CN110269852A

CN110269852A - β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN110269852A
Application number: CN201910727176.XA
Authority: CN
Inventors: 董子钢; 李美贤; 赵冉; 曼加拉多斯.弗雷迪莫西斯; 刘康栋
Original assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Current assignee: China (henan) Hormel Institute For Cancer Research
Priority date: 2019-08-07
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2019-09-24

Abstract

本发明公开了一种β,β‑二甲基丙烯酰阿卡宁在制备抗肿瘤药物中的应用，属于医药技术领域。本发明通过细胞增殖实验，验证了β,β‑二甲基丙烯酰阿卡宁在人源结直肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌等细胞系中的抑制效果，显示了β,β‑二甲基丙烯酰阿卡宁在治疗结直肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌等癌症上有显著的效果。发明人通过将β,β‑二甲基丙烯酰阿卡宁处理人源结肠癌PDX小鼠模型，结束实验时，发现β,β‑二甲基丙烯酰阿卡宁药物处理组小鼠的肿瘤体积与对照组比较具有显著的统计学差异，从而显示了β,β‑二甲基丙烯酰阿卡宁在预防和治疗结肠癌上有显著的效果。

Description

β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症已成为中国首位死亡原因，是严重的公共卫生问题。癌症是由环境、饮食以及生活方式与遗传因素协同作用的结果，由致癌物作用结合细胞遗传因素导致细胞遗传基因突变而逐渐发展为癌。癌症早期的临床症状不明显，当临床症状较为突出时，患者的病情已经处于中期或者晚期，所以选择安全有效的预防和治疗癌症的方法对于改善患者的预后及生活质量都具有重要意义。

β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁(β,β-dimethylacrylalkannin，分子式：C₂₁H₂₂O₆，分子量：370.4，CAS号34539-65-6)是新疆紫草中的一种重要成分。紫草属于紫草科多年生草本植物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用。β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁作为紫草的主要成分，是由新疆紫草细胞大规模培养技术生产，具有抗癌活性。有研究表明紫草提取中的萘醌类乙酰紫草素诱导细胞凋亡，抑制口腔癌，胰腺癌，胃癌等的发生发展。邹志华等研究发现β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁可通过抑制人结肠癌细胞SW480和MG-63的生长，促进细胞凋亡。但对β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对癌症作用的确切效果和作用机制尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备抗肿瘤药物中的应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备抗肿瘤药物中的应用，所述化合物具有如下(1)或(2)所示的功能；(1)抑制癌细胞增殖；(2)治疗和/或预防肿瘤。

进一步地，所述癌细胞为直肠癌，食管癌，胃癌或皮肤癌细胞。

进一步地，结肠癌，食管癌，胃癌或皮肤癌细胞的数量为1000个，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁剂量范围为1.25～10μM，非锚定实验中，肿癌细胞数量为8000个每孔，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁用量范围为40～600nM。

进一步地，所述β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁通过下述方法获得：

(1)使用乙醇对紫草根原料回流提取获得紫草根的提取液，将所得提取液进行浓缩获得粗提取物；

(2)将步骤(1)所得粗提取物用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，获得有效成分；

(3)将步骤(2)所得的有效成分通过孔径为200-300nm大孔吸附树脂柱进行分离，洗脱液为正己烷-氯仿-甲醇三者混合溶液，正己烷、氯仿和甲醇体积比例为25:6:1，利用薄层色谱进行鉴定，合并收集同一种成分的洗脱液并进行浓缩，获得7种提取成分，成分1，2，3，4和5为有效成分的粗品，成分6和7中是紫草根中的植物残渣。

进一步地，所述步骤(1)的具体过程为：向10kg紫草根原料中加入60L的90％以上的乙醇溶液，提取2～4次，每次回流1.5～3h，过滤，收集液体，蒸除溶剂，即得。

进一步地，所述步骤(2)的具体过程为：将步骤(1)所得粗提取物经2L蒸馏水稀释后，先用石油醚萃取2～4次，再用乙酸乙酯萃取2～4次，最后再经正丁醇萃取2～4次，所述石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇的用量均为3L，合并石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇层，蒸除溶剂，即得。

进一步地，将提取成分2溶于体积比为20:1的石油醚和乙酸乙酯混合液中，通过流过孔径为200-300nm、直径为5cm，高度为20cm的大孔吸附树脂柱，流速为1秒/滴，洗脱液为甲醇，获得单一化合物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；将提取成分3经羟丙酰基交联葡聚糖凝胶Sephadex-LH20柱进行分离，分离柱直径为5cm，高度为1.20米，洗脱液为体积比20:1的石油醚和乙酸乙酯混合液，获得两种化合物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素；将提取成分4流过孔径为200-300nm、直径为5cm、高度为20cm的大孔吸附树脂柱，流速为1秒/滴，洗脱液为体积比为25:6:1正己烷-氯仿-甲醇混合溶液，获得乙酰紫草素，其余产物通过羟丙酰基交联葡聚糖凝胶Sephadex-LH20柱进行分离，分离柱直径为5cm，高度为1.20米，洗脱液甲醇，获得了β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁。

一种利用PDX小鼠模型检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备结肠癌药物中有效剂量的方法，将所取的结肠癌样本种植于免疫缺陷小鼠体内，2-5周后将得到免疫小鼠结肠癌肿瘤，取所得的结肠癌肿瘤并传代于免疫缺陷小鼠，直至3-4代后，获得结肠癌PDX小鼠模型，并利用灌胃的方法饲喂PDX模型小鼠，检测结肠癌小鼠体内肿瘤的生长情况。

进一步地，将β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶于PEG400和水中制得60～120mg/kg的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶液，小鼠灌胃时按照10μL/g进行。

所述的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁由中美(河南)荷美尔研究院自行提取制备，纯度达97％。本发明中，通过试验发现：结合正常结直肠细胞系的毒性筛选，确定β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在体外实验中使用的安全剂量范围为1.25～10μM，并发现在该浓度范围下，该化合物可以明显抑制结肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌的增殖以及明显抑制结肠癌细胞克隆的形成数量及大小。

本发明中β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁是从紫草根中提取得到的，未曾见该药物用于临床治疗肿瘤的相关报道。因此，本发明欲通过相关实验证明该天然化合物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁可以有效抑制结肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌的生长，从而最终实现该化合物可以用于结肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌等多种癌症患者的临床治疗。本发明在SCID小鼠的体内肿瘤治疗浓度为60～120mg/kg体重，所述药物可以以5.4～10.8mg/kg的剂量制成口服液、饮料，供患者饮用。本发明利用了β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在结肠癌的预防及治疗中的增效作用，显著提高结肠癌的预防及治疗效果。该化合物有临床预防和治疗多种癌症的潜在应用价值。本发明中β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的抗肿瘤效果，不仅限于对结肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌的治疗作用。通过给患者β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，在临床上可预防及治疗多种癌症。

可将本发明的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约5.4～10.8mg/kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁还可与其他治疗剂一起使用。

未曾见β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁该药物用于临床治疗肿瘤的相关报道。通过本发明的相关实验可证明该药物可以运用于结肠癌等多种癌症的临床治疗。

附图说明

图1为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的¹HNMR图；

图2为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的¹³CNMR图；

图3为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对正常的结肠细胞系生长抑制情况(与对照组相比，差异有统计学意义，*表示P<0.05，**表示P<0.01)。

图4为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对结肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌细胞系生长抑制情况：其中，A为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁处理结肠癌细胞后细胞生长变化趋势图；B为为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁处理食管癌细胞后细胞生长变化趋势图；C为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁处理胃癌细胞后细胞生长变化趋势图；D为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁处理皮肤癌细胞后细胞生长变化趋势图。(与对照组相比，差异有统计学意义，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001)。

图5为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对结肠癌细胞系非锚定生长抑制情况：结肠癌细胞HCT-15,DLD1和SW620在β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁非锚定实验3周后，结肠癌细胞非锚定生长变化趋势。

图6为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在结肠癌(编号：HJG194P8)PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果：其中，A为给药期间小鼠体重变化趋势图；B为给药期间小鼠肿瘤体积变化趋势图；C为对照组与给药组的肿瘤图片(与对照组相比，差异有统计学意义，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001)。

具体实施方式

β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁为天然化合物，未有研究表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在治疗癌症过程中的作用。以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明主要通过MTT，非锚定性生长实验方法，人源性异种移植模型体内模型，检测β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对结肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌等细胞增殖的影响。人源性异种移植模型保留了固有的基因和表型，是一种更接近人体肿瘤发生、发展过程的模型，对个体化治疗非常有意义的模型。本发明表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁可以治疗或者预防人结肠癌细胞以及异种肿瘤移植模型鼠上肿瘤的生长。本发明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁抑制肿瘤的生长和发展，不仅适用于结肠癌，食管癌，胃癌及皮肤癌还适用于其他癌症。

实施例：

1.材料与方法

1.1.1β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁

本发明使用的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁由中美(河南)荷美尔肿瘤研究院从紫草根中提取，纯度为97％。

β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁提取的具体过程如下：取10kg的紫草根于60L的95％乙醇中经回流处理2h，重复该步骤3次，过滤，收集上述所得的粗提取物的溶液，蒸除乙醇获得暗红色粗提物。将所得的粗提物溶于2L蒸馏水中，先用石油醚萃取三次，再用乙酸乙酯萃取三次，最后再经正丁醇萃取三次，所述石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇的用量均为3L，合并石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇层，蒸除溶剂，将该提取物利用200-300孔径的滤柱以及正己烷-氯仿-甲醇(正己烷、氯仿和甲醇体积比例为25:6:1)混合液4L进行洗脱获得7种紫草根提取物，成分6和7主要是紫草根中的植物残渣，化合物含量较低。其中提取物1，2，3，5和5的质量分别为为2.856g，12.56g，42.34g，18.37g，19.25g和4.765g。

将提取成分2溶于体积比为20:1的石油醚和乙酸乙酯混合液，通过孔径为200-300nm的大孔吸附树脂柱，大孔吸附树脂柱直径为50cm，高度为20cm，流速为1秒/滴，洗脱液为甲醇，甲醇用量为1L，获得一种单一化合物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，其质量为6.75g；提取成分3中经羟丙酰基交联葡聚糖凝胶Sephadex-LH20分离柱进行分离，分离柱直径为50cm，高度为1.20米，洗脱液为体积比20:1的石油醚和乙酸乙酯混合液，获得两种化合物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁质量为12.216g，乙酰紫草素为5.765g，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁与乙酰紫草素质量比为60：40；提取成分4通过孔径为200-300nm的大孔吸附树脂柱直径为50cm，高度为20cm，流速为1秒/滴，洗脱液为正己烷-氯仿-甲醇混合溶液(体积比25:6:1)，获得乙酰紫草素4.657g，其余产物通过羟丙酰基交联葡聚糖凝胶柱Sephadex-LH20进行分离，凝胶柱直径为50cm，高度为1.20米，洗脱液为1L的甲醇，获得了β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁12.216g。

化合物β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁通过氢谱和碳谱进行了验证表征，所用试剂为氘代氯仿，如图1和图2所示，δ_H(J in Hz)，7.03(1H dd)，12.61(1H，s，-OH)，7.20(2H，brs)，12.44(1H，s，-OH)，6.08(1H，m)，2.64(1H，m)，2.51(1H，m)，3.06(2H,dd J＝4.0,4.0)，1.71(3H，s)，1.58(3H，brd)，5.15(1H,m)，2.02(3H,s)，1.56(3H brd)。δ_C177.5，176.0，170.4，169.0，168.1，167.5，147.9，136.1，133.1，132.9，131.3，117.7，111.8，111.5，79.3，69.7，44.2，32.9，26.6，26.5，25.7，22.3，17.9。其结构式如下：

1.1.2试剂

RPMI-1640培养基以及FBS购于BI公司，MEM/EBSS培养基，L-15培养基购于江苏凯基公司，青链霉素双抗以及EDTA-胰酶购于solarbio，噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma公司。

1.1.3结肠正常细胞及结肠癌细胞系

本发明使用的人正常结肠上皮细胞CCD18-Co，人结肠癌细胞HCT-15,DLD1，SW620，食管癌KYSE30，胃癌AGS及皮肤癌A431均来自于ATCC。

1.1.4肿瘤组织

本发明使用了的人结肠癌组织标本编号为JG194。JG194来源于河南省肿瘤医院，本发明使用的JG194模型为第8代。

1.2实验动物

本实施例中Cb-17SCID免疫缺陷小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号为：SCXK(京)2012-0001，SPF级，5-6周领，体重16-18g，雌鼠。小鼠饲料购于北京华阜生物科技股份有限公司。许可证号为：实验动物饲养于中美(河南)荷美尔肿瘤研究院的动物设施内，在恒温(25-27℃)、恒湿(45％-50％)、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌(SPF级)饲养室条件下饲养，动物先放于有机塑料盒内(苏州市冯氏实验动物设备有限公司)，再置于IVC系统饲养，每个饲养盒内饲养3-4只动物，经无菌处理的饲料供动物自由摄入，高温消毒的垫料每三天更换一次，笼具及饮水每三天紫外线消毒一次，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。将实验动物在12:12小时光照/黑暗循环下饲养，可以自由接近食物和水，室温控制在21℃。

1.3试剂配制

1.3.1 100mMβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁：称量20mg提取的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁粉末溶解于861μL的DMSO中。

1.3.2 1.25mM，2.5mM，5mM，10mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁：抽取10μL浓度为100mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于90μL的DMSO中获得10mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；抽取20μL 10mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于20μL的DMSO中获得5mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；抽取20μL 5mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于20μL的DMSO中获得2.5mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；抽取20μL 2.5mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于20μL的DMSO中获得1.25mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁。

1.3.3 0.3μM，0.6μM，1.25μM，2.5μM，5μM、10μM的乙酰紫草素：抽取10μL浓度为1.25mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于10mL的DMSO中获得1.25μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；抽取10μL浓度为2.5mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于10mL的DMSO中获得2.5μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；抽取10μL浓度为5mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于10mL的DMSO中获得5μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；抽取10μL浓度为10mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于10mL的DMSO中获得10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁；抽取10μL浓度为1.25μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于10μL的DMSO中获得0.6μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，将10μL0.6μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶解于10μL的DMSO中获得0.3μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁。

1.3.4 120mg/mlβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁：称取480g提取的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁粉末溶于4ml DMSO中。

1.4仪器与器材：

1.4.1酶标仪(BD公司)

1.4.2倒置显微镜(OLYPUMS)

1.4.3海尔医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)

1.4.4分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)

1.4.5 Thermo超净工作台

1.4.6移液枪、移液管(规格分别为5ml，10ml，25ml)、离心管(规格分别为15ml/50ml)、6孔板，96孔板，10cm细胞培养皿，手术镊，无菌培养皿。

2.β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁肿瘤试验研究

2.1.1细胞增殖实验研究：将结直肠正常细胞CCD-18Co，人结肠癌细胞HCT-15，食管癌KYSE30，胃癌AGS及皮肤癌A431种植于96孔板中，其中CCD-18Co的培养基中MEM/EBSS培养基+10％体积FBS+1％体积青链霉素双抗，HCT-15细胞，KYSE30，AGS所使用的培养基为RPMI-1640+10％体积FBS+1％体积青链霉素双抗，每孔细胞数为1000个，经过48小时贴壁后，给予每孔细胞100uL的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁进行处理，其中乙酰紫草素的浓度分别为0、1.25、2.5、5、10μM进行处理，然后分别于0h、24h、48h以及72h后加入20μL噻唑蓝(MTT)随即放入37℃培养箱中孵育2个小时，取出后将96孔板内的液体弃掉，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，利用酶标仪在波长为570nm和620nm下检测细胞增殖情况，具体结果见图4A-D，其中，以正常人结肠上皮细胞CCD18-Co作为对照，详见图3。

2.1.2非锚定性实验研究：非锚定生长是肿瘤细胞生长的重要特性之一；发明人在一定浓度下观察β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁(0、0.3、0.6、1.2μM)对8000个每孔的结直肠癌细胞生长的抑制作用，下层胶配制方法为3mL的0.6％Agar加入3uL的DMSO溶液或0.3、0.6、1.2mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，使β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的终浓度为0、0.3、0.6、1.2μM，上层胶的配制方法为1mL的0.3％Agar加入3uL的DMSO溶液或0.3、0.6、1.2mM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，使β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的终浓度为相应的0、0.3、0.6、1.2μM，HCT-15和DLD1细胞所使用的培养基为RPMI-1640+10％体积FBS+1％体积青链霉素双抗，SW620细胞使用的培养基为L15+10％体积FBS+1％体积青链霉素双抗，并分别在第两、三周时进行拍照，进而计算β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对细胞非锚定生长的抑制效率，具体结果详见图5。

2.2人结直肠癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立

2.2.1将新鲜肿瘤组织取出坏死组织，剪成直径为3立方毫米左右，塞入6周龄、18g左右的雌性小鼠的背部皮下，将小鼠放入小鼠IVC系统饲养。等待肿瘤形成约15mm左右，无菌切除皮下肿瘤，选择实性肿块，取材剪成3立方毫米小块，移植于另外小鼠。颈椎脱臼处死小鼠，肿瘤周围皮肤用75％酒精消毒，用溶药针扎开一个小口，用镊子撑开后取出肿瘤放到小鼠皮下。用上述方法进行肿瘤传代，至第三代小鼠，小鼠皮下移植瘤均出现且肿瘤大小差异不大。再移植至免疫缺陷小鼠皮下，传三代。按上述方法对小鼠肿瘤进行传代，分别记录每一次皮下移植瘤小鼠肿瘤生长情况及成瘤率，皮下移植瘤等待肿瘤长到1.5mm时，取第八代小鼠皮下移植瘤标本，将组织用10％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片HE染色。

3.实验动物的治疗研究

3.1接种后一周后，小鼠背部肿瘤结节长到200立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，HJG194每组分9只小鼠。3组小鼠分别按照以下剂量自由饮水。当对照组小鼠肿瘤长到1500立方毫米左右时，终止实验，取下背部皮下肿瘤并称重。

A.对照组：对照组中DMSO，PEG400和H₂O三者的体积比：DMSO 5％+PEG 40045％+50％H₂O，即1mL对照组中含有50μL DMSO，450μL的PEG400和500μL的水。

B.60mg/kgβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁：120mg/mlβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的DMSO溶液5％+PEG 400 45％+50％H₂O,即1mL 60mg/kgβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁由50μL、120mg/ml的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，450μL的PEG400和500μL的水组成。

C.120mg/kgβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁：120mg/mlβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的DMSO溶液10％+PEG 400 45％+45％H₂O，即1mL 120mg/kgβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁由100μL、120mg/ml的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，450μL的PEG400和450μL的水组成。

每天根据小鼠体重以10μL/g的比例对小鼠灌胃β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，每天一次，每周两次记录小鼠体重以及肿瘤体积。当对照组小鼠肿瘤体积长到15立方毫米左右(约32天)，终止实验，取出肿瘤组织，称量肿瘤重量以及拍照，具体结果详见图6。

由图3可知，0.6、1.25、2.5、5、10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁组处理人正常结肠上皮细胞CCD18-Co对细胞生长无毒性影响。

图4A所示，1.25、2.5、5、10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够极显著的抑制结肠癌细胞的增殖p<0.001。图4B所示，1.25、2.5、5、10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够极显著的抑制食管癌细胞的增殖p<0.001。图4C所示，1.25、2.5、5、10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够极显著的抑制胃癌细胞的增殖p<0.001。图4D所示，1.25、2.5、5、10μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够极显著的抑制皮肤癌细胞的增殖p<0.001。

由此得出,β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够抑制结肠癌，食管癌，胃癌和皮肤癌细胞的生长，具有体外抗肿瘤生长的效果。

图5中可以看出，0.3、0.6、1.2μM的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够极显著的抑制结肠癌细胞的非锚定生长p<0.01。

图6为β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在结肠癌PDX小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果。如图6A所示，60mg/kg、120mg/kgβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁组对小鼠体重无明显影响。如图6B所示，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁组(60mg/kg,120mg/kg)在给药第32天后小鼠肿瘤体积较对照组比有显著差异p<0.05。如图6C所示，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁组(60mg/kg,120mg/kg)在给药第32天后小鼠肿瘤对照组肿瘤图片。

Claims

1.β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述化合物具有如下(1)或（2）所示的功能；(1)抑制癌细胞增殖；(2)治疗和/或预防肿瘤。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为直肠癌，食管癌，胃癌或皮肤癌细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，结肠癌，食管癌，胃癌或皮肤癌细胞的数量为1000个，β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁剂量范围为1.25~10μM，非锚定实验中，肿癌细胞数量为8000个每孔，β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁用量范围为40~600nM。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁通过下述方法获得：（1）使用乙醇对紫草根原料回流提取获得紫草根的提取液，将所得提取液进行浓缩获得粗提取物；

（2）将步骤（1）所得粗提取物用水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，获得有效成分；

（3）将步骤（2）所得的有效成分通过孔径为200-300nm大孔吸附树脂柱进行分离，洗脱液为正己烷-氯仿-甲醇三者混合溶液，正己烷、氯仿和甲醇体积比例为25:6:1，利用薄层色谱进行鉴定，合并收集同一种成分的洗脱液并进行浓缩，获得7种提取成分，成分1，2，3，4和5为有效成分的粗品，成分6和7 中是紫草根中的植物残渣。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）的具体过程为：向10kg紫草根原料中加入60L的90%以上的乙醇溶液，提取2~4次，每次回流1.5~3h，过滤，收集液体，蒸除溶剂，即得。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）的具体过程为：将步骤（1）所得粗提取物经2L蒸馏水稀释后，先用石油醚萃取2~4次，再用乙酸乙酯萃取2~4次，最后再经正丁醇进行萃取2~4次，所述石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇的用量均为3L，合并石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇层，蒸除溶剂，即得。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将提取成分2溶于体积比为20:1的石油醚和乙酸乙酯混合液中，通过流过孔径为200-300nm的大孔吸附树脂柱，洗脱液为甲醇，获得单一化合物β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁；将提取成分3经羟丙酰基交联葡聚糖凝胶Sephadex-LH20柱进行分离，洗脱液为体积比20:1的石油醚和乙酸乙酯混合液，获得两种化合物β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰紫草素；将提取成分4流过孔径为200-300nm的大孔吸附树脂柱，洗脱液为体积比为25:6:1正己烷-氯仿-甲醇混合溶液，获得乙酰紫草素，其余产物通过羟丙酰基交联葡聚糖凝胶Sephadex-LH20柱进行分离，洗脱液甲醇，获得了β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁。

8.一种利用PDX小鼠模型检测β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁在制备结肠癌药物中有效剂量的方法，其特征在于，将所取的结肠癌样本种植于免疫缺陷小鼠体内，2-5周后将得到免疫小鼠结肠癌肿瘤，取所得的结肠癌肿瘤并传代于免疫缺陷小鼠，直至3-4代后，获得结肠癌PDX小鼠模型，并利用灌胃的方法饲喂PDX模型小鼠β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁，检测结肠癌小鼠体内肿瘤的生长情况。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶于PEG400和水中制得60~120 mg/kg的β, β-二甲基丙烯酰阿卡宁溶液，小鼠灌胃时按照10μL/g进行。