CN110257380A - Yap蛋白在血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡中的应用 - Google Patents

Yap蛋白在血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及YAP蛋白在血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡中的应用。本申请涉及YAP蛋白与Hippo通路的相关性研究，还涉及YAP抑制剂，包括siRNA、shRNA。YAP抑制剂(siRNA、shRNA)转染血管平滑肌细胞后，会敲低YAP的表达。当YAP被敲低后，会抑制血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下的细胞增殖。这为血液疾病的治疗开拓了新的研究前景，为YAP抑制剂的深度开发和血液疾病的临床治疗提供了新的思路。

Description

YAP蛋白在血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡 中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及YAP蛋白在血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡中的应用。
背景技术
YAP(Yes-associated protein，YAP)是Hippo信号通路下游的主要效应分子，分子量为65kD，富含脯氨酸。由于该蛋白能够与非受体酪氨酸激酶YES的Src homolog domain 3(SH3)区结合，因而被命名为Yes-associated protein(YAP65)。人类YAP基因位于染色体11q22区，YAP存在2种变位剪切形式，即YAP1和YAP2。YAP1 具有一个WW结构域，而YAP2具有2个WW结构域。YAP蛋白广泛表达于除外周血白细胞外的各种组织中。YAP存在多个结构域或特异氨基酸序列，包括N端富含脯氨酸的结构域，转录因子TEADs结合区， 2个WW结构域，1个SH3结合基序，C端的转录激活域以及PDZ结合基序。通过这些结构域或氨基酸序列，YAP与多种蛋白互相作用，参与细胞内多条信号通路的调控，行使多种生物学功能。YAP主要定位于细胞核中，由于缺乏明显的DNA结合结构域，YAP被认为是转录共激活因子，需要与转录因子结合，起始下游基因的转录。
Hippo信号通路是目前报道的调节YAP活性的主要方式。Hippo 通路上游成员Mst1/2磷酸化该通路中其它3个核心成员WW45、Mob、 Lats1/2，活化的Lats1/2磷酸化下游效应分子YAP及其旁系同源物Taz，磷酸化的YAP和Taz与14-3-3结合，从细胞核转位至细胞质中，失去其转录共激活因子的活性。此外，YAP第381位丝氨酸被Lats1/2 磷酸化后促使其它位点的丝氨酸被CK1δ/ε磷酸化，最终使YAP通过泛素-蛋白酶体途径被降解。
血管平滑肌细胞(VSMC)是血管壁的主要组成细胞，受到血液流动产生的切应力、周期性张应力等力学因素的作用，是一种对应力敏感的细胞。有研究表明，在适宜的周期性应力作用下，血管平滑肌细胞可以发生增殖、分化和迁移，进而完成多种相关的生理活动。然而，应力刺激如何被VSMC感知，从而转化为生物化学信号来调控VSMC的增殖、分化和迁移，目前还缺乏深入的研究。本发明探索了YAP蛋白在血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下所起的作用，通过抑制YAP的含量/表达，能够调节血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下的增殖或凋亡。这为血液疾病的治疗开拓了新的研究前景，为YAP抑制剂的深度开发和血液疾病的临床治疗提供了新的思路。
发明内容
本发明提供了一种siRNA，其核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-3。
本发明提供了一种shRNA，其正义链的核苷酸如SEQ ID NO：4 所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明提供了一种载体，其包含所述siRNA或所述shRNA。
在一个方面中，所述载体选自质粒、脂质体、病毒或其它合适类型的载体。优选的，所述质粒选自真核细胞质粒；所述脂质体选自 lipofectamin；所述病毒选自慢病毒；更优选的，所述慢病毒选自慢病毒LV3。
本发明提供了一种宿主细胞，其包含所述siRNA、所述shRNA或所述载体。
在一个方面中，所述宿主细胞选自肌肉细胞；优选的，所述宿主细胞选自血管平滑肌细胞。
本发明提供了一种药物组合物，其包含所述siRNA、所述shRNA、所述载体或所述宿主细胞，以及药学上可接受的辅料。
在一个方面中，所述药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，将所述siRNA、所述shRNA、所述载体或所述宿主细胞与药学上可接受的辅料混合或用辅料稀释。当辅料作为稀释剂时，其可以为液体。制剂选自混悬剂、乳剂、溶液剂、注射用溶液等形式。
本发明提供了所述siRNA、所述shRNA或所述载体在制备用于调节血管平滑肌细胞增殖或凋亡的药物中的用途。
在一个方面中，所述调节是血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡。
在一个方面中，所述调节是抑制血管平滑肌细胞的增殖/生长。
本发明提供了YAP抑制剂在制备用于调节血管平滑肌细胞增殖或凋亡的药物中的用途。
在一个方面中，所述YAP抑制剂为降低YAP核酸或蛋白表达的化合物。
在一个方面中，所述YAP抑制剂选自siRNA或shRNA。
在一个方面中，所述siRNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-3。
在一个方面中，所述shRNA序列如下，其正义链的核苷酸如SEQ ID NO：4所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在一个方面中，所述调节是血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡。
在一个方面中，所述调节是抑制血管平滑肌细胞的增殖/生长。
本发明的积极效果包括：血管平滑肌细胞在应对机械应力刺激时， 10％机械应力刺激激活了Hippo通路，促进YAP蛋白出核，更多的迁移至细胞质中，抑制了细胞增殖；15％机械应力刺激抑制了Hippo通路，促进YAP蛋白入核，更多的YAP滞留在核内，促进了细胞增殖。 YAP抑制剂(siRNA、shRNA)转染血管平滑肌细胞后，会敲低YAP的表达。当YAP被敲低后，会抑制血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下的细胞增殖。这为血液疾病的治疗开拓了新的研究前景，为YAP抑制剂的深度开发和血液疾病的临床治疗提供了新的思路。
附图说明
图1：细胞免疫荧光检测无机械应力刺激时YAP在细胞内定位的情况。
图2：细胞免疫荧光检测10％机械应力刺激时YAP在细胞内定位的情况。
图3：细胞免疫荧光检测15％机械应力刺激时YAP在细胞内定位的情况。
图4：Western Blot检测各组细胞YAP、VGLL4、ccnd1蛋白和 YAP蛋白的磷酸化水平。0％elongation为对照组，不进行应力刺激，培养0h，0.5h，1h，2h，6h；10％elongation为10％机械应力刺激组，刺激培养0h，0.5h，1h，2h，6h；15％elongation为15％机械应力刺激组，刺激培养0h，0.5h，1h，2h，6h。
图5：qRT-PCR检测各组细胞miR130a水平。注：*p<0.05，**p<0.01。 0％elongation、10％elongation、15％elongation各组含义与之前的一致。
图6：Western Blot检测各组细胞YAP蛋白水平。
图7：CCK-8检测细胞增殖情况。注：**p<0.01，##p<0.01。
图8：流式细胞术检测细胞凋亡情况。注：**p<0.01，##p<0.01， ^p<0.05。
图9：流式细胞术检测细胞周期情况。注：**p<0.01，##p<0.01， ^^p<0.01，@@p<0.01。
具体实施方式
下述实验方法中所用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下，本领域技术人员结合公知技术，可以对本发明做出诸多修改，这样的修改也落入本发明的保护范围之内。
实施例1、Hippo通路与VSMC在机械应力刺激中的相关性实验
一、实验材料
原代细胞分离及传代培养：雄性SD大鼠(200～220g)，胸主动脉取材，组织贴块法获取原代平滑肌细胞(VSMC)，传3-8代用于后续实验。
二、实验分组
A组：0％elongation。B组：10％elongation。C组：15％elongation。
三、实验方法
VSMC接受FX-5000T机械拉伸：将VSMC以3×105个/mL接种于 Bioflex 6孔板(事先用I型胶原包被)上，贴壁生长约24h后，更换无血清培养基，培养24h；重新加入10％FBSDMEM培养基，按照实验分组分别对VSMC施加机械拉伸，10％、15％elongation，0％为对照组，不做任何机械力处理。拉伸处理时间为24h。
实施例2、Hippo通路相关性的细胞免疫荧光检测
1、细胞爬片：盖玻片放入12孔板，以适当细胞浓度进行单层细胞爬片。
2、固定细胞：弃去培养基，用PBS洗涤，再用3％甲醛溶液室温固定10～15min，后用PBS洗涤。
3、穿透：标本用1％Triton-X 100进行打孔穿透，室温孵育5～ 10min。
4、封闭：每个样本位点加适量3％BSA封闭液，室温封闭30min。
5、一抗孵育：按1μg/mL的浓度稀释一抗，4℃封闭过夜，PBS 洗涤。
6、二抗及DAPI核染：按1：500的浓度稀释荧光二抗和DAPI混合液，避光室温孵育30～60min，后用PBS洗涤。
7、封片固定：用荧光淬灭封片剂封片，指甲油描边固定玻片。
8、激光共聚焦扫描观察。
实施例3、Hippo通路相关性的Western Blot检测
收集各组细胞样本，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书，进行BCA定量操作方法，Western Blot 分析蛋白表达含量。
实施例4、Hippo通路相关性的RT-PCR检测
Primer名称 碱基序列(5'to3')
miR-130a-F TCCCAGTGCAATGTTAAAAGGGCAT
U6-F CTCGCTTCGGCAGCACA
一、miRNA提取
1、取200μL样本，加入5倍体积Buffer RLM，震荡混匀30 秒，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离，4℃、12000rpm 离心5分钟，取上清。
2、按Buffer RLM：氯仿＝1：1体积比加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟，4℃、12000rpm离心15分钟，样品分为三层，取上层无色水。
3、向得到的溶液中加入1/3倍体积的无水乙醇，混匀，将溶液和沉淀一起转入吸附柱RM(Spin Column RM)中，12000rpm离心 30秒，收集流出液。
4、向得到的溶液中加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀，将溶液和沉淀一起转入吸附柱RS(Spin Column RS)中，12000rpm离心 30秒，弃掉流出液。
5、向吸附柱RS中加入700μL Buffer RWT，室温12000rpm 离心30秒,弃掉流出液。
6、向吸附柱RS中加入500μL Buffer RW2，室温12000rpm 离心30秒，弃掉流出液。
7、重复步骤6；12000rpm离心1分钟，弃掉流出液。
8、向吸附柱RS中间部位加入30μL RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，得到的RNA溶液保存在-70℃。
二、逆转录反应
(一)、miRNA加Poly(A)尾
1、将ATP稀释50倍(1μl的10mM ATP加49μl的1mM Tris， pH8.0)。
2、向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至总体积25μl。
3、轻轻混匀上述反应液，37℃孵育15分钟。
(二)修饰后的miRNA cDNA第一链合成
1、向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积20μL。
2、轻轻混匀上述反应液，42℃，孵育50分钟。
3、85℃，孵育5分钟，终止反应；合成的cDNA反应液可以直接进行荧光定量检测实验，也可以于-20℃保存备用。
(三)定量PCR
1、室温融化2×miRNA qPCR premix和Reverse primer(10μ M)。
2、将试剂置于冰上，并按下表配制反应体系
3、反应程序设置如下
实施例5、Hippo通路相关性的结果分析
一、细胞免疫荧光检测细胞YAP在细胞内定位
图1、2、3分别显示了细胞免疫荧光检测0％、10％、15％机械应力对细胞YAP定位的影响。0％应力时，YAP蛋白在胞浆和胞核均有表达。10％应力刺激时，30min、1h时，YAP蛋白在胞浆和胞核均有表达；2h时，YAP蛋白在胞核表达减少；在6h时，YAP蛋白在胞核表达进一步减少。15％应力刺激时，30min、1h时，YAP蛋白在胞浆和胞核均有表达；2h时，YAP蛋白在胞核表达增加，胞质表达减少；在6h时，YAP蛋白在胞核表达进一步增加，胞质表达进一步减少。
由结果可知，10％机械应力刺激促进YAP蛋白出核，15％机械应力刺激促进YAP蛋白入核，这是造成细胞增殖变化的原因。
二、Western Blot检测各组细胞YAP、VGLL4、ccnd1蛋白和YAP蛋白的磷酸化水平
图4显示了Western Blot检测0、10、15％机械应力刺激VSMC 0、 0.5、1、2、6h的细胞的YAP、VGLL4、ccnd1蛋白和YAP蛋白的磷酸化水平。由图4可知，在0％应力0、0.5、1、2、6h时，YAP、VGLL4、 ccnd1蛋白和YAP蛋白的磷酸化水平无明显改变。在处理2h和6h，与0％应力比较，10％应力刺激组的YAP蛋白的磷酸化和VGLL4蛋白水平明显增加，YAP蛋白和ccnd1蛋白水平明显减少。在处理2h和6 h，与0％应力比较，15％应力刺激组的YAP蛋白的磷酸化和VGLL4蛋白水平明显减少，YAP蛋白和ccnd1蛋白水平明显增加。
YAP、VGLL4、ccnd1蛋白均是细胞增殖和凋亡相关蛋白。YAP和 ccnd1蛋白水平和细胞增殖正相关，YAP蛋白磷酸化和和VGLL4蛋白水平与细胞增殖负相关。由结果可知，10％机械应力刺激激活了Hippo 通路，YAP磷酸化水平升高，磷酸化后的YAP出核，更多的迁移至细胞质中，与胞质蛋白14-3-3结合，促进了YAP降解。促转录因子YAP 在核内减少，再加上拮抗因子VGLL4的增加，YAP与转录因子TEAD 的结合也减少，导致下游调控细胞周期的靶基因ccnd1表达减少，抑制了细胞增殖；随着应力刺激增至15％，激活的Hippo通路被抑制， YAP磷酸化减弱，更多的YAP滞留在核内，与转录因子TEAD结合促进下游靶基因ccnd1的表达，促进了细胞增殖。
三、qRT-PCR检测各组细胞miR130a水平
图5显示了qRT-PCR检测0、10、15％机械应力刺激VSMC 0、 0.5、1、2、6h的细胞miR130a水平。由图5可知，在0、0.5h时， 0、10、15％机械应力刺激对miR130a水平无明显影响。在1、2h时，与0％应力比较，10％机械应力刺激的miR130a水平下降，15％机械应力刺激的miR130a水平上调，但均无显著差异(p>0.05)。在6h时，与0％应力比较，10％机械应力刺激的miR130a水平显著下降(p<0.05)， 15％机械应力刺激的miR130a水平极其显著上调(p<0.01)。
miR130a水平和细胞增殖正相关。由结果可知，10％应机械力刺激抑制miR130a表达，miR130a的减少促进了VGLL4蛋白水平的增加， VGLL4与TEAD结合，减少了YAP与TEAD的结合，从而抑制下游ccnd1 的表达，导致细胞增殖被抑制；15％机械应力刺激促进了miR130a的表达，miR130a的表达抑制了VGLL4蛋白水平的增加，更多的YAP与 TEAD结合，促进了下游基因ccnd1的表达从而促进细胞增殖。由此可知，10％和15％机械应力刺激对动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的调控存在两种方式，Hippo通路和miR130a-VGLL4可能都参与了此过程的发生。
实施例6、YAP siRNA转染VSMC的实验
一、实验材料
原代细胞分离及传代培养：雄性SD大鼠(200～220g)，胸主动脉取材，组织贴块法获取原代平滑肌细胞(VSMC)，传3-8代用于后续实验。
二、siRNA序列设计
si YAP-1：ACAGCAGGAGTTATTTCGG(SEQ ID NO：1)
si YAP-2：GACCTCTTCTGGTCAGAGA(SEQ ID NO：2)
si YAP-3：ATCACAATGATCAGACAAC(SEQ ID NO：3)
MOCK：TTCTCCGAACGTGTCACGT
三、实验方法
(一)细胞培养
将VSMC培养于含10％FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基中。
(二)实验分组
组1：VSMC。
组2：VSMC+Mock siRNA。
组3：VSMC+si YAP-1。
组4：VSMC+si YAP-2。
组5：VSMC+si YAP-3。
(三)细胞处理
将上述VSMC经胰酶消化后，按照20×105/孔接种于6孔板中，过夜培养。
(四)细胞转染方法
对应每孔的数量，加入100pmol siRNA稀释到250μL的I ReducedSerum Medium中；将5μL lipofectamin2000 稀释到250μL的I Reduced SerumMedium中，轻轻混匀，静置5min；将siRNA溶液加入到lipofectamin2000溶液中，轻轻混匀，静置20min；将细胞培养板中的培养液吸出，重新加入 1.5mL新鲜的培养基；将上述混合溶液加入到细胞培养皿中；37℃， 5％CO2中培养48小时。
实施例7、Western Blot检测转染细胞
一、实验方法
收集各组细胞样本，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书，进行BCA定量操作方法，Western Blot 分析蛋白表达含量。
二、实验结果
图6显示了Western Blot检测VSMC转染YAP siRNA后YAP蛋白表达。由图6可知，YAPsiRNA1敲低YAP基因的效果最好。
后续选择YAP siRNA1构建慢病毒。
实施例8、YAP敲低后VSMC在应对机械刺激后Hippo通路的改变
一、慢病毒的构建
1、载体名称：LV3(H1/GFP&Puro)-大鼠
2、产品包装：500ng/μL，共50ug
3、靶序列：ACAGCAGGAGTTATTTCGG(si YAP-1)
4、shRNA模板序列：
(1)S：GATCCGACAG CAGGAGTTAT TTCGGTTCAA GAGACCGAAA TAACTCCTGCTGTTTTTTTG(SEQ ID NO：4)
(2)A：AATTCAAAAA AACAGCAGGA GTTATTTCGG TCTCTTGAAC CGAAATAACTCCTGCTGTCG(SEQ ID NO：5)
5、转录产物序列结构：
ACAGCAGGAG TTATTTCGGT TCAAGAGACC GAAATAACTC CTGCTGTTT
6、测序结果：
CTTTGCAGTTATAAATACTGAATAATAAGATGACATGAACTACTACTGCTAGAGATTTT CCACACTGACTGAAAGGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACGGG CACACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCTTAAGCAGTGGGTTCCCT AGTTAGCCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTAGAAGC AAAAAGCAGAATCGAAGAATTCAAAAAAACAGCAGGAGTTATTTCGGTCTCTTGAA CCGAAATAACTCCTGCTGTCGGATCCAAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAAT CCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATTG CAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGG GTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGC GTTCCAATTCTTGACATCGTTGGGAGTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTT AAAAAGTGGCTAAGATCTACAGCTGCCTTGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTACCAGGCG GGGAGGCGGCCCAAAGGGAGATCCGACTCGTCTGAGGGCGAAGGCGGAGACGCGGAAGA GGCCGCAGAGCCGGCAGCAGGCCGCGGGAAGGAAGGTCCGCTGGATTGAGGGCCGAAGG GACGTAGCAGAAGGACGTCCCGCGCAGAATCCAGGTGGCAACACAGGCGAGCAGCCAAG GAAAGGACGATGATTTCCCCGACAACACCACGGAATTGTCAGTGCCCAACAGCCGAGCC CCTGTCCAGCAGCGGGCAAGGCAGGCGGCGATGAGTTCCGCCGTGACAATAGGGAGGGG GAAAGCGAAGTCCCGGGAAAGGAGCTGACAGGTGGTGGCAATGCCCCACCAGTGGGGGG TGCGTCAGCAAACACAGTGCACACCACGCCACGTGCCTGACACGGCACACTCTCATAAG AGAAAGCACAGAATTATACAGAGAGAAATGAAGGCATACCGTAAGCCATAGCATGATAC AAGCAATAAGCACGATCCATAGCGTAAAGGCACTAGGTGAGAAATACCAGGTCATCGTC
二、实验方法
1、将第3～8代大鼠VSMC培养于含10％FBS DMEM培养基中。
2、将上述VSMC经胰酶消化后，按3×105个/mL接种于Bioflex 6 孔板(事先用I型胶原包被)上，贴壁生长约24h后，更换无血清培养基，培养24h；重新加入10％FBS DMEM培养基。
3、用上述病毒按照MOI＝50感染细胞，对照组转染含对照序列的慢病毒。
4、VSMC接受FX-5000T机械拉伸；拉伸频率为1Hz，拉伸强度分为0％、10％、15％，拉伸时间为24h。
5、实验分组
A组：VSMC Control+0％elongation
B组：VSMC YAP shRNA+0％elongation
C组：VSMC Control+10％elongation
D组：VSMC YAP shRNA+10％elongation
E组：VSMC Control+15％elongation
F组：VSMC YAP shRNA+15％elongation
实施例9、YAP敲低后CCK-8检测细胞增殖
在拉伸应激后24h后，按1：10体积比混合Cell Counting Kit -8(CCK-8)和无血清基本培养基，每孔100μL加入待测孔中，在 37℃，5％CO2孵育1h；用酶标仪测定450nm波长吸光度。
实施例10、YAP敲低后流式细胞术检测细胞周期
1、不同时间的VSMC用胰酶消化，制备单细胞悬液，计数并调整细胞浓度为106/mL；离心弃去上清，PBS洗涤去除细胞碎片；缓慢加入冷75％乙醇1mL，吹打均匀，4C固定过夜。
2、PBS洗涤，细胞重悬于1mL PI染色液中(50ug/mL碘化丙啶 PI，0.2mg/mL RNase，0.1％Triton X-100)，室温避光30min。细胞流式仪检测。
实施例11、YAP敲低后流式细胞术检测细胞凋亡
1、不同时间的VSMC用胰酶消化，终止消化，1500rpm离心5min，弃去上清，收集细胞；用PBS洗涤，1500rpm离心5min；加入300 μL的Binding Buffer悬浮细胞。
2、Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15min；PI标记：加入10μL的PI染色，混匀后，避光，室温孵育10min；流式细胞仪检测，CELLQuest软件分析。
实施例12、YAP敲低后的结果分析
一、CCK-8检测细胞增殖
图7显示了CCK-8检测细胞增殖情况。由图7可知，与A组比较， B组、C组的细胞增殖明显下调(p<0.01)，E组的细胞增殖明显上调 (p<0.01)。与C组比较，D组的细胞增殖明显下调(p<0.01)。与E 组比较，F组的细胞增殖明显下调(p<0.01)。由此可知，当YAP被敲低后，会抑制VSMC的细胞增殖。
二、流式细胞术检测细胞凋亡
图8显示了流式细胞术检测细胞凋亡情况。由图8可知，与A组比较，B组、C组的细胞凋亡明显上调(p<0.01)，E组的细胞凋亡下调，但无显著差异(p>0.05)。与C组比较，D组的细胞凋亡明显上调(p<0.01)。与E组比较，F组的细胞凋亡上调(p<0.05)。由此可知，当YAP被敲低后，会抑制VSMC的细胞增殖。
三、流式细胞术检测细胞周期
图9显示了流式细胞术检测细胞凋亡情况。由图9可知，与A组比较，B组、C组的细胞G0/G1期明显上调(p<0.01)，E组的细胞G0/G1 期明显下调(p<0.01)。与C组比较，D组的细胞G0/G1明显上调 (p<0.01)。与E组比较，F组的细胞周期G0/G1期明显上调(p<0.01)。与B组比较，D组的细胞周期G0/G1期明显上调(p<0.01)，F组的细胞周期G0/G1期明显下调(p<0.01)。由此可知，当YAP被敲低后，会抑制VSMC的细胞增殖。

Claims (10)

1.一种siRNA，其核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-3。
2.一种shRNA，其正义链的核苷酸如SEQ ID NO：4所示，其反义链的核苷酸序列如SEQID NO：5所示。
3.一种载体，其包含如权利要求1所述的siRNA或如权利要求2所述的shRNA；优选的，所述载体选自质粒、脂质体、病毒或其它合适类型的载体；更优选的，所述质粒选自真核细胞质粒；所述脂质体选自lipofectamin；所述病毒选自慢病毒；特别优选的，所述慢病毒选自慢病毒LV3。
4.一种宿主细胞，其包含如权利要求1所述的siRNA、如权利要求2所述的shRNA或如权利要求3所述的载体；优选的，所述宿主细胞选自肌肉细胞；更优选的，所述宿主细胞选自血管平滑肌细胞。
5.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的siRNA、如权利要求2所述的shRNA、如权利要求3所述的载体或如权利要求4所述的宿主细胞，以及药学上可接受的辅料。
6.如权利要求1所述的siRNA、如权利要求2所述的shRNA或如权利要求3所述的载体在制备用于调节血管平滑肌细胞增殖或凋亡的药物中的用途；优选的，所述调节是血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡；更优选的，所述调节是抑制血管平滑肌细胞的增殖/生长。
7.YAP抑制剂在制备用于调节血管平滑肌细胞增殖或凋亡的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，所述YAP抑制剂为降低YAP核酸或蛋白表达的化合物；优选的，所述YAP抑制剂选自siRNA或shRNA。
9.如权利要求7或8所述的用途，所述siRNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-3；或者，所述shRNA序列如下，其正义链的核苷酸如SEQ ID NO：4所示，其反义链的核苷酸序列如SEQID NO：5所示。
10.如权利要求7-9中任一项所述的用途，所述调节是血管平滑肌细胞应对机械应力刺激下增殖或凋亡；优选的，所述调节是抑制血管平滑肌细胞的增殖/生长。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111909958A (zh) * 2020-07-09 2020-11-10 西安医学院 血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建
CN112891619A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 四川大学 具有选择性抑制平滑肌细胞表型转化的基因洗脱涂层材料及其制备方法
CN117568466A (zh) * 2023-11-20 2024-02-20 南方医科大学南方医院 动脉重塑标志物及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160361340A1 (en) * 2014-02-11 2016-12-15 Inetitut Pasteur Treatment of cardiac diseases with modulators of the hippo pathway

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160361340A1 (en) * 2014-02-11 2016-12-15 Inetitut Pasteur Treatment of cardiac diseases with modulators of the hippo pathway

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANG WEN-JIAN等: "Disruption of mechanical stress in extracellular matrix is related to Stanford type A aortic dissection through down-regulation of Yes-associated protein", 《AGING》 *
LIU TAO等: "YAP1 up-regulation inhibits apoptosis of aortic dissection vascular smooth muscle cells", 《EUROPEAN REVIEW FOR MEDICAL AND PHARMACOLOGICAL SCIENCES》 *
姜文剑等: "机械牵张力改变诱导YAP蛋白下调参与升主动脉瘤的发生", 《心肺血管病杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111909958A (zh) * 2020-07-09 2020-11-10 西安医学院 血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建
CN111909958B (zh) * 2020-07-09 2023-12-29 西安医学院 血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建
CN112891619A (zh) * 2021-01-28 2021-06-04 四川大学 具有选择性抑制平滑肌细胞表型转化的基因洗脱涂层材料及其制备方法
CN112891619B (zh) * 2021-01-28 2021-10-26 四川大学 具有选择性抑制平滑肌细胞表型转化的基因洗脱涂层材料及其制备方法
CN117568466A (zh) * 2023-11-20 2024-02-20 南方医科大学南方医院 动脉重塑标志物及其应用
CN117568466B (zh) * 2023-11-20 2024-07-09 南方医科大学南方医院 动脉重塑标志物及其应用

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