CN110279652B - 一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂及制备方法，通过制备眼用雷公藤内酯醇纳米乳凝胶药物递送系统，并对该剂型进行了抗炎作用效果及机制研究；利用纳米乳增溶的特点，使难溶性药物雷公藤内酯醇的溶解度提高，并对雷公藤内酯醇纳米乳的抑菌效果进行了研究；利用温度敏感型原位凝胶可以延长药物作用时间的特点，使雷公藤内酯醇能够在眼部达到缓释的效果，从而发挥药物的抗炎作用，同时起到减毒的效果；本发明LPS建立了兔角膜基质炎模型，对眼用雷公藤内酯醇纳米乳凝胶进行了动物体内抗炎作用效果及分子机制研究。

Description

一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂及制备方法
技术领域
本发明公开一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂及制备方法，是一种即对外源性感染和内源性感染都有良好抗炎作用的眼用制剂，属于医学医药技术领域。
背景技术
眼部的感染性炎症是由于一些外源致炎因素感染引起的疾病，如细菌和病毒等引起的结膜炎和角膜炎等眼部炎症，一般以抗菌或抗病毒类的滴眼剂进行治疗；非感染性的眼部炎症产生的原因是由于非感染性病因引起的，如免疫性、代谢性疾病等引起的干眼症、葡萄膜炎等疾病，一般以激素类和免疫抑制剂类的药物进行治疗。感染性角膜炎是由细菌、真菌和病毒等引起的眼部疾病，会产生角膜瘢痕，生成新生血管，最终可能会导致失明。感染性角膜炎会导致角膜的结构被破坏后，会更加容易被一些病原体所感染，角膜的免疫系统则会使炎性细胞聚集，并释放一系列细胞因子，导致炎症加剧。
滴眼液主要是通过角膜和结膜吸收，药物首先渗透入角膜内，角膜是药物渗透的主要屏障，传统滴眼液具有眼部滞留时间短和生物利用率低的缺点。滴眼液中的药物会经鼻泪管进入鼻腔或消化道，从而被全身吸收，这增加了诱发副作用和毒性的风险。因此，选择能增加药物角膜透过性和眼部滞留时间的新剂型，可以保证眼部用药的安全有效。
雷公藤内酯醇于1972年首次被分离出来，最初被认为是一种抗白血病药物。经过多年研究，发现雷公藤内酯醇具有多种药理作用，包括抗炎、抗癌和免疫抑制的作用, 由于其溶解度低，毒性较强不适用于眼部等敏感的部位使用。
发明内容
本发明公开一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂，通过制成纳米乳凝胶滴眼剂，解决雷公藤内酯醇溶解度低的问题，降低了雷公藤内酯醇毒性，改善了药物的角膜透过性并延长了药物的眼部滞留时间。
本发明所述的一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂，其特征在于是由以下原料制备的：
雷公藤内酯醇0.01-0.1份，表面活性剂5-15份，助表面活性剂2.5-7.5份，油相3-10份，凝胶基质材料20-29份，水47.4-74.49份。
本发明所述的一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂的制备方法，包括以下步骤:
将雷公藤内酯醇溶解在油相中，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；加入表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；加入助表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；再边磁力搅拌边逐滴加入去离子水，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌12-24h，制成纳米乳；冰浴下加入温敏型凝胶基质，放入4℃冰箱中溶胀12-24h，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌1-3h，涡旋振荡10-30s，振荡3-6次，混合均匀后放入4℃冰箱中保存即得；
其平均粒径为20.2nm，多分散系数为0.15；无膜溶出模型的溶出效果良好；180天内的粒径变化不明显，稳定性较好。
本发明中所述的雷公藤内酯醇为中国食品药品检定研究院的标准品。
本发明中所述的表面活性剂为吐温-80、聚乙二醇400和聚氧乙烯蓖麻油EL中的一种。
本发明中所述的助表面活性剂为辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、无水乙醇和1，2-丙二醇中的一种。
本发明中所述的油相为油酸、油酰聚氧乙烯甘油酯、辛癸酸甘油酯中的一种或它们的混合物。
本发明中所述的凝胶基质原料为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188中的混合物。
本发明在4℃条件下放置超过6个月后仍为澄清、透明的液态，稳定性好。温度敏感型胶凝可以延长药物的眼部滞留时间，达到缓释效果，具有广阔的应用前景。纳米级的粒径能改善雷公藤内酯醇的角膜透过性，再制备成温敏原位凝胶，则可以延长药物在眼部的滞留时间，从而达到缓释的效果，
本发明的无膜溶出模型实验显示雷公藤内酯醇的溶出量和溶出时间线性关系良好。
本发明在单次给药和多次给药后，均不会对兔眼部造成刺激性。
本发明在兔眼部的滞留时间高于左氧氟沙星滴眼液，凝胶状态可以增加药物在眼部的作用面积，使药物更好的向眼部扩散，加上较长的作用时间，可以使药物持续发挥作用。
本发明的雷公藤内酯醇纳米乳凝胶对LPS建立的兔角膜基质炎模型具有降低角膜新生血管生成、炎症细胞数量的作用，恢复角膜内NF-κB、VEGF和IL-8的表达量到正常水平。
本发明的积极效果在于：
通过制备眼用雷公藤内酯醇纳米乳凝胶药物递送系统，并对该剂型进行了抗炎作用效果及机制研究；利用纳米乳增溶的特点，使难溶性药物雷公藤内酯醇的溶解度提高，并对雷公藤内酯醇纳米乳的抑菌效果进行了研究；利用温度敏感型原位凝胶可以延长药物作用时间的特点，使雷公藤内酯醇能够在眼部达到缓释的效果，从而发挥药物的抗炎作用，同时起到减毒的效果；本发明LPS建立了兔角膜基质炎模型，对眼用雷公藤内酯醇纳米乳凝胶进行了动物体内抗炎作用效果及分子机制研究。
雷公藤内酯醇纳米乳凝胶的开发研究，在治疗眼部的外源性和内源性炎症方面起到积极的作用，达到即抑菌又提高患者的免疫力，弥补目前某些临床药物的耐药性的不足。本发明解决了雷公藤内酯醇水溶性较差问题，同时降低了雷公藤内酯醇毒性，改善了药物的角膜透过性并延长了药物的眼部滞留时间，提高了药物的生物利用度。
附图说明
图1为本发明中雷公藤内酯醇纳米乳凝胶的粒径分布图；
图2为本发明中雷公藤内酯醇纳米乳凝胶的抑菌效果图；
图3为本发明中雷公藤内酯醇纳米乳凝胶的溶出图；
图4为本发明中雷公藤内酯醇纳米乳凝胶与左氧氟沙星滴眼液的眼部滞留时间图；
图5为本对兔角膜注射LPS引起的角膜基质炎模型图；
图6为本发明中雷公藤内酯醇纳米乳凝胶对LPS致兔角膜炎症模型的角膜切片HE染色图；
图7-A、图7-B、图7-C为本发明中雷公藤内酯醇纳米乳凝胶对LPS致兔角膜炎症模型的角膜NF-κB、VEGF和IL-8蛋白水平影响图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行具体描述。实施例是对本发明的进一步说明，所属领域的技术人员，根据本发明内容，对本发明进行的非本质性的改进或调整，应仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种雷公藤内酯醇纳米乳凝胶滴眼剂，按原料总质量百分比计为：
雷公藤内酯醇 0.1份；
聚氧乙烯蓖麻油EL 13.5份；
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 4.5份；
油酰聚氧乙烯甘油酯 2份；
泊洛沙姆407 22.5份；
泊洛沙姆188 3.2份；
注射用水 余量。
制备方法：
1）将雷公藤内酯醇溶解在油相中，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；
2）加入表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；
3）加入助表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；
4）再边磁力搅拌边逐滴加入去离子水，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌12-24h，制成纳米乳；
5）冰浴下加入温敏型凝胶基质，放入4℃冰箱中溶胀12-24h，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌1-3h，涡旋振荡10-30s，振荡3-6次，混合均匀后放入4℃冰箱中保存。
在激光粒度仪中测得实例1的粒径为20.2nm。
实施例2
一种雷公藤内酯醇纳米乳凝胶滴眼剂，按原料总质量百分比计为：
雷公藤内酯醇 0.1份；
聚氧乙烯蓖麻油EL 16.3份；
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 3.7份；
油酰聚氧乙烯甘油酯 7.5份；
泊洛沙姆407 22.5份；
泊洛沙姆188 3.2份；
注射用水 余量。
制备方法与实例1的制备方法相同，在激光粒度仪中测得实施例2的粒径为18.7nm。
实施例3
一种雷公藤内酯醇纳米乳凝胶滴眼剂，按原料总质量百分比计为：
雷公藤内酯醇 0.1份；
聚氧乙烯蓖麻油EL 16.3份；
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 3.7份；
油酰聚氧乙烯甘油酯 11.5份；
泊洛沙姆407 22.5份；
泊洛沙姆188 3.2份；
注射用水 余量。
制备方法与实例1的制备方法相同，在激光粒度仪中测得实例3的粒径为14.1nm。
雷公藤内酯醇纳米乳凝胶的粒径分布图：取实施例1条件下制得的雷公藤内酯醇纳米乳凝胶通过激光粒度仪测定粒径分布，结果见图1，平均粒径为20.2nm。
实验例1
雷公藤内酯醇纳米乳的抑菌实验
实验方法：利用微量培养基稀释法测定雷公藤内酯醇纳米乳的抑菌效果。取无菌96孔板，每行首孔加入200μL 500μg/m L 雷公藤内酯醇纳米乳，第2孔到第5孔分别加入100 μL LB培养基，从第 1 孔吸取 100 μL 雷公藤内酯醇纳米乳加入到第2孔，混匀后再吸取 100 μL 到第 3 孔，依次倍比稀释至第5 孔，第5孔药液混匀后吸取 100 μL 药液弃去，第6孔加入左氧氟沙星滴眼液作为阳性对照，第7孔加入 100 μL菌液，作为阴性对照组。最后向第1孔到第6孔分别加入 100 μL OD600为0.05的菌液。每行雷公藤内酯醇的终浓度从高至低分别为250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL，每个浓度设置3个复孔。 盖上96 孔板盖子，放入37 ℃培养箱中孵育12h后，在波长600nm下测定吸光度值。
实验结果：在雷公藤内酯醇浓度为250μg/mL下，其对金黄色葡萄球菌、烟曲霉、茄病镰刀菌和白色念球菌的抑制率分别为70%、71%、61%和63%，结果见图2。
实验例2
雷公藤内酯醇纳米乳凝胶的无膜溶出模型实验
实验方法：将一定重量的雷公藤内酯醇纳米乳凝胶装入已称重的离心管中，将离心管置于37±1℃的恒温振荡器中预热15min，使凝胶剂完全形成凝胶。再加入先预热到37℃的人工模拟泪液适量，作为释放介质。振荡频率为100rpm，震荡20min后，立即倾出全部释放介质，称重并记录，放回到恒温水浴振荡器中平衡15min后，再小心加入预热的人工模拟泪液，震荡20min后取出，倾出全部释放介质后，擦干刻度试管表面，称重并记录。如此反复操作，直至剩余凝胶量不足加入量的10%时停止。相邻时间点样品的重量差异即为此期间的凝胶溶蚀量。倾出的释放介质经适当稀释后，采用紫外法在218nm处测量吸光度，并计算雷公藤内酯醇的含量。
实验结果：雷公藤内酯醇的溶出与释放时间的线性关系良好，雷公藤内酯醇的溶出量会随着时间的增加而增加，结果见图3。
实验例3
雷公藤内酯醇纳米乳凝胶在兔眼部的滞留时间的测定
实验方法：向雷公藤内酯醇纳米乳凝胶中加入2%的荧光素钠，混合均匀。拉开兔眼一侧眼下睑，使眼睑成袋状，向结膜囊内滴入雷公藤内酯醇纳米乳凝胶4OuL，兔眼被动闭合lOs。每隔2min用紫外灯照射眼部，观察眼角膜表面连续荧光层的强弱，连续荧光层消失的时间计为眼部滞留时间。连续测定3次,取平均值为眼部滞留时间。
雷公藤内酯醇纳米乳凝胶在兔眼部的滞留时间约为12min，结果如表1、图4所示。
表1 雷公藤内酯醇纳米乳凝胶兔眼部滞留时间结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实验例4
雷公藤内酯醇纳米乳凝胶的兔眼部刺激性实验
实验方法：准备实验兔6只，于实验开始前先适应动物房环境7天，排除应激因素干扰。实验前24h观察每只兔眼的结膜、角膜及附属器官情况，若存在至少1眼异常则可排除整只兔，检查合格者应用于实验。
单次给药眼部刺激性实验：采用自身对照法，轻轻拉开兔眼一侧眼下睑，使眼睑成袋状，6只兔的左眼作为实验眼结膜囊内滴入雷公藤内酯醇纳米乳凝胶4OuL，右眼作为对照眼结膜囊内滴入生理盐水 4OuL，兔眼被动闭合1Os以防药物丢失。给药后6h,24h,48h和72h分别观察兔眼局部刺激反应。
多次给药眼部刺激性实验：6只兔，随机分为2组，每组各3只，分别为生理盐水对照组和雷公藤内酯醇纳米乳凝胶组，每日滴眼3次，连续给药7d，每次给药前及最后一次给药后24h, 48h和72h观察兔眼局部刺激反应，方法同前。
眼部刺激性试验评分标准：
以Draize眼刺激试验为评价眼刺性的标准。Draize眼刺激标准及其评分标准如表2所示，Draiz眼刺激性试验眼部刺激反应评分标准见表3。
表2 眼刺激性试验评分标准
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表3 Draiz眼刺激性试验眼部刺激反应评分标准
Figure DEST_PATH_IMAGE006
实验结果：
T10纳米乳凝胶在给药6h后，给药眼眼角有少量的分泌物，但除此之外，给药眼都没有其它异常反应，之后的每只给药眼的综合评分都是0分，即眼部刺激性反应积分与生理盐水对照眼没有差异，结果如表4所示，说明T10纳米乳凝胶在单次给药后对兔眼没有刺激性；
表4 单次给药刺激性试验得分
Figure DEST_PATH_IMAGE007
多次给药刺激性评价
T10纳米乳凝胶在多次给药后，眼角会有少量的分泌物，但不会随着给药时间的增加而加重刺激反应，结果如表5所示，根据Draize眼刺激试验评分标准，可以说明T10纳米乳凝胶在多次给药后对兔眼没有刺激性。
表5 多次给药刺激性试验得分
Figure DEST_PATH_IMAGE008
实验例5
雷公藤内酯醇纳米乳凝胶治疗兔眼部炎症实验
1、利用LPS建立角膜基质炎模型
实验方法：
取LPS 0.4mg，0.36g泊洛沙姆407，加入2mL生理盐水，磁力搅拌5min，4℃冰箱中溶胀12h，超声1min；通过耳缘静脉向实验兔注射2mL戊巴比妥钠溶液。用29G注射器从兔角膜的周边基质层穿至中央，注射约20uL脂多糖的温控凝胶。
实验结果：注射成功的标志为注射区基质局部变白和微隆起。结果见图5。
、雷公藤内酯醇纳米乳凝胶治疗LPS致兔角膜炎症的角膜切片HE染色实验
实验方法：
在给药后3、7和14天后，各组取一只实验动物的眼部进行观察和照相，经耳缘静脉注射过量戊巴比妥那溶液麻醉致死，立即取下完整眼球，放入中性甲醛固定液中进行固定。取下角膜组织，进行包埋、切片和HE染色。于高倍镜（40×10）下统计分析各组组切片中炎性细胞数量的差异性。
实验结果：结果如表6、图6所示，在给药14天后，T10低剂量组和中剂量组的角膜切片内的炎症细胞明显降低。
表6 各组角膜切片HE染色炎症细胞计数
Figure DEST_PATH_IMAGE009
3、雷公藤内酯醇纳米乳凝胶治疗兔角膜炎分子机制研究实验
实验方法：
首先建立LPS兔角膜基质炎模型。利用29G注射器从兔角膜的周边基质层穿至中央，注射LPS 20uL的温控凝胶。注射成功的标志为注射区基质局部变白和微隆起。造模完成后，实验兔被随机分为空白对照组、模型组、左氧氟沙星组、T10纳米乳凝胶低浓度组(5ug/mL)、T10纳米乳凝胶中浓度组(25ug/mL)、T10纳米乳凝胶高浓度组(50ug/mL)，在造模成功后的24小时之后进行给药，每日给药三次。再给药14天后，各组取兔角膜，进行WesternBlot实验，检查角膜中NF-κB、VEGF和IL-8因子的含量。
实验结果如图7-A： NF-κB；图7-B： VEGF；图7-C：IL-8。
表明雷公藤内酯醇纳米乳凝胶可以抑制由LPS引起的角膜炎模型中的NF-κB、VEGF和IL-8含量，使炎症因子恢复到正常水平，雷公藤内酯醇纳米乳凝胶具有明显的抗炎效果。

Claims (2)

1.一种治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂，其特征在于是由以下原料制备的：
雷公藤内酯醇0.01-0.1份，表面活性剂5-15份，助表面活性剂2.5-7.5份，油相3-10份，凝胶基质材料20-29份，去离子水47.4-74.49份；所述表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油EL，所述助表面活性剂为辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，所述油相为油酰聚氧乙烯甘油酯，所述凝胶基质材料为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的混合物；
所述治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂的制备方法，包括以下步骤:
将雷公藤内酯醇溶解在油相中，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；加入表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；加入助表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；再边磁力搅拌边逐滴加入去离子水，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌12-24h，制成纳米乳；冰浴下加入温敏型凝胶基质，放入4℃冰箱中溶胀12-24h，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌1-3h，涡旋振荡10-30s，振荡3-6次，混合均匀后放入4℃冰箱中保存即得。
2.根据权利要求1所述治疗角膜炎的纳米乳凝胶滴眼剂的制备方法，包括以下步骤:
将雷公藤内酯醇溶解在油相中，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；加入表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；加入助表面活性剂，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌10-30min；再边磁力搅拌边逐滴加入去离子水，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌12-24h，制成纳米乳；冰浴下加入温敏型凝胶基质，放入4℃冰箱中溶胀12-24h，转子在1000-2000rpm下磁力搅拌1-3h，涡旋振荡10-30s，振荡3-6次，混合均匀后放入4℃冰箱中保存即得。
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