CN110234994A - 用于检测切换事件带有不同捕获分子的系留粒子生物传感器 - Google Patents

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Abstract

用于生物感应靶标物质[110]的方法使用通过系留分子[102]系至表面[100]的粒子[104]的集合。第一捕获分子[106]附连至粒子[104]或附连至系留分子。第二捕获分子[108]附连至表面[100]或附连至系留分子。选择第一捕获分子[106]以结合靶标物质[110]并具有第一靶标解离速率，并且选择第二捕获分子[108]以结合靶标物质[110]并具有与第一靶标解离速率相差至少三倍的第二靶标解离速率。检测粒子的空间坐标参数的时间系列，并且在检测的时间系列内鉴定靶标物质与捕获分子的个体关联/解离事件的时间序列。每个事件对应于第一捕获分子[106]和第二捕获分子[108]与靶标物质[110]的结合状态之间的变化。从鉴定的个体联合/解离事件的时间序列确定靶标物质的浓度。还描述了竞争性测定配置。

Description

用于检测切换事件带有不同捕获分子的系留粒子生物传感器
发明领域
本发明一般涉及用于检测靶标物质的生物传感器。更具体地，本发明涉及使用生物传感器检测靶标物质的技术，其中靶标物质的存在来自于对系留粒子运动(TPM)的测量。
发明背景
系留粒子生物传感(tethered particle biosensing)是用于检测靶标物质浓度的已知技术。它已被应用于生化传感，连续监测，生化患者监测和人体生物分子监测。例如，WO/2016/096901描述了一种基于系留粒子的生物传感器，以及通过测量系留粒子运动来感测靶标物质浓度的方法。具体地，在该系留粒子生物传感器中，微米级或纳米级粒子通过系留分子(tether molecule)与基体系连。在夹心测定中，粒子和基体用捕获分子官能化，两者都可与靶标物质结合。当不存在靶标物质时，粒子在其系留物(tether)上自由移动。然而，在存在靶标物质的情况下，靶标物质与两种捕获分子结合，限制系留粒子的运动。
系留粒子的运动通常使用光源照射含有系留在单元内表面的大量粒子的液体单元(liquid cell)来光学测量。可以使用多种显微镜成像技术，例如明场照射，暗场照射，渐逝波照射，吸收检测，散射检测，荧光检测等。成像检测器产生系留粒子的一系列图像，并且处理器分析图像以确定随时间变化的空间坐标参数，其代表单元内系留粒子运动的状态。
通过从空间坐标参数确定系留粒子运动是对应于未结合状态还是更受限的结合状态来检测单元中靶分子的存在。为了凭经验将这些状态互相区分，结合状态需要具有足够长的保持时间(lifetime)，即两种捕获分子都应具有足够低的解离速率。另外，为了对靶标物质的存在具有高灵敏度，应在靶标物质存在的情况下快速形成结合状态，即两种捕获分子应具有足够高的结合速率(association rate)。
发明内容
与已知的系留粒子生物传感技术不同，本发明的实施方式基于使用具有不等解离速率的两种捕获分子。优选地，两种捕获分子的解离速率相差三倍或更多。由于这种差异，传统观点认为一种捕获分子的次优解离速率将缩短结合态的保持时间，从而不利地影响区分粒子运动的结合和未结合状态的能力。然而，发明人已经发现使用具有相差三倍或更多倍的解离速率的两种捕获分子仍然可以提供足够的可区分性，同时提供增强切换速率的附加益处，从而提供整体改进的生物传感系统。例如，增强的切换速率提供改进的可检测性、信噪比、校准、统计、区分能力、灵敏度和/或特异度。
在一个方面，本发明提供了用于生物感应靶标物质的方法。该方法包括使含有靶标物质的基质与传感器装置接触，所述传感器装置具有表面、通过系留分子系至表面的粒子的集合，和捕获分子的集合，其中捕获分子的集合包括附连至所述粒子或系留分子的第一捕获分子，和附连至所述表面或系留分子的第二捕获分子，其中所述第一捕获分子被选择以结合靶标物质并具有第一靶标解离速率，且第二捕获分子被选择以结合靶标物质并具有与第一靶标解离速率相差至少三倍的第二靶标解离速率。该方法还包括检测粒子的空间坐标参数的时间系列，其中空间坐标参数相对于表面测量，和，在检测的时间系列内鉴定靶标物质与捕获分子的个体联合/解离(association/dissociation)事件的时间序列，其中各事件对应于第一捕获分子CM1和第二捕获分子CM2与靶标物质T的结合状态之间的变化。该方法还包括，由对于个体联合/解离事件所鉴定的时间序列来确定基质中的靶标物质的浓度。
在一些实施方式中，结合状态之间的变化是夹心样状态与开放状态之间的变化，所述夹心样状态中T与CM1和CM2两者结合，而所述开放状态中T未结合CM1，T未结合CM2或T未与CM1和CM2两者结合。
在一些实施方式中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定靶标物质的浓度包括确定捕获分子与靶标物质的反应的特征时间。
在一些实施方式中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定靶标物质的浓度包括分析空间坐标参数和空间坐标参数的二阶距散度(second moment divergence)。
在一些实施方式中，检测靶标物质与捕获分子的个体联合/解离事件的时间序列包括测量粒子的多个空间坐标参数和粒子的多个空间坐标参数的二阶距散度。
在一些实施方式中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定靶标物质的浓度包括利用二阶距散度函数分析测量的空间坐标参数和/或其时间导数，以确定数据通道中观察到的偏差的显著性，并通过二阶距散度函数的反向外推来确定粒子行为发生变化的发散时间点。
在一些实施方式中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定靶标物质的浓度包括确定靶标物质捕获状态的持续时间或靶标物质对捕获分子的平均占据。
另一方面，本发明提供了一种用于生物感应靶标物质的方法。该方法包括使含有靶标物质的基质与传感器装置接触，所述传感器装置具有表面、通过系留分子系至表面的粒子的集合、靶标类似物的集合和捕获分子的集合，其中捕获分子的集合附连于粒子或表面，并且其中靶标类似物的集合附连于粒子或表面，其中选择捕获分子以结合靶标物质并具有靶标解离速率，和选择靶标类似物以结合捕获分子并具有与靶标解离速率相差至少三倍的靶标类似物解离速率。该方法还包括检测粒子的空间坐标参数的时间系列，其中空间坐标参数相对于表面测量，和，在检测的时间系列内鉴定靶标物质与捕获分子的个体联合/解离事件的时间序列，其中各事件对应于捕获分子与靶标物质或靶标类似物的结合状态之间的变化。该方法还包括由所鉴定的个体联合/解离事件的时间序列确定基质中的靶标物质的浓度。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测靶标物质的生物传感装置。该装置包括在其内部包含生物传感表面的单元；将光发射进入该单元的光源；感测来自单元的光的光感测器；以及根据感测的来自单元的光来确定单元中靶标物质浓度的处理器。生物传感表面具有表面，通过系留分子系至表面的粒子集合，以及捕获分子的集合。捕获分子的集合包括与粒子或系留分子结合的第一捕获分子，以及与表面或系留分子结合的第二捕获分子。第一捕获分子被选择以结合靶标物质并具有第一靶标解离速率，并且第二捕获分子被选择以结合靶标物质并具有与第一靶标解离速率相差至少三倍的第二靶标解离速率。处理器检测粒子的空间坐标参数的时间系列，并在检测到的时间系列内鉴定靶标物质与捕获分子的个体联合/解离事件的时间序列，并由所鉴定的个体联合/解离事件的时间序列确定浓度，其中各事件对应于第一捕获分子和第二捕获分子与靶标物质的结合状态之间的变化。
附图简述
图1A和图1B是说明根据本发明的一个实施方式，处于未结合状态和结合状态的系留粒子生物传感构型的示意图，其中粒子和基体用捕获分子官能化。
图1C和图1D是说明根据本发明的一个实施方式，处于未结合状态和结合状态的系留粒子生物传感构型的示意图，其中系留物和基体用捕获分子官能化。
图1E和图1F是说明根据本发明的一个实施方式，处于未结合状态和结合状态的系留粒子生物传感构型的示意图，其中粒子和系留物用捕获分子官能化。
图1G和图1H是说明根据本发明的一个实施方式，处于未结合状态和结合状态的系留粒子生物传感构型的示意图，其中系留物在两个位置用捕获分子官能化。
图2是说明根据本发明的一个实施方式，两种捕获分子A和B与靶标T的四种不同结合状态以及这些状态之间的相应联合和解离速率的示意图。
图3A和图3B是说明根据本发明的一个实施方式，处于未结合状态和结合状态的系留粒子生物传感构型的示意图，其中粒子和基体用捕获分子和靶标类似物官能化以进行竞争性测定。
图4A和图4C分别说明了根据本发明实施例的处于未结合状态和其运动受限的结合状态的系留粒子。图4B和图4D说明了根据本发明的一个实施方式，随时间测量的未结合的粒子分别在未结合和结合状态下的x-y坐标位置。
图5是根据本发明的实施方式，用于进行系留粒子生物感应的光学生物传感装置的示意图。
具体实施方式
在生物感应领域，通常已知使用两种或更多种捕获分子可以在夹心测定中灵敏且特异地检测低浓度靶标物质。想要检测的靶标物质可由一种分子或多于一种分子组成，例如分子复合物，多聚体，病毒或病毒片段，微生物或微生物片段，细胞片段，囊泡或脂质体。靶标，也称为分析物，可作为人们想要量化的物质的替代品。
通常使用具有尽可能高的亲和性的捕获分子，即捕获分子具有尽可能低的解离速率(低koff)，因此具有缓慢解结合(unbinding)的特点(长的保留时间，大τoff)。
通常还已知，可使用两种或更多种捕获分子在竞争测定中灵敏且特异地检测靶标，所述两种或更多种捕获分子中，至少一种是靶标类似物或竞争剂分子。同样，为了检测低靶标浓度，通常使用具有尽可能高亲和性的捕获分子，即捕获分子具有尽可能低的解离速率(低koff)，因此具有缓慢解结合的特点(长的保留时间，大τoff)。
在具有单分子分辨率的生物传感器中，靶标浓度的测量涉及检测到的结合和/或解结合事件的数量或速率。在这样的生物传感器中，有利的是具有良好的统计数据，即在给定时间内检测大量结合和解结合的事件，以供良好的信号和数据分析，高灵敏度，准确性，特异性，稳健性等。这需要个体信号事件的保持时间不过长，否则在给定的测量时间跨度内记录的事件不足。
在TPM生物传感器的情况下，如果系留粒子运动受到限制的状态是短暂的，则可能是有利的。状态保持时间应该足够长以使其可被检测到，但是如果它是短暂的，则是有利的，因为这增强了统计性。
另一方面，如果基体中的靶标分子在低靶标浓度下已经可检测，则可能是有利的。这需要TPM系统中(例如在粒子上，在基体上或附连至系留物)的至少一种捕获分子，其在与靶分子结合时产生长保持时间。
本发明的实施方式提供了用于TPM生物传感器的方案，其中使用至少两个分子对，其中这两对在生物传感系统中所用的物理和化学条件下(例如，在预定的操作温度下)具有相差至少三倍的保持时间。本发明的实施例允许以检测低浓度的靶标，同时记录和分析具有表示靶标浓度的动态切换特征的信号。这允许随时间监测靶标浓度。
图1A是说明根据本发明的实施方式的用于系留粒子运动生物感应的技术的示意图。单元内部的表面100(例如，基体)具有与其附连的系留分子102的一端。系留分子102的另一端附连到粒子104，在粒子104和表面100之间产生主要结合。系留物102是柔性的并且允许粒子104在一定区域内自由移动，该区域的尺寸取决于系留物的长度，且其位置以系留物102到表面100的连接点为中心。
为了实现生物感应，粒子104用一种或多种捕获分子(例如配体)(例如捕获分子106)官能化，并且表面100用一种或多种捕获分子(例如配体)(例如捕获分子108)官能化。选择捕获分子106和108以对靶标物质110具有结合亲和性。此外，选择捕获分子106和108，使得两者可同时结合靶标物质110。该结合状态如图1B所示。当捕获分子106和108都与靶110结合时，导致粒子104和表面100之间的二级键合。结果是，与其在未结合状态(如图1A所示)中的运动相比，粒子104在该结合状态下的运动受到显著限制。作为具体实例，将1μm直径的粒子104用寡聚物B作为捕获分子106进行官能化，并用40nm长的双链DNA系留物102系至基体100。基体100用寡聚物A作为捕获分子108进行官能化。靶分子110处于溶液中或引入生物传感器装置的单元中的其它基体材料中。当靶标被捕获时，该二级键合约束粒子的运动。更一般地，可以在本发明的实施方式中使用的捕获分子的实例包括大分子，蛋白质，抗体，抗体片段，重组蛋白，肽，糖类，聚合物，分子印迹聚合物，具有配位化学的聚合物，核酸，DNA，PNA，修饰的核酸，适体，多价粘合剂，小分子及其组合。
动力学–联合与解离速率
图1A和图1B(以及图1C-H)中描述的TPM生物传感器的反应动力学的特征在于靶标与两个捕获分子各自之间的联合和解离速率。在下面的讨论中，我们将两个捕获分子称为A和B，将靶标称为T。我们将T与A的相互作用的联合与解离速率分别表示为kA on和kA off。类似地，我们将T与B的相互作用的联合与解离速率分别表示为kB on和kB off。图2是捕获分子A和B与靶T的四种结合状态，以及这些状态之间的相应联合与解离速率的示意图。当A和B同时与T结合时，系留粒子处于结合状态。否则，系留粒子处于未结合状态。对于各相互作用(即，T与A和T与B)，我们还定义联合常数(即亲和性)分别为KA a＝kA on/kA off和KB a＝kB on/kB off，并且解离常数分别为KA d＝kA off/kA on和KB d＝kB off/kB on。
所有相互作用都是可逆的，并且通常假设反应速率常数对于结合配体A和B与靶标T以及复合物BT和AT的相互作用基本相等。换言之，通常假设kA on＝kB on且kA off＝kB off。不同的是，本发明的实施方式不做这种假设。
在这两种相互作用中，具有较高亲和性的那种相互作用(联合常数Ka)控制其中传感器(最)灵敏的低浓度方案。它还控制传感器对浓度变化的响应时间。换言之，灵敏的浓度方案由具有较小解离常数Kd的相互作用确定。相互作用的解离速率(off-rate)koff与结合速率(on-rate)kon确定对靶分子浓度变化的响应时间。解离速率koff确定特征键合保持时间τoff＝1/koff，其对于系统能够响应靶标分子浓度降低的时间尺度很重要。
在这两种相互作用中，具有较低亲和性的相互作用(联合常数Ka)控制二级键合的保持时间。为了提高统计和测量效率，二级键合的结合时间应保持较短，但应足够长以能够进行检测。例如，0.01秒至100秒量级的二级键合保持时间非常适合于检测。
具有不同功能的四个特征时间可分为两类。在该例中，粒子和基体上可及的粘合剂的数量是相同的，只假设单键(没有多重键)，并且假定粒子上的粘合剂具有比基体上的粘合剂更高的亲和性：
两个特征时间与生物传感器响应靶标分子浓度变化的特征时间有关：
·τon 靶标其间靶标分子附连在粒子侧的粘合剂的反应的特征时间；这是增加靶标分子浓度的响应时间。时间τon 靶标取决于靶分子浓度。
·τoff 靶标其间靶分子从粒子侧的粘合剂脱离的反应的特征时间；这使减小靶分子浓度的响应时间。
上述特征时间均取决于最高亲和性粘合剂与靶分子的反应速率常数，并且靶分子的数量起一定作用。
两个特征时间与状态切换信号的产生有关：
·τon 二级二级键合形成的特征时间。该时间取决于粒子与靶分子的占据性，并且以取决于靶分子浓度的方式。系统参数例如粒子的扩散速率、粘合剂的位置、系留长度、系留刚度和分子结合速率在该时间常数中起一定作用。
·τoff 二级二级键合的特征保持时间。这主要取决于A-T-B复合物中最弱键的亲和性。
在TPM生物传感器的一个实施方式中，特征时间τon 靶标和τoff 靶标保持低于相关的时间时间尺度τ基质，其间靶标分子浓度在其中检测到靶分子的基质内变化。例如，时间τ基质可以是由生物传感器监测的生理过程的时间尺度。这确保了生物传感器可及时响应靶标分子浓度的相关变化。
特征时间τoff 二级最好保持较短以使传感器空载时间(dead-time)最小化，但大于检测粒子运动状态所需的最小时间(T检测)。将二级键合形成时间τon 二级设计为低水平，以确保良好的信号生成。优选地，二级键合形成时间具有下限：在靶标分子[靶标]的最高可测量浓度下，形成二级键合τon 二级所需的时间不应低于T检测，以确保结合和未结合状态之间的可靠区分。
替代性TPM实施方式
应当理解，可以在各种替代实施方式中实现本发明的原理。图1A和图1B的实施方式使用这样的配置，其中一种类型的捕获分子106附连到粒子104，另一种类型的捕获分子108附连到表面100。基本上相同的功能可以使用其中一种或两种捕获分子替代地附连至系留物102的实施方式来实现。
例如，图1C和图1D的实施方式使用这样的配置，其中一种类型的捕获分子118附连到系留物114而不是附连到粒子116，而另一种类型的捕获分子120附连到表面112。当捕获分子118和120都结合到靶标物质122时，粒子116的运动受到约束，正如图1A和图1B的实施方式中那样。
图1E和图1F的实施方式使用这样的配置，其中一种类型的捕获分子132附连至系留物126而不是附连至表面124，而另一种类型的捕获分子130附连至粒子128。同样地，当捕获分子130和132都结合到靶标物质134时，粒子128的运动受到约束。
图1G和图1H的实施方式使用这样的配置，其中一种类型的捕获分子142附连至系留物138而不是附连至粒子140，并且另一种类型的捕获分子144附连至系留物138而不是附连至系统表面136。同样地，当捕获分子142和144都结合到靶标物质146时，粒子140的运动受到约束。
还应理解，在这些实施方式中，A型和B型捕获分子可以互换或反转，以获得功能等同的生物传感器。
实现本发明原理的生物传感器也可以在竞争性测定配置中实施。例如，图3A和图3B再次示出了通过系留物302附连至表面300的粒子304。在该配置中，捕获分子306附连至粒子304，但靶标类似物308而非另一种捕获分子附连至表面300。在这种情况下，靶标类似物308和靶标物质310都竞争结合捕获分子306。当靶标物质310存在并与捕获分子306结合时，它阻止靶标类似物308与捕获分子306结合。因此，在靶标存在的情况下，粒子304不太可能具有受约束的运动。
应当理解，如果靶标类似物附连于粒子并且捕获分子附连于表面，则获得基本相同的功能。因此，通过颠倒它们的角色可获得另一实施方式。另外，如果靶标类似物和/或捕获分子附连于系留物而不是粒子或表面，则将获得基本相同的功能。
为了具有高测量统计学，优选选择靶标类似物和捕获分子之间的结合为短保持时间(高解离速率)；这可通过靶标类似物的设计和选择、其偶联方法等方式来调节。为了在低浓度下感测靶标，选择靶标和捕获分子之间的结合是长保持时间的(低解离速率)；这可通过捕获分子的设计和选择、其偶联方法等方式来调节。
运动分析方法
在TPM生物传感器中，系留粒子的运动模式取决于粒子处于结合状态还是未结合状态。因此，可以通过测量粒子运动来推断粒子的状态，例如坐标参数，例如在平行于表面的x-y平面中的坐标位置。例如，图4A说明处于未结合状态的系留粒子，图4C显示处于结合状态的系留粒子，该状态中其运动受到限制。测量未结合粒子随时间的x-y坐标位置作为图4B的图像中的单点，并且结合粒子随时间测量的x-y坐标位置显示为图4D的图像中的单点。TPM生物传感器的一个重要部分是随时间测量这些位置(或其它坐标参数)，并分析这些测量值以确定粒子的结合状态和靶标物质的浓度。例如，在一种已知技术中，根据x-y坐标位置数据的协方差矩阵的特征分解来计算运动的旋转对称参数。因为图4B中的点的分布是对称的，而图4D中的分布不是，所以该对称参数可用于区分结合和未结合粒子状态。其他参数在TPM中也可能是有用的，例如均方位移、运动幅度和步长。运动参数的直方图(例如，作为时间的函数的坐标和步长)通常用于区分不同的状态。可以通过将阈值应用于运动参数以对数据进行分类来鉴定不同的状态。基于来自系统的预期信号选择阈值。然而，许多传统的数据分析方法在异质系统(heterogeneous system)中的粒子运动分析中是无效的。在这些异质系统中，结合状态的数量以及结合状态的位置和大小因粒子而异。由于反应的随机性质，异质系统经常在生物化学测定中出现。
粒子/分子/基体系统可以处于不同状态，因为键合的数量、位置和取向受机遇/随机结合反应的影响。当存在与靶标物质的相互作用具有不同动力学的多种类型的捕获分子时，不同状态的数量增加。这种异质性导致数据分析困难，因为粒子运动的时刻和变化类型不是先验已知的。此外，粒子还可通过其它各种相互作用(例如非特异性相互作用)与基体相互作用。因此，应使用能够检测异质结合状态的灵敏且稳健的分析方法，以实现生物传感技术的良好灵敏度和特异度。
本发明的实施方式提供了用于检测具有异质移动性状态的系统中的变化的数据分析方法和算法，其可以用于分析在系留粒子生物传感器系统中观察到的迁移率变化。该数据分析方法包括一种强大的技术，用于检测连续数据流中数据分布的重大变化阶距(moment)。然后在用于检测粒子运动变化的技术中进行该方法。
本发明的实施方式分析系留粒子的运动数据，目的是检测系留粒子系统的状态的统计学显著变化。这些变化包括特异性二级键合和非特异性二级键合的发生。
因此，本发明的实施方式优选地包括多于一个数据通道的组合分析。这增加了状态变化确定的稳健性。实施方式优选地还包括对于散度(divergence)函数的分析。这样可以准确地确定状态变化和状态变化的时间。
具体地，随时间测量多个空间坐标参数，产生多个对应的数据通道。单独分析这些通道，然后组合来自不同通道的分析的信息，以给出粒子状态变化的可靠且稳健的指示。在一个实施方式中，例如，使用表示八个空间坐标参数的八个通道：两个笛卡尔(Cartesian)坐标，它们的两个时间导数，两个极坐标，以及它们的两个时间导数。注意，这里的空间坐标参数是指位置坐标和从它们导出的参数，例如运动范围，移动性，位置范围，速度，角度范围，步长或其它导出参数。坐标参数还可以涉及距离和/或相对取向的变化。坐标参数也可以是诸如时间导数或二阶距的导出参数。
在一个实施方式中，坐标通道的分析包括使用二阶距散度函数。这允许两个关键的确定：1)量化数据通道中观察到的偏差的重要性，和2)通过对二阶距散度函数进行反向外推(back-extrapolation)来确定粒子的行为已经改变时的散度点(即时间点)。
单个数据通道中观察到的变化与其它数据通道相关。如果观察到的变化与预定的显著性阈值匹配，则检测到粒子状态的变化。
在一个实施方式中，数据分析方法基于对任意显著性水平的数据的二阶距(second moment)的变化进行连续检测。在第一步中，分析算法使用二阶距散度函数来检测运动的变化并确定变化的时间点。在第二步中，使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫(Kolmogorov-Smirnov)检验组合具有相似运动数据的时间间隔。在最后一步中，采用由步长和运动覆盖的区域来清除事件的假阳性检测。
系留粒子的运动数据由粒子位置和步长作为时间的函数表示。二阶距散度函数C(n)＝∑i＝1,n(xi-μ)2-σ2量化一系列数据点xi从具有一定标准偏差σ和平均μ的分布的偏差。计算直至时间tn处的数据点n的二阶距散度函数C(n)。对于TPM数据而言，这反映了到那个时间点的运动数据。我们假设数据是连续的，序列由测量时间确定，数据点在等距时间点获取。对于位置值的平均μ和标准偏差σ不变的数据，C(n)将在<C(n)>＝0附近波动。如果分布发生变化，C(n)将偏离零，表示粒子的状态已经改变。
如果数据的分布与参考参数μ和σ不同，则C(n)将以斜率S＝<(xi-μ)2-σ2>线性增加。通过对开始偏离零的C(n)的部分进行线性拟合，可以确定C(n)的增加。通过反向外推拟合，可以估计发散开始的点td＝-a/b。必须注意，仅包括作为拟合中C(n)的上升/下降侧翼(flank)的一部分的数据点，并且包括足够的数据点以平均掉随机波动。
检测算法检测粒子运动的显著变化。在步骤1中，将运动模式的中心确定为参考点，并且以笛卡尔坐标和极坐标表示运动，并计算这些坐标中的每一个中的相应步长。基于二阶距散度函数扫描这些通道中的每一个中的数据以观察运动行为的显著变化，并且使用组合所有8个通道中的检测到的偏差的标准来组合所有8个通道的结果。在算法的第一步结束时，已经解析了所有数据，并且已经构建了候选事件列表。在算法的下一步中，进一步仔细检查这些候选事件。
在步骤2中，使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验在几次通过情况中比较检测到的事件之间的数据，其中增加了测试的所需显著性。用于渐进通过的显著性水平列表首先是0.1σ，然后以0.25为单位从0.5σ增加到3σ。当没有发现显著差异时，移除事件并合并间隔。
在步骤3中，确定粒子的物理运动参数，并且去除没有明显行为变化的间隔。
本发明的实施方式允许使用TPM生物传感器来测量基体中的靶分子随时间的浓度。通过使用对靶分子具有两种不同亲和性的捕获分子，分别优化生物传感器的灵敏度范围和响应时间以及检测速率。优选地，在生物传感系统中使用的物理和化学条件下，捕获分子的解离速率相对于靶标物质相差至少三倍。可以使用半经验关系koff＝103-0.5n来估计寡聚物相互作用的解离速率常数koff，其中n是PBS缓冲液中室温下互补连续核苷酸的数目。因此，通过适当地选择n，可以选择解离速率。例如，如果寡聚物B具有与靶分子互补的11个核苷酸，则产生估计的koff＝0.003s-1，其对应于5分钟的特征结合时间τoff＝1/koff。如果寡聚物A有8个互补核苷酸，其预期koff＝0.1s-1。这对应于10秒的特征键合保持时间τoff＝1/koff。
这些技术通过更好地鉴定不同状态并确定状态之间的转换事件，提高了TPM生物传感器的灵敏度和特异度。
通道的信号处理可以分别检测单个粒子的各个切换事件。或者，它可以检测一组粒子的切换，例如，每单位时间的平均切换事件数。靶标物质的感测也可以通过计算结合粒子的平均数量或通过记录处于结合状态的平均时间来进行。
对于具有短保持时间二级键合的夹心型生物传感器的实例，事件检测通常在比计数结合粒子或记录结合状态下的平均时间更低的浓度下灵敏。在较高的靶标浓度下，事件的检测可能饱和并且不太灵敏，而计数结合的粒子或记录结合状态的平均时间可能是灵敏的。
因此，在生物传感系统中组合不同的检测方法可能是有用的，从而可以执行剂量-响应曲线的拼接(stitching)，以获得更高的可靠性，更高的动态检测范围和更高的精度。
装置
在一个实施例中，本发明提供了一种用于实现上述技术的光学生物传感装置。
如图5所示，该装置包括光源500，其发射光以用于系留粒子的电磁激发。如上文详细描述，激发光508进入液体单元502，液体单元502在其内部具有带有系留粒子的生物传感表面。由于激发光508与系留粒子的相互作用，光510离开单元502并由成像检测器504感测。对于高信噪比，优选的成像方法是暗场成像，例如在暗背景下测量从粒子发射的光(例如散射、荧光、发光、磷光)。可以直接测量系留粒子坐标参数，例如，通过从发射光的图像测量的空间坐标。例如，在一种实施方式中，使用Nikon Ti-E倒置显微镜(尼康仪器欧洲有限公司(Nikon Instruments Europe BV)，荷兰)，使用iXon Ultra 897(安多尔公司(Andor)，英国贝尔法斯特)以20x的总放大倍数测量粒子运动。在暗场照射条件下以30Hz的帧速率记录405×405μm2的视场中的粒子运动5分钟。
在处理器/分析器506中处理和分析成像信号，其确定粒子切换事件和靶标物质浓度。
在替代实施方式中，可以使用电压源而不是光源来激发粒子。激发路径被设计成主要激发粒子并避免其它情况下产生的光到达成像检测器。光学激发方法可包括例如全内反射(TIR)激发或高角度(HA)照射。
在替代实施例中，可以间接地确定系留粒子坐标参数，例如，通过光谱变化或与空间坐标相关的颜色变化，例如在等离子体感测伴随等离子体共振变化的情况下。
为了调整目的，可以在系统中集成移动部件，例如基体或透镜或安装在线性平台上的成像传感器。部件沿光轴的运动允许焦平面相对于传感器平面的调谐，有助于形成物体及其发射光的清晰图像。可以使用驱动系统，例如音圈电机(VCM)或硅MEMS。
在操作中，该装置以单分子分辨率进行连续监测，例如确定DNA靶标的浓度随时间的变化。通过短的(40nm)初级dsDNA系留物将微米尺寸的粒子系留在传感器表面附近。粒子和基体各自用ssDNA寡聚物官能化，两者都与DNA靶标的不同部分互补。在靶标存在下，一种或两种寡聚物可同时与靶分子结合；然后粒子通过二级键合与表面结合。与仅用主要系留物系留的粒子的运动相比，这导致粒子运动的明显变化。二级键合的结合和解结合事件的频率或活性是溶液中靶标浓度的直接量度。此外，靶标溶液可以在不需要再生系统的情况下进行交换，因为系留粒子形成了独立的系统。将通过靶分子形成的二级键合设计为可逆的；DNA靶和两种寡聚物之间的相互作用被有意设计为弱的，使得形成的键是可逆的。这允许系统响应增加和减少的靶标浓度，因此适合于连续监测靶标分子的浓度。然而，两种相互作用的解离速率优选相差三倍或更多。
通过确定暗背景上的亮粒子的强度中心来执行粒子运动的跟踪。对许多单个粒子的轨迹进行轨迹分析，以检测和量化测量期间结合和解结合事件的发生次数和持续时间。为了实现这一点，该算法扫描运动数据，检测运动数据中粒子位置分布的显著变化。这些变化对应于次要相互作用的形成或破坏。检测算法能够检测多个位置的单个粒子的结合事件；二级键合可在任何位置形成，其中粒子进入与基体形成二级键合所需的距离，并且粒子和基体都具有键形成所需的寡聚物。在官能化反应期间，抗体和寡聚物随机分布在基体和粒子表面上。因此，潜在的结合点异质地分布在表面上。使用相同的算法分析所有测量数据，确保所有检测到的事件满足相同的检测标准。检测超过0.8秒的持续时间的粒子迁移性变化的灵敏度大于80％。
系留粒子的运动模式的形状根据运动幅度和运动的对称性来解释。根据每个粒子的运动模式，通过计算位置数据的协方差矩阵来确定主要(A主要)和次要(A次要)运动轴的幅度。根据运动幅度计算对称参数S对称＝A次要/A主要。径向限制参数定义为用于排除具有受限环形运动模式的粒子。
关于本发明的实施方式的补充性详细内容包括在2016年12月28日提交的优先权申请US 62/439833中，其通过引用纳入本文。

Claims (9)

1.一种用于生物感应靶标物质的方法，所述方法包括：
使含有靶标物质的基质与传感器装置接触，所述传感器装置具有表面、通过系留分子系至表面的粒子的集合，和捕获分子的集合，
其中，所述捕获分子的集合包括附连至粒子或系留分子的第一捕获分子，和附连至表面或系留分子的第二捕获分子，
其中，所述第一捕获分子被选择以结合靶标物质并具有第一靶标解离速率，并且所述第二捕获分子被选择以结合靶标物质并具有与第一靶标解离速率相差至少三倍的第二靶标解离速率；
检测粒子的空间坐标参数的时间系列，其中，空间坐标参数相对于所述表面测量，
在检测的时间系列内鉴定靶标物质与捕获分子的个体联合/解离事件的时间序列，
其中，各事件对应于第一捕获分子CM1和第二捕获分子CM2与靶标物质T的结合状态之间的变化；
从所鉴定的个体联合/解离事件的时间序列确定基质中的靶标物质的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述结合状态之间的变化是T与CM1和CM2两者结合的夹心样状态与T未结合CM1、T未结合CM2或T未与CM1和CM2两者结合的开放状态之间的变化。
3.如权利要求1所述的方法，其中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定所述靶标物质的浓度包括确定所述捕获分子与所述靶标物质的反应的特征时间。
4.如权利要求1所述的方法，其中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定所述靶标物质的浓度包括所述分析空间坐标参数和所述空间坐标参数的二阶距散度。
5.如权利要求1所述的方法，其中，检测靶标物质与捕获分子的个体联合/解离事件的时间序列包括测量粒子的多个空间坐标参数和粒子的多个空间坐标参数的二阶距散度。
6.如权利要求1所述的方法，其中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定所述靶标物质的浓度包括利用二阶距散度函数分析测量的空间坐标参数和/或其时间导数，以确定数据通道中观察到的偏差的显著性，并通过二阶距散度函数的反向外推来确定粒子行为发生变化的发散时间点。
7.如权利要求1所述的方法，其中，由检测的个体联合/解离事件的时间序列确定所述靶标物质的浓度包括确定所述靶标物质捕获状态的持续时间或所述靶标物质对捕获分子的平均占据。
8.一种用于生物感应靶标物质的方法，所述方法包括：
使含有靶标物质的基质与传感器装置接触，所述传感器装置具有表面、通过系留分子系至表面的粒子的集合、靶标类似物的集合，和捕获分子的集合，
其中，捕获分子的集合附连至粒子或表面，并且其中，靶标类似物的集合附连至粒子或表面，
其中，所述捕获分子被选择以结合至靶标物质且具有靶标解离速率，靶标类似物被选择以结合至捕获分子且具有与靶标解离速率相差至少三倍的靶标类似物解离速率；
检测粒子的空间坐标参数的时间系列，其中，空间坐标参数相对于所述表面测量，
在检测的时间系列内鉴定靶标物质与捕获分子的个体联合/解离事件的时间序列，
其中，各事件对应于捕获分子与靶标物质或靶标类似物的结合状态之间的变化；
从所鉴定的个体联合/解离事件的时间序列确定基质中的靶标物质的浓度。
9.一种用于检测靶标物质的生物传感装置，该装置包含：
在其内部包含生物传感表面的单元；
将光发射进入所述单元的光源；
感测来自所述单元的光的光感测器；
根据感测的来自单元的光来确定所述单元中靶标物质浓度的处理器；
其中，所述生物传感表面具有表面，通过系留分子系至表面的粒子集合，以及捕获分子的集合，
其中，捕获分子的集合包括与粒子或系留分子结合的第一捕获分子，以及与表面或系留分子结合的第二捕获分子，
其中，所述第一捕获分子被选择以结合靶标物质并具有第一靶标解离速率，并且所述第二捕获分子被选择以结合靶标物质并具有与第一靶标解离速率相差至少三倍的第二靶标解离速率；
其中，所述处理器检测粒子的空间坐标参数的时间系列，并在检测的时间系列内鉴定靶标物质与捕获分子的个体联合/解离事件的时间序列，并从所鉴定的个体联合/解离事件的时间序列确定所述浓度，
其中，各事件对应于第一捕获分子和第二捕获分子与靶标物质的结合状态之间的变化。
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