错误检查部分。在一些实施方案中，特殊位可以是附着于串的不同分子位或位结构，例如哑铃，花或当其通过纳米孔时易于定义的其它“大”分子结构。如上所述，它不是大，而是可以具有其他分子性质，所述性质可以提供与1位和0位不同的电容或谐振的独特变化。
另一示例数据格式7130仅示出没有地址组件的数据组件7140，以及错误检查组件7110。在该结构中，该字符串仅保存“数据”组件而没有地址组件，其可以存储在其他串中，如下所述。在该示例中，还存在特殊位S1，S2，S3，分别如数字7132，7134，7136所示。类似于示例7120，这些特殊位S1，S2，S3可以是预定的一系列位或代码，其指示数据部分之间的分离并指示何时接下来是错误检查部分，或者可以是附着于串的不同分子位或位结构，当其穿过纳米孔时易于定义，如上所述。
参见图72，示出了单行存储器单元7202-7208，其中样本存储串7210-7216分别与每个单元相关联。本公开的存储器系统与传统的半导体存储器明显不同，因为代替存储单个信息位(1或0)的每个存储器单元，本公开的每个存储器单元可以存储大量数据。因此，如果传统的半导体存储器被视为2D阵列，则本存储器系统是3D阵列，其中阵列中的每个存储器单元位置具有显著的存储深度。这为如何存储数据和检索数据提供了大量选项。
对于图72中所示的示例，每个单元可以存储线性自包含信息串(存储字)，类似于图71的示例7110中讨论的信息。在这种情况下，每个存储字在其他存储字上背靠背来存储。并且该行中的每个单元7202-7208复制该结构，并且对于多行(未示出)重复该结构。
参见图73，在一些实施方案中，一些单元可以仅存储地址信息，并且一些单元仅存储数据信息。在那种情况下，每行可以具有单元，例如单元1，7310，其具有地址或指针的存储串7302，并且该行的其余部分(例如，单元2-单元N，7310-7316)分别具有相应的数据串7304-7308。在这种情况下，地址或指针将具有指示数据存储在存储器芯片上的位置的值，例如行，列和条目号，例如，第3行，第8列，条目50，意味着对应于该地址的数据驻留在第3行和第8列中的第50个数据块。这有效地将地址与物理上紧邻数据的位置脱钩，这可以提供存储的灵活性。而且，每个串可以具有一个或多个错误检查或安全组件，以验证存储在串上的信息。这可以针对阵列中的每一行重复。
参见图74，代替将信息连续地(或串行地)存储在给定的存储串上，数据可以并行地存储在存储器单元阵列中。例如，当存储存储字时，它可以在单个存储操作中更快地存储，将其存储在阵列中，类似于传统半导体存储器的工作方式，但由于3D深度允许它一遍又一遍地执行，每次将另一个存储字“推”(存储)到串上。这种格式还能够快速并行检索给定的存储字(一旦定位)。在那种情况下，某些单元7402可以被分配用于存储地址/指针，某些单元7204可以被分配用于存储并行数据，并且某些单元7406可以被分配用于存储错误检查和安全数据。例如，图72中所示的存储字7210(其串联存储在一个串上)可以如存储字7410所示存储，具有地址1，数据1和错误检查1，并且在多个单元(1-N，N+1到M，以及M+1到P)间并行地存储。类似地，对于存储字7412，其将与存储字7410并行地堆叠在相同的串上(取决于串上的存储方向，在下面或顶部)。在一些实施方案中，数据可以并行存储在2维中，从而创建存储信息的分层2D阵列，例如可以存储多层2D图像捕获数据，除了允许实时存储2D图像之外，每个2D快照分层在之前的快照上。
位可以是二进制位；然而，它们不限于任何碱基编号系统，因为本公开允许存储器棒写入(或添加)多于两个不同的值，如本文所述。在这种情况下，将相应地调整单元设计。例如，对于碱基-4系统(例如，GCAT，用于基于DNA的系统)，将存在4个添加室和单个解封闭室，如本文所述。这可以扩展到大于2的任何碱基系统，例如3，4，5，6，7，8，9，10(十进制)或更多，最多N。其中将有N个添加室和1个解封闭室。唯一的限制是室的取向使得存储串(或DNA或聚合物)可以到达所有添加室。
这里使用的术语“数据”包括所有形式的数据，包括可以存储在存储器中的表示地址(或标签或指针，包括物理或虚拟)的数据，任何类型的机器代码(包括但不限于目标代码，可执行代码等)，错误检查，加密，库，数据库，堆栈等。在某些例子中，例如图71-74(或上下文暗示的其他地方)中，术语“数据”可以被示出或描述为与“地址”或“错误检查”分开。在这些情况下，仅为了说明目的，这些术语可用于显示不同形式的数据。
芯片流体仪器和控制：参见图75，纳米孔芯片6700(图67)可以与读/写存储器控制器6802相互作用，如上文用图68所讨论的，其可以控制电压(AC和DC)以引导或控制聚合物来在存储串上添加位和/或读取位，如线7504总体所示。存储器芯片还可以与线7506上的仪器7502接口，其可以向存储器芯片提供流体，例如用缓冲液，酶和/或聚合物或DNA(或其他存储串)填充芯片，如本文所讨论的。仪器7502和存储器控制器6802可以被控制或从计算机系统6870接收命令，例如在图68A所描述和示出的，可以与用户6878交互并且可以具有显示器6880。计算机系统6870可以是通过计算机总线6872(图68)与读/写存储器控制器6802和仪器7502交互。仪器7502具有必要的电子装置，计算机处理能力，接口，存储器，硬件，软件，固件，逻辑/状态机，数据库，微处理器，通信链路，显示器或其他视觉或音频用户界面，打印装置和任何其他输入/输出接口，包括足够的流体和/或气动控制，供应和测量能力，以提供功能或实现本文所述的结果。
特别地，仪器可以利用存储芯片执行以下流体动作：首先通过毛细管作用和/或微泵向芯片填充必要的流体，酶，试剂，DNA等。对于其中添加1和添加0具有流通通道和解锁为隔离的室的实施方案，可以首先一起填充解封闭室(通过毛细管作用)，然后密封的-水和缓冲液将进入添加室，然后可以用它们的酶/缓冲液填充添加室或解封闭室可以通过有靶向添加(例如喷墨)单独填充并干燥和密封。在这种情况下，可以在真空下填充添加室以确保没有气泡被捕获在解封闭室中，或者可以用允许气体但不允许水通过的材料(例如PDMS)密封解封闭室。而且，可以通过在组装期间使单元的底部保持打开以及将单元底部放置在期望的流体中来填充解封闭室，并且流体将通过毛细管作用吸走到解封闭室中。
有各种将实现流体填充和漂洗的所需结果的流体设计。例如，加“0”通道和加“1”通道可以分别以连续的蛇形(前后)图案连接在一起(如同通道一样)，并且从通道上方的层通过通孔供给流体。通孔可以通过足以向通道供应所需流体的标准流体接口连接到仪器。在一些实施方案中，每个添加通道可以通过单独的通孔从用于加“0”通道的公共存储器和从位于通道上方的层上的加“1”通道的单独的公共存储器馈送。如果需要，可以使用任何其他流体设计。添加通道的样本尺寸为：从芯片的一侧到另一侧的宽度为约100nm至约10微米，高度为约1微米至约50微米，长度为约100mm(1cm或1000微米)。蛇形连接通道将是其倍数，取决于串联连接的通道数量。
如果需要，还可以在初始化和单元测试期间使用仪器7502。例如，对于单元初始化和单元测试，用于纳米孔质量的质量控制(QC)以确保观察到预期电流(电流与孔径成比例)。此外，用于DNA存在的QC：确保预期的电流(或电容或阻抗，或谐振的幅度或相位的变化，如本文所讨论的)改变移动通过纳米孔的DNA(或聚合物等)的特征(例如，预期的电流减小，或谐振的幅度或相位的变化，如本文所讨论的)。另外，它可以用于电路形成的QC，其类似于对纳米孔质量进行的电路形成。
仪器7502还可以用于DNA添加，如本文先前所述，其中通过添加室(或通道)之一引入具有折纸的DNA，可以将电流施加到单元直到检测到插入，在解封闭室中的修饰的DNA端扩散然后附着到表面，并且向添加室引入限制酶以切割折纸，然后通过缓冲液流去除折纸。
在另一个实施方案中，本发明提供如上所述的单链或双链DNA分子，其中单链或编码序列基本上由非杂交碱基组成，例如腺嘌呤和胞嘧啶(A和C)，其顺序排列以对应于二进制代码，例如，用于数据存储方法。例如，本发明提供DNA(DNA 1)，其中DNA是单链或双链，至少1000个核苷酸长，例如1000-1,000,000个核苷酸，或例如5,000到20,000个核苷酸长，其中核苷酸的序列对应二进制代码；例如，
1.1.DNA 1，其中DNA是单链的。
1.2.DNA 1，其中DNA是双链的。
1.3.任何前述DNA，其中单链或编码链中的核苷酸选自腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸，例如，选自腺嘌呤和胞嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。
1.4.任何前述DNA，主要由非杂交核苷酸组成，因此当以单链形式时它不会形成显著的二级结构。
1.5.任何前述DNA，其中核苷酸至少为95％，例如，99％，例如100％腺嘌呤和胞嘧啶核苷酸。
1.6.任何前述DNA，包含被添加以分离或标记包含二进制代码的核苷酸的核苷酸或核苷酸序列，例如，以分离1和0或1和0的组，使得可以更容易地读取连续的1或0。
1.7.任何前述DNA，其中(a)二进制代码中的每个位对应于单个核苷酸，例如，1和0中的每一个对应于A或C；或者(b)二进制代码中的每个位对应于一系列超过1个核苷酸，例如2、3或4个核苷酸，例如AAA或CCC。
1.8.任何前述DNA，它是结晶的。
1.9.任何前述DNA，其以干燥形式与一种或多种缓冲盐(例如硼酸盐缓冲液)，抗氧化剂，保湿剂，例如多元醇和任选的螯合剂(例如US 8283165B2中所述，通过引入并入本文)一起；和/或在核酸和聚合物之间的基质中，例如聚(乙二醇)-聚(1-赖氨酸)(PEG-PLL)AB型嵌段共聚物；和/或与互补核酸链或结合DNA的蛋白质一起提供。
1.10.任何前述DNA，含有识别序列。
1.11.任何前述DNA，含有PCR扩增序列。
1.12.任何前述DNA，含有一个或多个校准序列，例如，可用于校准基于纳米孔的测序装置的已知核苷酸序列，例如，测量通过纳米孔的DNA通道的速度或可归因于通过纳米孔的不同核苷酸的电容或电流的相对影响。
1.13.任何前述DNA，含有末端连接基团，使其能够锚定在基于纳米孔的装置(例如Nanochip 1等)中的纳米孔附近的表面上，间隔序列，其足够长以允许DNA链到达纳米孔时锚定于表面，数据存储序列，其中所述序列编码数据、密码子或其他信息，以及任选的限制酶序列，其使DNA能够一旦在合成后被切割和检索。
1.14.任何前述DNA，由方法1等或方法2等或方法A等中的任何一种制备。
在另一个实施方案中，本发明提供任何DNA 1等在用于存储信息的方法中的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了单链DNA在用于存储信息的方法中的用途，例如，其中所述序列基本上是非自杂交的。
可以制造纳米芯片，例如如图23-29所示。例如，在一种形式中，每个聚合物链与两个或四个添加室相关联，其中两个添加室形式可用于编码聚合物中的二进制代码，并且四个添加室形式对于制备定制DNA序列特别有用。每个添加室包含可单独控制的电极。添加室含有在缓冲液中将单体添加到聚合物中的试剂。添加室由包含来自储备室的一个或多个纳米孔的膜隔开，所述储备室可以是多个添加室共用的，并且其包含去保护试剂和缓冲液，以使添加室中添加的受保护单体或寡聚体去保护。纳米芯片包括多个添加室组，以允许许多聚合物的平行合成。
例如，在一些实施方案中，本公开的基于纳米孔的存储装置可以在抛光的单晶硅晶片(例如，约400微米厚)上制造。通过例如低压化学气相沉积或其他类似技术将约200nm厚的氮化硅层沉积在硅晶片的两侧上。接下来，在单晶硅晶片的顶侧上沉积例如约5微米厚的二氧化硅层，然后抛光。接下来，在二氧化硅层的顶部，沉积薄(例如，约5nm)氮化硅层。然后，沉积一层二氧化硅(例如，约5微米)。在二氧化硅层的顶部，沉积一层氮化硅，例如约200nm厚。接下来，通过蚀刻通过顶层氮化硅和通过二氧化硅，在沟道底部暴露出薄的氮化硅层，产生流体“加”通道。这些通道将成为“加1”和“加0”通道。另一个硅晶片(约300微米厚，具有填充有导电金属的绝缘(使用例如二氧化硅)通孔用作布线)与原始硅晶片和粘合在一起的晶片对准。然后从装置底部通过氮化硅然后硅层蚀刻粘合的晶片。此后，在二氧化硅中蚀刻各个解封闭室，暴露出薄的氮化硅层。然后使用电子束或其他适当的技术在薄氮化硅层中的适当位置产生纳米孔。附加的硅晶片(约300微米厚，具有填充有导电金属的绝缘(例如，通孔，例如二氧化硅)通孔用作布线)与粘合的晶片的底部对准并粘合。通过蚀刻或钻入装置的顶层，通过流体通道引入流体入口和出口。可以在装置的顶部和底部表面上接近到嵌入装置内的电极的连接(其内部连接到流体通道和解封闭室)。
高带宽和低噪声纳米孔传感器和检测电子器件对于实现单DNA碱基分辨率是重要的。在某些实施方案中，纳米芯片与互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片电连接。固态纳米孔可以集成在CMOS平台内，紧邻偏置电极和定制设计的放大器电子器件，例如，如Uddin等人，“Integration of solid-state nanopores in a 0.5μm cmos foundry process”,Nanotechnology(2013)24(15):155501所述，其内容通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于合成和/或测序带电聚合物(例如DNA)的纳米芯片(纳米芯片1)，包含至少两种不同的单体，所述纳米芯片包含至少第一和第二反应室，由包含一个或多个纳米孔的膜隔开，其中每个反应室包括一个或多个电极以将带电聚合物吸入室中，并且还包含电解介质和任选的用于将单体添加到聚合物中的试剂，例如，
1.1.纳米芯片1，其中纳米孔的直径为2-20nm，例如2-10nm，例如2-5nm。
1.2.任何前述纳米芯片，其中纳米芯片的反应室的一些或所有壁包含硅材料，例如硅，二氧化硅，氮化硅或其组合，例如氮化硅。
1.3.任何前述纳米芯片，其中纳米芯片的反应室的一些或所有壁包含硅材料，例如硅，二氧化硅，氮化硅或其组合，例如氮化硅，并且一些或所有纳米孔是由离子轰击制成。
1.4.任何前述纳米芯片，其中一些或所有纳米孔在膜，例如脂质双层中包含成孔蛋白α-溶血素。
1.5.任何前述纳米芯片，其中反应室的一些或所有壁被涂覆以最小化与试剂的相互作用，例如涂覆有聚合物例如聚乙二醇，或涂覆有蛋白质，例如牛血清白蛋白。
1.6.任何前述纳米芯片，包含电解质介质。
1.7.任何前述纳米芯片，包含电解质介质，所述电解质介质包含缓冲液，例如pH7-8.5，例如约pH8的缓冲液，例如，包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，合适的酸和任选的螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))的缓冲液，例如含有Tris碱，乙酸和EDTA的混合物的TAE缓冲液，或包含Tris碱，硼酸和EDTA的混合物的TBE缓冲液；例如，包含10mM Tris pH 8,1mMEDTA，150mM KCl，或例如50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，pH7.9@25℃的溶液。
1.8.任何前述纳米芯片，包含用于向聚合物中添加单体的试剂。
1.9.任何前述纳米芯片，能够合成(“书写”，例如，通过将单体或单体组依次添加到聚合物中)和测序(“读取”，例如，通过测量单体通过纳米孔时的电流和/或电感的变化)聚合物。
1.10.任何前述纳米芯片，其中包含一个或多个纳米孔的膜在两侧包括金属表面，金属表面由绝缘体，例如氮化硅膜隔开，金属表面例如通过光刻装置配置，以在每个纳米孔的任一端提供电极，例如，使得可以经电解质介质通过纳米孔建立穿过纳米孔的电流，例如，使得电流可以通过纳米孔吸取聚合物并且当聚合物通过纳米孔时，可以测量穿过纳米孔的电势变化并将其用于鉴定聚合物中单体的序列。
1.11.任何前述纳米芯片，包含带电聚合物，所述带电聚合物是DNA。
1.12。任何前述纳米芯片，包含带电聚合物，所述带电聚合物是单链DNA(ssDNA)。
1.13.任何前述纳米芯片，包含带电聚合物，所述带电聚合物是包含预定限制位点的DNA。
1.14.任何前述纳米芯片，包含带电聚合物，所述带电聚合物是DNA，其中所述DNA是如以上DNA 1等中任何一项所述的DNA。
1.15.任何前述纳米芯片，包含带电聚合物，所述聚合物是DNA，其中DNA包含至少95％，例如99％，例如100％腺嘌呤和胞嘧啶。
1.16.任何前述纳米芯片，包含带电聚合物，所述聚合物是DNA，其中DNA仅包含腺嘌呤和胞嘧啶。
1.17.任何前述纳米芯片，包括一个或多个端口，以允许引入和冲洗出缓冲液和试剂。
1.18.任何前述纳米芯片，包含缓冲溶液，例如包含pH7-8.5例如，约pH8的缓冲液的溶液，例如，包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，合适的酸和任选的螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液，例如含有Tris碱，乙酸和EDTA的混合物的TAE缓冲液，或包含Tris碱，硼酸和EDTA的混合物的TBE缓冲液；例如，包含10mM Tris pH 8,1mM EDTA，150mM KCl，或例如50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，pH7.9@25℃的溶液。
1.19.任何前述纳米芯片，其是或能够被冻干用于存储并随后再水化，例如，其中纳米芯片的结构包含可水合或水可渗透的聚合物。
1.20.任何前述纳米芯片，其以干燥形式合成，例如，其中纳米芯片的结构包含可水合或水可渗透的聚合物，然后在使用前水合，任选地一旦写入过程完成就冻干以长期存储。
1.21.任何前述纳米芯片，其中带电聚合物，例如DNA，用组蛋白稳定。
1.22.任何前述纳米芯片，其中内表面带正电荷。
1.23.任何前述的纳米芯片，其中电极可操作地连接在能够经纳米孔提供射频脉冲直流电的电容电路中，例如频率为1MHz至1GHz，例如，50-200MHz，例如约100MHz，例如其中脉冲直流电可以通过纳米孔吸引带电聚合物，并且当带电聚合物通过纳米孔时，可以测量经纳米孔的电容变化来确定单体序列。
1.24.任何前述纳米芯片，包括储备室或解封闭室，其包含在添加室之一中添加单体或寡聚体后用于聚合物去保护的试剂。
1.25.任何前述纳米芯片，包括多对添加室。
1.26.任何前述纳米芯片，包括通过晶片键合连接的电控制层，流体层和电接地层，例如，如图24所示。
1.27.任何前述纳米芯片，其中纳米孔通过用FIB，TEM，湿法或干法蚀刻钻孔制成。
1.28.任何前述纳米芯片，其中包含纳米孔的膜为1原子层至30nm厚。
1.29.任何前述纳米芯片，其中包含纳米孔的膜由SiN，BN，SiOx，石墨烯，过渡金属二硫属化物，例如，WS2或MoS2制成。
1.30.任何前述纳米芯片，包括由金属或多晶硅制成的布线。
1.31.任何前述纳米芯片，其中通过3D堆叠增加布线密度，通过电介质沉积(例如，通过PECVD，溅射，ALD等)提供电隔离。
1.32.任何前述纳米芯片，其中与加料室添加室中的电极的接触触点是使用穿透硅通孔(TSV)通过深反应离子蚀刻(DRIE)制造的，例如，使用低温或BOSCH工艺，或通过湿硅蚀刻。
1.33.任何前述纳米芯片，其中对每个添加室中的电极的单独电压控制允许每个添加室中的电极被单独控制和监控。
1.34.任何前述纳米芯片，其中每种聚合物与第一添加室，第二添加室和解封闭室相关联。
1.35.任何前述纳米芯片，其中一个或多个室具有流体流动。
1.36.任何前述纳米芯片，其中一个或多个室是流体隔离的。
1.37.任何前述纳米芯片，其中解封闭室具有流体流动。
1.38.任何前述纳米芯片，其中添加室具有共同的流体流动。
1.39.任何前述纳米芯片，其中室之间的布线在相似类型的室之间是共同的(例如在第一添加室之间，第二添加室之间以及解封闭室之间)。
1.40.任何前述纳米芯片，其中添加室具有单独的电压控制，并且解封闭室具有共同的电接地。
1.41.任何前述纳米芯片，其中解封闭室具有单独的电压控制，第一添加室具有共同的电接地，第二添加室具有共同的电接地。
1.42.任何前述纳米芯片，其中纳米芯片通过晶片键合制造，并且在键合之前用所需的试剂预填充室。
1.43.任何前述纳米芯片，其中一个或多个内表面被硅烷化。
1.44.任何前述纳米芯片，具有一个或多个用于引入或移除流体的端口。
1.45.任何前述纳米芯片，其中室中的电极被限制而不与带电聚合物直接接触，例如，其中电极放置得离纳米孔太远而不能通过与纳米孔相邻的表面结合的带电聚合物到达，或者其中电极受到允许水和单原子离子(例如，Na+，K+和Cl-离子)通过但不会使聚合物或单体或寡聚体试剂通过以与聚合物连接的材料的保护。
1.46.任何前述纳米芯片，其与互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片电连接。
1.47.任何前述纳米芯片，其可操作地连接到芯片控制器，如上所述。
例如，在一个实施方案中，本发明提供了一种纳米芯片，例如，根据Nanochip 1等中的任一种，用于对包含至少两个不同单体的带电聚合物(例如DNA)进行测序，所述纳米芯片包含至少第一和第二反应室，所述反应室包括电解质介质并由包含一个或多个纳米孔的膜隔开，其中每个反应室包括设置在膜的相对侧上的至少一对电极，其中电极在能够经纳米孔提供射频脉冲直流电的电容电路中可操作地连接在一起，例如，频率为1MHz至1GHz，例如，50-200MHz，例如约100MHz，例如其中脉冲直流电可以通过纳米孔吸引带电聚合物，并且当带电聚合物通过纳米孔时，可以测量经纳米孔的电容变化来确定单体序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种读取带电聚合物的单体序列的方法，所述带电聚合物包含至少两种不同类型的单体，例如DNA分子，所述方法包括在纳米孔中施加射频脉冲直流电，例如频率为1MHz至1GHz，例如50-200MHz，例如约100MHz，其中脉冲直流电流通过纳米孔吸引带电聚合物，并且当带电聚合物通过纳米孔时通过测量纳米孔上的电容变化来读取单体序列，例如其中电路是谐振电路，并且通过检测谐振频率的变化来检测电容变化。
例如，在特定实施方案中，本发明提供基于纳米孔的装置(装置1)，例如，根据纳米芯片1等的任何一种纳米芯片，其能够读取聚合物中存储的数据，该装置包括：
a.具有电感器和单元的谐振器，该单元具有纳米孔和可以穿过纳米孔的聚合物，该谐振器响应于探测频率下的AC输入电压而具有探测频率的AC输出电压频率响应；
b.AC输入电压源，被配置为提供至少探测频率的AC输入电压；和
c.监视装置，被配置为至少在探测频率下监视AC输出电压，探测频率下的AC输出电压指示在监视时存储在聚合物中的数据。
例如，在装置1的某些实施方案中，聚合物包含至少两种具有不同性质的单体，在探测频率下引起不同的谐振频率响应，所述响应指示至少两种不同数据位，例如，两种不同的DNA核苷酸或寡核苷酸；和/或电感器与有效电容串联连接以产生谐振器，电感器和有效电容的组合与探测频率下的谐振频率响应有关。
例如，在一个具体实施方案中，本发明提供了一种方法(方法3)，用于读取存储在聚合物中的数据，例如，结合方法1等，以及方法A等，或方法2等中的任何一种，例如，使用根据纳米孔1等或装置1等中任一项的装置，包括：
a.提供具有电感器和单元的谐振器，该单元具有纳米孔和可以穿过纳米孔的聚合物，该谐振器响应于探测频率下的AC输入电压而具有在探测频率下的AC输出电压频率响应；
b.提供至少具有探测频率的AC输入电压；和
c.至少在探测频率下监测AC输出电压，探测频率下的AC输出电压指示在监测时存储在聚合物中的数据；例如，
3.1.方法3，其中聚合物包含至少两种不同类型的单体或寡聚体，其具有引起不同谐振频率响应的不同性质。
3.2.方法3.1，其中至少两种不同类型的单体或寡聚体包含至少第一单体或寡聚体，其具有当第一单体或寡聚体在纳米孔中时引起第一谐振频率响应的第一性质，和具有第二性质的第二单体或寡聚体，当第二单体或寡聚体在纳米孔中时所述第二性质引起第二谐振频率响应。
3.3.方法3.2，其中探测频率下的第一频率响应的特征不同于探测频率下的第二频率响应的相同特征。
3.4.方法3.3，其中第一和第二频率响应的特征包括幅度和相位响应中的至少一种。
3.5.方法3.4，其中单体的第一性质和第二性质包括介电性质。
3.6.任何前述方法，其中第一和第二单体或寡聚体各自包含多种单体或寡聚体。
3.7.任何前述方法，其中单元至少包括顶电极和底电极，纳米孔设置在电极之间，并且单元中具有流体，并且其中电极，纳米孔和流体具有在聚合物通过纳米孔时改变的有效单元电容。
3.8.任何前述方法，其中电感器与有效电容串联连接以产生谐振器，电感器和有效电容的组合与谐振频率响应有关。
3.9.任何前述方法，其中聚合物通过施加到电极的DC转向电压移动通过纳米孔。
3.10.任何前述方法，其中单元具有至少三个室，至少两个纳米孔和至少三个电极，用于使聚合物移动通过纳米孔。
3.11.任何前述方法，其中至少两种单体指示至少两个不同的数据位。
3.12.任何前述方法，其中多个单体表示一个数据位。
3.13.任何前述方法，其中聚合物包含DNA，并且其中DNA包含碱基，至少两个碱基在探测频率下提供独特的频率响应。
3.14.任何前述方法，其中探测频率为约1MHz至1GHz。
3.15.任何前述方法，其中至少两种单体具有影响谐振器的频率响应的介电性质，以在探测频率产生至少两种不同的频率响应。
3.16.任何前述方法，其中聚合物包含DNA，并且序列编码蛋白质或生物学功能性RNA，例如mRNA。
3.17.任何前述方法，其中序列编码计算机可读数据，例如，二进制，三进制或四进制编码。
3.18.任何前述方法，其是读取或确认根据方法1等，方法A等或方法2等中任一方法测序的聚合物序列的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于在基于纳米孔的芯片中原位存储和读取聚合物上的数据的方法，包括：
a.提供具有至少三个室的单元，包括加“1”室，其布置成向聚合物加“1”位，加“0”室，其布置成向聚合物加“0”位，以及“解封闭”室，其布置成当聚合物分别进入加”1“或加”0“室时，使聚合物能够接收”1“位和”0“位；
b.依次将聚合物从“解封闭”室通过纳米孔基于预定的数字数据模式引导至加“1”室或加“0”室以在聚合物上产生数字数据模式；和
c.使用芯片上的纳米孔-聚合物谐振器(NPR)的谐振频率响应，例如使用根据方法3的方法，等等，在聚合物通过纳米孔时读取存储在聚合物上的数字数据。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用纳米芯片，例如纳米芯片1等中的任何一种制备包含至少两个不同单体或寡聚体的带电聚合物，例如DNA的数据存储和装置的方法，其中单体或寡聚体按顺序排列以对应于二进制代码，例如，根据任何前述方法1和/或2等。
例如，在一个实施方案中，包含如此合成的聚合物的纳米芯片提供数据存储装置，因为可以激活纳米芯片并且通过在任何时间使其通过非孔来检测聚合物的序列。在其他实施方案中，将聚合物从纳米芯片中移出，或扩增并从纳米芯片中取出扩增的聚合物，存储直至需要，然后使用常规测序仪，例如常规纳米孔测序装置读取。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种存储信息的方法，包括合成DNA 1等中的任何一种，例如，根据方法1等或方法2等的任何一种方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种使用纳米孔测序仪，例如使用如本文所述的纳米芯片1等，读取二进制代码(例如，在DNA 1等中的任一种上编码的)的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供任何前述方法，其中使用酶来擦除纳米芯片，所述酶裂解带电聚合物，例如脱氧核糖核酸酶(DNA酶)以水解DNA。
本文描述的所有尺寸是针对本公开的示例性实施方案示出的，如果需要，可以使用其他尺寸、几何形状、布局和取向，只要它们提供本文所述的功能。
此外，本公开不限于与基于DNA的数据存储一起使用，并且可以与任何类型的分子数据存储一起使用，例如具有实现本文所描述的功能或性能的必要属性的任何聚合物或其他材料。
这里描述的任何自动或半自动装置或组件可以是计算机控制的装置，其具有必要的电子装置，计算机处理电源，接口，存储器，硬件，软件，固件，逻辑/状态机，数据库，微处理器，通信链接，显示器或其他视觉或音频用户界面，打印装置和任何其他输入/输出接口，包括足够的流体和气动控制，供应和测量能力，以提供功能或实现本文所述的结果。除非在此明确或隐含地指示，否则本文描述的过程或方法步骤可以在一个或多个通用计算机上执行的软件模块(或计算机程序)内实现。可替代地，可以使用特别设计的硬件来执行某些操作。另外，本文描述的计算机或基于计算机的装置可以包括能够执行本文描述的功能的任何数量的计算装置，包括但不限于：平板电脑，膝上型计算机，台式计算机等。
尽管本文已使用用于实施本公开的示例性技术，算法或过程来描述本公开，但所属领域的技术人员应了解可以使用或执行其他技术，算法和过程或所述技术的其他组合和顺序，其实现本文描述的相同功能和结果，并且包括在本公开的范围内。
本文提供的过程流程图中的任何过程描述，步骤或框指示一种可能的实施方案，并且替代实施方案包括在本文描述的系统和方法的优选实施方案的范围内，其中如本领域普通技术人员所理解的，取决于所涉及的功能，可以删除功能或步骤或者从所示或讨论的顺序以外执行，包括基本上同时或以相反的顺序执行。
应当理解，除非本文中另外明确或隐含地指示，否则关于本文中的特定实施方案描述的任何特征，特性，备选方案或修改也可以被应用，使用或结合本文描述的任何其他实施方案。此外，除非另有说明，否则本文的附图未按比例绘制。
实施例
实施例1-固定邻近纳米孔的DNA的一端并通过电流控制DNA的来回移动
开发实验程序以证明在相关蛋白质不在室之间移动的条件下，DNA通过电流在由纳米孔分开的两个室之间来回移动。
包含两个室的纳米芯片由氮化硅制成。如Briggs K等人，Automated fabricationof 2-nm solid-state nanopores for nucleic acid analysis,Smal l(2014)10(10):2077-86所述，制备<4nm(对于dsDNA或ssDNA)和2nm(仅对于ssDNA)的纳米孔。这两个室被称为“近”和“远”室，远室是DNA的3’端被缀合的室。
显示ssDNA(2nm孔)和ssDNA+dsDNA(4nm孔)而非蛋白质通过纳米孔。穿过纳米孔是由电流破坏来检测的。
DNA与孔表面的缀合：通过碳二亚胺介导的附着将5’氨基修饰的DNA连接到羧基包被的聚苯乙烯珠(BB Carboxylate Microspheres 0.05μm，来自Polysciences，Inc.)。用生物素标记的DNA的3’。DNA具有预定长度。
链霉亲和素缀合：如在Arafat，A.Covalent Biofunctionalization of SiliconNitride Surfaces Langmuir(2007)23(11)：6233-6244中所述，在氮化硅纳米孔缀合物链霉亲和素的“远”侧进行对表面的缀合。
在纳米孔附近的DNA固定：将缓冲液中的DNA缀合的聚苯乙烯珠加入“附近”室中，并将缓冲液加入’远’室(标准缓冲液：10mM Tris pH8,1mM EDTA，150mM KCl)。施加电压(～100mV)直至观察到电流中断(使用Axon Nanopatch200B膜片钳放大器)。50nm的珠子不能通过纳米孔，因此当DNA链穿过并且珠子压在纳米孔的端时，电流被严重破坏。保持电流1-2分钟，直到DNA通过生物素的结合不可逆地与远侧固定的链霉亲和素结合。为了确认DNA已被固定，反转电流。如果DNA在孔内或孔外，则观察到不同的电流。如果看起来DNA没有被固定，则重复该过程。
通过核酸内切酶释放珠子：将限制性酶缓冲液中的限制性酶加入到DNA附着的室中。在一个实施方案中，DNA是单链的，并含有可被酶裂解的限制位点，该酶将切割单链DNA。参见，例如，Nishigaki,K.,Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general.Nucleic Acids Res.(1985)13(16):5747-5760。在备选实施方案中，将互补寡核苷酸加入到DNA连接的室中，使其杂交30分钟以产生dsDNA，然后加入限制性酶。一旦珠子被释放，它就会被冲走。电流在正向和反向之间切换，以确认DNA进入/通过和离开孔。
阐述受控的来回移动：使用标准缓冲液，在向前方向上施加电流直到观察到信号中断，然后在DNA通过后恢复到“正常”。施加反向电流直到观察到信号中断。观察到信号不会恢复正常，因为DNA保留在孔中。将电流在正向和反向上的施加重复几个循环以确认DNA通过纳米孔来回移动。
实施例1a：在二氧化硅芯片中邻近纳米孔固定DNA链
纳米芯片内壁由二氧化硅制成。两侧都被硅烷化，但寡核苷酸仅与芯片壁的一侧缀合，然后产生纳米孔。
硅烷化：在30℃下用Pirannah溶液(市售的各种品牌，通常包括硫酸(H2SO4)和过氧化氢(H2O2)的混合物，其从表面除去有机残留物)清洁芯片壁的表面，并用双蒸水洗涤。制备(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)的储备溶液，其中含有50％甲醇(MeOH)，47.5％APTES，2.5％纳米纯H2O，并且在4℃下老化>1小时。然后将APTES储备液在MeOH中1：500稀释并施加到芯片壁并与它一起在室温下温育。然后用MeOH冲洗芯片壁并在110℃下干燥30分钟。
缀合：然后将芯片壁在室温下在0.5％w/v的1,4-亚苯基二异硫氰酸酯(PDC)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中温育5小时。将其用DMSO短暂洗涤两次，并用双蒸水短暂洗涤两次。然后将芯片壁与100nM胺修饰的单链DNA寡聚体(约50聚体)在双蒸水(pH8)中于37℃温育过夜。然后用28％氨溶液洗涤芯片壁两次以使任何未反应的材料失活，并用双蒸水洗涤两次。然后在壁中产生一个或多个纳米孔。
一旦纳米芯片的制造完成，内壁涂覆有DNA寡聚体，约50bp长。这允许具有与表面结合的DNA互补的末端序列
的单链DNA通过将ssDNA附着到相对大体积结构(例如珠子，蛋白质或具有直径太大而不适合纳米孔的DNA折纸结构)而定位到纳米孔，其中与表面结合的DNA互补的序列在大体积结构的远端，使用电流将带电聚合物拉过纳米孔，运行ssDNA与邻近纳米孔的互补表面结合的DNA寡聚体结合，并切除大体积结构。
实施例2：DNA合成-单核苷酸添加
通过施加适当的电流并检测DNA移动，将DNA移至“储备”室。
在合适的缓冲液(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，pH7.9@25℃)中的末端转移酶(TdT，New England Biolabs)加上可逆封闭的dATP*加入到’添加’室中。缓冲液也添加到“储备”室。
在3’-OH上具有可逆嵌段嵌端(blocks)的dNTP用于向DNA添加核苷酸。当添加到DNA链中时，直到被封闭的dNTP被解封闭才能添加下一个dNTP。
解封闭可以是化学的或酶促的。使用了不同的方法：
a.3’O-烯丙基：如Ju J,Four-color DNA sequencing by synthesis usingcleavable fluorescent nucleotide reversible terminators.Proc Natl Acad Sci US A.(2006)；103(52):19635-40所述，通过水性缓冲溶液中Pd催化的去烯丙基化，或在聚乙二醇-400中使用碘(10mol％)，如Shankaraiah G.等人，Rapid and selectivedeallylation of allyl ethers and esters using iodine in polyethylene glycol-400.Green Chem.(2011)13:2354-2358所述，除去烯丙基。
b.3’O-NH2：在缓冲的NaNO2中除去胺，如US 8034923中所述。
c.3’-磷酸盐。用内切核酸酶IV(New England Biolabs)水解磷酸盐。其他可能用内切核酸酶IV除去的3’修饰包括磷酸甘油醛和脱氧核糖-5-磷酸。
d.3’-O-Ac：如Ud-Dean，A theoretical model for template-free synthesisof long DNA sequence.Syst Synth Biol(2008)2:67-73所述，通过酶水解除去乙酸。
然后通过施加适当的电流并检测DNA移动将DNA移至“远”室。通过切换缓冲液并添加解封闭缓冲液/溶液来去保护DNA，如以上a-d所述。
根据需要重复该过程以产生目的序列。
实施例3：DNA合成：阻断寡核苷酸添加
双链DNA的3’端附着于具有4nm孔径的纳米孔附近。DNA的5’端具有CG的突出端(从5’到3’读数)。
寡聚盒A和B如下制备：
5’CGAAGGG<代码A或B>GTCGACNNNNN
3’GCTTCCC<互补>CAGCTGNNNNN
代码A和代码B各自表示信息序列。Ns指任何核苷酸。5’序列包含拓扑异构酶识别位点，并且3’序列包含Acc1限制位点。寡核苷酸暴露于拓扑异构酶，而拓扑异构酶与3’胸苷结合：
5’CGAAGGG<代码A或B>GTCGACNNNNN
3’*TTCCC<互补>CAGCTGNNNNN(*＝拓扑异构酶)
通过施加适当的电流并检测DNA移动，将DNA移至“附近”室。带有拓扑异构酶的’代码A’寡核苷酸在’添加’室中提供。通过施加适当的电流并检测DNA移动将DNA移入添加室，于是代码A寡核苷酸与DNA结合，将Acc1加入“储备”室，其中它在限制位点切割，以提供拓扑异构酶连接位点。
重复该过程，直到达到所需的序列，添加其他“代码A”或“代码B”。指出的是，不需要不断地将新的Acc1添加到“储备”室；当从代码A或代码B切换时，只需要在’添加’室中清洗代码A或代码B寡核苷酸。
为了对仅允许ssDNA通过的孔进行测序，需要对上述方案进行一些修改。众所周知，当dsDNA遇到小孔(2nm)时，只有ssDNA会通过并且互补体将被“剥离”掉。因此，如果用2nm孔进行这种合成，必须确保适当的dsDNA能够在另一侧“重新形成”。要做到这一点，可以将“CGAAGGG<代码A或B>GTCGACNNNNN”添加到近室(以确保产生限制酶位点)和将“CGAAGGG<代码A或B>GT”添加到远室(以确保生成拓扑相容的位点)。
阐述前述方法，证明了DNA编码信息的顺序“添加”到具有≥2个连续添加的不断增长的DNA链中(代表性2位数据)，每个都包括’添加’和’去保护’步骤。用于优化和概念验证的初始实验在微管中进行。
在该实施例中描述的方法中，一位的信息被编码在一串核苷酸中。待“添加”的DNA位是与牛痘拓扑异构酶I(topo)缀合的短dsDNA序列。在存在合适的“去保护的”‘接收体’DNA的情况下，带topo的DNA’位’通过拓扑异构酶酶促和共价连接(’添加’)到接纳体，在该过程中从DNA除去它。然后限制性酶可以切割添加的位以“去保护”它并产生合适的“接纳体”序列以用于添加下一位。
拓扑负荷：通用负荷方案如下，在图22和下面示意性地描绘，其中N表示任何核苷酸，并且A，T，G和C分别表示具有腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的核苷酸。彼此在对方上方的N是互补的。虽然该实施例使用限制性酶HpyCH4III，但基本策略用其他限制性酶一起也可行，例如，如实施例4中所证明的。
添加通用‘添加’反应:
去保护通用‘去保护’反应:
以下寡核苷酸是从Integrated DNA Technologies(IDT)排序的。一些寡核苷酸末端的“b”表示生物素)：
BAB:
CGATAGTCTAGGCACTGTTTGCTGCGCCCTTGTCCGTGTCGCCCTTATCTACTTAAGAGATCATACAGCATTGCGAGTACG
B1:b-CACGTACTCGCAATGCTGTATGATCTCTTAAGTAGATA
B2:ATCTACTTAAGAGATCATACAGCATTGCGAGTACG
TA1:b-CACACTCATGCCGCTGTAGTCACTATCGGAAT
TA2:AGGGCGACACGGACAGTTTGAATCATACCG
TA3b:
AACTTAGTATGACGGTATGATTCAAACTGTCCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTGACTACAGCGGCATGAG
TB1:b-CACACTCATGCCGCTGTAGTCACTATCGGAAT
TB2:AGGGCGCAGCAAACAGTGCCTAGACTATCG
TB3b:
AACTTAGTATGACGATAGTCTAGGCACTGTTTGCTGCGCCCTTATTCCGATAGTGACTACAG
CGGCATGAG
FP1:CACGTACTCGCAATGCT
FP2:CGGTATGATTCAAACTGTCCG
FP3:GCCCTTGTCCGTGTC
将寡核苷酸在TE缓冲液中溶解至100μM并储存在-20℃。
通过如下所述混合寡核苷酸，加热至95℃持续5分钟，然后每3分钟将温度降低5℃直至温度达到20℃，来制备杂交的寡核苷酸。杂交的寡核苷酸储存在或寡核苷酸的组合如下：
B1/2
48uL B1
48uL B2
4uL 5M NaCl
A5
20uL TA1
20uL TA2
5uL TA3b
4uL 5M NaCl
51uL TE
B5
20uL TB1
20uL TB2
5uL TB3b
4uL 5M NaCl
51uL TE
在本实施例中使用以下缓冲液和酶：
TE：10M Tris pH 8.0,1mM EDTA，pH 8.0
WB：1M NaCl，10mM Tris pH8.0,1mM EDTA pH8.0
1x Topo：20mM Tris pH7.5,100mM NaCl，2mM DTT，5mM MgCl 2
1x RE：50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，100ug/ml BSA，pH7.9,25℃下。
牛痘DNA拓扑异构酶I(topo)购自Monserate Biotech(10,000U/mL)
HypCH4III购自NEB
链霉亲和素包被的磁珠(s-MagBeads)购自ThermoFisher。
如下制备接纳体：将5uL的s-magbeads在200uL WB中洗涤一次(结合时间1分钟)。将5uL B1/2+195uL WB加入到珠子中并在室温下温育15分钟，然后用200uL WB洗涤一次，然后用200uL 1x Topo洗涤一次，并重悬于150uL的1x Topo中。
如下制备负荷Topo的A5(参见图20)：将4uL 10x topo缓冲液+23uL水+8uL A5+5uLtopo在37℃下温育30分钟，加入到5uL s-magbeads中(用200uL WB洗涤1次，用200uL 1xTopo洗涤1次，重悬于150μL 1xtopo中)，并在室温下结合15分钟。
向接纳体中’加’负荷的A5：将s-magbeads从负荷Topo的A5中除去，加入接纳体中，并在37℃下温育60分钟。取出等分试样，在TE中稀释1/200，并在-20℃下存储。
去保护：用200uL WB洗涤该材料一次，并用200uL的1x RE洗涤一次，并重悬于15uL10xRE和120uL水中。加入15uL HypCH4III。将混合物在37℃下温育60分钟，然后用200uL WB洗涤一次，用200uL 1x topo洗涤一次，以产生称为“接纳体-A5”的产物。
如下制备负荷Topo的B5(参见图21)：4uL 10x topo缓冲液。将23uL水和8uL B5+5uL topo合并，并在37℃下温育30分钟。将产物加入到5uL s-magbeads中(用200uL WB洗涤一次，用200uL 1x Topo洗涤一次，并重悬于150μL1 xtopo中)并使其在室温下结合15分钟。
向接纳体-A5“加入”负荷的B5：从负荷Topo的B5中除去s-magbeads，加入接纳体-A5并在37℃下温育60分钟。然后取出等分试样，用TE稀释1/200，并存储在-20℃。
去保护：将材料用200uL WB洗涤一次，然后用200uL 1x RE洗涤一次，并重悬于15uL 10xRE和120uL水中。加入15uL HypCH4III，将混合物在37℃下保温60分钟。
确认上述反应起作用是通过PCR扩增来自A5的等分试样(加入A5的接纳体：步骤iii，在示意图中为’A5添加的’)和B5(加入B5的接纳体-A5：步骤vi，在示意图中为’B5添加的’)来提供的。’无模板’用作A5的阴性对照，A5用作B5的阴性对照，寡聚BAB用作B5的阳性对照。A5 PCR的预期产物大小为68bp，B5 PCR的预期产物大小为57bp。(B1/2也在凝胶上运行，预期大小为～47bp，但这可能是近似的，因为存在突出端并且它是生物素化的)。PCR反应(30个循环的95/55/68(每个1分钟)如下进行：
使用4-20％Tris-甘氨酸凝胶的SDS-PAGE用于证实产生预期大小的寡核苷酸。如上所述进行负荷，但在负荷后(37℃温育步骤)直接混合加载缓冲液并将样品加热至70℃保持2分钟并在运行凝胶之前使其冷却。凝胶用考马斯染色。对于阴性对照，将水而不是topo加入反应。图30描绘了结果，清楚地示出了对应于A5 PCR和B5 PCR的预期产物大小的条带。
因此显示通过负荷拓扑异构酶的DNA盒的DNA位添加和通过限制性酶进行的去保护是可行的。在这些概念实验证据中，DNA通过链霉亲和素缀合的磁珠固定，并顺序移动到不同的反应混合物中，但是为纳米孔芯片形式，我们产生了单独的反应室并使用电流将DNA移动到那些不同的反应室中。
最后，PCR证明当进行对应于’位’信息的DNA序列的顺序添加时，产生预期的DNA序列。这些反应按设计工作，即使只进行了极少的优化。
使用商业纳米孔测序仪(来自Oxford Nanopore的MinION)回收并测序如实施例2和3中所述制备的DNA，证实获得了所需的序列。
实施例4-DNA合成：使用不同的限制性酶阻断寡核苷酸添加
以下合成类似于实施例3进行，但使用限制性酶MluI，其在’ACGCGT’处切割以形成：
...NNNA CGCGTNNN...
...NNNTGCGC ANNN…
在这个实施例中，TOPO被负荷以形成具有序列互补性的复合物，其将使负荷后的TOPO能够将DNA转移至用MluI切割的DNA：
(b＝生物素。这可以用链霉亲和素去除)
通过类似于前述实施例的方法，然后使用负荷后的TOPO将寡聚体添加到正在合成的链的5’端，其具有互补的接纳体序列，从而释放TOPO，然后使用MluI将该链“去保护”，重复该循环直至获得所需的寡聚体序列。
实施例5-使用拓扑异构酶策略添加单个碱基
已经发现拓扑异构酶系统也可以设计成将单个碱基添加到单链DNA链中(与实施例3相比，其描述了添加’盒’)。待“添加”的DNA位包含在与牛痘拓扑异构酶I(topo)缀合的短DNA序列中。在存在合适的单链“去保护的”‘接纳体’DNA的情况下，负荷topo的DNA通过拓扑异构酶酶促和共价连接(’添加’)到接纳体，在该过程中拓扑异构酶从DNA中除去。然后，IIS型限制性酶可以切割所有添加的DNA，除了单个碱基之外(正在’添加’的碱基)。重复这种去保护-添加过程以添加额外的碱基(位)。
Topo负荷：通用负荷方案如下，类似于实施例3：
如在实施例3中那样，在彼此上方的N是互补的。I是肌苷。生物素用于去除未反应的产物和副产物。单碱基的添加如下进行
使用BciVI限制性酶(粗体位点)阐明脱保护如下：
以下寡核苷酸是商业合成的(B＝生物素，P-磷酸，I＝肌苷)：
将寡核苷酸在TE缓冲液中溶解至100μM并储存在-20℃。
杂交：通过如上所述混合寡核苷酸，加热至95℃持续5分钟，然后每3分钟将温度降低5℃直至温度达到20℃，来制备以下杂交的寡核苷酸。杂交的寡核苷酸储存在4℃或-20℃。
NAT1b/NAT9c I/NAT9x
8μL NAT1B
10μL NAT9cI
10μL NAT9x
48μL TE
4μL 5M NaCl
NAT1/NAT9cI
10μL NAT1
10μL NAT9cI
80uL PBS
NAT1/NAT9
10μL NAT1
10μL NAT9
80uL PBS
缓冲液和酶：使用以下缓冲液：
TE：10M Tris pH 8.0,1mM EDTA，pH 8.0
PBS：磷酸缓冲盐水(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4)(pH7.4)
10x Cutsmart:500mM KAc,200mM Tris-Ac,100mM Mg-Ac,1mg/mL BSA pH 7.9
BciVI购自NEB，链霉亲和素包被的磁珠(s-MagBeads)购自ThermoFisher
添加反应如下进行。
1.Topo负荷：按照表格组装试剂：
然后将试剂在37℃下温育30分钟。在室温下10分钟后，使用链霉亲和素磁珠(5uL)在1x topo拓扑缓冲液中除去副产物以允许结合。
2.反应：按照表格组装试剂：
然后将试剂在37℃下温育30分钟。添加反应预计如下进行：
星号(*)表示拓扑异构酶。指出的是，NAT9cI是磷酸化的，但出于说明目的未示出。
当负荷的topo存在接纳体序列时，它经历以下反应：
PCR扩增和测量琼脂糖凝胶上产物的分子量证实了产生了预期的产物。参见图30，描绘了泳道1(实验)中正确大小的条带，阴性对照中没有条带。
B.去保护反应：试剂按表格组装：
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| NAT1/NAT9 | 1 | 1 | - | - |
| NAT1/NAT9cI | - | - | 1 | 1 |
| 10x cutsmart | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 水 | 17 | 16 | 17 | 16 |
| BciVI | 0 | 1 | 0 | 1 |
将试剂在37℃下温育90分钟。对于去保护反应，使用购买的寡核苷酸产生添加反应的代表性产物，并测试用BciVI限制酶的消化：
鉴于切割位点的3’是一系列肌苷而不是“常规”碱基，不知道限制性酶是否会按预期切割DNA。作为阳性对照，制备NAT1/NAT9cI的“适当的”碱基配对的等同物(NAT1/NAT9c)：
产物的PCR扩增后测量琼脂糖凝胶上的分子量(图31)，表明酶按预期工作。对于阳性对照，未消化时观察到较大的条带(泳道1)，但消化时观察到较小的条带。使用NAT1/NAT9cI观察到相同的模式，表明肌苷的存在不会消除或干扰消化。用NAT1/NAT9cI似乎保留了少量未消化的产物，这表明至少在这些条件下，裂解不如NAT1/NAT9c那样有效。通过改变缓冲条件和/或在NAT9cI的5’端添加更多的肌苷，可以提高切割效率。
前述实施例证明使用Topo/TypeIIS限制性酶组合将单个核苷酸添加到靶单链DNA的5’端是可行的。使用类似的过程，识别序列CCCTG(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446)的相关拓扑异构酶SVF用于添加’G’而不是’T’，从而允许用T和G构造编码二进制信息的序列。
如上所述，当使用拓扑异构酶策略产生dsDNA时，可以使用连接酶和ATP修复相对链上的DNA中的切口。但是当进行单核苷酸添加时，如本实施例所示，我们正在构建单链DNA，因此没有需要修复的切口且不需要使用连接酶。
实施例6-使用拓扑异构酶策略加5’磷酸偶联添加单个碱基
在单个碱基添加的另一种方法中，我们使用5’-磷酸盐作为保护基团以在3’至5’方向上提供单碱基对添加。负荷反应用具有5’磷酸基团的单个T(或G，或所需的其他核苷酸)负荷拓扑异构酶。当负荷后的拓扑异构酶“看到”游离的5’未被封闭的(未磷酸化的)单链DNA链时，它会将T加到该链上，从而提供了具有添加到5’的T的DNA。通过具有拓扑异构酶和单链接纳体DNA可以结合的序列的衔接头DNA的存在促进了这种添加。(指出的是，衔接头DNA是催化性的-它可以在重复反应中作为模板重复使用。)添加的核苷酸上有5’磷酸，因此它在暴露于去除5’磷酸的磷酸酶之前不会成为进一步添加的底物。重复该过程，使用Topo将单个“T”添加到靶标单链DNA的5’端和使用SVF拓扑异构酶添加单个’G’，从而允许用T和G构建编码二进制信息的序列。该过程示意性地描述如下：
实施例7-使用DNA折纸有助于将DNA附着于纳米孔附近
在一端具有大折纸结构的DNA链被捕获在纳米孔中，并通过DNA上的末端生物素部分固定到表面缀合的链霉亲和素上。在限制性酶切割折纸结构后，固定的DNA可以通过孔来回移动，如通过电流破坏所证实的。固定化使得单个DNA分子能够通过孔受控地移动，这反过来又能够将信息“读取”和“写入”到DNA。
如图35所示，形成庞大的双链DNA单元，其太大而不能适合穿过纳米孔，具有单链区域，通过两个短的双链区域与大体积部分连接，所述双链区域具有用于锚定待添加到合成中的DNA。然后可以将单链区域分离并锚定到与纳米孔相邻的表面，并释放折纸结构。参见图33。
纳米孔在3mm芯片中形成，具有20nm SiO2，具有50×50μm的窗口。芯片由NanoporeSolutions提供。Nanopore盒支架和流动池由Nanopore Solutions提供。放大器是TecellaPico 2放大器。这是usb供电的放大器，它使用usb-计算机接口进行控制。Tecella提供(Windows)软件来控制放大器。万用表是FLUKE 17B+数字万用表，能够检测低至0.1uA的电流。为了筛选射频噪声，我们使用带有USB接口的Concentric Technology Solutions TC-5916A屏蔽盒(法拉第笼)。寡核苷酸获自IDT.com。“PS”是来自http://www.gelest.com/product/o-propargyl-n-triethoxysilylpropyl carbamate-90/的炔丙基硅烷-O-(炔丙基)-N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)氨基甲酸酯。
折纸结构基于具有“蜂窝状”立方体折纸结构的单链m13，其一侧为～20nm。在蜂窝附近存在双链区域，每个区域包含独特的限制位点。这些位点之一用于附着修饰的DNA以使得能够附着在纳米孔附近，另一个用于在DNA附着后切除折纸结构。
纳米孔形成：使用介电击穿在芯片中形成纳米孔，如下：
1.芯片小心地安装在盒中
2.润湿：将100％乙醇小心地移液到芯片上。必须除去气泡。但是，应避免在芯片上直接吸取溶液，否则芯片会破裂(SiO2仅为20nm)。
3.表面处理：除去乙醇，并将新鲜制备的Piranah溶液(75％硫酸，25％过氧化氢(30％))移液到芯片上。(让Pirannah溶液达到室温)。离开30分钟。
4.用蒸馏水冲洗4次。
5.用HK缓冲液(10mM HEPES pH 8,1M KCl)冲洗2次
6.将盒组装入流动池。
7.在流动池的每个室中加入700μL HK缓冲液。
8.插入连接到放大器的银电极并关闭法拉第笼。
9.用300mV测试电阻。不应检测到电流。如果检测到，芯片可能会破裂，必须重新开始。
10.将电极连接到6V的直流电流，并用万用表测试电流。
电流应该很低且不应该改变。将电压增加1.5V并保持电压直到电阻增加。如果5-10分钟后阻力没有增加，再增加1.5V的电压，然后再试一次。重复直到电阻增加，此时应立即停止施加的电压。(用足够的电压，发生介电击穿，并在SiO2膜中产生“孔”。最初创建时，孔很小，但会在保持电压时增大尺寸。)
11.使用放大器测试孔。在300mV时，应该看到几到若干nA的电流。电流越大，孔越大。
图34描绘了基本功能纳米孔。在每个小图中，y轴是电流(nA)并且x轴是时间(s)。左图“RF噪声的筛选”说明了法拉第笼的实用性。将没有纳米孔的芯片放置在流动池中并施加300mV。当法拉第笼的盖子关闭时(第一个箭头)，可以看到降噪。当闩锁闭合时(第二箭头)，发生小的尖峰锋电位。注意电流是0nA。在孔制造(中间图)之后，施加300mV(箭头)导致～3.5nA的电流。当将DNA应用于接地室并施加+300mV时，可以观察到在电流的瞬时降低时观察到的DNA易位DNA迁移(右图)。(指出的是，在这种情况下使用TS缓冲液：50mM Tris，pH 8,1M NaCl)。Lambda DNA用于该DNA迁移实验。
氯化银电极：
1.银线焊接在绝缘铜线上。
2.将铜线接地，并将银浸入新鲜的30％次氯酸钠中30分钟。
3.银应该获得深灰色涂层(氯化银)。
4.将银线在蒸馏水中充分冲洗并干燥。
5.其现在可以使用了。
珠子的硅烷化：硅烷化方法最初在SiO2涂覆的磁珠(GBioscience)上开发/测试。采用以下方案：
1.在新鲜的Pirannah溶液中预处理珠子30分钟。
2.用蒸馏水洗3次。
3.在甲醇中洗涤2次。
4.用甲醇1：500稀释APTES储备液。
5.将稀释的APTES加入珠子中，在室温下温育45分钟。
6.用甲醇冲洗。
7.100℃30分钟。
8.在真空下存储。
硅芯片的硅烷化
1.将具有纳米孔的芯片安装在盒中。
2.用甲醇冲洗，小心地去除任何气泡。
3.加入新鲜的Pirannah溶液(平衡至室温)并温育30分钟。
4.用蒸馏水洗4次。
5.用甲醇洗3次。
6.用甲醇1：500稀释APTES储备液，用于洗涤芯片2次。在RT温育45分钟。
7.用甲醇冲洗2次。
8.在空气流下干燥。
9.在真空下存储过夜。
珠子的链霉亲和素缀合：最初在上面制备的硅烷化珠子上开发/测试链霉亲和素缀合。
1.用改良的磷酸盐缓冲盐水(MPBS)洗涤硅烷化珠子
2.在MPBS中制备1.25％戊二醛的新鲜溶液(使用50％戊二醛储备液，冷藏保存)。
3.向珠子中加入1.25％戊二醛，静置60分钟，每隔15分钟温和上下抽吸(pepetting)。
4.用MPBS洗2次。
5.用水洗2次。
6.真空干燥。
7.将链霉亲和素(在MPBS中500μg/mL)加入珠子中并温育60分钟。(对于阴性对照珠，使用牛血清白蛋白(BSA)(在MPBS中2mg/mL)代替链霉亲和素)。
8.去除链霉亲和素并加入BSA(2mg/mL，在MPBS中)。温育60分钟。
9.在MPBS中洗2次。
10.存储在4℃。
硅芯片的链霉亲和素缀合
1.用乙醇冲洗硅烷化芯片2次
2.用MPBS冲洗硅烷化芯片2次
3.在MPBS中制备1.25％戊二醛的新鲜溶液(使用50％戊二醛储备液，冷藏保存)。
4.用1.25％戊二醛冲洗芯片2x，静置60’，每隔15分钟温和上下抽吸
5.用MPBS洗2次
6.用水洗2次
7.空气流干燥
8.向芯片的一半添加BSA(MPBS中2mg/mL)，并添加另一种链霉亲和素(MPBS中500μg/mL)。温育60分钟。在盒上做标记以指示芯片的哪一半是链霉亲和素修饰的。
9.用BSA(MPBS中2mg/mL)冲洗两半芯片。温育60分钟。
10.用MPBS清洗。
本文使用的缓冲液如下制备：
MPBS：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L磷酸二钠，0.240g/L磷酸钾，0.2g/L聚山梨醇酯-20(pH 7.2)
PBS：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L磷酸二钠，0.240g/L磷酸钾
TS：50mM Tris pH 8.0,1M NaCl
HK：10mM HEPES pH 8.0,1M KCl
TE：10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0
Pirannah溶液：75％过氧化氢(30％)+25％硫酸
APTES储备液：50％甲醇，47.5％APTES，2.5％纳米纯水。在老化至少1小时。存储在4℃。
PDC储备液：在DMSO中0.5％w/v 1,4-亚苯基二异硫氰酸酯
寡核苷酸(5’至3’)的有序的：
寡核苷酸对杂交如下进行：
1.在TE缓冲液中制备浓度为100uM的寡聚体的储备溶液
2.在PBS中将寡聚体稀释至10μM
3.在热循环仪中加热至85℃，持续5’
4.每3’使加热降低5℃，直到25℃
5.存储在4℃或-20℃
链霉亲和素缀合：使用SiO2涂覆的磁珠开发和测试链霉亲和素与SiO2的缀合，然后将方案适用于SiO2芯片。测试生物素化的寡核苷酸与链霉亲和素和BSA缀合的珠子的结合。如所预期的，用BSA缀合的珠观察到可忽略的结合，而用链霉亲和素缀合的珠观察到强结合。参见图38。由于在高盐中进行缀合将更方便(DNA移动在高盐中进行)，还测试了珠子在HK缓冲液中结合的能力。HK缓冲液中的结合与MPBS缓冲液中的结合相当(图39)。
如上文在图35-37中所描述的，制备并确认折纸构造是可操作的。使用寡核苷酸测试折纸结构的生物素化。已经从上面针对图37描述的’折纸’结果知晓AlwNI位点是活跃的。下面使用在折纸DNA中重建精确序列区段的寡核苷酸对(o1/o3)。折纸分子如下所示：
寡聚体对o1/o3是
在T4 DNA连接酶和与折纸序列3’侧的突出端互补的生物素化寡核苷酸(其自身附着于长的ssDNA序列，ssDNA序列自身附着于折纸的另一面)存在下，用AlwNI消化DNA，根据以下反应：
在该策略中，AlwN1切割靶DNA。当加入连接酶时，该DNA可以重新连接，但限制性酶会再次将其切割。但是，如果/当(右)片段(o1/o3)与BN1/N2结合时，不会重新产生限制酶位点，因此不会切割该产物。通过使用和不使用限制性酶进行测试来确认特异性附着：
加入除连接酶外的所有试剂，并将溶液在37℃下温育60分钟。加入连接酶并将溶液在16℃温育过夜。10x lig buff是指NEB 10x T4 DNA连接酶缓冲液。连接酶是NEB T4DNA连接酶。o1/o3和n1/n2是指退火的寡核苷酸对，如上所述。单位是微升。琼脂糖凝胶分析证实，在AlwNI存在下，形成较大的产物，对应于附着于与折纸结构连接的长ssDNA臂的生物素化的寡核苷酸。在需要时，类似的策略用于3’生物素化。
上面我们证明了形成并使用纳米孔以检测穿过孔的DNA的电压诱导的转运的能力，产生折纸分子，其具有在其远端连接生物素的长ss区域，以及链霉亲和素向二氧化硅的缀合，并用于捕获生物素化的DNA。这些工具用于附着和控制纳米孔旁边的单个DNA分子的移动。
第一步是将链霉亲和素缀合至SiO2纳米孔的一个表面(和BSA缀合至另一侧)。这是根据上述方案完成的。产生的孔倾向于具有比它们最初具有的更低的电流。在短暂的6v脉冲之后，电流恢复到接近其原始电流。此时的功能性纳米孔如图40所示。
接下来，插入折纸DNA。当将折纸DNA添加到适当的室中并且电流打开时，折纸将插入室中。图41中示出了这种情况的表示。当以50pM的最终浓度引入折纸时的实验结果证实具有折纸的DNA相对较快地(通常以秒为单位)插入孔中，这可通过流过纳米孔所得的电流减小来检测(例如，在这些实验中，折纸插入前的电流为～3nA，插入后为～2.5nA)。如果允许电流运行更长时间，则可以观察到双重插入。如果使用更高的浓度，则插入发生得太快而无法观察到。
插入的DNA与芯片的结合。将折纸插入纳米孔后，在再次施加电压之前允许经过15分钟。折纸的ssDNA区域的末端含有生物素，并且链霉亲和素与纳米孔的表面缀合。链霉亲和素与抗生物素蛋白结合的亲和力常数接近共价键。15分钟的时间允许DNA扩散并且允许生物素端发现并结合链霉亲和素。如果DNA实际上已经附着在表面上，当电压反转时，观察到的电流应该略低于之前看到的电流。此外，来回切换电流应导致两个方向上的电流低于自由孔所见的电流。在此处所示的实施例中，自由孔显示～3nA的电流。图42示出了连接的DNA的表示，图43示出了连接的折纸DNA的电压切换的实验结果。指出的是，在两个方向上看到的电流是+/-2.5nA，这低于用自由孔观察到的+/-3nA。如果DNA未与表面结合，则在切换电压时将恢复原始电流(图44)。
为了去除折纸结构，移除包含折纸结构的流动池室中的缓冲液，并用具有1uLSwa1/20°L的1x Swa1缓冲液替代。另一个流通池室中的缓冲液用不含Swa1的1x Swa1缓冲液替代。将其在室温下温育60分钟，然后用HK缓冲液洗涤，并施加电压。图45中所示的DNA来回移动由图46中的实验数据证实，示出了固定化DNA通过SiO2纳米孔的受控移动。
实施例8-将聚合物附着到邻近纳米孔的表面的替代方法
前述实施例描述了通过生物素化DNA并用链霉亲和素包被附着表面，将DNA附着到与纳米孔相邻的表面上。图47中描绘了一些连接聚合物的备选方法。
a)DNA杂交：在一种方法中，在本发明的方法中延伸的DNA与附着在纳米孔附近的短寡核苷酸杂交。一旦合成完成，可以容易地除去合成的DNA而不需要限制性酶，或者由结合的寡核苷酸和合成的DNA形成的双链可以提供限制性酶的底物。在该实施例中，短的寡聚体使用生物素-链霉亲和素与表面缀合，或使用1,4-亚苯基二异硫氰酸酯连接如下：
生物素化DNA与SiO2的缀合：
A.硅烷化：
1.预处理：nha溶液30分钟，用双蒸水(ddH2O)洗涤
2.制备APTES储备液：50％MeOH，47.5％APTES，2.5％纳米纯水：老化>1小时4℃
3.在MeOH中1：500稀释APTES储备液
4.在室温下温育芯片
5.冲洗MeOH
6.干燥
7.在110℃加热30分钟
缀合：
1.用PDC储备液处理芯片5h(室温)(PDC储备液：在DMSO中的0.5％w/v 1,4-亚苯基二异硫氰酸酯)
2.在DMSO中洗2次(快速！)
3.在ddH2O中洗2次(快速！)
4.在ddH2O中的100nM氨基修饰的DNA(pH 8)O/N 37℃
5.28％氨水溶液洗涤2次(去活化)
6.ddH2O洗涤两次
如上所述引入具有与连接的寡核苷酸互补的末端序列的单链DNA，并使其与连接的寡核苷酸杂交。
b)点击化学：点击化学是对简单且热力学有效的反应的一般术语，不产生有毒或高反应性副产物，并且在水或生物相容性溶剂中操作，并且经常用于使用特定的生物分子连接选择的底物。在这种情况下的点击缀合使用与a)中使用的相似的化学物来连接寡核苷酸，这里仅用于连接在本发明的方法中在合成过程中延伸的聚合物。虽然在这个例子中，DNA是聚合物，但这种化学物可以工作以附着其他通过加入相容的叠氮基而官能化的聚合物。
硅烷化：
1.预处理：Piranha溶液30’，洗涤ddH2O
2.制备PS(炔丙基硅烷)储备液：50％MeOH，47.5％PS，2.5％纳米纯水：老化>1小时4C
3.在MeOH中1：500稀释APTES储备液
4.在室温下温育芯片
5.冲洗MeOH
6.干燥
7.在110℃加热30分钟
在叠氮官能团中终止的DNA将共价结合该表面(如图47所示)。叠氮化物终止的寡核苷酸是有序的，并附着在较长的折纸DNA上，如先前对DNA的生物素添加所述。
实施例9：优化的拓扑异构酶介导的DNA合成
寡核苷酸盒由三种寡核苷酸组成，其被杂交以形成双链DNA盒。盒设计有正DNA链上的痘苗病毒拓扑异构酶识别序列(CCCTT)，然后是负链上的GCCG序列。在拓扑异构酶识别其靶序列后，拓扑异构酶切割寡核苷酸，并与寡核苷酸的5'区段形成共价键，导致形成“负荷的”拓扑异构酶。在正链上加入正好CCCTT3’的不匹配碱基对(与负链上的GCCG匹配的CGAA)导致更有效的拓扑异构酶负荷。当将链霉亲和素包被的珠加入混合物中时，可以从负荷的拓扑异构酶中去除寡核苷酸盒的切割的3'部分(称为副产物)，与附着于正DNA链的3'末端的生物素结合。该反应描述如下：
初始负荷寡核苷酸：
5'GCGCACGGTCTCCCGGCGTATCCATCCCTTCGAATTCACGTACTCGCCAGTCTACAG-生物素3’
斜体的寡核苷酸是5'磷酸化的。
拓扑异构酶负荷后：
拓扑异构酶与CCCTT识别序列的3'T共价连接(未示出)。
通过与链霉抗生物素蛋白珠结合的生物素去除副产物寡核苷酸
5'CGAATTCACGTACTCGCCAGTCTACAG-生物素3'与S/A包被的磁珠结合
3'AGTGCATGAGCGGTCAGATGTC 5'
负荷的拓扑异构酶具有将寡核苷酸的5'部分添加到具有互补突出端的DNA接纳体链的独特能力：
由一个盒(或位)延伸的DNA接纳体链：
拓扑异构酶通过该反应释放。然后通过用识别核苷酸GGTCTC的限制酶Bsa I消化“去保护”寡核苷酸盒或位。Bsa I是IIS型限制酶，其识别不对称DNA序列(GGTCTC序列)并在其识别序列之外切割。设计盒以使用Bsa I切割将产生CGGC突出端。该突出端与DNA接纳体链中发现的相同，允许另一个盒或位通过另一个负荷的拓扑异构酶添加。
带有一个受保护盒的DNA接纳体(Bsa I限制性位点以粗体显示)：
Bsa I消化后带有一个盒的DNA接纳体：
用负荷的拓扑异构酶温育导致添加另一个盒(位)，并延伸DNA链以编码更多信息。
与负荷的Topo结合的DNA，DNA接纳体链加上一个盒
DNA接纳体链延伸两个盒(或位)
该过程可以一遍又一遍地重复，以用编码数据的“位”延伸DNA链。
实验细节：
拓扑异构酶负荷反应：将40微升链霉抗生物素蛋白包被的磁性dynabeads(ThermoFisher)在B&W缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA，2M NaCl)中洗涤5次。将2.7pmole生物素化的负荷寡核苷酸加入到珠中，并将混合物在室温下温育10分钟，轻轻摇动。将上清液从珠中取出并丢弃，仅留下结合的负荷寡核苷酸。然后将珠在含有痘苗病毒拓扑异构酶(6μg)，10单位T4多核苷酸激酶(3'磷酸酶减去，NEB)，0.1μM ATP(NEB)和5mM DTT的1xCutsmart缓冲液(New England Biolabs，NEB)中温育，在37℃下持续30分钟以负荷拓扑异构酶。在拓扑异构酶切割负荷寡核苷酸后，多核苷酸激酶使新形成的副产物寡核苷酸的5'末端磷酸化，从而防止拓扑异构酶再次将负荷寡核苷酸连接在一起，并提高负荷反应的效率。任何不负荷的拓扑异构酶通过静电力与链霉抗生物素蛋白包被的Dynabeads结合。负荷的拓扑异构酶不含链霉抗生物素蛋白包被的珠。多核苷酸激酶(PNK)被重组虾碱性磷酸酶中和，其逆转PNK的活性，或者优选地，通过离子交换层析或通过镍-NTA珠(拓扑异构酶是His-6标记的)纯化负荷的拓扑异构酶，
接纳体DNA与珠的初始结合：将20微升链霉抗生物素蛋白包被的磁性dynabeads(Thermo Fi sher)在B&W缓冲液(10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA，2M NaCl)中洗涤5次。将0.03pmole的生物素化的DNA接纳体寡核苷酸加入到洗过的珠中，并在室温下振荡温育10分钟。将上清液从链霉抗生物素蛋白包被的珠中取出并丢弃，仅留下与珠结合的DNA接纳体链。添加反应：为了制备添加混合物，将大肠杆菌DNA连接酶加1mM NAD加入到负荷的拓扑异构酶中。可选的：加入100uM香豆霉素或1mM新生霉素。(理由：大肠杆菌DNA连接酶(需要NAD)将“修复”当负荷的拓扑异构酶将DNA添加到接纳体时留下的缺口。这确保了如果未负荷的拓扑异构酶遇到这种DNA，它将不会切割它。此外，香豆霉素和新生霉素将抑制拓扑异构酶，并优选抑制“负荷”而不是“添加”反应。因此抑制剂也有助于确保在反应过程中形成的任何未负荷的拓扑异构酶都不活跃)。向珠中加入50微升添加混合物，并在37℃下温育15分钟，以允许将DNA盒添加到DNA接纳体分子中。图76显示4％琼脂糖凝胶，证明如预期地添加盒。为了从磁珠中释放DNA以制备该凝胶，用Eco(EcoRI)消化样品。
然后将珠放在磁铁附近，并取出拓扑异构酶溶液并存储在冰上。然后用50微升1xcutmart缓冲液(NEB)洗涤珠3次，以去除拓扑异构酶的任何残余物。
解封闭反应：然后将珠与50微升的cutsmart缓冲液(含有NAD和任选的香豆霉素/新生霉素)一起温育，其含有40单位的Bsa I和1单位的虾碱性磷酸酶。当限制酶切割DNA时，留下5'磷酸，这抑制了负荷的拓扑异构酶添加另一个盒。虾碱性磷酸酶的添加去除了5'磷酸，从而有效地去保护盒。使用磷酸酶如虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶提高了反应效率；没有磷酸酶，5'磷酸具有抑制作用。
从珠中去除Bsa I和SAP，并将珠在cutsmart缓冲液中洗涤3x。现在它们已准备好用于通过负荷的拓扑异构酶添加另一个盒。
通过将DNA接纳体链与负荷的拓扑异构酶(/连接酶)一起温育，然后用BsaI/rSAP消化这一添加盒的顺序被重复需加入的盒数。
Claims (18)
1.一种读取存储在聚合物中的数据的方法，包括：
i)提供具有电感器和单元的RLC谐振器，该单元具有纳米孔和能够穿过纳米孔的聚合物，该谐振器响应于在探测频率下的AC输入电压而具有在探测频率下的AC输出电压频率响应；
ii)提供至少具有探测频率的AC输入电压；和
iii)至少在探测频率下监测AC输出电压，探测频率下的AC输出电压指示在监测时存储在聚合物中的数据，
其中所述单元包括至少顶部和底电极，纳米孔设置在电极之间，并且单元中具有流体，其中通过施加到电极的DC转向电压使聚合物移动通过纳米孔，其中电极，纳米孔和流体具有有效单元电容，当聚合物通过纳米孔时，所述单元电容改变,其中所述电感器与所述单元串联连接以产生谐振器，电感器和有效单元电容的组合与谐振频率响应相关。
2.权利要求1所述的方法，其中所述聚合物包含至少两种类型的具有引起不同的谐振频率响应的不同性质的单体或寡聚体。
3.权利要求2所述的方法，其中所述至少两种类型的单体或寡聚体包含至少第一单体或寡聚体，其具有当第一单体或寡聚体在纳米孔中时引起第一谐振频率响应的第一性质，和第二单体或寡聚体，其具有当第二单体或寡聚体在纳米孔中时引起第二谐振频率响应的第二性质。
4.权利要求3所述的方法，其中探测频率下的第一频率响应的特征不同于探测频率下的第二频率响应的相同特征。
5.权利要求4所述的方法，其中第一和第二频率响应的特征包括幅度和相位响应中的至少一种。
6.权利要求3所述的方法，其中单体的第一性质和第二性质包括介电性质。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述单元具有至少三个室，至少两个纳米孔和至少三个电极，用于使聚合物移动通过纳米孔。
8.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述聚合物包含至少两种类型的单体或寡聚体，所述单体或寡聚体具有引起不同谐振频率响应的不同性质，并且其中在所述聚合物中所述至少两种类型的单体或寡聚体的至少部分序列以计算机可读代码的形式存储数据。
9.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述聚合物包含DNA，并且其中所述DNA包含至少两种类型的核苷酸，每种类型的核苷酸在探测频率下提供独特的频率响应。
10.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述探测频率为1MHz至1GHz。
11.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述聚合物包含至少两种不同类型的单体或寡聚体，每种类型具有不同的介电性质，所述介电性质影响谐振器的频率响应以在探测频率下产生至少两种不同的频率响应。
12.一种用于读取存储在聚合物中的数据的基于纳米孔的装置，包括：
i)具有电感器和单元的RLC谐振器，该单元具有纳米孔和能够穿过纳米孔的聚合物，该谐振器响应于在探测频率下的AC输入电压具有在探测频率下的AC输出电压频率响应；
ii)AC输入电压源，被配置为提供至少探测频率下的AC输入电压；和
iii)监视装置，其被配置为监视至少在探测频率下的AC输出电压，探测频率下的AC输出电压指示在监视时存储在聚合物中的数据，
其中所述单元包括至少顶部和底电极，纳米孔设置在电极之间，并且单元中具有流体，其中通过施加到电极的DC转向电压使聚合物移动通过纳米孔，其中电极，纳米孔和流体具有有效单元电容，当聚合物通过纳米孔时，所述单元电容改变,其中所述电感器与所述单元串联连接以产生谐振器，电感器和有效单元电容的组合与谐振频率响应相关。
13.权利要求12所述的装置，其中所述聚合物包含至少两种具有不同性质的单体或寡聚体，在所述探测频率下所述性质引起不同的谐振频率响应，所述响应指示至少两个不同的数据位。
14.一种用于在基于纳米孔的装置中合成包含至少两种不同单体或寡聚体的带电聚合物的方法，所述基于纳米孔的装置包括
含有缓冲溶液和试剂的一个或多个添加室或通道，用于将一种或多种单体或寡聚体以封闭的形式加入到带电聚合物中，使得在一个反应循环中只能加入一种单体或寡聚体；和
一个或多个含有缓冲溶液和试剂的解封闭室或通道，用于从带电聚合物中去除保护基团，
其中所述添加室或通道通过包含一个或多个纳米孔的一个或多个膜与解封闭室或通道分离，和
其中带电聚合物可以通过纳米孔，并且用于添加一种或多种单体或寡聚体的至少一种试剂不能通过纳米孔，
该方法包括
a)通过电吸引将具有第一端和第二端的带电聚合物的第一端移动到添加室或通道中，由此将单体或寡聚体以保护形式添加到所述第一端，
b)用以保护形式加入的单体或寡聚体将带电聚合物的第一端移动到解封闭室或通道中，从而从添加的单体或寡聚体中去除保护基团；
c)重复步骤a)和b)，其中步骤a)中加入的单体或寡聚体相同或不同，直至得到所需的聚合物序列；和
d)在加入一种或多种单体或寡聚体后，验证聚合物中单体或寡聚体的序列，其中使用权利要求1-11中任一项的方法验证该序列。
15.权利要求14所述的方法，其中所述带电聚合物是DNA。
16.权利要求14所述的方法，其中所述聚合物的第二端与表面结合。
17.权利要求14所述的方法，其中所述装置包括一个或多个第一添加室或通道，其含有适于添加第一类单体或寡聚体的试剂，和一个或多个第二添加室，其含有适于添加第二类单体或寡聚体的试剂，并且其中在步骤a)中，取决于是否需要添加第一类单体或寡聚体或第二类单体或寡聚体，将带电聚合物的第一端移入第一添加室或第二添加室中。
18.权利要求15所述的方法，其中用于向带电聚合物中添加一种或多种单体或寡聚体的试剂包括选自拓扑异构酶、DNA聚合酶或其组合的试剂。
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