CN110320288A - 含acei的组合物、有关物质的分离检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时测定马来酸依那普利叶酸及其有关物质的分析检测方法，通过高效液相色谱仪，以辛烷基键合硅胶为填充剂，pH为2.0～3.0的磷酸盐缓冲溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，检测波长为210nm～220nm，柱温40℃～60℃。本发明采用梯度洗脱实现各杂质的有效分离，各吸收峰的分离度＞5，进样精密度良好，RSD＜1％，方法耐用性好，系统适用性溶液稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及含血管紧张素转化酶抑制剂的组合物及其有关物质的分离检测方法，尤其涉及马来酸依那普利叶酸及其有关物质的分离检测方法。
背景技术
脑卒中的主要危险因素是高血压、高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血症、血糖异常、血脂异常等，其中高血压与Hcy的干预对脑卒中影响最大。对心脑血管常见危险因素的流行病学调查表明，中国人群高血压、高血糖、高胆固醇的患病率均明显低于美国，但Hcy水平则较美国人群高出50％。中国高血压患者中伴有血浆Hcy水平升高的比例高达75％，伴有Hcy水平升高的高血压称之为H型高血压，这也是导致我国脑卒中高发的重要原因。
由我国国家食品药品监督管理局2008年3月批准上市的一类新药马来酸依那普利叶酸片，为血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)依那普利和B族维生素叶酸组成的多效固定复方制剂，商品名为“依叶”，规格为5mg/0.4mg，5mg/0.8mg，10mg/0.8mg。其独特性在于，两种药物分别作用于降血压和降低血浆同型半胱氨酸(Hcy)两个环节，在有效控制血压的同时保护靶器官，减少靶器官的损害，降低冠心病、脑卒中等动脉粥样硬化性及血栓性心脑血管疾病的发生率。马来酸依那普利叶酸片针对多环节、多靶点，可达到更显著的预防脑卒中发生的目的，其也因此成为全球首个被批准用于治疗H型高血压的药物。
药品内在质量直接影响其临床疗效和安全性，有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。基于安全性和生产实际情况的考虑，可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大，危害人体健康、无效或影响药物稳定性的有关物质必须严格控制。因此，有关物质的检测是控制药物质量的关键指标。
叶酸中的有关物质为降解产物碟酸和中间体对氨基苯甲酰谷氨酸，马来酸依那普利中的有关物质为降解产物依那普利拉和依那普利双酮，具体结构如下：
由于马来酸依那普利片中，依那普利占主要成分，叶酸量较少，因此我们先参考药典中依那普利的方法进行有关物质的检测。
2015版中国药典公开了马来酸依那普利有关物质的检测方法，以磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH为2.2)-乙腈(75:25)为流动相，检测波长215nm，柱温50℃。但是用该方法检测马来酸依那普利，发现依那普利峰形不好，拖尾严重。
欧洲药典公开的马来酸依那普利有关物质的检测方法，流动相A：pH6.8的磷酸二氢钠溶液/乙腈＝95:5，流动相B：pH6.8的磷酸二氢钠溶液/乙腈＝34:66，梯度洗脱。但是用该方法检测马来酸依那普利叶酸片，发现马来酸、叶酸和碟酸的分离效果不好，还存在梯度峰。
文献《中国药学杂志》HPLC测定马来酸依那普利叶酸片中两组分的含量，2006，第41卷，第15期，p1181-1183报道了马来酸依那普利和叶酸含量的测定方法，采用反相高效液相色谱法，C18柱，以乙腈-40mmol/L磷酸氢二钾(40:60)(含10mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵，用磷酸调pH到7.5)为流动相，流速1.0mL/min，检测波长215nm，柱温60℃。用该方法检测马来酸依那普利叶酸片，只能检测出马来酸，叶酸，依那普利，依那普利拉和依那普利双酮，叶酸的有关物质碟酸和对氨基苯甲酰谷氨酸不能有效检出，且峰形不好，叶酸和依那普利峰拖尾。流动相中的十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子型表面活性剂，可溶于水，震荡时产生大量泡沫，长期使用对色谱柱损耗较大。
上述文献均不能同时检测出马来酸依那普利叶酸及其有关物质，因此需要寻找一种新的检测方法，可以一次进样，同时检测出马来酸、依那普利、依那普利拉、依那普利双酮、叶酸、碟酸和对氨基苯甲酰谷氨酸。
发明内容
为克服现有技术缺陷，本发明对检测波长、流动相比例、流动相pH、洗脱梯度、柱温、流速、稀释剂等条件进行筛选，确定了一种可以同时分离检测马来酸依那普利叶酸及其有关物质的分析方法，该方法可用于马来酸依那普利叶酸原料药、制剂及其有关物质的检测分析。
本发明提供了一种新的检测方法，该方法可以同时检测马来酸、依那普利、叶酸、碟酸、对氨基苯甲酰谷氨酸、依那普利拉和依那普利双酮7种物质，采用梯度洗脱实现各杂质的有效分离，各吸收峰的分离度＞5，进样精密度良好，RSD＜1％，方法耐用性好，系统适用性溶液稳定性好。
本发明目的在于提供一种用高效液相色谱同时检测马来酸依那普利叶酸及其有关物质的方法，其特征在于：
色谱柱以辛烷基键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐缓冲溶液和乙腈，按以下梯度洗脱：
| 时间(min) | 磷酸盐缓冲溶液(v/v) | 乙腈(v/v) |
| 0 | 85～95 | 15～5 |
| 5 | 85～95 | 15～5 |
| 25～40 | 70 | 30 |
| 60 | 70 | 30 |
| 70 | 85～95 | 15～5 |
| 75 | 85～95 | 15～5 |
检测波长：210nm～220nm；
柱温：40℃～60℃；
流速：1mL/min～2mL/min；
进样量：1μL～100μL。
本发明优选方案，所述的梯度条件：
| 时间(min) | 磷酸盐缓冲溶液(v/v) | 乙腈(v/v) |
| 0 | 85～95 | 15～5 |
| 5 | 85～95 | 15～5 |
| 25～30 | 70 | 30 |
| 60 | 70 | 30 |
| 70 | 85～95 | 15～5 |
| 75 | 85～95 | 15～5 |
本发明优选方案，所述的梯度条件：
| 时间(min) | 磷酸盐缓冲溶液(v/v) | 乙腈(v/v) |
| 0 | 85～95 | 15～5 |
| 5 | 85～95 | 15～5 |
| 25 | 70 | 30 |
| 60 | 70 | 30 |
| 70 | 85～95 | 15～5 |
| 75 | 85～95 | 15～5 |
本发明优选方案，所述的梯度条件：
| 时间(min) | 磷酸盐缓冲溶液(v/v) | 乙腈(v/v) |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 | 90 | 10 |
| 25 | 70 | 30 |
| 60 | 70 | 30 |
| 70 | 90 | 10 |
| 75 | 90 | 10 |
检测波长：210nm～220nm；
柱温：45℃～55℃；
流速：1.4mL/min～1.6mL/min；
进样量：10μL～20μL。
本发明优选方案，流动相中所述的磷酸盐缓冲溶液配制方法为取磷酸二氢钠或磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至2.0～3.0，所述的磷酸二氢钠或磷酸二氢钾溶液的浓度为0.01mol/L～0.03mol/L，优选0.01mol/L～0.02mol/L，更优选0.01mol/L。
本发明优选方案，流动相中所述的磷酸盐缓冲溶液的pH为2.4～2.6，进一步优选2.5。
本发明优选方案，所述的柱温为50℃。
本发明优选方案，所述的流速为1.5mL/min。
本发明优选方案，所述的进样量为20μL。
本发明优选方案，所述的检测波长为215nm。
本发明优选方案，检测的有关物质选自以下杂质：
在一些实施例中，配制定位溶液或系统适用性溶液所用的稀释剂为pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液，体积比为9:1，所述的磷酸盐缓冲溶液的配制方法为取0.01mol/L磷酸二氢钠溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH至6.8，加水定容至1L。
本发明的方法与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明的方法能在同一个高效液相色谱条件下同时分离马来酸、依那普利、依那普利拉、依那普利双酮、叶酸、碟酸和对氨基苯甲酰谷氨酸7种物质，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高工作效率，适合工业大生产的要求；
(2)本发明的方法所用仪器设备及试剂均是常规用品，实验参数无苛刻条件，成本低；
(3)本发明采用梯度洗脱实现各杂质的有效分离，各吸收峰的分离度＞5，进样精密度良好，RSD＜1％；
(4)本发明方法耐用性好，流速在1.4mL/min～1.6mL/min、流动相pH值在2.0～3.0、柱温在45℃～55℃，磷酸缓冲盐浓度在0.01mol/L～0.03mol/L，缓冲盐为钠盐或钾盐，检测波长在210nm～220nm之间变化，对马来酸依那普利叶酸及其有关物质的检测无明显变化；
(5)本发明检测方法中配制系统适用性溶液所用的稀释剂为pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液，体积比为9:1，系统适用性溶液稳定，马来酸依那普利叶酸及其有关物质在该稀释剂中可以完全溶解，同时室温放置12小时含量无明显变化，稳定性好。
附图说明
图1空白溶液的色谱图；
图2马来酸对照品的色谱图，保留时间t＝4.773min；
图3叶酸对照品的色谱图，保留时间t＝12.947min；
图4马来酸依那普利对照品的色谱图，马来酸保留时间t＝4.890min，依那普利保留时间t＝28.083min；
图5依那普利拉对照品的色谱图，保留时间t＝19.530min；
图6依那普利双酮对照品的色谱图，保留时间t＝48.857min；
图7碟酸对照品的色谱图，保留时间t＝14.800min；
图8对氨基苯甲酰谷氨酸对照品的色谱图，保留时间t＝5.920min；
图9马来酸依那普利、叶酸及其有关物质的分离度色谱图，保留时间4.913min的为马来酸，保留时间6.123min的为对氨基苯甲酰谷氨酸，保留时间12.923min的为叶酸，保留时间14.780min的为碟酸，保留时间19.537min的为依那普利拉，保留时间28.093min的为依那普利，保留时间48.930min的为依那普利双酮；
图10按欧洲药典方法检测的色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步解释和说明本发明。本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，因此在本发明的方法的基础上对本发明的简单改进或替换均属本发明要求保护的范围。
以下对照品购于中国食品药品检定研究院(简称“中检所”)
马来酸依那普利对照品批号10075-201203
叶酸对照品批号10074-201214
马来酸对照品批号190015-201302
依那普利拉对照品批号100707-200401
依那普利双酮对照品批号100706-200902
碟酸对照品批号006AD9
对氨基苯甲酰谷氨酸对照品01KR25
HPLC：戴安U3000DAD高效液相色谱仪
紫外：TU-1810紫外分光光度计
乙腈：默克色谱纯
水：超纯水
“约”在本发明中是指在所述数值的±10％以内；
分离度，用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。用R表示，R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R<1时，两峰有部分重叠，当R＝1.0时，分离度可达98％，当R＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志，中国药典规定R应大于1.5。
实施例1检测波长的确定
用紫外分光光度计分别测定依那普利、叶酸对照品及其有关物质在200～400nm波长范围的吸收波长，结果发现叶酸、碟酸和对氨基苯甲酰谷氨酸在285nm和末端215nm均有最大吸收，马来酸、依那普利、依那普利拉、依那普利双酮均有末端吸收。在285nm下依那普利几乎无吸收，因此确定215nm为检测波长。
实施例2色谱条件的筛选
2.1稀释剂的选择
表1马来酸依那普利和叶酸在不同稀释剂中的溶解情况
由表1可以看出，叶酸在磷酸盐缓冲溶液/乙腈＝75:25和28.6g/L的碳酸钠溶液中溶解性不好，在0.01mol/L～0.1mol/L的碳酸钠溶液完全溶解，因此可选0.01mol/L～0.1mol/L的碳酸钠溶液做稀释剂。
2.2检测条件的选择
表2马来酸依那普利、叶酸及其有关物质检测条件的筛选
编号1检测的样品为马来酸依那普利对照品，编号2～3检测的样品为马来酸依那普利对照品、叶酸对照品和马来酸对照品的混合溶液，编号4～7检测的样品为马来酸依那普利对照品、叶酸对照品、碟酸对照品、对氨基苯甲酰谷氨酸对照品、依那普利拉对照品和依那普利双酮对照品的混合溶液。
实验结果发现，稀释剂为碳酸钠溶液时，依那普利拉增加明显，检测样品稳定性不好。选pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液(体积比为9:1)做稀释剂，样品可以溶解且稳定性良好，因此确定pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液(体积比为9:1)作为稀释剂。
当采用以辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液/乙腈，缓冲溶液为0.01mol/L磷酸二氢钠溶液，用磷酸调pH至2.5时，马来酸、依那普利、依那普利拉、依那普利双酮、叶酸、碟酸和对氨基苯甲酰谷氨酸之间的分离度达到了较好的效果，梯度程序如表3所示。
表3梯度程序
| 时间(min) | 磷酸盐缓冲溶液(v/v) | 乙腈(v/v) |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 | 90 | 10 |
| 25 | 70 | 30 |
| 60 | 70 | 30 |
| 70 | 90 | 10 |
| 75 | 90 | 10 |
实施例3系统适用性
色谱条件：戴安U3000型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；色谱柱以辛烷基键合硅胶为填充剂；紫外检测波长：215nm；流动相：磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L磷酸二氢钠溶液，用磷酸调pH至2.5)和乙腈，梯度程序同表3；柱温50℃，进样体积20μL，流速1.5mL/min。
稀释剂的配制：
取0.01mol/L磷酸二氢钠溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8，加水定容至1L，作为磷酸盐缓冲溶液。
取90mL磷酸盐缓冲溶液和10mL乙腈，摇匀，作为稀释剂。
定位溶液的配制：
取叶酸对照品，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1mL含0.2mg的溶液，作为叶酸的定位溶液。
取马来酸对照品、马来酸依那普利对照品、依那普利拉对照品、依那普利双酮对照品、碟酸对照品和对氨基苯甲酰谷氨酸对照品，精密成定，分别用稀释剂溶解并定量稀释制成每1mL含0.1mg的溶液，分别作为马来酸、马来酸依那普利、依那普利拉、依那普利双酮、碟酸和对氨基苯甲酰谷氨酸的定位溶液。
系统适用性溶液的配制：
分别取马来酸依那普利、依那普利拉、依那普利双酮和叶酸的定位溶液各1mL，碟酸和对氨基苯甲酰谷氨酸的定位溶液各2mL，置10mL容量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀得系统适用性溶液。
取稀释剂(空白)、定位溶液和系统适用性溶液各20μL，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。其中，空白溶液为图1、定位溶液为图2～8，系统适用性溶液为图9，本方法对马来酸依那普利叶酸及其有关物质分离情况见表4。
表4马来酸依那普利叶酸及有关物质的分离情况
| 名称 | 保留时间/min | 峰面积 | 理论板数 | 分离度 |
| 马来酸 | 4.913 | 389624.904 | 17669 | 6.53 |
| 对氨基苯甲酰谷氨酸 | 6.123 | 533673.085 | 12013 | 34.56 |
| 叶酸 | 12.923 | 715774.174 | 91304 | 10.76 |
| 碟酸 | 14.780 | 925639.553 | 114073 | 11.97 |
| 依那普利拉 | 19.537 | 452614.906 | 15800 | 12.93 |
| 依那普利 | 28.093 | 266710.658 | 25408 | 29.77 |
| 依那普利双酮 | 48.930 | 304089.467 | 78519 | / |
结论：各杂质与马来酸、叶酸和依那普利主峰之间均达到有效分离，分离度≥5，空白溶剂无干扰，说明本方法适用于测定马来酸依那普利叶酸及其有关物质。
实施例4进样精密度实验
取系统适用性溶液，连续进样6次，进样量20μL，记录色谱图，并对结果进行评价，结果见表5。
表5进样精密度实验结果
结论：6次测定结果的相对标准偏差RSD小于1％，表明本实验进样精密度良好。
实施例5溶液稳定性
取系统适用性溶液，分别于0，2h，4h，8h，12h的时间点进样，进样量为20μL，记录色谱图，结果见表6。
表6系统适用性溶液稳定性实验
结果：系统适用性溶液室温放置12h小时，各成分含量无明显变化，稳定性好，由此可以说明马来酸依那普利叶酸及其有关物质在稀释剂中稳定，pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液(体积比为9:1)适合作为稀释剂。
实施例6耐用性
通过将色谱条件的流速、流动相pH值、磷酸盐缓冲溶液、检测波长、柱温等进行微小变动，测定结果不受影响的承受程度，耐用性结果见表7～表11。
表7不同流速的测试结果
结论：流速在1.4mL/min～1.6mL/min之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
表8流动相不同pH值的测试结果
结论：流动相pH在2.0～3.0之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
表9不同浓度的磷酸盐缓冲溶液的测试结果
结论：流动相中缓冲盐浓度在0.01mol/L～0.03mol/L之间变化，缓冲盐为钠盐或钾盐，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
表10不同检测波长的测试结果
结论：检测波长在210nm～220nm之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
表11不同柱温的测试结果
结论：柱温在45℃～55℃之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
Claims (10)
1.一种用高效液相色谱检测马来酸依那普利叶酸及其有关物质的方法，其特征在于：
色谱柱以辛烷基键合硅胶为填充剂，流动相为磷酸盐缓冲溶液和乙腈，按以下梯度洗脱：
检测波长：210nm～220nm；
柱温：40℃～60℃；
流速：1mL/min～2mL/min；
进样量：1μL～100μL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
梯度条件为：
检测波长：210nm～220nm；
柱温：45℃～55℃；
流速：1.4mL/min～1.6mL/min；
进样量：10μL～20μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于流动相中所述的磷酸盐缓冲溶液配制方法为取磷酸二氢钠或磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至2.0～3.0，所述的磷酸二氢钠或磷酸二氢钾溶液的浓度为0.01mol/L～0.03mol/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于流动相中所述的磷酸盐缓冲溶液的pH为2.5，所述的磷酸二氢钠溶液的浓度为0.01mol/L～0.02mol/L。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的柱温为50℃。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的流速为1.5mL/min。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的进样量为20μL。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的检测波长为215nm。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于检测的有关物质选自以下杂质：
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，配制定位溶液或系统适用性溶液所用的稀释剂为pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液和乙腈的混合溶液，体积比为9:1。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |