CN1102959C - 营养酸模sod的提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体地说是一种超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法。本发明包括原料的预处理、25-35%硫酸铵沉淀、85-95%硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100柱层析五步。本发明所获得的SOD粗酶可用于医药、兽药、作物抗逆增产剂、日用化妆品、保健食品和保健饮料。
Description
本发明属于生物技术领域，具体地说是一种SOD超氧化物歧化酶的提取方法。
SOD(超氧化物歧化酶)酶是生物重要保护酶之一，能增强机体抗逆能力，防衰老。营养酸模是采用不同地区野生酸模通过基因工程培育而成的多年生物种，目前，国内主要用于生产实践的是鲁梅克斯杂交酸模。营养酸模具有优质、高产、速生、耐寒、耐旱、耐盐碱等生物学特性，适于盐渍、风沙、荒漠化土地生长。营养酸模的茎叶在抽茎期所含叶蛋白高达30％以上，仅次于大豆籽粒，另外，它还含有丰富的色素、氨基酸、维生素和微量元素。本申请人经过测定，发现营养酸模中含有较高的SOD活性，但至今没有人对其提取工艺进行深入的研究。
本发明的目的在于提出一种从营养酸模中提取SOD粗酶的生产工艺。
以下叙述本发明的主要内容：
一种营养酸模SOD粗酶的提取工艺，包括原料的预处理、25-35％硫酸铵沉淀、85-95％硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100柱层析五步，其特征在于向粗提液加入硫酸铵，使粗提液中硫酸铵达到25-35％饱和度，过滤后，向滤液中再加入硫酸铵使其饱和度达到85-95％。
图1为本发明的工艺流程图。下面结合附图叙述本发明实施过程：
1.原料的预处理：将新鲜营养酸模的根、茎和叶通过组织捣碎机捣碎，残余的组织块面积小于2mm2；将捣碎的组织匀浆离心，弃除沉淀残渣，保留上清液作为粗提液。
2. 25-35％硫酸铵沉淀：将离心后的获得的粗提液加入硫酸铵后，使粗提液中硫酸铵的饱和度达到25-35％，在室温(20-28℃)下搅拌45-60分钟，静置100-120分钟即可进行离心或过滤。
3. 85-95％硫酸铵沉淀：在25-35％硫酸铵沉淀后的滤液中，加入硫酸铵使其饱和度达到85-95％，在室温(20-28℃)下搅拌45-60分钟，离心10000-13000rpm，将沉淀溶于最小量的5mM pH7.8磷酸钾缓冲液中(含2mMEDTA)，然后用上述缓冲液和SephadexG-25脱盐。
4.Sephadex G-25脱盐：Sephadex G-25柱，预先用5mM pH7.8的磷酸钾缓冲液平衡；将经过85-95％硫酸铵沉淀的酶样溶解在最小量的5mM pH7.8磷酸钾缓冲液中，经过SephadexG-25柱层析，收集酶液。用奈氏试剂检测收集脱盐的SOD酶液。
5.Sephadex G-100柱层析：预先用pH7.8、5mM的磷酸钾缓冲液平衡Sephadex G-100柱，将脱盐后的粗酶提取液加入到G-100柱中，采用全自动分布收集系统收集。将SOD活力高的部分收集。测SOD活力。
6.粗酶提取过程及制剂的质量要求：粗酶提取液经过Sephadex G-100柱层析后，比活达1300以上，产率达65％-75％；SOD粗酶制剂酶活＞25000IU/g。
本发明较已有技术相比具有如下典型优点：
1、本发明创立的营养酸模SOD提取工艺可用于从营养酸模提取生产SOD粗酶。所获得的SOD粗酶既可用于医药、兽药、作物抗逆增产、日用化妆品、保健食品和保健饮料等，还可进一步用于提纯SOD精酶和SOD结晶以及酶的性质、结构、氨基酸顺序测定的研究，具有广泛的开发应用前景。
2、该工艺流程简单，损耗小，能耗小，节约能源，成本低，且无污染。
3、本发明经过反复试验，选择25-35％的硫酸铵沉淀，SOD酶无损失；，选择85-95％的硫酸铵沉淀，可使SOD酶全部沉淀。
以下叙述本发明的实施例：
实施例1
用100公斤营养酸模提取300克SOD粗酶
1.原料的预处理：取100公斤新鲜营养酸模用组织捣碎机充分捣碎，捣碎的组织匀浆4000rpm离心10分钟，弃沉淀留上清，获得粗提液72.5公斤。
2. 30％硫酸铵沉淀：将粗提液加入硫酸铵，使粗提液中硫酸铵达到30％饱和度。在23℃下搅拌55分钟，静置110分钟，采用膜系统过滤获得滤液。
3. 90％硫酸铵沉淀：在30％硫酸铵沉淀后的滤液中，加入硫酸铵使其饱和度达到90％，在23℃下搅拌60分钟，离心12000rpm，将沉淀溶于最小量的5mM pH7.8磷酸钾缓冲液中(含2mM EDTA)。
4. Sephadex G-25脱盐：Sephadex G-25柱，预先用5mM pH7.8的磷酸钾缓冲液平衡；将经过90％硫酸铵沉淀的酶样溶解在最小量的5mM pH7.8磷酸钾缓冲液中，经过SephadexG-25柱层析，收集酶液。得到60公斤粗酶提取液。
5. Sephadex G-100柱层析：Sephadex G-100柱，预先用pH7.8、5mM的磷酸钾缓冲液平衡；将60公斤脱盐后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述缓冲液洗脱。采用全自动分布收集系统收集洗脱液，合并SOD活力高的收集液。得到SOD粗酶液浓缩、冷冻干燥得到SOD粗酶制剂300克干粉，酶活为27500IU/g。
实施例2
SOD的测定
SOD的测定方法采用NBT光化学法，具体如下：
(1)设备：752型分光光度计；台式离心机；光照培养箱；冰箱；10ml小烧杯等。
(2)试剂：氯化硝基氮蓝四唑(NBT)——上海前进制剂厂生产
L-甲硫氨酸(L-Met)——上海康达氨基酸厂生产
乙二胺四乙酸(EDTA)——北京化工厂生产
核黄素(VB2)——北京西中化工厂生产
(3)反应液的配制
NBT反应液的制备：配制pH7.8，50mmol/L的磷酸缓冲液1000ml，加入1.933mg的L-Met，待完全溶解后，放入45.8mg NBT，0.47mg核黄素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mgEDTA，溶液终浓度：Met为13mmol/L；NBT为6.3×10-3mmol/L；核黄素为1.3×10-3mmol/L；EDTA为0.1mmol/L，置于棕色试剂瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1个月。
(4)材料的预处理
脐橙果肉用研钵研碎，按照果肉∶50mM磷酸缓冲液＝1∶2的比例加入缓冲液，10000rpm离心10分钟，取上清液进行SOD酶活测定。
(5)测定方法
吸取30μl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3mlNBT反应液，混匀，在28℃SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20分钟(光照为4000勒克司)，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设3次重复，整个测定过程除光化反应外，均在避光或弱光条件下进行。同时测试过程中以美国″Sigma″公司、上海宝安公司的标准酶和贵州老来福药业公司生产的SOD口服液作为测试对照。
(6)计算
式中：CK——空白对照透光度
n——样品稀释倍数
A——品透光度
酶活单位：IU/g
Claims (1)
1、一种营养酸模SOD粗酶的提取方法，其特征在于提取步骤为：
(1)原料预处理
新鲜营养酸模的根、茎和叶通过组织捣碎机捣碎，残余的组织块面积小于2mm2；将捣碎的组织匀浆离心，弃沉淀残渣，获得上清液作为粗提液；
(2)25-35％硫酸铵沉淀
将粗提液加入硫酸铵，使粗提液中硫酸铵饱和度达到25-35％，在室温20-28℃下搅拌45-60分钟，静置100-120分钟进行离心或过滤；
(3)85-95％硫酸铵沉淀
在25-35％硫酸铵沉淀后的滤液中，加入硫酸铵使其饱和度达到85-95％，在室温20-28℃下搅拌45-60分钟，离心10000-13000rpm，将沉淀溶于最小量的5mM pH7.8磷酸钾缓冲液中，该缓冲液含有2mM EDTA，然后用上述缓冲液和SephadexG-25脱盐；
(4)Sephadex G-25脱盐
Sephadex G-25柱，预先用pH7.8 5mM的磷酸钾缓冲液平衡；将经过85-95％硫酸铵沉淀的酶样溶解在最小量的5mM pH7.8磷酸钾缓冲液中，经过Sephadex G-25柱层析，收集酶液，并用奈氏试剂检测收集脱盐的SOD酶液；
(5)Sephadex G-100柱层析
Sephadex G-100柱，预先用pH7.8 5mM的磷酸钾缓冲液平衡；将脱盐后的粗酶提取液加入到G-100柱中，采用全自动分布收集系统收集洗脱液，将SOD活力高的部分收集，测SOD活力。
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