CN110295115A - 一株具有广谱抗菌活性的地衣内生真菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株具有广谱抗菌活性的地衣内生菌的菌株，菌种名称：Daldinia childiae，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日：2019年4月17日，保藏编号：CGMCC No.17469。该菌株对多种临床致病菌和耐药菌具有抑制活性，尤其对耐药藤黄微球菌效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体为一株具有广谱抗菌活性的地衣内生真菌。
背景技术
近年来，由各种细菌、真菌、病毒以及癌症引起的疾病极大地威胁着人类的健康。令人担忧的是，人类使用抗生素的数量与日俱增。已经有越来越多的人因细菌对所有已知抗生素产生耐药性而死亡，而这些细菌正变得日益普遍。滥用抗生素已成为21世纪最大的污染源。世界卫生组织指出目前新抗生素的开发严重不足，难以打击日益增长的抗微生物药物耐药性威胁。有预测认为，如果细菌耐药不能得到很好的控制，到2050年，全球将会有1000万人死于超级耐药细菌感染。应对这种严峻的形势，目前主要的策略是加快新型抗菌物质的研发，开发抗菌活性更高的药物。
天然产物是发现药物先导化合物的重要源泉。而大多数的抗菌药物都是从微生物中发现，微生物作为天然产物的重要来源，具有生长周期短、易培养、易扩大、易操作等特点，是一个具有巨大潜力的活性物质来源。至今，人们已经从微生物中发现了近几万个次生代谢产物，大多具有生物活性。迄今为止，已知的微生物物种占可能存在的物种数的比例不足5%，说明还有很大数量的微生物有待发现。由于微生物的分布广泛，生态多样，为了适应多样的生存环境，微生物必然会产生结构和活性多样的次生代谢产物，因此，微生物次生代谢产物在活性天然产物研究中具有重要地位。近年来，随着对微生物次级代谢产物研究的深入，人们在发现大量有价值化合物的同时，微生物资源的重复筛选问题也日渐突出，新颖结构活性物质的发现几率逐渐下降。针对这一情况，开拓微生物药物新资源，将工作重心移到从不同的环境样本中寻找新药，从特殊环境中寻找新颖结构活性物质成为大多数研究者关注的热点问题。
地衣是由真菌与藻类共生形成的稳定复合有机体，由于其结构的特异性与功能的适应性，使其广泛分布于各种生态系统中。在漫长的生物演化过程中，地衣形成了特殊的共生关系，由于独特的生态环境, 地衣体内蕴藏着多种独特的代谢产物。近年来，由于地衣内生菌中化合物的出新率高而报道越来越多, 目前已成为新结构活性化合物发现的新热点之一。
发明内容
申请人从贵州斗篷山景区中分离到一株具有广谱抗菌活性的DPS-165-9，通过ITSrRNA克隆和序列分析，发现该真菌菌株属于Daldinia childiae，具有广谱抗菌活性。
本发明首先提供了一株真菌菌株(Daldinia childiae)，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center, CGMCC)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌保中心内；保藏编号为CGMCC No. 17469，保藏日期为2019年4月17日。
该菌株Daldinia childiae自命名为DPS165-9，其形态学特征为：菌丝紧密，无水滴，蔓延生长，呈绒毛状，初期呈白色，后期会分泌黑色色素。
该菌株经过培养后，可用于抑制金黄色葡萄球菌S. aureus 25923、金黄色葡萄球菌S. aureus 6538、表面葡萄球菌 Z12、布氏杆菌Brucellasp. B103、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 163 以及耐药藤黄微球菌Micrococcus luteus 261 等临床致病菌及耐药菌，具有广谱抗菌活性。
将该菌株用PDA培养7-10天，再经过为乙酸乙酯溶剂萃取，减压浓缩后即可制得抗菌活性物质。
与现有技术相比，本申请提供的地衣内生真菌DPS165-9菌株具有广谱抗菌活性，特别是能有效抑制金黄色葡萄球菌S. aureus 25923、金黄色葡萄球菌S. aureus 6538、表面葡萄球菌 Z12、布氏杆菌Brucellasp. B103、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 163 以及耐药藤黄微球菌Micrococcus luteus 261等临床致病菌、耐药菌的生长，弥补了该类菌株在临床研究上的空白，为开发新的抗菌物质提供了新的途径。
附图说明
图1为本发明菌种的电子显微镜照片；
图2为本发明菌种的菌落照片；
图3为本发明菌株的系统发育分析；
图4为本发明菌株的抗菌活性测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例便于更好地理解本发明，但下列实施例仅仅是进一步阐明本发明，并无将本发明局限于该具体实施例的意图。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。
下述实施例中涉及的耐药藤黄微球菌Micrococcus luteus 261、表面葡萄球菌Z12、变形杆菌Proteus sp.P12、布氏杆菌Brucellasp. B103、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 163由遵义医科大学附属医院检验科提供；金黄色葡萄球菌S. aureus 25923、金黄色葡萄球菌S. aureus 6538、大肠杆菌E.coli 25922、白色念珠菌C. albicans 10213由本实验室保存，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
实施例1
1.地衣内生真菌DPS165-9菌株的获得
1）菌株的分离、纯化与保存
将从贵州省地跨都匀、麻江、贵定三县境的斗篷山随机采集的地衣样本先用自来水冲洗1～2h，剔除表面杂物，然后用无菌水涮洗3遍，75%乙醇消毒30s，3%NaClO溶液消毒3min，重复操作2~3次，将消毒好的地衣样本置于无菌吸水纸上，剪碎消毒样本，用灭好菌的镊子将样本接种到PDA培养基（去皮马铃薯200g，切块煮沸15min，8层纱布去滤液，葡萄糖20g，琼脂20g，水补足至1L，自然pH，121℃，灭菌20 min）上；将上述培养皿，置于28℃恒温培养箱中培养3-4天。
根据顶端纯化法，结合菌落的形态及颜色，待培养基长出菌落后，将其转接至新PDA培养基上，多次纯化，直到得到单一、稳定的菌落，4℃条件下保存。该菌种的电子显微镜照片如图1所示，菌落形态如图2所示。
2）菌株的鉴定与保藏
本发明一方面通过显微结构对纯化菌株进行鉴定分析，在电镜下观察活性菌株的菌丝形态分布，菌丝细长，湿润，粘稠，易挑起，表面光华，如图1所示。
本发明一方面通过采用分子生物学技术通过ITS序列对纯化菌株进行种属鉴定分析。技术路线为：DNA提取→ITS片段扩增→序列测定→Blast比较分析。
将筛选得到的纯化菌株利用试剂盒（索莱宝真菌基因组DNA提取试剂盒，货号：D2300，规格：50T/100T）提取基因组总DNA，作为扩增模板。再利用真菌的通用引物 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）/ ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增，PCR反应条件为：20μL反应体系（10μL of 2×Taq PCR Master Mix , 7μL of ddH2O , 0.5μMof each primer and 2μL of templet DNA.），94℃预变性 5min；PCＲ热循环程序为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，扩增34个循环，72℃总延伸5min。然后将PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测。ITS序列的PCR扩增产物测序由北京博友顺生物技术有限公司完成。测序结果用NCBI数据库中Blast软件在线比对。从GenBank数据库中获得相似性较高的典型菌株的18srRNA/5.8srRNA序列作为参比对象，采用 MEGA 7 软件进行聚类分析和构建 NJ 系统发育树。
如图3，为本发明菌株的系统发育分析。
经菌株纯化培养后，获得一株拮抗效果较好的菌株，申请人将其自命名为DPS165-9，送至中国科学院微生物研究所进行检测鉴定，鉴定结果为Daldinia childiae，并对该菌株进行原始菌株的冻藏。本发明的Daldinia childiae菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 17469，保藏日期为2019年4月17日。
实施例2
2.地衣内生真菌DPS165-9菌株发酵液的抗菌活性试验
1）菌株的活化、发酵培养与提取
取出在4℃条件下保存的地衣内生真菌，于PDA培养基中活化，在28℃条件下培养4~5天。然后取适量活化菌株接种于100mL PDA 液体培养基(250mL瓶装)中，于28℃，150r/min摇床振荡培养7天。将培养的内生真菌发酵液抽滤，按1：1的比例加入乙酸乙酯进行萃取，重复操作2~3次，利用旋转蒸发仪将粗提液减压蒸干，获得粗提物。
2）抗菌活性测试
称取粗提物各3.0mg，用1mL甲醇溶解，在超净台内将每种测试菌接种至MH培养基（MH（A）：蒸馏水=36.5:1000，121℃高温高压灭菌15min），用灭好菌的打孔器在平板上打孔，直径为8mm，然后用移液枪移取100μL待测粗提物溶液和一个甲醇溶液空白对照，设置两个重复平板。置于37℃恒温箱内培养，24h后观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈大小(表1)。
表1 DPS165-9菌株发酵液提取物的抗菌实验结果
如图4和表1为本发明菌株的抗菌活性测试结果。其中a为本发明菌株抗金黄色葡萄球菌S. aureus 25923的实验照片，b为本发明菌株抗布氏杆菌Brucellasp. B103的实验照片，c为本发明菌株抗耐药藤黄微球菌Micrococcus luteus 261的实验照片，d为本发明菌株抗表面葡萄球菌 Z12的实验照片，e为本发明菌株抗枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 163的实验照片，f为本发明菌株抗金黄色葡萄球菌S. aureus 6538的实验照片。
通过实验图片可以看出，本发明菌株可以抑制金黄色葡萄球菌S. aureus 25923、金黄色葡萄球菌S. aureus 6538、表面葡萄球菌 Z12、布氏杆菌Brucellasp. B103、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 163 以及耐药藤黄微球菌Micrococcus luteus 261 等临床致病菌及耐药菌，对耐药藤黄微球菌Micrococcus luteus 261的抑制作用最强，抑菌圈可达34mm，所以本发明菌株具有广谱抗菌活性。
Claims (5)
1. 一株地衣内生真菌(Daldinia childiae)菌株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 17469；保藏日期为：2019年4月17日。
2.如权利要求1所述菌株用于制备抗菌活性物质方面的应用。
3.如权利要求2所述菌株的应用，其特征是，所述抗菌活性具体是针对：金黄色葡萄球菌 S. aureus 25923、金黄色葡萄球菌 S. aureus 6538、表面葡萄球菌 Z12、大肠杆菌E.coli 25922、白色念珠菌 C. albicans 10213、布氏杆菌 Brucellasp. B103、变形杆菌Proteus sp.P12、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 163以及耐药藤黄微球菌Micrococcus luteus 261。
4.如权利要求2所述菌株应用的制备方法，将所述菌株进行液体培养基培养7-10天，再经过溶剂萃取，减压浓缩后制得。
5.如权利要求3所述菌株应用的制备方法，其特征是，所述培养基为PDA培养基，所述萃取溶剂为乙酸乙酯。
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