CN110305919A - 利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,该方法包括以下步骤:将桑黄发酵得到发酵液,经离心,过滤,得发酵滤液;调整发酵滤液pH值至4‑6,然后加入大孔树脂,在20‑30℃,145‑155r/min条件下震荡22‑26h;将吸附平衡的大孔树脂抽滤,洗净表面的溶液后,放入容器中,并加入体积百分比为70%‑90%的乙醇溶液,在20‑30℃,转速145‑155r/min条件下震荡22‑26h,然后对解析液进行浓缩,纯化,制得桑黄素。本发明通过生物发酵法大量生产桑黄素,再通过大孔树脂富集分离,能够克服常规溶剂提取分离桑黄素的局限性,且该方法操作简单,可适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于食药用菌活性成分提取技术领域,具体涉及一种利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法。
背景技术
桑黄又名桑耳、胡孙眼、梅树菌,是一种名贵的多年生大型食药用菌,属担子菌亚门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、针层孔菌属(Phelliunus),它主要寄生于桑树、桦树、杨树等阔叶树的树干上,有“森林黄金”的美称。据目前研究表明,桑黄中所含有各种化学物质不下百种,并且这些化学物质大多数都有药理活性,能够治疗多种疾病,有良好的应用和开发前景。
桑黄素属于多酚类化合物,此类化合物可以作为天然色素,而且具有很好的抗氧化、清除自由基、抗肿瘤和降血糖的药用作用,具有很高的利用价值。但是由于该类化合物的合成工艺比较困难,难以通过人工合成的方式进行量产,常规溶剂提取法也无法高效地富集此类化合物,因此限制了该类化合物的开发与利用。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题,本发明提供一种利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,该方法操作简单,能高效富集桑黄素,可适用于工业化生产。
为实现上述目的,本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,包括以下步骤:
(1)将桑黄发酵得到发酵液,经离心,过滤,得发酵滤液;
(2)吸附:调整发酵滤液pH值至4-6,然后加入大孔树脂,在20-30℃,145-155r/min条件下震荡22-26h,此时达到吸附平衡;其中,发酵滤液与大孔树脂的比例关系为1mL:(1-4)g;
(3)解析:将吸附平衡的大孔树脂抽滤,洗净表面的样品溶液后,放入容器中,并加入体积百分比为70%-90%的乙醇溶液,在20-30℃,转速145-155r/min条件下震荡22-26h,此时达到解析完全,然后对解析液进行浓缩,纯化,制得桑黄素。
进一步地,步骤(1)具体过程为:将桑黄接种到液体培养基中,置于26-28℃,160-180r/min条件下培养6-8天,得种子液,将种子液按体积百分比为8-12%的接种量接种到发酵罐中,在26-28℃,160-180r/min,通气量为0.5-0.8vvm条件下培养6-8天,得发酵液,发酵液经离心,过滤,得发酵滤液。
进一步地,液体培养基由以下组分组成:葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、蛋白胨2g、酵母粉2g和去离子水1L。
进一步地,制备种子液时条件为:28℃,180r/min,培养7天。
进一步地,将种子液按体积百分比为10%的接种量接种到发酵罐中,在28℃,180r/min,通气量为0.6vvm条件下培养8天。
进一步地,步骤(2)中调整发酵滤液pH值至5。
进一步地,步骤(2)中大孔树脂型号为ADS-17。
进一步地,步骤(2)中发酵滤液与大孔树脂的比例关系为1mL:4g。
进一步地,步骤(3)中加入的乙醇溶液的体积百分比为70%。
进一步地,吸附和解析条件均为20℃,150r/min,时间为24h。
本发明提供的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,具有以下有益效果:
本发明通过生物发酵法大量生产桑黄素,再通过大孔树脂富集分离,能够克服常规溶剂提取分离桑黄素的局限性,且该方法操作简单,能高效富集桑黄素,可适用于工业化生产。
附图说明
图1为发酵滤液与桑黄素标准液紫外图谱。
图2为桑黄素标准曲线图。
图3为不同培养基发酵产桑黄素的比较结果图。
图4为不同培养基对树脂吸附桑黄素的影响结果图。
图5为不同pH对发酵滤液紫外吸收图谱的影响结果图。
图6为不同pH对树脂吸附桑黄素的影响结果图。
图7为桑黄素浓度对树脂吸附的影响结果图。
图8为料液比对树脂吸附桑黄素的影响结果图。
图9为不同温度对树脂吸附桑黄素的影响结果图。
图10为不同洗脱剂对解析率的影响结果图。
图11为不同洗脱浓度的洗脱剂对解析率的影响结果图。
具体实施方式
实施例1
一种利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,包括以下步骤:
(1)种子液的制备:取生长良好的桑黄平板,用灭菌后的的打孔器,打取直径为0.5cm生长一致的菌饼5块,加入到含有100mL液体培养基的250mL三角瓶中,恒温28℃,转速180r/min,培养7天,然后用高速匀浆机将菌丝球打碎,制得种子液;
其中,桑黄购于中国农业科学研究院菌种保藏中心,编号为ATCC36121。
液体培养基由以下组分组成:葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、蛋白胨2g、酵母粉2g和去离子水1L;
(2)发酵培养:将种子液按体积百分比为10%的接种量接种到发酵罐中,发酵罐装液量为4.5L,然后在28℃,180r/min,通气量为0.6vvm条件下培养8天,得发酵液;
(3)过滤:将发酵液经过滤纸过滤,除去菌丝球,得发酵滤液,该发酵滤液中桑黄素浓度为6.78mg/mL;
(4)吸附:调整发酵滤液pH值至5,然后加入大孔树脂,在20℃,150r/min条件下震荡24h,此时达到吸附平衡;其中,发酵滤液与大孔树脂的比例关系为1mL:4g;大孔树脂为ADS-17;
(5)解析:将吸附平衡的大孔树脂抽滤,洗净表面的样品溶液后,放入容器中,并加入体积百分比为70%的乙醇溶液,在20℃,转速150r/min条件下震荡24h,此时达到解析完全,然后对解析液进行浓缩,纯化,制得桑黄素。
桑黄素的核磁共振波谱分析数据如表1所示,化合物碳原子编号见分子式:
表1核磁共振波谱数据
上述发酵滤液中桑黄素浓度的测定方法如下:
由于桑黄素的化学结构上具有不饱和的共轭结构,在紫外区有较强的吸收,因此桑黄素含量的测定可以直接采用紫外吸收法测定。具体过程为:称取纯化的桑黄素20mg,用70%乙醇溶液溶解并定容于50mL容量瓶中,作为标准液。吸取桑黄素标准液200μL加入70%乙醇1.8mL混匀,扫描300nm-600nm的光谱,并记录最大吸收波长,然后准确吸取发酵滤液200μL,同上方法测量其紫外光谱,比较发酵滤液紫外吸收图谱与桑黄素标准液紫外吸收图谱,如果图谱的最大吸收波长相似,则可以将桑黄素标准液的最大紫外吸收波长作为发酵液中桑黄素测量最佳的波长。
标线制作:准确吸取桑黄素(LA)溶液0、20、50、100、200、300μL,置于石英比色皿中,加入70%乙醇至2.0mL,混匀,在最大吸收波长处测其吸光度,以桑黄素的实际浓度(X)对吸光度(Y)线性回归,得其回归方程。
发酵滤液中桑黄素测量:取发酵滤液100μL,加入1.9mL 70%乙醇测量其在最佳吸收波长处的吸光度。按回归方程计算发酵液中的桑黄素含量。
发酵滤液和桑黄素标准液的全波长扫描结果见图1。由图1可知,发酵滤液在300-600nm之间的紫外吸收图谱与桑黄素纯品相似,发酵液的最大吸收为373nm,桑黄素纯品的最大吸收为365nm,因此可以选择365nm作为发酵液中桑黄素测定的波长。
以吸光度对桑黄素纯品浓度作标准曲线,结果见图2。由图2可知经线性回归得到吸光度与发酵液桑黄素浓度之间的方程为y=111.67x-1.4097,R2=0.999,测得发酵液在365nm下的紫外吸光度,带入方程可得发酵液中的桑黄素含量。
实施例2
用大孔树脂HPD600、DM130、D101、AB-8和HPD5000分别替换实施例1中的大孔树脂ADS-17,测定吸附平衡前后发酵滤液中桑黄素吸光度的变化情况,按照公式1-1和1-2计算平衡吸附量qe及吸附率ε1。同时测定解析液中桑黄素的吸光度,按公式1-3计算解析率ε2。
式中,qe为平衡吸附量(μg/g湿树脂),C为解析液中桑黄素浓度(μg/mL),C0为发酵液中桑黄素初始浓度(μg/mL),Ce为发酵液中桑黄素平衡浓度(μg/mL),V为发酵液的体积(mL),W为树脂质量(g湿重)。
表2不同大孔树脂的物理性能及吸附效果比较
由表2可知,大孔吸附树脂平衡吸附量和吸附率较大的是ADS-17和HPD600,其次是DM130和D101,较差的是AB-8和HPD5000。解吸附率最大为ADS-17,达到76.04%。大孔树脂吸附性能大小受到树脂极性,空间结构(孔径、比表面积、孔容)以及桑黄素分子量、结构性质的综合影响。桑黄发酵滤液中的桑黄素含酚羟基,使得桑黄素具有一定的极性和亲水性,生成氢键的能力较强,有利于被极性树脂和容易形成氢键的树脂吸附。HPD600是含有酰胺基,极性大,ADS-17兼具表面吸附和氢键吸附双重作用,因此这两种树脂吸附的桑黄素LA量在被测试的大孔树脂中较大。以70%乙醇为洗脱剂时,ADS-17解析率大,综上所述选用ADS-17大孔树脂吸附桑黄发酵滤液中桑黄素。
实施例3
用其他7种培养基分别替换实施例1中的液体培养基,实施例1中的液体培养基记为蘑菇完全培养基(MCM),其余7种培养基分别为沙氏培养基(SDA)、马铃薯土豆培养基(PDA)、查氏培养基(CAZ)、马丁氏培养基(MA)、真菌2号培养基(FM2)、高氏1号培养基(GSA)、刘伟桑黄培养基(LW)。
沙氏培养基(SDA):葡萄糖40g,蛋白胨10g,去离子水1L。
马铃薯土豆培养基(PDA):土豆200g,葡萄糖20g,去离子水1L。
查氏培养基(CAZ):硝酸钠3g,磷酸二氢钾1g,七水合硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g,硫酸铁0.01g,蔗糖30g,去离子水1L。
马丁氏培养基(MA):磷酸氢二钾1g,七水合硫酸镁0.5g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,去离子水1L。
真菌2号培养基(FM2):甘露醇20g,葡萄糖10g,酵母粉3g,麦芽糖20g,味精10g,磷酸二氢钾0.5g,七水合硫酸镁0.3g,去离子水1L。
高氏1号培养基(GSA):硝酸钾1g,淀粉20g,磷酸氢二钾0.5g,七水合硫酸镁0.5g,氯化钠0.5g,硫酸亚铁0.01g,去离子水1L。
刘伟桑黄发酵培养基(LW):葡萄糖10g,酵母粉12g,蛋白胨12g,磷酸二氢钾1.02g,硫酸镁1.5g,去离子水1L。
每种培养基设置三个平行,分别取100μL发酵滤液,测量发酵滤液中的桑黄素的含量,测定结果见图3。
由图3可知,沙氏培养基、刘伟桑黄培养基、蘑菇完全培养基和马铃薯葡萄糖培养基的菌丝产量和桑黄素产量都比较高,其中蘑菇完全培养基菌丝产量和桑黄素产量均最高,分别达到9.84g/L和8.17mg/mL。
此外,测定沙氏培养基、刘伟桑黄培养基、蘑菇完全培养基和马铃薯葡萄糖培养基发酵滤液中大孔树脂吸附平衡前后桑黄素的吸光度,计算吸附率和饱和吸附量。测定解析后解析液中的桑黄素的吸光度,计算解析率,测定结果见图4。
由图4可知,蘑菇完全培养基不论是吸附率、解析率还是饱和吸附量均高于其他三种培养基。因此,蘑菇完全培养基为桑黄发酵培养产桑黄素以及树脂吸附最优的培养基。
实施例4
实施例1中调整发酵滤液的pH值5,而实施例4中将发酵滤液的pH值分别调整为2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13代替实施例1中的5,每个pH做三个平行,测定吸附前后发酵滤液中桑黄素的吸光度,计算树脂吸附平衡时的吸附量和吸附率。
不同pH对发酵滤液紫外吸收图谱的影响结果见图5,不同pH对树脂吸附影响见图6。
由图6可知,饱和吸附量和吸附率都先增加后减小,pH为5时吸附效果最佳,饱和吸附量和吸附率分别达到14.38mg/g和96.42%。pH较小时吸附量较低,可能是因为酸性太强,桑黄素LA变化成佯盐,不容易被吸附。由光谱图5可看出,pH较大时,桑黄素的特征吸收峰消失了,说明强碱性条件下会使桑黄素共轭体系结构发生变化,不利于桑黄素LA的吸附,故最佳吸附pH为5。
实施例5
将实施例1中的发酵滤液用去离子水稀释,使得发酵滤液中桑黄素的浓度分别为5.57mg/mL、4.59mg/mL、3.58mg/mL、2.97mg/mL、1.96mg/mL、1.07mg/mL、0.38mg/mL,代替实施例1中的6.78mg/mL,每个浓度做三个平行。然后测定吸附前后发酵滤液中桑黄素的浓度,并计算各浓度下树脂吸附平衡时的吸附量和吸附率。
发酵滤液中桑黄素的浓度对树脂吸附的影响结果见图7。由图7可知,在该实施例的浓度范围内,桑黄素浓度与饱和吸附量成正比关系,桑黄素浓度越高,树脂吸附桑黄素也就越多,并且吸附率均在95%以上。因此在吸附前不需对发酵滤液进行稀释
实施例6
发酵滤液为10mL,加入不同重量的大孔树脂,大孔树脂和发酵滤液的比例为1:1-1:100g/mL,代替实施例1中的4:1,测定不同重量ADS-17湿树脂对吸附前后发酵滤液中桑黄素的影响,并计算各料液比条件下树脂吸附平衡时的吸附量和吸附率,结果见图8。
由图8可知,在一定体积的发酵滤液前提下,树脂越多,吸附率也就越高,料液比为1:1时的吸附率为97.05%,料液比为1:100时的吸附率只为20.79%,而当料液比为1:4时,吸附率比料液比为1:1只下降了1.71%,树脂用量却少了4倍。综合考虑,料液比为1:4时,综合性能最优。
实施例7
大孔树脂对发酵滤液中桑黄素的吸附温度分别设定为30℃、40℃和50℃,代替实施例1中的20℃,测定吸附前后发酵液中桑黄素的吸光度,计算树脂吸附平衡时的吸附量,结果见图9。
由图9可知,ADS-17树脂的平衡吸附量随温度的升高而降低,在20℃条件下吸附效果最佳。
实施例8
用甲醇、丙酮、乙腈、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、叔丁醇、乙酸乙酯作为洗脱剂,代替实施例1中的乙醇,测定解析液中桑黄素的含量,计算解析率,结果见图10。
由图10可知,不同的洗脱也对解析率影响差别较大,当乙醇作为洗脱液时,解析率最高,达到99%,虽然其他部分洗脱液也有较高的解析率,当考虑到成本和毒性,选择乙醇作为洗脱液最佳。
实施例9
分别用0-100%乙醇溶液代替实施例1中的70%乙醇溶液,测定解析液中桑黄素的吸光度,计算解析率,结果见图11。
由图11可知,随着乙醇浓度的增加,解析率也越来越大,当乙醇浓度达到70%后,解析率达到平衡,因此,选择70%乙醇溶液作为洗脱剂,解析率最高。
Claims (10)
1.利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将桑黄发酵得到发酵液,经离心,过滤,得发酵滤液;
(2)吸附:调整发酵滤液pH值至4-6,然后加入大孔树脂,在20-30℃,145-155r/min条件下震荡22-26h;其中,发酵滤液与大孔树脂的比例关系为1mL:(1-4)g;
(3)解析:将吸附平衡的大孔树脂抽滤,洗净表面的溶液后,放入容器中,并加入体积百分比为70%-90%的乙醇溶液,在20-30℃,转速145-155r/min条件下震荡22-26h,然后对解析液进行浓缩,纯化,制得桑黄素。
2.根据权利要求1所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,步骤(1)具体过程为:将桑黄接种到液体培养基中,置于26-28℃,160-180r/min条件下培养6-8天,得种子液,将种子液按体积百分比为8-12%的接种量接种到发酵罐中,在26-28℃,160-180r/min,通气量为0.5-0.8vvm条件下培养6-8天,得发酵液,发酵液经离心,过滤,得发酵滤液。
3.根据权利要求2所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,液体培养基由以下组分组成:葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、蛋白胨2g、酵母粉2g和去离子水1L。
4.根据权利要求2所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,制备种子液时条件为:28℃,180r/min,培养7天。
5.根据权利要求2所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,将种子液按体积百分比为10%的接种量接种到发酵罐中,在28℃,180r/min,通气量为0.6vvm条件下培养8天。
6.根据权利要求1所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,步骤(2)中调整发酵滤液pH值至5。
7.根据权利要求1所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,步骤(2)中大孔树脂型号为ADS-17。
8.根据权利要求1所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,步骤(2)中发酵滤液与大孔树脂的比例关系为1mL:4g。
9.根据权利要求1所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,步骤(3)中加入的乙醇溶液的体积百分比为70%。
10.根据权利要求1所述的利用大孔树脂从桑黄中静态吸附桑黄素的方法,其特征在于,吸附和解析条件均为20℃,150r/min,时间为24h。
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刘奥: "桑黄(Inonotus baumii)发酵与桑黄素LA分离耦合工艺研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
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