CN110272032B - 一种镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法。以富钙贝壳为主要原料，利用水热合成技术结合柠檬酸钠螯合剂制备镁掺杂羟基磷灰石微球并装载抗肿瘤、促修复药物。所得微球具有较小的球形尺寸（2‑3μm），且其多孔结构可确保较大药物装载率，同时具有良好的生物相容性、诱导骨生长性、药物持续释放性及pH响应性，载药微球可良好持续药物特性并发挥作用，可用于药物递送及骨缺损修复。本发明整体制备方法简单，原料来源广泛，成本低廉，易于推广，有望成为一种新型药物递送、骨修复材料。

Description

一种镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法
技术领域
本发明属于材料制备与生物医学领域，具体涉及一种镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法。
背景技术
羟基磷灰石(Cal0(P04)6(OH)2, HAP),在陶瓷类矿物的体系中拥有重要的地位，同时也是哺乳动物体内牙齿、骨骼等坚硬部位的主要无机质成分。由于其优异的生物相容性、骨传导性和生物活性等，国内外在有关人工合成羟基磷灰石理化性质、合成条件等方面的探索研究已多年，制备出了多种形貌、不同尺寸、多种掺杂的衍生物，也已经得到在各个领域内的多种应用。其中，具有特殊内部结构和外部形状的HAP在生物医学的治疗器械等应用方面具有巨大的潜在价值。其中，球形羟基磷灰石因其表面积大、吸附能力强等特点，广泛应用于药物递送、元素吸附、水净化等领域。然而，目前报道的用于生物医药方面的球形羟基磷灰石基本存在尺寸过大问题，这大大限制了其实际应用性，此外，目前报道的球形羟基磷灰石多为单纯磷酸钙成分，具备一定功能性的功能羟基磷灰石微球少有报道。
镁是人体必需的矿物元素，是维持神经、肌肉和心脏应激性的重要离子之一。因其在人体的含量较多，也是人体内常量元素之一。人体内镁主要分布于细胞内，广泛参与物质代谢和能量代谢，可激活人体多种酶的活性；维护骨骼生长和神经肌肉的兴奋性；维护胃肠道和激素的功能；具有镇静、降低血压、导泻、增强长期记忆力等作用。如果人体内镁缺乏，不仅会对上诉功能发生影响，还会导致血清钙下降、骨质疏松、神经肌肉兴奋性亢进等，也有研究表明镁耗竭可导致胰岛素抵抗（与糖尿病有关）。因此将镁离子掺入生物材料当中应用于生物医药领域，不仅可以为人体补充少量的镁离子，还可以增进生物材料的功能性，拓宽应用领域。
鲍鱼、贻贝、牡蛎、珍珠贝等均为海洋贝类，此外其另一个共同点为其贝壳体型较大，占整体的绝大部分质量。由于他们的主体成分均为碳酸钙，因此它们均为丰富的钙源材料。然而随着海产养殖业的迅速发展，大量的贝壳被抛弃，造成环境污染与资源浪费。利用其丰富钙源特性，将其转化为羟基磷灰石、骨水泥等生物材料可大大增进及价值，变废为宝。
本发明从贝壳资源高值化及环境保护的角度出发，以贝壳为主要钙源，采用柠檬酸钠作为鳌合剂同时结合水热合成技术，制备镁掺杂羟基磷灰石载药微球。整体制备过程简单，无需煅烧。掺杂羟基磷灰石载药微球的pH响应性及药物控缓释效应可保持持久药效，同时较小的球形尺寸提高了可注射性及实际应用性，镁离子的存在使其具备促骨修复、激活人体内酶等功能性，有望成为一种新型、高效的生物材料应用于抗肿瘤、促骨修复治疗。
发明内容
本发明的致力于解决贝类水产经加工后空壳被大量废弃、利用率低下问题，提供一种以贝壳为主要的钙源的镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法，本发明制备方法简单，原料来源广泛，成本低廉，易于推广。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法：以贝壳为主要原料，利用鳌合剂结合水热合成技术制备镁掺杂羟基磷灰石微球同时搭载抗肿瘤、促修复药物。
包括以下步骤：
（1）将贝壳粉碎研磨，用200目滤网进行筛选，获得贝壳粉末；
（2）将贝壳粉末溶于醋酸溶液中，并不断地搅拌至不产生气泡，而后进行离心得到上清液；
（3）将步骤（2）得到的上清液定容至50ml，而后进行搅拌的同时向其中以1ml/min的速率滴加磷酸溶液；
（4）待磷酸溶液滴加结束，向溶液中添加镁盐、柠檬酸钠、尿素并持续搅拌0.5h得到澄清前驱体反应液；
（5）将步骤（4）制得的前驱体反应液进行水热反应；
（6）反应结束后，自然冷却至室温，离心水洗，乙醇洗涤，干燥，得到所述的镁掺杂羟基磷灰石微球；
（7）将步骤（6）中得到的镁掺杂羟基磷灰石微球加入至1mg/ml药物-超纯水溶液中，恒温避光持续震荡；
（8）将步骤（7）中震荡后混合溶液离心水洗三次，避光真空干燥，得到镁掺杂羟基磷灰石载药微球。
各步骤的工艺参数如下：
步骤（2）中醋酸溶液的浓度为10～30vol.％，离心转数为9000rpm，离心时间为5～10min；离心温度4℃；
步骤（2）中贝壳粉末和步骤（3）中磷酸的用量按（Ca+ Mg）/P摩尔比为n(Ca2++Mg2 +):n(PO4 3-)=1.67：1添加；磷酸溶液体积为50ml；
步骤（2）中贝壳粉末用量为0.25-0.5g，步骤（4）中柠檬酸钠用量为0.2352～2.3528g，尿素使用量为6g，镁盐用量为0.002-0.6g；步骤（4）的前驱体反应液中Mg2+：Ca2+摩尔比为1：1～49；
步骤（5）中水热反应温度为60～90℃，时间为36-48h；
步骤（6）中离心转数为8000rpm，离心时间为10～15min，离心温度为4℃；用去离子水洗离三遍，无水乙醇洗涤一次；干燥温度为60℃；
步骤（7）中震荡温度为37℃，震荡时间为48h；
步骤（8）中离心转数为5000rpm，离心时间为10～15min，离心温度为4℃；用去离子水洗离三遍，真空干燥温度为50℃，干燥时间30min。
所述的贝壳为鲍鱼壳、贻贝贝壳、牡蛎壳、珍珠贝中的一种或几种；
所述的镁盐为氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、氢氧化镁中的一种或几种；
所述的药物为淫羊藿苷、阿霉素、盐酸阿霉素、卡铂、顺铂、姜黄素、环磷酰胺、博来霉素、长春新碱、泼尼松及他们衍生物中的一种或几种。
本发明的显著优点在于：本发明以贝壳为主要原料，通过柠檬酸根对钙离子与镁离子的共鳌合作用，吸附钙、镁离子形成成核位点，再在水热环境下吸引磷酸根离子富集并原位自组装形成镁掺杂羟基磷灰石多孔微球，尺寸较小、载药率高，可用做药物递送载体及骨缺损修复，因镁离子的存在使其具备良好的功能性，同时原料来源广泛，制备方法简单，成本低廉，易于推广。
相对于其他羟基磷灰石微球的制备方法有以下优点：
（1）原料来源广泛，成本低廉，将其转化为羟基磷灰石微球可增加其价值的同时减轻其对环境的污染；
（2）使用水热合成法得到的羟基磷灰石微球结晶性好，反应过程无团聚，无需高温灼烧处理，通过改变水热条件（水热时间、水热温度等）、柠檬酸钠添加量、镁掺杂比例可调节反应进程、结晶速率、结晶尺寸及晶格畸变，进而调控羟基磷灰石微球的尺寸及形成率；由于镁离子与钙离子的离子尺寸不一样，镁离子的离子尺寸小于钙离子，因此将镁掺入羟基磷灰石当中是会因离子尺寸差异而产生一定的晶格畸变，进而对微球的尺寸及形成产生影响；
（3）该羟基磷灰石微球具有较小的微球尺寸，方便于实际应用，同时具有较高的载药包封率同时具有pH响应性、药物控缓释性，可有效抑制肿瘤细胞增殖的同时促进骨髓间充质干细胞的增殖；
（4）该羟基磷灰石微球生物相容性好，镁离子成功掺入微球且可持续释放镁离子，具备促成骨、降血压、激活多种酶活性等功能性，大大丰富其应用领域；
（5）该羟基磷灰石微球的制备工艺较简单，操作方便，易于推广。
附图说明
图1为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的X射线衍射图谱；
图2为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的扫描电子显微图；
图3为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的孔型及孔径分布图；
图4为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的降解元素释放图；
图5为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石载药微球的药物控缓释行为曲线；
图6为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石载药微球与bMSCs骨髓间充质干细胞共培养后的细胞存活率；
图7为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石载药微球和镁掺杂羟基磷灰石载药微球与MG63成骨肉瘤细胞共培养后的细胞存活率。
具体实施方式
实施例1
1）将洗净干燥后的牡蛎壳进行粉碎研磨，用200目滤网进行筛选，获得牡蛎壳粉末；
2）取牡蛎壳粉末0.4g，使用20ml的10 vol.％的醋酸溶液溶解，持续搅拌至不产生气泡后离心取上清液, 离心转速为9000rpm，时间为5min，温度为4℃；
3）将上清液定容至50ml，持续搅拌中以1ml/min的速率滴加50ml磷酸溶液（摩尔比(Ca+Mg)/P=1.67：1）；
4）待磷酸溶液滴加结束后，向混合液中加入0.2352g柠檬酸钠、0.203g氯化镁及6g尿素，持续搅拌0.5h至完全溶解，得到前驱体反应液，其中Mg2+：Ca2+摩尔比为1：4；
5）将4）中所得前驱体反应液转移至反应釜中，放入烘箱，90℃水热反应48h。
6）反应结束后，取出高压反应釜，自然冷却至室温后离心，得到镁掺杂羟基磷灰石微球沉淀，离心转速为8000rpm，时间为5min，温度为4℃，用去离子水洗离三遍，无水乙醇洗涤一遍。
7）洗涤后的样品抽气过滤，60℃干燥4h，得到镁掺杂羟基磷灰石微球。
8）称取50mg镁掺杂羟基磷灰石微球，加入至1mg/ml的阿霉素溶液中，37℃避光持续震荡48h。
9）将震荡后混合液离心水洗三次，离心转速5000rpm，时间为5min，温度为4℃。50℃避光真空干燥，得到镁掺杂羟基磷灰石载药微球。
实施例2
1）将洗净干燥后的贻贝壳进行粉碎研磨，用200目滤网进行筛选，获得贻贝壳粉末；
2）取贻贝壳粉末0.45g，使用20ml的10 vol.％的醋酸溶液溶解, 持续搅拌至不产生气泡后离心取上清液, 离心转速为9000rpm，时间为5min，温度为4℃；
3）将上清液定容至50ml，持续搅拌中以1ml/min的速率滴加50ml磷酸溶液（摩尔比(Ca+Mg)/P=1.67:1）；
4）待磷酸溶液滴加结束后，向混合液中加入0.2352g柠檬酸钠、0.1015g氯化镁及6g尿素，持续搅拌0.5h至完全溶解，得到前驱体反应液，其中Mg2+：Ca2+摩尔比为1：9；
5）将4）中所得前驱体反应液转移至反应釜中，放入烘箱，90℃水热反应48h。
6）反应结束后，取出高压反应釜，自然冷却至室温后离心，得到镁掺杂羟基磷灰石微球沉淀，离心转速为8000rpm，时间为5min，温度为4℃，用去离子水洗离三遍，无水乙醇洗涤一遍。
7）洗涤后的样品抽气过滤，60℃干燥4h，得到镁掺杂羟基磷灰石微球。
8）称取50mg镁掺杂羟基磷灰石微球，加入至1mg/ml的淫羊藿苷溶液中，37℃避光持续震荡48h。
9）将震荡后混合液离心水洗三次，离心转速5000rpm，时间为5min，温度为4℃。50℃避光真空干燥，得到镁掺杂羟基磷灰石载药微球。
实施例3
1）将洗净干燥后的鲍鱼贝壳进行粉碎研磨，用200目滤网进行筛选，获得鲍鱼贝壳粉末；
2）取鲍鱼贝壳粉末0.25g，使用20ml的10 vol.％的醋酸溶液溶解, 持续搅拌至不产生气泡后离心取上清液, 离心转速为9000rpm，时间为5min，温度为4℃；
3）将上清液定容至50ml，持续搅拌中以1ml/min的速率滴加50ml磷酸溶液（摩尔比(Ca+Mg)/P=1.67:1）；
4）待磷酸溶液滴加结束后，向混合液中加入0.2352g柠檬酸钠、0.5075g氯化镁及6g尿素，持续搅拌0.5h至完全溶解，得到前驱体反应液，其中Mg2+：Ca2+摩尔比为1：1；
5）将4）中所得前驱体反应液转移至反应釜中，放入烘箱，90℃水热反应48h。
6）反应结束后，取出高压反应釜，自然冷却至室温后离心，得到镁掺杂羟基磷灰石微球沉淀，离心转速为8000rpm，时间为5min，温度为4℃，用去离子水洗离三遍，无水乙醇洗涤一遍。
7）洗涤后的样品抽气过滤，60℃干燥4h，得到镁掺杂羟基磷灰石微球。
8）称量0.1g的镁掺杂羟基磷灰石微球于烧杯中，加入5ml PBS，37℃水浴加热，于1,3,5,7,14,21,28d各吸取1ml上清液并新添1ml PBS，检测其中的Ca、Mg、P元素离子浓度。
9）称取50mg镁掺杂羟基磷灰石微球，加入至1mg/ml的淫羊藿苷溶液中，37℃避光持续震荡48h。
10）将震荡后混合液离心水洗三次，离心转速5000rpm，时间为5min，温度为4℃。50℃避光真空干燥，得到镁掺杂羟基磷灰石载药微球。
11）称取10mg羟基磷灰石载药微球加至30ml pH分别为7.4、6.4、5.6的PBS溶液中，37℃避光震荡，每隔固定时间吸取2ml并新添2mlPBS，270nm处紫外检测吸光度(OD值)。
12）培养bMSCs骨髓间充质干细胞并以2×103/孔铺于96孔板中，37℃培养24h后加入不同浓度的镁掺杂羟基磷灰石载药微球，共培养24h、48h、72h后检测细胞存活数量。
13）培养MG63成骨肉瘤细胞并以8×103/孔铺板于96孔板中，37℃培养24h后加入不同浓度的镁掺杂羟基磷灰石微球与镁掺杂羟基磷灰石载药微球，共培养24h、48h、72h后检测细胞存活数量。
实施例4
1）将洗净干燥后的鲍鱼壳进行粉碎研磨，用200目滤网进行筛选，获得鲍鱼壳粉末；
2）取鲍鱼壳粉末0.3g，使用20ml的10 vol.％的醋酸溶液溶解, 持续搅拌至不产生气泡后离心取上清液, 离心转速为9000rpm，时间为5min，温度为4℃；
3）将上清液定容至50ml，持续搅拌中以1ml/min的速率滴加50ml磷酸溶液（摩尔比(Ca+Mg)/P=1.67:1）；
4）待磷酸溶液滴加结束后，向混合液中加入0.2352g柠檬酸钠、0. 406g氯化镁及6g尿素，持续搅拌0.5h至完全溶解，得到前驱体反应液，其中Mg2+：Ca2+摩尔比为2：3；
5）将4）中所得前驱体反应液转移至反应釜中，放入烘箱，90℃水热反应48h。
6）反应结束后，取出高压反应釜，自然冷却至室温后离心，得到镁掺杂羟基磷灰石微球沉淀，离心转速为8000rpm，时间为5min，温度为4℃，用去离子水洗离三遍，无水乙醇洗涤一遍。
7）洗涤后的样品抽气过滤，60℃干燥4h，得到镁掺杂羟基磷灰石微球。
8）称取50mg镁掺杂羟基磷灰石微球，加入至1mg/ml的盐酸阿霉素溶液中，37℃避光持续震荡48h。
9）将震荡后混合液离心水洗三次，离心转速5000rpm，时间为5min，温度为4℃。50℃避光真空干燥，得到镁掺杂羟基磷灰石载药微球。
实施例5
1）将洗净干燥后的珍珠贝壳进行粉碎研磨，用200目滤网进行筛选，获得珍珠贝壳粉末；
2）取珍珠贝壳粉末0.49g，使用20ml的10 vol.％的醋酸溶液溶解, 持续搅拌至不产生气泡后离心取上清液, 离心转速为9000rpm，时间为5min，温度为4℃；
3）将上清液定容至50ml，持续搅拌中以1ml/min的速率滴加50ml磷酸溶液（摩尔比(Ca+Mg)/P=1.67:1）；
4）待磷酸溶液滴加结束后，向混合液中加入0.2352g柠檬酸钠、0.00265g硝酸镁及6g尿素，持续搅拌0.5h至完全溶解，得到前驱体反应液，其中Mg2+：Ca2+摩尔比为1：49；
5）将4）中所得前驱体反应液转移至反应釜中，放入烘箱，90℃水热反应48h。
6）反应结束后，取出高压反应釜，自然冷却至室温后离心，得到镁掺杂羟基磷灰石微球沉淀，离心转速为8000rpm，时间为5min，温度为4℃，用去离子水洗离三遍，无水乙醇洗涤一遍。
7）洗涤后的样品抽气过滤，60℃干燥4h，得到镁掺杂羟基磷灰石微球。
8）称取50mg镁掺杂羟基磷灰石微球，加入至1mg/ml的顺铂溶液中，37℃避光持续震荡48h。
9）将震荡后混合液离心水洗三次，离心转速5000rpm，时间为5min，温度为4℃。50℃避光真空干燥，得到镁掺杂羟基磷灰石载药微球。
图1为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的X射线衍射图谱。从图中可以看出羟基磷灰石特征衍射峰。（带星号）
图2为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的扫描电子显微图。从图中可以看出羟基磷灰石的形貌为球形，大小为2-3μm，具备多孔结构。
图3为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的孔型及孔径分布图。图中IV型氮吸附-脱附曲线及H3型迟滞回线表明微球具有介孔结构且孔径3μm左右,比表面积为184.7681m2/g。
图4为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石微球的降解元素释放图。图中各元素在28天仍呈持续释放且在第一周释放较为迅速。
图5为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石载药微球的药物释放行为曲线。从图中可以看出载药微球药物释放具有明显的pH响应性及控缓释效应。
图6为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石载药微球与bMSCs骨髓间充质干细胞共培养后的细胞存活率。从图中可以看出镁掺杂羟基磷灰石载药微球对bMSCs骨髓间充质干细胞的增殖具有较好的促进作用。
图7为实施例3制得的镁掺杂羟基磷灰石载药与镁掺杂羟基磷灰石载药微球与MG63成骨肉瘤细胞共培养后的细胞存活率。从图中可以看出镁掺杂羟基磷灰石载药对MG63无明显影响，而载有淫羊藿苷后各浓度载药微球均对骨肉瘤细胞具有较好的抑制作用。
以上所述仅为本发明的制备方法，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法，其特征在于：以贝壳为主要原料，利用水热合成技术制备镁掺杂羟基磷灰石微球，所述镁掺杂羟基磷灰石微球为多孔结构，微球尺寸为2-3μm，孔径为3nm，所装载药物为抗肿瘤、促修复药物；
所述镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）将贝壳粉碎研磨，用200目滤网进行筛选，获得贝壳粉末；
（2）将贝壳粉末溶于醋酸溶液中，并不断地搅拌至不产生气泡，而后进行离心得到上清液；
（3）将步骤（2）得到的上清液定容至50ml，而后进行搅拌的同时向其中以1ml/min的速率滴加磷酸溶液；
（4）待磷酸溶液滴加结束，向溶液中添加镁盐、柠檬酸钠、尿素并持续搅拌0.5h得到澄清前驱体反应液；
（5）将步骤（4）制得的前驱体反应液进行水热反应；
（6）反应结束后，自然冷却至室温，离心水洗，乙醇洗涤，干燥，得到所述的镁掺杂羟基磷灰石微球；
（7）将步骤（6）中得到的镁掺杂羟基磷灰石微球加入至1mg/ml的药物-超纯水溶液中，恒温避光持续震荡；
（8）将步骤（7）中震荡后混合溶液离心水洗三次，避光真空干燥，得到镁掺杂羟基磷灰石载药微球；
步骤（2）中醋酸溶液的浓度为10～30vol.％，离心转数为9000rpm，离心时间为5～10min；离心温度4℃；
步骤（2）中贝壳粉末和步骤（3）中磷酸的用量按（Ca+ Mg）/P摩尔比为n(Ca2++Mg2+):n(PO4 3-)=1.67：1添加；磷酸溶液体积为50ml；
步骤（2）中贝壳粉末用量为0.25-0.5g，步骤（4）中柠檬酸钠用量为0.2352～2.3528g，尿素使用量为6g，镁盐用量为0.002-0.6g；步骤（4）的前驱体反应液中Mg2+：Ca2+摩尔比为1：1～49；
步骤（5）中水热反应温度为60～90℃，时间为36-48h；
步骤（6）中离心转数为8000rpm，离心时间为10～15min，离心温度为4℃；用去离子水洗离三遍，无水乙醇洗涤一次；干燥温度为60℃；
步骤（7）中震荡温度为37℃，震荡时间为48h；
步骤（8）中离心转数为5000rpm，离心时间为10～15min，离心温度为4℃；用去离子水洗离三遍，真空干燥温度为50℃，干燥时间30min。
2.根据权利要求1所述的镁掺杂羟基磷灰石载药微球的制备方法，其特征在于：所述的贝壳为鲍鱼壳、贻贝贝壳、牡蛎壳、珍珠贝中的一种或几种；所述的镁盐为氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、氢氧化镁中的一种或几种；所述的药物为淫羊藿苷、阿霉素、盐酸阿霉素、卡铂、顺铂、姜黄素、环磷酰胺、博来霉素、长春新碱、泼尼松中的一种或几种。
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