CN110295161B - 一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法。本发明是将巨大口蘑和双胞蘑菇的菌丝体酶解得到原生质体，以巨大口蘑原生质体紫外灭活，双孢蘑菇原生质体热灭活做为标记，采用PEG介导的化学融合方法将巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇的原生质体融合，融合子再生，综合验证，获得融合菌株。本发明的方法能够有效将巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合，提高选育目的新菌株的成功概率，转化率为80～120％，获得的巨大口蘑新菌株产量高达亩产3000～5000公斤，在8～12℃条件下贮藏30天不变色、不变味，在26～30℃条件下均能生长。

Description

一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法

技术领域

本发明涉及食用菌生物育种技术领域，具体涉及一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法。

背景技术

巨大口蘑(Macrocybe gigantea(Massee)Pegler&Lodge)属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，伞菌目(Agaricales)，白蘑科(又称口蘑科，Tricholomataceae)，大杯伞属(Macrocybe)，异名为洛巴伊口蘑(Tricholoma lobayenseR.Heim)和大白口蘑(Tricholoma spectabilis Peerally&Sutra)，商品名有仁王占地、金福菇、白色松茸、金鞭口蘑等。巨大口蘑质地致密，盖、柄口感细腻，脆而鲜甜，清香浓郁，含有蛋白质、多糖、脂肪、纤维素和多种矿质元素。巨大口蘑耐储性好，常温下比其它鲜菇类保存的时间都要长，在8～12℃条件下保鲜期可达一个月不变色、不变味，适合鲜售与加工，但由于其菌丝生长速度慢，出菇时间较长，制约了该菇的工厂化与规模化发展。双孢蘑菇(Agaricus bisporus)属真菌门(Mycobionta)，担子菌纲(Basidiomycetes)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)，伞菌目(Agaricales)，蘑菇科(Agaricaceae)，蘑菇属(Agaricus)，也是唯一确定了染色体组型(含13条染色体)的食用菌栽培种。双孢蘑菇色泽洁白、质地柔嫩、营养丰富、味道鲜美，含有丰富的蛋白质、多种氨基酸、维生素及矿物质，是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，产量约占世界食用菌总产量的40％。但由于双孢蘑菇极易失水萎蔫、褐变、开伞、腐烂变质，给贮运保鲜带来了很大难度。

张功等研究了蒙古口蘑与双孢蘑菇原生质体融合育种，经遗传稳定性检验，融合菌株的遗传稳定率为80％，从菌落特征、菌丝形态、菌丝生长量、酯酶、游离全蛋白、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和过氧化物酶等同工酶方面对融合子进行筛选，获得了一株具有双亲性状的融合株(张功等，2005)。目前，还没有专门针对巨大口蘑和双胞蘑菇原生质体融合的方法见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法，培养获得的巨大口蘑新菌株产量高、耐贮藏、适温性广。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法，将巨大口蘑和双孢蘑菇活化，得到的菌丝体分别酶解，获得其原生质体，纯化，以巨大口蘑原生质体紫外灭活，双孢蘑菇原生质体热灭活做为标记，采用PEG介导的化学融合方法将巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇的原生质体融合，融合子再生，获得融合菌株。

所述的菌丝体分别酶解所采用的酶液均为纤维素酶和蜗牛酶的混合酶液。

所述的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体融合是将灭活处理的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体混合，预热，加入PEG缓冲液，水浴融合，得到原生质体融合物悬液，离心，弃上清液，洗涤。

优选地，所述的巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法，具体包括如下步骤：

(1)菌丝体制备

将巨大口蘑和双孢蘑菇菌丝块分别接种于培养基中，培养，得到菌丝球，将菌丝球转接于培养基中，继续培养，得到巨大口蘑和双孢蘑菇菌丝体；

(2)原生质体制备

将步骤(1)得到的巨大口蘑菌丝体采用纤维素酶浓度为质量体积比4.8～5.2％、蜗牛酶浓度为质量体积比4.6～5.5％的巨大口蘑混合酶液进行酶解，得到巨大口蘑酶解液；双孢蘑菇采用纤维素酶浓度为质量体积比7.3～8％、蜗牛酶浓度为质量体积比3.5～4.5％的双孢蘑菇混合酶液进行酶解，得到双孢蘑菇酶解液；

(3)原生质体纯化

将步骤(2)中得到的巨大口蘑酶解液和双孢蘑菇酶解液过滤去除菌丝残片，洗涤，离心，去上清液，收集原生质体，洗涤，重悬，得到纯化的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体悬液；

(4)原生质体灭活

将步骤(3)中得到的纯化的巨大口蘑原生质体采用紫外灭活处理；将步骤(3)中得到的纯化的双孢蘑菇原生质体采用热灭活处理；

(5)原生质体融合：将步骤(4)中灭活处理的巨大口蘑原生质体悬液和双孢蘑菇原生质体悬液混合，25～35℃预热2～5min，加入质量体积比为20～30％的PEG缓冲液，迅速置于25～35℃水浴25～35min融合，得到原生质体融合物悬液，2000～4000r/min离心10～20min，弃上清液，洗涤，得到原生质体融合物沉淀；

(6)融合子再生：将步骤(5)得到的原生质体融合物沉淀重悬，取悬液涂布于PDA再生培养基上，20～30℃培养10～20d，菌落长出后挑出并转接，即得融合子。

所述的巨大口蘑和双孢蘑菇原生质体的融合方法还包括将融合子进行包括拮抗试验、菌落表型、菌丝形态、菌丝生长速度、出菇试验及简单重复序列区间(ISSR)在内的融合株综合验证过程。

步骤(1)中所述的培养基为液体PDA培养基：马铃薯(浸汁)200g/L、葡萄糖20g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、蒸馏水定容至1000mL，pH自然。

步骤(1)中所述的培养为24～32℃、100～200r/min培养7～10d。

步骤(1)中所述的继续培养为24～32℃静置培养4～6d。

优选地，步骤(1)中所述的巨大口蘑菌丝体制备方法：在PDA培养基上取2～3片1.2cm最前端生长旺盛的菌丝块，接种于160mL液体PDA培养基中，30℃、160r/min培养7～10d，得到菌丝球，将菌丝球转移到160mL液体PDA培养基中，30℃静置培养4d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到巨大口蘑菌丝体。

优选地，步骤(1)中所述的双胞蘑菇菌丝体制备：在PDA培养基上取2～3片1.2cm最前端生长旺盛的菌丝块，接种于160mL液体PDA培养基中，26℃、160r/min培养7～10d，得到菌丝球，将菌丝球转移到装有160mL液体PDA培养基中，26℃静置培养4d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到双胞蘑菇菌丝体。

步骤(1)中所述的巨大口蘑和双孢蘑菇菌丝体采用无菌滤纸吸干水分。

步骤(2)中所述的巨大口蘑混合酶液优选为纤维素酶浓度为质量体积比5％、蜗牛酶浓度为质量体积比5％的混合酶液。

步骤(2)中所述的双孢蘑菇混合酶液优选为纤维素酶浓度为质量体积比7.6％、蜗牛酶浓度为质量体积比4％的混合酶液。

步骤(2)中所述的巨大口蘑混合酶液和双孢蘑菇混合酶液均采用渗透压稳定剂溶解纤维素酶和蜗牛酶得到。

所述的渗透压稳定剂以0.6moL/LKCl与0.6mol/L甘露醇按照体积比1:1～1:1.5复配得到；优选为按照体积比1:1复配得到。

步骤(2)中所述的酶解的酶解液用量均为每0.3～0.5g菌丝(湿重)加入1mL混合酶解液。

步骤(2)中所述的巨大口蘑菌丝体的酶解为28～32℃酶解4～5h；优选为31℃酶解4.5h。

步骤(2)中所述的双孢蘑菇菌丝体的酶解为28～34℃酶解2～3h；优选为32℃酶解2.2h。

步骤(3)中所述的洗涤和重悬均采用渗透压稳定剂。

步骤(3)中所述的离心为3000～4000r/min离心15～20min。

步骤(3)中所述的纯化的原生质体悬液浓度为1×10⁶个/mL。

步骤(4)中所述的紫外灯灭活处理是采用10～20 W紫外灯于10～30cm处照射巨大口蘑原生质体15～25min灭活；优选为采用15W紫外灯于25cm处照射巨大口蘑原生质体18min灭活。

步骤(4)中所述的热灭活处理是采用50～60℃水浴热灭活双孢蘑菇原生质体20～35min；优选为56℃水浴热灭活双孢蘑菇原生质体30min。

步骤(5)中所述的混合是将灭活处理的巨大口蘑原生质体悬液和双孢蘑菇原生质体悬液按照体积比1:1混合。

步骤(5)中所述的预热优选为30℃预热5min。

步骤(5)中所述的PEG缓冲液优选为质量体积比为30％的PEG缓冲液。

所述的质量体积比为30％的PEG缓冲液的成分配比为：质量体积比为30％的PEG6000、50mmol/L CaCl₂、pH7.5的Tris-HCl 10mmoL/L。

所述的质量体积比为30％的PEG缓冲液用量为按照1mL质量体积比为30％的PEG缓冲液与巨大口蘑原生质体、双孢蘑菇原生质体各0.5×10⁶个配比。

步骤(5)中所述的水浴优选为30℃水浴30min。

步骤(5)中所述的离心优选为3000r/min离心15min。

步骤(5)中所述的洗涤为采用渗透压稳定剂洗涤以去除PEG；洗涤的次数为2次。

步骤(6)中所述的重悬为采用渗透压稳定剂重悬。

步骤(6)中所述的PDA再生培养基为PDA培养基中含有0.6mol/L KCl，pH＝7.0。

步骤(6)中所述的培养优选为26℃避光培养。

所述的巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合菌株的菌落特征及生长特性如下：

菌丝形态接近巨大口蘑，菌丝较粗壮，表面呈绒毛状，锁状联合体很多，菌丝宽度介于巨大口蘑与双孢蘑菇之间；融合菌株的出菇时间明显比巨大口蘑缩短，在温度和湿度都随天气改变的条件下也能正常出菇，只是出菇量相对减少，表现出有明显的抗逆性，进一步说明融合菌株具有其优越性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.采用本发明的原生质体融合方法可以将巨大口蘑和双孢蘑菇原生质体有效融合，获得的巨大口蘑新菌株转化率为80～120％，产量高达亩产3000～5000公斤，在8～12℃条件下贮藏30天不变色、不变味，且适温性广，在26～30℃条件下均能生长。

2.本发明的原生质体融合方法有别于传统人工诱变育种，采用双灭活的标记方法，能够有效提高原生质体融合率和选育目的新菌株的成功概率，融合率可高达3.87×10^-4。

3.本发明的原生质体融合方法重复性较强，且属于非基因育种方式，更有利于食品安全。

附图说明

图1为融合子与亲本拮抗试验结果图。

图2为融合子与亲本菌落形态图；其中，A为融合子H49；B为融合子H99；C为融合子H100；D为融合子612；E为融合子41；F为融合子710；G为融合子75；H为巨大口蘑；I为双孢蘑菇。

图3为融合子与亲本菌株菌丝显微图；其中，A为巨大口蘑；B为双孢蘑菇；C为融合子H49；D为融合子H99；E为融合子H100；F为融合子612。

图4为实施例1中母本巨大口蘑与融合菌株H49在平板中的菌丝生长速度比较图。

图5为实施例2中母本巨大口蘑与融合菌株H49菌袋中菌丝生长速度比较图。

图6为实施例2中母本巨大口蘑与融合菌株H49出菇比较图。

图7为实施例2中母本菌株与融合菌株H49贮藏比较图。

图8为实施例2中巨大口蘑六菌株褐变度比较

图9为实施例3中PEG浓度对融合率的影响结果图。

图10为实施例4中不同Ca²⁺浓度对融合率的影响结果图。

图11为实施例5中不同pH值对融合率的影响结果图。

图12为实施例6中不同PEG处理时间对融合率的影响结果图。

图13为实施例7中不同融合温度对融合率的影响结果图。

图14为实施例8中不同Tris添加量对融合率的影响结果图。

具体实施例

下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

巨大口蘑(喻晓明,徐学锋,蔡佺佑,et al.三种巨大口蘑菌株贮藏期间褐变及相关酶活性[J].食品工业科技,2018,39(21):281-285.)由华南农业大学食品学院应用真菌实验室保存，双孢蘑菇(AS2796)购于广东省微生物所。

实施例1

(1)菌丝体制备：

在PDA培养基上取2～3片最前端生长旺盛的巨大口蘑菌丝块，将其接种到装有160mL液体PDA培养基的250mL三角瓶中，于26℃、160r/min的摇床中培养7～10d，取适量培养所得菌丝球转移到装有160mL液体PDA培养基的250mL三角瓶中，于30℃静置培养4d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到巨大口蘑新鲜的菌丝体。

在PDA培养基上取2～3片最前端生长旺盛的双孢蘑菇菌丝块，将其接种到装有160mL液体PDA培养基的250mL三角瓶中，于26℃、160r/min的摇床中培养7～10d，取适量培养所得菌丝球转移到装有160mL液体PDA培养基的250mL三角瓶中，于26℃静置培养4d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到双胞蘑菇新鲜的菌丝体。

(2)原生质体制备：

巨大口蘑原生质体的制备：取菌丝体(每0.3～0.5g菌丝(湿重)加入1mL酶解液)，以0.6moL/L的KCl与0.6mol/L的甘露醇按照体积比1:1复配作为渗透压稳定剂，在5％(m/v)的纤维素酶和5％(m/v)的蜗牛酶的混合酶液作用下酶解，酶解温度为31℃，酶解时间为4.5h；双孢蘑菇原生质体制备：采用液体静置培养5d的菌丝体(每0.3～0.5g菌丝(湿重)加入1mL酶解液)，以0.6moL/L的KCl与0.6mol/L的甘露醇按照体积比1:1复配作为渗透压稳定剂，在7.6％(m/v)的纤维素酶和4％(m/v)的蜗牛酶的混合酶液作用下酶解，酶解温度32℃，酶解时间为2.2h。

(3)原生质体纯化：

酶解完毕后，采用六层擦镜纸过滤去除菌丝残片，分别加入步骤(2)中巨大口蘑和双孢蘑菇菌丝体酶解时各自所用的渗透压稳定剂，3000r/min离心15min，去上清液，用渗透压稳定剂反复洗涤2次，用渗透压稳定剂重悬原生质体，调节浓度至1×10⁶个/mL，得到纯化的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体悬液。

(4)原生质体灭活：

取0.5mL步骤(3)得到的纯化巨大口蘑原生质体悬液，采用15 W紫外灯于25cm处垂直照射18min；取1mL步骤(3)得到的纯化双孢蘑菇原生质体，采用56℃水浴处理30min。

(5)原生质体融合：

分别将0.5mL纯化灭活的巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体悬液按照体积比1:1混合，30℃预热5min，然后加入1mL质量体积比为30％的PEG缓冲液(PEG缓冲液的成分和配比：30％(m/v)的PEG6000、50mmol/LCaCl₂、pH为7.5的10mmoL/L Tris-HCl缓冲液，)，迅速置于30℃水浴30min融合，得到原生质体融合物悬液，3000r/min离心15min，弃上清液，再加0.6moL/L渗透压稳定剂洗涤2次，去除PEG，得到原生质体融合物沉淀。

(6)融合子再生：

取步骤(6)处理后得到的的原生质体融合物沉淀用0.6moL/L渗透压稳定剂重悬，调节浓度至1×10⁶个/mL，取0.1mL悬液涂布于PDA再生培养基(PDA中加入0.6mol/L KCl，pH＝7.0)，26℃避光培养10～20d，定期观察菌落生长情况，待菌落长出后，及时挑出并转接，即获得融合子。融合率为3.87×10^-4。

(7)融合子综合验证：

1)拮抗试验

将步骤(6)得到的融合子、亲株巨大口蘑与双孢蘑菇充分活化，转接于固体PDA培养基(马铃薯培养基：马铃薯(浸汁)200g、葡萄糖20g、KH₂PO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、琼脂20g、蒸馏水定容至1000mL，pH自然)上，三菌株彼此呈60°角且相距1～2cm，培养一段时间后观察拮抗线。结果如图1所示，融合子H49、H99、H100、612、41、710、75均与亲本菌株形成明显的拮抗线；H49、H99、H100与巨大口蘑的拮抗线明显；612、41、710、75与双孢蘑菇的拮抗线明显。

2)菌落表型

挑取在苯菌灵MA培养基(加富培养基：马铃薯(浸汁)200g、葡萄糖20g、KH₂PO₄ 2g、MgSO₄ 0.5g、V_B1 10mg、琼脂20g、蒸馏水定容至1000mL，pH＝7.0)上传代3次后的融合株菌丝接种于MA培养基上，使之在没有药物的条件下继续培养5d，观察菌落特征，并与亲本菌株巨大口蘑与双孢蘑菇的菌落特征进行比较。结果如图2所示，巨大口蘑的菌落边缘较整齐，菌丝粗壮，表面呈绒毛状；双孢蘑菇的菌落边缘不规整，菌丝细密，呈菌束状并且疏松；融合株的菌落形态介于两者之间，H49、H99、H100菌丝形态接近巨大口蘑，菌丝较粗壮，表面呈绒毛状，与巨大口蘑的同源性较大，而612、41、710、75的菌丝形态接近双孢蘑菇，菌丝细密，呈菌束状并且疏松，与双孢蘑菇的同源性较大。

3)菌丝形态

将H49、H99、H100、612及亲本菌株巨大口蘑与双孢蘑菇菌株采用插片法培养(用高压灭菌后冷却到50℃左右的PDA固体培养基制备平板，凝固后用接种环挑取菌悬液划线接种。将灭过菌的盖玻片以45℃斜插入固体培养基中，紧靠接种物，使菌体沿盖玻片生长，置30℃培养箱培养3d～5d)，待菌丝长满盖玻片后用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，于16×40倍镜下观察并拍照。结果如图3所示，巨大口蘑的菌丝体较细，有锁状联合；双孢蘑菇菌丝体较巨大口蘑菌丝体粗，没有锁状联合，横隔膜较明显；融合子H99锁状联合很多，菌丝细密，而融合子H49、H100、612菌丝有较少锁状联合，菌丝宽度介于巨大口蘑与双孢蘑菇之间。

4)菌丝生长速度

用直径为1.2cm的打孔器分别取1片融合子(H49、H99、H100、612、41、710、75)和亲本菌丝块接种于MA培养基，培养7天后记录菌丝的生长直径。结果如表1和图4所示。

表1融合子与亲本菌丝生长速度比较

在相同的培养条件下，双孢蘑菇菌丝的生长速度较快，巨大口蘑的生长速度较慢，而融合株菌丝的生长速度有的快，有的慢。H49、H99、H100三菌株菌丝形态接近巨大口蘑，但是菌丝生长速度明显比巨大口蘑快，而且差异性达到极显著；612、41、710、75四菌株菌丝形态接近于双孢蘑菇，而612与双孢蘑菇菌丝生长速度快于双胞蘑菇，且达到极显著水平；41、710、75三个融合菌株的生长速度与双孢蘑菇差异不显著。

5)出菇试验

通过对融合菌株H49与巨大口蘑菌株进行出菇实验，考察其出菇时间和商品性状，记录比较出菇时间。结果如表2所示，在同一个环境条件下，融合菌株H49的出菇时间明显比巨大口蘑缩短，在温度和湿度都随天气改变的条件下也能正常出菇，只是出菇量相对减少，表现出有明显的抗逆性，进一步说明融合菌株H49表现出了其优越性。

表2融合菌株H49与巨大口蘑出菇时间比较

6)ISSR(简单重复序列区间)

通过ISSR筛选12条ISSR引物(表3)，其中9条能扩增出条带清晰且具有多态性的带谱，共扩增出62条多态性DNA片段条带，每个引物扩增的条带数目在3～9条之间。

表3 PCR扩增所用引物

将供试融合子(H49、H99、H100)与亲本的ISSR指纹图谱转化为0、1数据矩阵，用NTSYSpc2.1专业版软件计算遗传相似系数。结果如表4所示，融合子与亲本遗传相似系数变异范围为0.40～0.73，巨大口蘑与双孢蘑菇之间的遗传差异性最大，H49与巨大口蘑之间的遗传相似系数为0.65，与双孢蘑菇的遗传相似系数为0.47；H99与巨大口蘑之间的遗传相似系数为0.60，与双孢蘑菇的遗传相似系数为0.47；H100与巨大口蘑的遗传相似系数为0.47，与双孢蘑菇的遗传相似系数为0.73。以上ISSR分子生物学检验说明，融合株继承了双亲株的遗传特性，再一次证实了本发明的原生质体融合方法的有效性。

表4融合株与亲本的遗传相似系数矩阵

实施例2

(1)发酵栽培料：按重量份配比称取栽培原材料(甘蔗渣、棉籽壳、麸皮、KH₂PO₄、CaCO₃)，加水拌匀，在加水过程中用搅拌机充分搅拌，使其充分吸收水份，再加入适量石灰水拌匀，使其pH值为7.0～9.0，建堆发酵7～10天。

(2)装袋：将发酵栽培料含水量调整为58％～68％，pH7.0～9.0，装入22×44聚丙烯塑料袋，每袋装重1500±10g，压实，使松紧度一致，中间打孔至袋底1/5处，然后用套环和装有海绵过滤空气的塑料盖盖紧。

(3)灭菌：采用高压杀菌法121℃灭菌4～6h，至无菌状态，搬进冷却室，将料温冷却至30℃左右。

(4)接种：每袋菌种接27～30袋左右融合菌株H49和母本巨大口蘑菌包，保证接种量一致，不漏接。接种过程中防止发生污染情况，接种前所有相关设备、作业工具、器具及手(或手套)须消毒。

(5)菌丝培养：接种完毕后移入菌种培养室培养，菌种室保持洁净，温度控制在26～30℃。由于菌丝生长过程中会产生热量，加上菌种袋堆放密度高，料内温度约高于室温2～3℃，需经常检查确保发菌料内温度低于34℃，湿度控制在55～70％，二氧化碳浓度控制在3000ppm以下，无需光照。不同时间测量菌丝生长速度，结果如表5和图5，可以看出，融合菌株H49菌袋启动和前期生长速度显著快于母本巨大口蘑，但是35d差异不显著，所以在制栽培种的时候有一定优势。

表5融合子H49与巨大口蘑菌袋生长速度比较

(6)菌丝后熟：接种结束后培养50～70d，菌丝可长满袋，满袋后需要继续放置20～30d后熟。

(7)搔菌：挑选无杂菌、已后熟好的栽培种进行搔菌，搔菌时用灭菌镊子将接入的老菌种挖掉，深度袋口往下到料面1.5～2.0cm。

(8)覆土育菇：将搔菌后的巨大口蘑培养袋，去掉塑料薄膜袋，排入育菇房的床架上或者育菇棚的畦面，覆土3～5cm，喷一次重水。育菇房内温度控制在26℃～30℃，空气湿度控制在90％～95％。刚将巨大口蘑培养袋放入育菇房时，每日通风2次，每次半小时，使二氧化碳浓度控制在400～1000ppm。第一天到第三天保持黑暗培养，第三天菌丝可完全恢复。待菌丝恢复后立即给光光照，光照强度为100～600lx，光照时间为每天8小时，直到菌丝扭结形成原基。

(9)催蕾：育菇房内，温度控制在26℃～30℃，空气湿度控制在85～95％，二氧化碳浓度控制在800～2000ppm，光照强度为100～600lx，每天光照8小时。出现小菇蕾后，停止光照。待菇蕾长了0.4cm时，增加通风次数至2～3次和每次通风时间至1h。

(10)生育：育菇房内，不进行光照，温度控制在26℃～30℃，空气湿度控制在90％～95％，二氧化碳浓度控制在400～600ppm。

(11)疏蕾：在生育中，看菇的形状进行通风、调节二氧化碳浓度(需菌柄长长时提高二氧化碳浓度，需菌盖长大时降低二氧化碳浓度)若需菌柄长度为15～25cm、菌盖直径为4.0～7.0cm时，二氧化碳浓度控制在400～800ppm；若需菌柄长度为25～35cm、菌盖直径为2.0～4.0cm时，二氧化碳浓度控制在800～1500ppm。

(12)采收：当巨大口蘑和融合菌株H49长度为15～25cm时，生育完毕，开始采收。

本实施例采用袋栽巨大口蘑的培育方法栽培巨大口蘑融合菌株，得到的菌株品质好、质量稳定、发育一致，而且菌盖均匀适中。

统计每袋产量，结果如下：融合菌株H49平均每袋产量1200～1500g，子实体为棒状；单朵重60～600g，菌柄长度15.0～35.0cm，菌柄直径3.0～10.0cm，菌盖直径5.0～28cm。栽培结果如图6所示，可以看出融合菌株的出菇速度比母本菌株快，在覆土时间一样的情况下，融合菌株H49的蘑菇可以采收时母本菌株才出菇蕾。

贮藏保鲜研究：将实施例1的融合菌株H49、H99、H100和母本巨大口蘑SCAU1、3、4的子实体放在事先微喷少许水的保鲜袋中，置于8～12℃恒温箱中贮藏30d，不变味，褐变度低于5％(图7、图8)。

实施例3

在实施例1步骤(5)巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合过程中，选用分子量为6000的PEG(浓度分别为质量体积比10％、20％、30％、40％、50％)，Ca²⁺浓度为0.01mol/L，pH值为8.0的10mmoL/L Tris-HCl缓冲液，30℃下PEG融合处理20min。结果如图9所示，当PEG6000的浓度为30％时，巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体的融合率最高，达到1.07×10^-4。

实施例4

在实施例1步骤(5)巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合过程中，选用浓度为30％(m/v)的PEG 6000，pH值为8.0的10mmoL/L Tris-HCl缓冲液，Ca²⁺浓度分别为0、0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L，30℃下PEG融合处理20min。结果如图10所示，当Ca²⁺浓度为0.02mol/L时，巨大口蘑和双孢蘑菇原生质体的融合率最高，达到1.23×10^-4。

实施例5

在实施例1步骤(5)巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合过程中，选用浓度为30％(m/v)的PEG 6000，Ca²⁺浓度为0.01mol/L，pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的10mmoL/LTris-HCl缓冲液，30℃下PEG融合处理20min，结果如图11所示。当pH值为8时，巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合率最高，为1.26×10^-4。

实施例6

在实施例1步骤(5)巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合过程中，选用浓度为30％(m/v)的PEG 6000，Ca²⁺浓度为0.01mol/L，pH值为8.0的10mmoL/L Tris-HCl缓冲液，30℃下PEG融合处理时间分别选用5min、10min、15min、20min、25min和30min。结果如图12所示，当PEG融合处理时间为20min时，巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合率最高，为1.43×10^-4。

实施例7

在融合步骤中，选用PEG 6000浓度为30％，Ca²⁺浓度为0.01mol/L，PEG处理时间为20min，pH值为8.0的10mmoL/L Tris-HCl缓冲液，融合温度分别选用20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，结果如图13所示。30℃时融合率达到最高，为1.63×10^-4。

实施例8

在实施例1步骤(5)巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合过程中，选用浓度为30％(m/v)的PEG 6000，Ca²⁺浓度为0.01mol/L，30℃下PEG融合处理20min，pH值为8.0的10mmoL/LTris-HCl缓冲液，Tris添加量分别为0、0.005mol/L、0.01mol/L、0.015mol/L、0.02mol/L、0.025mol/L，结果如图14所示。在Tris添加量为0.01mol/L时融合率达到最高，为2.07×10^-4。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法，其特征在于：将巨大口蘑和双孢蘑菇活化，得到的菌丝体分别酶解，获得其原生质体，纯化，以巨大口蘑原生质体紫外灭活，双孢蘑菇原生质体热灭活做为标记，采用PEG介导的化学融合方法将巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇的原生质体融合，融合子再生，获得融合菌株；

所述的菌丝体分别酶解所采用的酶液均为纤维素酶和蜗牛酶的混合酶液；

所述的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇的原生质体融合是将灭活处理的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体混合，预热，加入PEG缓冲液，水浴融合，得到原生质体融合物悬液，离心，弃上清液，洗涤；

所述的巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法，具体包括如下步骤：

（1）菌丝体制备

在PDA培养基上取2～3片1.2 cm最前端生长旺盛的巨大口蘑菌丝块，接种于160 mL液体PDA培养基中，30℃、160 r/min培养7～10 d，得到菌丝球，将菌丝球转移到160 mL液体PDA培养基中，30℃静置培养4 d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到巨大口蘑菌丝体；

在PDA培养基上取2～3片1.2 cm最前端生长旺盛的双孢蘑菇菌丝块，接种于160 mL液体PDA培养基中，26℃、160 r/min培养7～10 d，得到菌丝球，将菌丝球转移到装有160 mL液体PDA培养基中，26℃静置培养4 d以上，无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，得到双胞蘑菇菌丝体；

（2）原生质体制备

将步骤（1）得到的巨大口蘑菌丝体采用纤维素酶浓度为质量体积比5%、蜗牛酶浓度为质量体积比5%的巨大口蘑混合酶液进行酶解，得到巨大口蘑酶解液；双孢蘑菇采用纤维素酶浓度为质量体积比7.6%、蜗牛酶浓度为质量体积比4%的双孢蘑菇混合酶液进行酶解，得到双孢蘑菇酶解液；

（3）原生质体纯化

将步骤（2）中得到的巨大口蘑酶解液和双孢蘑菇酶解液过滤去除菌丝残片，洗涤，离心，去上清液，收集原生质体，洗涤，重悬，得到纯化的巨大口蘑原生质体和双孢蘑菇原生质体悬液；

（4）原生质体灭活

将步骤（3）中得到的纯化的巨大口蘑原生质体采用紫外灭活处理；将步骤（3）中得到的纯化的双孢蘑菇原生质体采用热灭活处理；

（5）原生质体融合：

将步骤（4）中灭活处理的巨大口蘑原生质体悬液和双孢蘑菇原生质体悬液混合，30℃预热5 min，加入质量体积比为30%的PEG缓冲液，迅速置于30℃水浴30min融合，得到原生质体融合物悬液， 3000 r/min离心15 min，弃上清液，洗涤，得到原生质体融合物沉淀；

（6）融合子再生：将步骤（5）得到的原生质体融合物沉淀重悬，取悬液涂布于PDA再生培养基上，20～30℃培养10～20 d，菌落长出后挑出并转接，即得融合子；

所述的巨大口蘑和双孢蘑菇的原生质体融合方法还包括将步骤（6）得到的融合子进行包括拮抗试验、菌落表型、菌丝形态、菌丝生长速度、出菇试验及简单重复序列区间在内的融合株综合验证过程；

步骤（1）中所述的培养基为液体PDA培养基：浸汁马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、KH₂PO₄1.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、蒸馏水定容至1000 mL，pH自然；

步骤（2）中所述的巨大口蘑混合酶液和双孢蘑菇混合酶液均采用渗透压稳定剂溶解纤维素酶和蜗牛酶得到；

所述的质量体积比为30%的PEG缓冲液的成分配比为：质量体积比为30%的PEG6000、50mmol/L CaCl₂、pH7.5的Tris-HCl 10 mmoL/L；

步骤（6）中所述的PDA再生培养基为PDA培养基中含有0.6 mol/L KCl，pH=7.0；

所述的渗透压稳定剂以0.6 moL/LKCl与0.6 mol/L甘露醇按照体积比1:1～1:1.5复配得到；

所述的质量体积比为30%的PEG缓冲液用量为按照1 mL质量体积比为30%的PEG缓冲液与巨大口蘑原生质体、双孢蘑菇原生质体各0.5×10⁶个配比；

步骤（2）中所述的酶解的酶解液用量均为以湿重计每0.3～0.5 g菌丝加入1 mL混合酶解液；

步骤（5）中所述的混合是将灭活处理的巨大口蘑原生质体悬液和双孢蘑菇原生质体悬液按照体积比1:1混合；

步骤（3）中所述的纯化的原生质体悬液浓度为1×10⁶个/mL；

步骤（2）中所述的巨大口蘑菌丝体的酶解为31℃酶解4.5 h；

步骤（2）中所述的双孢蘑菇菌丝体的酶解为32℃酶解2.2 h；

步骤（4）中所述的紫外灯灭活处理是采用15W紫外灯于25 cm处照射巨大口蘑原生质体18 min灭活；

步骤（4）中所述的热灭活处理是采用56℃水浴热灭活双孢蘑菇原生质体30 min；

步骤（3）中所述的洗涤和重悬均采用渗透压稳定剂；

步骤（3）中所述的离心为3000～4000 r/min离心15～20 min；

步骤（5）中所述的洗涤为采用渗透压稳定剂洗涤以去除PEG；洗涤的次数为2次；

步骤（6）中所述的重悬为采用渗透压稳定剂重悬；

步骤（6）中所述的培养为26℃避光培养。