CN108078927A - 一种具有协同作用的杨梅素胶束滴眼液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有协同作用的杨梅素胶束滴眼液，包括杨梅素为主药，其特征在于还包括瑞鲍迪苷A为药物辅料，所述杨梅素主药和瑞鲍迪苷A药物辅料质量比在1:15‑1:30之间，其特征在于还包括瑞鲍迪苷A(CAS登记号58543‑16‑1，分子式C44H70O23，分子量967.03)纯度≥98％。本发明制备的杨梅素胶束滴眼液，给药浓度可达10mg/ml，且胶束粒径小，分布范围均一，药物稳定性良好，还显著降低了给药刺激性、提高了角膜对药物的吸收、降低了给药浓度、延长了药物作用时间、减少了给药次数、提高了患者的顺从性，同时瑞鲍迪苷A具有的抗糖尿病、抗炎等活性，使得杨梅素胶束滴眼液具有很好的协同的眼部治疗糖尿病性角膜病变和角膜神经病变的药效，本发明的杨梅素胶束滴眼液具有很好的经济性。

Description

一种具有协同作用的杨梅素胶束滴眼液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种杨梅素滴眼液，特别涉及一种具有协同作用的杨梅素胶束滴眼液及其制备方法。
背景技术
我国的糖尿病患病率近几年快速增长，糖尿病已成为我国重大的公共卫生问题。患者长期的高血糖状态导致全身各组织器官发生病变，引起严重的糖尿病相关并发症，包括糖尿病性角膜病变。此外，糖尿病患者在角膜外伤或接受角膜手术时极易出现角膜上皮愈合延迟甚至不愈，临床表现为持续性角膜上皮损失、反复性角膜上皮糜烂、浅层角膜溃疡形成、继发严重角膜感染甚至失明，治疗棘手，预后差，患者的经济和精神负担严重。目前糖尿病性角膜病变的临床治疗手段有限，因此，研究糖尿病性角膜病变新的治疗靶标和有效防治措施具有重要的临床意义。
糖尿病性角膜神经病变引起的角膜知觉减退为糖尿病周围神经病变的一部分，研究表明线粒体产生过多的超氧化物是导致糖尿病所有慢性并发症的共同发病机制。多种研究发现，氧化应激在糖尿病的发生发展中起着举足轻重的作用，慢性高血糖诱导氧化应激，角膜和三叉神经节氧化还原水平的失衡是糖尿病发生的重要病理生理学特征。本专利发明人课题组开展了纠正氧化应激水平治疗糖尿病性角膜病变的研究，取得了一定的研究成果，进一步印证了通过着眼于氧化应激治疗糖尿病性角膜病变的有效性与可行性。
从植物中提取的多酚类化合物具有强抗氧化活性、抑制细菌与癌细胞生长等多种药理学活性。现在广泛研究和应用的多酚类化合物有白藜芦醇、姜黄素、芦丁、杨梅素等。这些多酚类化合物面临的普遍性问题是难溶于水、水溶液易氧化极其不稳定、对光和热不稳定、生物利用度低等，严重制约这些多酚类化合物的临床应用。而这些多酚类化合物在眼科临床的应用受到其水溶性差、水溶液稳定性等问题制约尤为突出，因眼科临床用药90％以上均为水溶性滴眼液。目前已有一些文献报道对白藜芦醇、姜黄素等多酚类化合物进行研究，以期待解决这些多酚类化学物的水溶性、稳定性和生物利用度等问题，如发明专利申请号CN201510674789.3公开了一种以聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物为药物辅料的白藜芦醇胶束滴眼液及其制备方法、申请号CN201610547678.0公开了一种姜黄素乳剂滴眼液及其制备方法等。而目前杨梅素却仍未有好技术和方法解决其眼科临床应用。
杨梅素(Myricetin，CAS号529-44-2)是广泛存在于天然植物中的一种多酚类化合物，具有防治心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性，最新的研究表明，因杨梅素具有显著的抗氧化、抗炎、清除自由基等广泛的药理学活性，在治疗糖尿病及其并发症方面，如糖尿病性角膜病变有着广阔的应用前景。但杨梅素稳定性差，水溶性较小，导致其半衰期短、生物利用度低等，限制了其临床应用，因此，很有必要进一步探索既安全，又经济又有效的眼部治疗糖尿病性角膜病变和角膜神经病变的杨梅素药物。
杨梅素在目前已知的多酚类化合物中，其抗氧化等药理学活性是最强的，这主要由其特殊的化学分子结构决定的。多酚类化合物，顾名思义，其分子结构中存在多个酚羟基，如姜黄素分子结构中有2个酚羟基，柚皮素分子结构中有3个酚羟基，白藜芦醇分子结构中有3个酚羟基，水飞蓟素分子结构中有4个酚羟基，芦丁分子结构中有4个酚羟基。而杨梅素分子结构中则含有多达6个酚羟基，是目前已知的多酚类化合物中酚羟基最多的化合物之一。分子结构中含有多达6个酚羟基决定了杨梅素具有比其他多酚类化合物更强的药理学活性，但是因为酚羟基极其不稳定，也决定了杨梅素极其差的水溶液不稳定性。本发明人通过实验进行比较，发现目前已有的文献报道和技术均不能满足杨梅素滴眼溶解度及其水溶液稳定性的要求。
发明人采用其已申请并获得授权的发明专利“一种环孢素A胶束滴眼液及其制备方法”(ZL201210529616.9)技术制备了杨梅素纳米胶束滴眼液，在治疗效果性评价研究中，杨梅素纳米胶束眼表给药可部分纠正角膜中的氧化还原失衡，但是因单纯基于聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物构建的胶束且其水溶液在贮存过程中，杨梅素会逐渐从胶束中游离出来，其水溶液在25℃室温下的有效稳定性只有1个月，而在34℃环境下，其水溶液15分钟即出现颜色变黄，表现出明显的水溶液极其不稳定性。发明人采用其已申请的发明专利“一种姜黄素胶束滴眼液及其制备方法”(专利申请号：201510391874.9)技术制备了杨梅素纳米胶束滴眼液，水溶液不稳定性没有有效解决，且在治疗效果性评价研究中，我们还发现因在体系中使用了地喹氯铵，长期使用过程中眼表刺激性较大，长期使用易引起眼表毒性、药源性角膜炎等问题。此外，上述的两项发明专利技术均使用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物来构建的胶束，但是聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物为不可生物降解性高分子材料，临床长期使用中存在该高分子材料在体内蓄积从而引起毒副作用等潜在风险。
目前常用的眼用纳米药物递送系统如胶束、纳米粒等主要采用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、羟基乙酸与乳酸的共聚物(PLGA)、乙交酯一丙交酯一己内酯三元无规共聚物(PGLC)等，其本身仅为一种载体而已，没有治疗作用，且这些人工合成的高分子材料载体，因存在降解性等问题，长期使用存在一定的安全隐患。如能使用天然提取物质，特别是天然提取的小分子物质作为一种新型载体，这种载体课起到构建纳米药物递送系统的作用，提高药物稳定性，增强角膜药物吸收、提高疗效。目前已报道的天然小分子物质作为载体的有人参皂苷(发明专利申请号201310155639.2)、甜菊甙(现代食品科技,2014,30(1):115-119；J Agric FoodChem,2013,61(18):4433-4440)等。上述已有研究和报道的天然小分子物质作为载体可满足对白藜芦醇、姜黄素等多酚类化学物的包载，但是本发明人通过实验对比，发现目前已有的文献报道的人参皂苷、甜菊甙均不能满足杨梅素滴眼溶解度及其水溶液稳定性的要求。这是因为杨梅素分子结构中含有多达6个酚羟基，极易被氧化，上述已有的文献报道的人参皂苷、甜菊甙等均无抗氧化活性或抗氧化活性很弱，对其包载的杨梅素没有一个很好的抗氧化保护作用。因此，需要选择一种本身就有非常强抗氧化活性的天然小分子物质，起到抗氧化剂保护杨梅素不被氧化失活，同时还能有效包封杨梅素，从而提高杨梅素在水溶液中的溶解度极其稳定性。且本发明人实验结果发现人参皂苷浓度在15mg/ml、甜菊甙浓度在20mg/ml兔眼局部滴眼后即可表现出强烈的刺激性，不适合作为眼部药物递送的载体。
瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A，CAS登记号58543-16-1，分子式C44H70O23，分子量967.03)是从菊科植物Stevia Rebaudia(该植物在我国称作甜叶菊)的叶子中提取出来的一种糖苷，作为一种新型天然甜味剂而广泛应用于食品、饮料、调味料的生产中。在南美洲使用甜叶菊作为药草和代糖已经有几百年历史。近年的研究表明，瑞鲍迪苷A具有强抗氧化活性(Saravanan R,Ramachandran V.Modulating efficacy of Rebaudioside A,aditerpenoid on antioxidant and circulatory lipids in experimental diabeticrats.Environ Toxicol Pharmacol.2013,36(2):472-83)，同时，瑞鲍迪苷A具有强抗糖尿病、抗炎、免疫调节等作用(V,S,N,et al.Insight into anti-diabetic effect of low dose of stevioside.Biomed Pharmacother.2017,90:216-221)。本发明人研究发现，浓度高达500mg/ml的瑞鲍迪苷A一天滴眼4次，连续滴眼4周，未发现有眼局部刺激性，说明瑞鲍迪苷A眼部应用安全性良好。而从菊科植物Stevia Rebaudia(该植物在我国称作甜叶菊)的叶子中提取出来的另一种成分甜菊甙(又名甜菊糖苷，CAS登记号57817-89-7，分子式C38H60O18，分子量804.87)，本发明人研究发现，浓度20mg/ml的甜菊糖苷滴眼即可发现显著的眼局部刺激性，说明甜菊甙则不适用于眼部药物递送。人参皂苷浓度在15mg/ml兔眼局部滴眼后也即可表现出强烈的刺激性(一些文献报道人参皂苷具有引起溶血作用)，也不适合作为眼部药物递送的载体。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种创新性杨梅素胶束滴眼液，改善杨梅素分子稳定性，提高滴眼给药后的药物吸收率，提高滴眼液的贮存稳定性，同时提高眼用安全性，同时，构建杨梅素胶束滴眼液的载体是一种天然的安全的小分子物质，具有抗糖尿病、抗炎、免疫调节等作用，使得其构建的杨梅素胶束滴眼液具有协同的眼部治疗糖尿病性角膜病变和角膜神经病变的药效。
本发明的另外一个目的是提供上述杨梅素胶束滴眼液的制备方法。
本发明技术构思：杨梅素具有明确的促进上皮修复、抗炎、抗糖尿病和神经保护等药理学活性，但是杨梅素分子结构极其不稳定、难溶于水、口服生物利用度低等问题严重限制了杨梅素在眼科药物治疗中的应用，尤其是滴眼液主要为水溶液性，而杨梅素分子结构中含有6个酚羟基，是多酚类化合物中分子结构中酚羟基数最多的化合物之一，其在水溶液中极易氧化失活。而将杨梅素制备为在水溶液中稳定的、眼局部用滴眼液能有效提高眼局部应用的疗效，采用纳米药物递送系统将杨梅素构建成纳米滴眼液，因纳米药物递送系统的本身所特有的优势，将使杨梅素滴眼液进一步提高稳定性、延长给药后的角膜滞留时间、增强疗效，采用具有生物活性的小分子天然产物作为构建杨梅素纳米滴眼液的载体，不仅起到有效构建梅素滴眼液，还因载体具有药理学活性，则可进一步增强杨梅素滴眼液的疗效。本发明人研究发现，瑞鲍迪苷A在水溶液中可自发形成具有类似胶束的纳米结构，发挥增溶杨梅素的作用，且因瑞鲍迪苷A本身就有强抗氧化活性，可起到保护包载的杨梅素不被氧化失活。瑞鲍迪苷A胶束增溶的杨梅素溶液，即杨梅素胶束溶液，稳定性显著提高，进一步实验发现杨梅素胶束溶液具有显著的促进角膜吸收、提高杨梅素治疗糖尿病性角膜病变的有效性作用。
本发明的技术方案：一种杨梅素胶束溶液滴眼液，包括杨梅素为主药，其特征在于还包括瑞鲍迪苷A作为药物辅料，所述杨梅素主药和瑞鲍迪苷A药物辅料质量比在1:15-1:30之间。
所述的瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A)为菊科植物Stevia Rebaudia(该植物在我国称作甜叶菊)的叶子中提取出来的一种糖苷(CAS登记号:58543-16-1，分子式:C44H70O23，分子量：967.01)，瑞鲍迪苷A纯度≥98％。
本发明的滴眼液的制备方法如下：将杨梅素和瑞鲍迪苷A溶解到无水乙醇中，通过40℃水浴旋转真空蒸发乙醇在容器内部均匀成膜，再加入蒸馏水以充分洗膜，水浴超声得胶束溶液，测定并调整杨梅素质量百分浓度为0.2～1.0％，并依据需要加入防腐剂、pH调节剂、等渗调节剂之后无菌过滤分装即可。其中防腐剂、pH调节剂、等渗调节剂可以按照已有常规技术添加。
上述杨梅素胶束滴眼液的制备方法，制得的杨梅素胶束粒径范围在6～15nm之间。
上述杨梅素胶束滴眼液的制备方法，使用的缓冲液为滴眼液常用的磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，pH值为6.5～7.4。
本发明制备的杨梅素胶束滴眼液，使得杨梅素在水溶液中有良好的溶解性，杨梅素的溶解度可达10mg/ml，且胶束粒径极小，分布范围均一，药物稳定性良好。该杨梅素胶束滴眼液不但提高了杨梅素在水溶液状态中的稳定性，还可显著降低了给药刺激性、提高了角膜对药物的吸收、降低了给药浓度、延长了药物作用时间、减少了给药次数，从而可提高患者的顺从性，同时瑞鲍迪苷A具有的抗糖尿病、抗炎等活性，使得杨梅素胶束滴眼液具有很好的协同的眼部治疗糖尿病性角膜病变和角膜神经病变的药效。因此，本发明的杨梅素胶束滴眼液具有很好的经济性。
附图说明
图1是实施例1制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液1组)与采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液2组)、以含15％丙二醇的磷酸盐缓冲液配置0.5％杨梅素滴眼液(设为溶液3组)对糖尿病小鼠角膜损伤修复作用对比图。
图2是对图1各组小鼠角膜上皮缺损面积定量分析图。
图3给药7天后对各组糖尿病小鼠角膜神经敏感度分析图。
图4是实施例1制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液1组)与采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液2组)细胞毒性实验结果图。
图5是实施例1制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液1组)与采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液2组)的稳定性实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1：
将50mg杨梅素、900mg瑞鲍迪苷A置于100mL圆底烧瓶中，加入50mL无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇，得到药物和共聚物的均匀分散薄膜，然后加入蒸馏水，充分洗膜，300w功率水浴超声10min，得胶束溶液。将胶束溶液过0.22μm微孔滤膜后，加入防腐剂苯扎氯铵、等渗调节剂氯化钠，pH调节为7.4，无菌过滤分装即可。激光粒度仪测得杨梅素胶束平均粒径为10.1nm，分散指数PDI＝0.015，分散均一性良好。将该杨梅素胶束滴眼剂在室温条件下保存3个月，杨梅素从胶束中渗漏量小于10％。
实施例2：
将20mg杨梅素、300mg瑞鲍迪苷A置于100mL圆底烧瓶中，加入50mL无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇，得到药物和共聚物的均匀分散薄膜，然后加入蒸馏水，充分洗膜，300w功率水浴超声10min，得胶束溶液。将胶束溶液过0.22μm微孔滤膜后，加入防腐剂苯扎氯铵、等渗调节剂氯化钠，pH调节为7.4，无菌过滤分装即可。激光粒度仪测得杨梅素胶束平均粒径为10.7nm，分散指数PDI＝0.021，分散均一性良好。将该杨梅素胶束滴眼剂在室温条件下保存2个月，杨梅素从胶束中渗漏量小于10％。
实施例3：
将100mg杨梅素、3000mg瑞鲍迪苷A置于100mL圆底烧瓶中，加入50mL无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇，得到药物和共聚物的均匀分散薄膜，然后加入蒸馏水，充分洗膜，300w功率水浴超声10min，得胶束溶液。将胶束溶液过0.22μm微孔滤膜后，加入防腐剂苯扎氯铵、等渗调节剂氯化钠，pH调节为7.4，无菌过滤分装即可。激光粒度仪测得杨梅素胶束平均粒径为10.5nm，分散指数PDI＝0.019，分散均一性良好。将该杨梅素胶束滴眼剂在室温条件下保存2.5个月，杨梅素从胶束中渗漏量小于10％。
实验效果例1：本发明的0.5％杨梅素胶束滴眼液有效性实验。
实验药物：0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备，设为溶液1组)。
对照药物：采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液2组)；以含15％丙二醇的磷酸盐缓冲液配置0.5％杨梅素滴眼液(设为溶液3组)；用磷酸盐缓冲液配置含瑞鲍迪苷A225mg/ml的溶液(设为溶液4组)；用磷酸盐缓冲液配置含聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)90mg/ml的溶液(设为溶液5组)
实验动物与实验方法：因STZ诱导的糖尿病小鼠作为较公认的类似于人非增殖期糖尿病视网膜病变模型，本部分内容采用此模型进行研究。选用C57BL/6小鼠，雄性，6-8周龄，体重18～25克(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)。动物随机分为两组，一组采用新鲜配置的柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)配制STZ溶液后对小鼠进行腹腔注射，连续注射5天，在最后一次(第五次注射)后的第8天(一周后)对每小鼠测量血糖，连续测量3天，STZ注射组血糖值大于300mg/dL(16.7mmol/L)认为Ⅰ型糖尿病模型成功。在12周实验取材时，对小鼠进行同样的体重和血糖监测，符合各参数指标和取组织材料的条件的小鼠用于实验。另一组注射不含STZ的柠檬酸缓冲液作为正常对照。实验结果表明，STZ腹腔注射建模的小鼠逐渐表现出多饮、多食、多尿、体重下降等糖尿病典型症状，其血糖稳定维持在较高水平，体重较正常小鼠偏低(表1)，表明造模成功。
表1正常和糖尿病模型小鼠在取样点时体重及血糖检测
小鼠成模12周后行角膜上皮刮除术建立糖尿病角膜/神经损伤模型，分别给予0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备，设为溶液1组)、采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液进行滴眼药物治疗(设为溶液2组)、以含15％丙二醇的磷酸盐缓冲液配置0.5％杨梅素滴眼液(设为溶液3组)、用磷酸盐缓冲液配置含瑞鲍迪苷A225mg/ml的溶液(设为溶液4组)、用磷酸盐缓冲液配置含聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)90mg/ml的溶液(设为溶液5组)，上述各组一天滴眼6次，于不同时间点角膜荧光素染色后裂隙灯观察拍照，在第7天，选用角膜触觉测量仪检测各组糖尿病小鼠角膜神经敏感度。
结果发现(如图1，及其对图1进行定量化分析而得到的图2)：相比于PBS对照组，以含15％丙二醇的磷酸盐缓冲液配置0.5％杨梅素滴眼液(设为溶液3组)没有显著促进糖尿病小鼠角膜损伤后的愈合作用，各时间点与PBS对照组相比无显著性差异(P≥0.05)，而0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备，设为溶液1组)眼表滴眼给药有效促进模型小鼠角膜上皮修复，疗效优于采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液滴眼给药(设为溶液2组)，而不含杨梅素的瑞鲍迪苷A溶液组则具有一定的促进角膜上皮修复作用(设为溶液4组)，而不含杨梅素的聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)则具未观察到明显的促进角膜上皮修复作用(设为溶液4组)，各时间点与PBS对照组相比无显著性差异(P≥0.05)。
角膜敏感度检测结果表明(如图3)，相比于PBS对照组，以含15％丙二醇的磷酸盐缓冲液配置0.5％杨梅素滴眼液(设为溶液3组)没有显著促进糖尿病小鼠角膜敏感度恢复作用，各时间点与PBS对照组相比无显著性差异(P≥0.05)，而0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备，设为溶液1组)眼表滴眼给药有效促进模型小鼠敏感度恢复，疗效优于采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液滴眼给药(设为溶液2组)，而不含杨梅素的瑞鲍迪苷A溶液组则具有一定的促进敏感度恢复作用(设为溶液4组)，而不含杨梅素的聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)则具未观察到明显的促进角膜敏感度恢复作用(设为溶液4组)，各时间点与PBS对照组相比无显著性差异(P≥0.05)。
实验效果例2：0.5％杨梅素胶束滴眼液的细胞毒性实验。
实验药物：0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备，设为溶液1组)。
对照药物：采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液2组)。
实验方法：采用人角膜上皮细胞系进行实验。24孔培养板中每孔接种2×104个细胞，使用含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液培养48小时后，更换为无血清培养液用于下游实验。用含10％胎牛血清的培养液将HCECs配成单个细胞悬液，以1000～3000个细胞/孔的密度接种到96孔板，培养24小时后加入空白滴眼液、0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备)、采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液溶液进行处理。细胞加入上述溶液后分别孵育4小时和24小时后，弃去原培养液，换为含0.5mg/ml MTT的无血清培养基，继续孵育4小时，弃掉上清，每孔加150ul DMSO，振荡10分钟以充分溶解细胞中的蓝紫色结晶物，酶联免疫检测仪测定490nm处的光吸收值。
显然，从图4中可以发现，本发明的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液1组)、对照实验的采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液2组)细胞孵育4小时后均没有明显的细胞毒性，但是进一步延长孵育时间至24小时后，采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液则表现出显著的细胞毒性(设为溶液2组)。
这是因为：大分子不可降解性高分子材料聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇不能够生物降解，长时间细胞孵育后，高分子材料进入细胞，不能降解，从时间孵育引起在细胞内蓄积，从而表现出了一定的细胞毒性。
实验效果例3：0.5％杨梅素胶束滴眼液的贮存稳定性。
实验药物：0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备)。
对照药物：采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液。
实验方法：制备0.5％杨梅素胶束滴眼液(实施例1制备)和采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液，分别封装于2ml安瓶中避光25度保存，定期取滴眼液，采用0.22μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱法测定过滤前后溶液中的杨梅素药物浓度，计算其贮存稳定性。
实验结果如图5，本发明的0.5％杨梅素胶束滴眼液相(设为溶液1组)比于对照实验的采用已有发明专利ZL201210529616.9技术，用聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物(PVCL-PVA-PEG)制备的0.5％杨梅素胶束滴眼液(设为溶液2组)贮存稳定性均较高，储存20周后的杨梅素含量均在90％以上。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种具有协同作用的杨梅素胶束滴眼液，包括杨梅素为主药，其特征在于还包括瑞鲍迪苷A为药物辅料，所述杨梅素主药和瑞鲍迪苷A药物辅料质量比在1:15-1:30之间。
2.如权利要求1所述的杨梅素胶束滴眼液，其特征在于所述杨梅素主药浓度为0.2％～1.0％。
3.如权利要求1所述的杨梅素胶束滴眼液，其特征在于所述瑞鲍迪苷A(CAS登记号58543-16-1，分子式C44H70O23，分子量967.03)纯度≥98％。
4.一种如权利要求1所述的杨梅素胶束滴眼液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将杨梅素主药和瑞鲍迪苷A药物辅料溶解在无水乙醇中，通过40℃水浴旋转真空蒸发有机溶剂在容器内部均匀成膜，再加入蒸馏水以充分洗膜，水浴超声得胶束溶液，杨梅素最终质量百分浓度为0.2％～1.0％，最后加入防腐剂、pH调节剂，等渗调节剂之后无菌过滤分装即可。
5.如权利要求4所述的杨梅素胶束滴眼液的制备方法，其特征在于制得的杨梅素胶束的粒径范围在6-15nm之间。
6.如权利要求4所述的杨梅素胶束滴眼液的制备方法，其特征在于所述缓冲液为常用磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，pH值为6.5～7.4。
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