CN110234764B - 同时抑制mTOR基因及STAT3基因表达的核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及同时抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因及信号传导与转录激活因子3(STAT3)基因表达的核酸分子，以及包含其的抗癌用药学组合物，具体地，为了克服由于小干扰核糖核酸(siRNA)或短发夹核糖核酸(shRNA)的靶特异性导致其治疗效果不高的缺点，以同时抑制与癌相关的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因及信号传导与转录激活因子3基因表达的方式设计的本申请的双链小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸具有促进癌细胞凋亡的效果。并且，当与抗癌剂联用时，具有提高癌细胞凋亡的协同作用，因此可以有效地用作各种癌症中的抗癌组合物或抗癌助剂。

Description

同时抑制mTOR基因及STAT3基因表达的核酸
技术领域
本发明涉及同时抑制mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)基因及STAT3(信号传导与转录激活因子3)基因表达的核酸分子，以及包含其的抗癌用药学组合物。
背景技术
癌症是世界上最致命的疾病之一，创新的癌症治疗方法的开发可降低治疗期间产生的医疗费用并创造高附加值。并且，根据2008年的统计，可克服现有抗癌剂耐性的分子治疗剂的7个主要国家(美国(US)、日本(Japan)、法国(France)、德国(Germany)、意大利(Italy)、西班牙(Spain)、英国(UK))占1.75亿美元，在2018年，占0.45亿美元左右的市场规模(market size)，相对于2008年，预计增长率将为9.5％。癌症的治疗分为手术、放疗、化疗和生物治疗，其中，化疗是一种抑制或杀死癌细胞增殖的治疗法，由于抗癌剂引起的毒性大多数也会在正常细胞中出现，因此具有一定程度的毒性，有必要开发一种选择性作用于癌细胞并且不产生抗性的抗癌剂，因为抗癌剂显示出在使用一段时间后效果丧失的效果(征服癌症的现地址Biowave 2004.6(19))。最近，通过确保癌症的分子遗传信息，开发了一种针对癌症分子特征的新型抗癌剂，据报告针对癌细胞仅具有的特征性分子靶标(moleculartarget)的抗癌剂不会产生耐性。
抑制基因表达的技术是开发用于治疗疾病的治疗剂和靶标验证中重要的工具。发现干扰RNA(RNA interference，以下称为RNAi)自其发现以来在各种哺乳动物细胞(mammalian cell)中作用于序列特异性mRNA(Silence of the transcripts：RNAinterference in medicine.J Mol Med(2005)83：764773)。RNAi是具有21～25个核苷酸大小的双螺旋结构的小干扰核糖核酸短干扰核糖核酸(small interfering RNA，以下称为siRNA)通过与具有互补序列的转录体(mRNA transcript)特异性结合来分解该转录体，由此抑制特定蛋白质的表达的现象。在细胞中，RNA双链被称为Dicer的核酸内切酶(endonuclease)加工并转化为21个至23个双链(base pair，bp)的siRNA，siRNA与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，引导(反义)链通过识别和分解靶mRNA过程来特异性抑制靶基因表达(NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS：BASIC PRINCIPLESAND RECENT APPLICATIONS.Nature Reviews Drug Discovery.2002.1，503-514)。据贝特朗(Bertrand)研究人员称发现，相对于反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASO)，针对相同靶基因的siRNA在生物体内和体外(in vitro及in vivo)抑制mRNA的表达的效果优秀，该效果包括持久的效果(Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAsin cell culture and in vivo.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002.296：1000-1004)。据分析，基于包含siRNA的RNAi技术的治疗剂市场估计到2020年将形成12兆韩元以上，可应用该技术的对象已被广泛扩展，被评价为可治疗难以通过现有的基于抗体、化合物的医药品治疗的疾病的下一代基因治疗技术。并且，由于siRNA的作用机制能够与靶mRNA互补结合，以序列特异性方式调节靶基因表达，与针对特定蛋白质靶标优化现有基于抗体的医药品或化学物质(小分子药物(small molecule drug))所需的长发展期和开发成本相比，具有可以大大扩展可适用的对象、缩短开发时间并可开发针对包含不可药用的靶物质在内的所有蛋白质靶标优化的先导化合物的优点(Progress Towards in Vivo Use ofsiRNAs.MOLECULAR THERAPY.2006 13(4)：664-670)。为此，最近，已提出这种RNA介导的干扰现象，以解决现有化学合成药物开发中出现的问题，进行在转录体水平上选择性地移植特定蛋白质的表达，并利用于各种疾病治疗剂，尤其肿瘤治疗剂的开发的研究。并且，与现有的抗癌剂不同，siRNA具有靶标明确且可预测副作用的优点，但是，在作为由各种基因问题引起的疾病的肿瘤的情况下，这种靶标特异性反而会成为治疗效果不高的原因。
mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；mammalian Target of rapamycin)是包含细胞因子刺激细胞增殖、用于调节细胞周期的G1相位的集中关键蛋白的mRNA的翻译(translation)、及白细胞介-2(IL-2)诱导因子(transcription)的在各种信号转导途径中的重要酶。mTOR的抑制导致细胞周期从G1到S进展受到抑制。mTOR抑制剂具有免疫抑制、抗增殖及抗癌活性，因此为了治疗这种疾病，将mTOR作为靶标(Current Opinion inLipidology，16：317-323，2005)。并且，mTOR是对自噬(autophage)调节重要的因子，将调节自噬途径的mTOR作为靶标，可治疗各种疾病，例如癌症、神经变性疾病、心脏疾病、老化、免疫疾病、感染疾病及克隆氏症等(Immunology，7：767-777；Nature 451：1069-1075，2008)。
STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)是通过将外部的各种生长因子(growth factor)和细胞因子(cytokine)的信号专递到核来促进转录的转录调节因子(transcription factor)，在细胞质内非活性状态下，当转录活性结构域(transactivation domain)的酪氨酸残基被磷酸化激活时，被引入核内(STAT3inhibitors for cancer therapy：Have all roads been explored Jak-Stat.2013；1；2(1)：e22882)。磷酸化的STAT3(p-STAT3)与核的DNA结合并诱导与肿瘤形成(tumorigenesis)如细胞生长(proliferation)和分化(differentiation)相关的广泛靶基因表达，在约70％的实体瘤及血液癌患者中经常被激活(Role of STAT3 in cancermetastasis and translational advances.BioMed research international.2013；2013：421821)。但是，由于STAT3等转录因子的蛋白质的三维结构，难以找出可抑制活性的靶标，因此在传统的合成新药物开发领域被认为是可挽回的(无成药性(undruggable))(Transcription Factor STAT3 as a Novel Molecular Target for CancerPrevention.Cancers.2014；16；6(2)：926-57)。因此，针对可抑制STAT3的表达的siRNA治疗剂及其传递技术的市场需求非常高。
即，STAT3及mTOR是主要的癌症相关基因，其预后根据表达程度由肺癌、前列腺癌和头颈癌等决定，虽然成为抗癌剂开发目标，但是由于存在于细胞质，因此不能用作常规抗体治疗剂，并且预期药物传递会引起全身副作用，因而难以开发新药来抑制它们。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供一种同时抑制mTOR基因及STAT3基因表达的核酸，在本发明中，为了克服siRNA的靶特异性引起的治疗效果不高的缺点，制备了同时抑制与癌相关的mTOR基因及STAT3基因表达的siRNA及shRNA，通过确认其抗癌活性及与抗癌剂的协同抗癌活性来将其用作预防或治疗癌症的药学组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种同时抑制mTOR及STAT3基因表达的核酸分子。
并且，本发明提供包含上述核酸分子的重组表达载体。
并且，本发明提供引入上述重组表达载体的重组微生物。
并且，本发明提供包含上述核酸分子作为有效成分的抗癌用药学组合物。
并且，本发明提供包括向个体给药药学有效量的权利要求1的核酸分子的步骤的预防及治疗癌的方法。
有益效果
在本发明中，在本申请的双链siRNA或shRNA中，有义链抑制mTOR基因表达，反义链抑制STAT3基因表达，即使不处理每种siRNA或shRNA，也可以同时抑制两种基因。由此，促进癌细胞凋亡，与抗癌剂联用时具有提高癌细胞凋亡的协同作用，并可进行局部传递，且选择性优秀，因此，可以有效地用作各种癌症中的抗癌组合物或抗癌助剂。
附图说明
图1为示出用于在细胞中表达在一条链中包含本发明的双链的siRNA序列与环序列的shRNA的载体图谱的图。
图2为确认基于本发明的双靶标的双链siRNA的mTOR或STAT3基因表达移植效果的图。
图3为分别或同时用siRNA处理mTOR基因或STAT3基因，确认mTOR与STAT3的表达量，以确认mTOR基因及STAT3基因表达之间的相互影响(nc2为对照组siRNA；simTOR是仅靶向mTOR的siRNA；siSTAT3是仅靶向STAT3的siRNA；simTOR和STAT3是靶向mTOR的siRNA及靶向STAT3的siRNA的联用)。
图4是确认使用本发明的双靶siRNA同时抑制mTOR及STAT3时的人肺癌细胞株A549细胞的细胞存活率的图。
图5是处理顺铂后，确认使用本发明的双靶siRNA同时抑制mTOR及STAT3时的人肺癌细胞株A549细胞的细胞存活率的图。
图6是处理紫杉醇后，确认使用本发明的双靶siRNA同时抑制mTOR及STAT3时的人肺癌细胞株A549细胞的细胞存活率的图。
图7是处理5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)后，确认使用本发明的双靶siRNA同时抑制mTOR及STAT3时的人肺癌细胞株A549细胞的细胞存活率的图。
图8是根据shRNA的DNA量确认基于包含序列20的TTGGATCCAA环shRNA序列或序列21的TTCAAGAGAG环shRNA的载体的mTOR及STAT3的表达量的图。
具体实施方式
本发明提供同时抑制mTOR及STAT3基因表达的核酸分子。
上述核酸分子可包含序列1及2；序列3及4；序列5及6；序列7及8；序列9及10；序列11及12；序列13及14；序列15及16；或序列17及18的碱基序列。
在一实施例中，由上述序列1、3、5、7、9、11、13、15及17表示的碱基序列通过核糖核酸干扰来抑制mTOR基因表达，由上述序列2、4、6、8、10、12、14、16及18表示的碱基序列可通过核糖核酸干扰来抑制STAT3基因表达，本发明的核酸分子可同时抑制mTOR基因和STAT3基因表达。
在一实施例中，制成上述序列1与序列2、序列3与序列4、序列5与序列6、序列7与序列8、序列9与序列10、序列11与序列12、序列13与序列14、序列15与序列16、序列17与序列18具有部分互补结合的双链(double strand)siRNA，双链的siRNA分别靶向mTOR及STAT3基因来抑制表达，从而确认是双靶siRNA组。
在本发明中，靶向mTOR或STAT3的siRNA具有与人(Homo sapiens)的mTOR基因或STAT3基因的一部分100％互补的序列，分解mTOR基因或STAT3基因的mRNA，或可抑制翻译。
使用于本发明的术语“抑制表达”是指降低靶基因表达或翻译，优选地，是指靶基因表达不可检测或以不显示的水平存在。
使用于本发明的术语“siRNA(small interfering RNA)”是指能够切割(cleavage)特定mRNA来诱导RNAi(RNA interference)现象的短双链RNA。通常，siRNA由具有与靶基因的mRNA同源的序列的有义RNA链和具有与其互补的序列的反义RNA链构成，本发明的双链siRNA是有义RNA链由序列1、3、5、7、9、11、13、15及17的碱基序列表示的siRNA(对mTOR基因的反义链)，反义RNA链由序列2、4、6、8、10、12、14、16及18的碱基序列组成的siRNA(对STAT3基因的反义链)，双链的siRNA可分别同时抑制mTOR及STAT3基因表达，因此作为有效的基因敲除(knock-down)方法或基因治疗(gene therapy)方法来提供。
在一实施例中，第一组的序列1及2的siRNA中的21mer中17mer、第二组的序列3及4的siRNA中的20mer中16mer、第三组的序列5及6的siRNA中的19mer中15mer、第四组的序列7及8的siRNA中18mer中14mer、第五组的序列9及10的siRNA中的17mer中16mer互补结合。并且，第六组的序列11及12的siRNA中的20mer中17mer、第七组的序列13及14的siRNA中的19mer中16mer、第八组的序列15及16的siRNA中的18mer中15mer、第九组的序列17及18的siRNA中的17mer中15mer互补结合。
上述碱基序列的变体包括在本发明的范围内。同时抑制本发明的mTOR及STAT3基因表达的核酸分子构成它的核酸分子的作用性等同物，例如，核酸分子的一部分碱基序列缺失(deletion)、取代(substitution)或插入(insertion)来修饰，但是包括以与核酸分子功能相同的方式起作用的变体(variants)的概念。具体地，上述基因可包含与序列1至18的碱基序列分别具有70％以上，更优选地具有80％以上，进一步优选地具有90％以上，更加优选地具有95％以上的序列同源性地碱基序列。通过比较两个最佳比对序列与比较区域来确认对核酸分子的“序列同源性的％”，相对于对两个序列的最佳比对的参考序列(不包括加或缺损)在比较区域中的核酸分子序列的一部分还可包括添加或缺失(即，缺口)。
并且，本发明提供包含上述核酸分子的重组表达载体。
在本发明中，为了使靶向mTOR及STAT3的双链siRNA在传递的细胞中适当地进行转录，优选地，将包含它的shRNA，尤其，序列1至18的碱基序列部分被修饰的shRNA以至少可操作性地连接在启动子中。上述启动子可以是能够在真核细胞中起作用的任何启动子。为了有效地转录靶向mTOR及STAT3的双链siRNA或shRNA，根据需要还可包含调节序列，包括前导序列、多腺苷酸化序列、启动子、增强子、上游激活序列、信号肽序列和转录终止因子。上述shRNA可由序列20或序列21的碱基序列表示。
本发明的术语“shRNA(short hairpin RNA，shRNA)”是指，单链RNA中部分包含环状碱基序列，3’区域中具有双链结构并形成如发夹一样的结构，在细胞中表达后可通过作为存在于细胞中的RNase的一种的dicer来传递并转化为siRNA的RNA，对于上述双链结构的长度没有特别限制，但是优选地为10核苷酸以上，更优选地为20核苷酸以上。在本发明中，上述shRNA可包含载体。
在本发明中术语“载体”可包括：质粒载体，作为在宿主细胞中用于表达目的基因的手段；噬菌粒载体；粘粒载体；以及病毒载体，如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。
在本发明优选的实例中，本发明的载体中基因可与启动子以可操作性地连接(operatively linked)。
在本发明中，术语“可操作性地连接”是指基因表达调节序列(例如：启动子，信号序列或转录调节因子结合位点)于其他基因序列之间的功能性结合，由此调节序列调节其他基因序列的转录和/或翻译。
本发明的载体系统可通过本技术领域中公知的方法来构建，其具体方法公开在Sambrook et al.(2001)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press中，该文献通过引用并入本文。
通常，可以将本发明的载体构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。并且，可以使用原核或真核细胞作为宿主构建本发明的载体。在本发明的载体是表达载体，以原核细胞为宿主的情况下，通常包括可进行转录的强启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子及T7启动子等)、用于开始翻译的核糖体结合位点及转录/翻译终止序列。在使用大肠杆菌(E.coli)(例如，HB101、BL21、DH5α等)作为宿主细胞的情况下，可使用大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵基因位点(Yanofsky，C.(1984)，J.Bacteriol.，158：1018-1024)和噬菌体λ的左侧启动子(pLλ启动子，Herskowitz，I.and Hagen，D.(1980)，Ann.Rev.Genet.，14：399-445)作为调节位点。
另一方面，可以通过操作本领域常用的质粒(例如：pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列及pUC19等)、噬菌粒(例如：pComb3X)、噬菌体或病毒(例如：SV40等)来制备可用于本发明的载体。
另一方面，在本分发明的载体为表达载体，以真核细胞为宿主的情况下，可使用来源于哺乳动物细胞的遗传体的启动子(例如：金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如：腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV4启动子)，通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
必要时，本发明的载体还可以与其他序列融合，以促进蛋白质的纯化，融合的序列可使用例如，谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)及6x His(hexahistidine；Quiagen，USA)等，但并不限定于此。并且，本发明的表达载体是选择标记，可包含本领域常用的抗生素抗性基因，例如，对氨苄西林、艮他霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新链霉素及四环素具有抗性的基因。
并且，本发明提供引入上述重组表达载体的重组微生物。
能够以稳定方式连续克隆和表达本发明载体的宿主细胞可以是本领域已知的任何宿主细胞，例如，芽孢杆菌属菌株，如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、枯草菌及苏云金杆菌；原核宿主细胞、链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(Staphylocus carnosus))，但并不限定于此。优选地上述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地为大肠杆菌ER2537、大肠杆菌ER2738、大肠杆菌XL-1Blue、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH系列、大肠杆菌TOP10、大肠杆菌TG1及大肠杆菌HB101。
将本发明的载体递送到宿主细胞中的方法可通过CaCl2方法(Cohen，S.N.et al.(1973)，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9：2110-2114)、Hanahan方法(Cohen，S.N.et al.(1973)，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9：2110-2114；以及Hanahan，D.(1983)，J.Mol.Biol.，166：557-580)及电穿孔方法(Dower，W.J.et al.(1988)，Nucleic.Acids Res.，16：6127-6145)等来实施。
并且，本发明提供包含上述核酸分子作为有效成分的抗癌药学组合物。
上述核酸分子还可包含抗癌剂，例如，可包含阿西维辛、阿柔比星、诺考达唑、四环素、阿多来新、阿拉诺新、阿地白介素、别嘌醇钠、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨萘非特、安普利近、安吖啶、雄激素、anguidine、氨苄西林甘氨酸、亮氨酸溶肉瘤素、天门冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、咪唑硫嘌呤、卡介苗(BCG)、贝氏抗叶酸药、β-2-deoxythioguanosine、bisanthrenehcl、硫酸博来霉素、白消安、丁硫氨酸硫酸亚胺、BWA 773U82、BW 502U83/HCl、BW7U85甲磺酸、神经酰胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氯喹喔啉磺酰胺、氯脲霉素、色素霉素A3、顺铂、克拉屈滨、皮质类固醇、棒状杆菌、CPT-11、克立那托、环胞苷、环磷酰胺、阿糖孢苷、色他巴、dabis maleate、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、deazauridine、右丙亚胺、卫康醇、地吖醌、二溴脱氧己六醇、膜海鞘素B、二乙基二硫代氨基甲酸酯、肌苷二醛、二氢-5-氮杂胞苷、阿霉素、棘霉素、依达曲沙(dedatrexate)、依地福新、依洛尼塞、埃利奥溶液、依沙芦星、表柔比星、依索比星、雌莫司汀磷酸盐、雌性激素、ethanidazole、氨磷汀、依托泊苷、法曲唑、法扎拉滨、维甲酰酚胺、非格司亭、非那雄胺、黄酮醋酸、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、5'-氟尿嘧啶、氟尿苷、氟他米特、硝酸镓、吉西他滨、醋酸戈斯特林、hepsulfam、六亚甲基二乙酰胺、高三尖杉酯碱、硫酸肼、4-羟基雄甾堆叠四二酮、硫酸羟脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、4-甘薯醇、异丙铂、异维甲酸、甲酰四氢叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体道诺红菌素、脂质体捕获阿霉素、洛莫司汀、氯尼达明、美登素、盐酸氮芥、美法仑、美诺立尔、美巴龙、6-巯基嘌呤、美司钠、卡介苗甲醇提取物、甲氨蝶呤、N-甲基甲酰胺、米非司酮、米托胍腙、丝裂霉素-C、米托坦、甲氧哌酮盐酸盐、单核/巨噬细胞集落刺激因子、庚苯吡酮、萘氧啶、新制癌菌素、醋酸奥曲肽、奥马铂、奥沙利铂、紫杉醇、PALA、喷司他丁、哌嗪二酮、胍血生、吡柔比星、吡曲克辛、盐酸吡咯酮、PIXY-321、普卡霉素、甲酰胺钠、泼尼莫司汀、甲基苄肼、孕激素、吡唑呋喃菌素、丙亚胺、沙格司亭、司莫司汀、锗螺胺、螺莫司汀、链黑霉素、链脲菌素、磺氯苯脲、苏拉明钠、三苯氧胺、泰索帝、喃氟啶、替尼泊苷、对苯脒、替罗昔隆、硫鸟嘌呤、噻替派、胸腺嘧啶注射液、噻唑羧胺核苷、拓扑替康、托瑞米芬、维甲酸、三氟拉嗪盐酸盐、三氟尿苷、三甲曲沙、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、乌拉莫司汀、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春利定、Yoshi 864、佐柔比星、阿糖胞苷、依托泊甙、米尔法兰、紫杉酚及它们的混合物。优选为顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿霉素、道诺红菌素、阿糖胞苷、依托泊甙、米尔法兰、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、长春地辛、丝裂霉素、博来霉素、三苯氧胺及紫杉酚、更优选为顺铂、紫杉醇或5-氟尿嘧啶，但为了以通过与本发明的核酸分子共处理来达到对抗癌效果显示出协同效应的目的，并不限定于此。
上述癌症可以为选自由大肠癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、脑瘤、头颈癌、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、肺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、食道癌、小肠癌、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、骨癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、中枢神经系统(centralnervous system；CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、多形性胶质母细胞瘤和垂体腺瘤组成的组中的一种以上。
除了单个机构与抗体之外，本发明的药学组合物还可包含助剂(adjuvant)。上述助剂只要是本技术领域中公知的，则可不受限制地使用，例如，它可能进一步包括弗氏(Freund)完全或不完全的佐剂，以提高其效果。
根据本发明的药学组合物可以通过将活性成分掺入药学上可接受的载体中来制备。其中，药学上可接受的载体包括制药领域中常用的载体、赋形剂和稀释剂。可用于本发明药学组合物的药学上可接受的载体包括但不限于，可以例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
根据常规方法，本发明的药学组合物可以剂型化成散剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等口服型剂型、外用剂、栓剂或灭菌注射溶液的形态来使用。
在制剂化的情况下，可以使用通常使用的稀释剂或赋形剂来制备，如填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂可以通过将活性成分与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合来制备。并且，处理简单的赋形剂之外，还可以使用润滑剂如脂酸镁和滑石。用于口服给药的液体制剂具有悬浮剂、内用液体、乳液、糖浆等，除常用的稀释剂如水和液体石蜡之外，还可包括各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于非口服给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶液、悬浮剂、乳液、冻干制剂和栓剂。作为非水溶液、悬浮剂可使用可注射的酯，例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、油酸乙酯。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、吐温(tween)61，可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
根据本发明的药学组合物可以通过各种途径给药个体。可以预期所有给药方式，例如，可通过口服、静脉、肌肉、皮下、腹腔内注射来给药。
考虑到个体的年龄、体重、性别、身体状况等，选择根据本发明的药学组合物的给药量。显然，上述药学组合物中包含的单结构域抗体的浓度可以根据受试者进行各种选择，优选地以0.01～5000μg/ml的浓度包含在药学组合物中。在其浓度小于0.01μg/ml的情况下，可能不会出现药理活性，在大于5000μg/ml的情况下它可能对人体有毒。
本发明的药学组合物可用于预防或治疗癌症及其并发症，也可用作抗癌助剂。
并且，本发明提供包括向个体给药药学有效量的权利要求1的核酸分子的步骤的预防及治疗癌的方法。
本发明的药学组合物以治疗有效量或药学有效量给药。术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，有效剂量水平可取决于个体种类、严重程度、年龄、性别、对药物的敏感性、给药时间、给药途径及释放比例、治疗时间、包括共同施用的药物的因素及在其他医学领域中众所周知的因素。
通过下述实施例进一步详细说明本发明。但是下述实施例仅用于具体化本发明，而本发明并不限定于此。
实施例1.制备双靶siRNA
由下述表1的序列制备可同时抑制STAT3(signal transducer and activator oftranscription 3)及mTOR(mammalian target of rapamycin)的双靶siRNA(doublestrand)(韩国大田Bioneer(Bioneer，Daejeon，Korea))。
表1
Figure SMS_1
上述第一组的序列1及2的siRNA中的21mer中17mer、第二组的序列3及4的siRNA中的20mer中16mer、第三组的序列5及6的siRNA中的19mer中15mer、第四组的序列7及8的siRNA中18mer中14mer、第五组的序列9及10的siRNA中的17mer中16mer互补结合。并且，第六组的序列11及12的siRNA中的20mer中17mer、第七组的序列13及14的siRNA中的19mer中16mer、第八组的序列15及16的siRNA中的18mer中15mer、第九组的序列17及18的siRNA中的17mer中14mer互补结合。
具体地，各组的两个序列双链(double strand)形式进入细胞后，各组的反义_mTOR的siRNA互补结合在mTOR mRNA(gi|206725550|ref|NM_004958.3|人类雷帕霉素的机制靶(标Homo sapiens mechanistic target of rapa mycin)(丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase))(mTOR)，mRNA)的靶位点。
并且，各组的反义_STAT3的siRNA互补结合在STAT mRNA(gi|47080104|ref|NM_139276.2|Homo sapiens signal transducer and activator of transcription 3(急性期反应因子(acute-phase response factor))(STAT3)，转录物变体1(transcriptvariant 1)，mRNA)的靶位点来减少mTOR及STAT3基因表达。
实施例2.制备表达包含双靶siRNA的shRNA的重组表达载体
为了在细胞中表达在上述实施例1中制备的第一组的序列1及2的双靶siRNA，制备了编码包含上述siRNA双链的序列和环序列的多个shRNA的核酸分子(TTGGATCCAA环shRNA及TTCAAGAGAG环shRNA)(各核酸分子序列在表2中分别表示为序列20和序列21)。将核酸分子分别置于pE3.1载体(图1)的限制酶PstⅠ及EcoRⅤ切割位点处的U7启动子(序列19)后，制备了可在细胞中表达包含靶向mTOR及STAT3的双靶siRNA的两种shRNA的重组表达载体(各shRNA序列表示为序列26及序列27)。
表2
Figure SMS_2
实验例1.确认双靶siRNA的mTOR及STAT3基因表达抑制效果
向12-孔板接种Hela细胞后，在添加有10％的胎牛血清(FBS)(Hyclone公司)的RPMI培养基(Hyclone公司)中于37℃的温度、5％的CO2的条件下培养，直到细胞融合度(confluent)为50％为止。之后，通过用脂质体(lipofectamine)3000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将上述实施例1中制备的双靶siRNA转染到上述细胞中，同时敲除Bcl1、BI1、AR、mTOR及STAT3。转染48小时后，破碎细胞并用Gene JET RNA纯化试剂盒(GeneJETRNA Purification Kit)(Invitrogen)提取总RNA。以提取的总RNA为模板通过RevoScriptTM RT PreMix(iNtRON BIOTECHNOLOGY)进行逆转录反应。使用含25ng至200ng的逆转录的cDNA的20μl的试样和AmpONE taq DNA polymerase(GeneAll)及TaqMan基因表达分析(TaqMan Gene Expression assays)(Applied Biosystems)，针对于mTOR(Hs00234522_m1)、STAT3(Hs01047580_m1)及GAPDH(Hs02758991_g1)，利用ABI PRISM 7700序列检测系统(ABI PRISM 7700Sequence Detection System)及QS3实时聚合酶链式反应(QS3 Real-time PCR)(Biosystems)来进行反应。实时聚合酶链式反应的反应条件为[两步循环，在50℃的温度下2分钟、在95℃的温度下10分钟、在95℃的温度下15秒钟及在60℃的温度下60秒钟]，共进行40个循环。所有反应重复3次，并求出其平均值。将结果标准化为持家基因的GAPDH的mRNA值。
其结果，通过第一组至第九组的双靶siRNA比较mTOR及STAT3与对照组，确认残留表达约为20％至40％，可知双靶siRNA可同时抑制两种基因的表达(图2)。
实验例2.确认mTOR及STAT3的基因相互表达影响性
如上述实验例1，利用脂质体3000将下述表3的mTOR siRNA(bioneer，1058906)(序列22及23)、STAT3 siRNA(bioneer，1145658)(序列24及25)或mTOR siRNA和STAT3 siRNA同时转染到人肺癌细胞株A549中。在转染48小时后，如上述实验例1，利用实时聚合酶链式反应(Taqman)确认mTOR及STAT3基因表达减少比例。
表3
Figure SMS_3
表4
Figure SMS_4
其结果，mTOR及STAT3的表达因各个siRNA而减少，对其结果与同时处理两种siRNA的情况进行比较的结果，mTOR基因及STAT3基因表达之间没有影响(图3及表4)。
实验例3.确认基于双靶siRNA的癌细胞凋亡效果
为了确认基于本发明的第一组至第九组的双靶siRNA的癌细胞凋亡效果，以5×103细胞/孔将人肺癌细胞株A549细胞接种于96-孔板后，用脂质体3000将双靶siRNA(同时敲除mTOR及STAT3)转染到各个细胞中。在转染48小时后，再进行24小时后对细胞处理5mg/mL的噻唑蓝(MTT)(Promega，Ltd.)，并培养4小时。随后，去除培养基，并处理150μl的增溶溶液(solubilization solution)及终止溶液(stop solution)，在37℃的温度下培养4小时。在570nm下测定反应溶液的吸光度，通过下述数学式计算细胞存活率。
关系式1：细胞存活率＝实验组吸光度(570nm)/对照组吸光度(570nm)×100％
其结果，相对于对照组，用本发明的第一组至第九组的双靶siRNA同时处理mTOR及STAT3时，细胞生产率显著减少。因此，本发明的第一组至第九组的双靶siRNA癌细胞被有效凋亡(图4)。
实验例4.确认通过联用处理双靶siRNA和抗癌剂的癌细胞凋亡效果
4-1.与顺铂(cisplatin)联用处理
以5×103细胞/孔将人肺癌细胞株A549细胞接种于96-孔板后，用脂质体3000将双靶siRNA(同时敲除mTOR及STAT3)转染到各个细胞中。在转染48小时后，处理5μM的顺铂来培养10小时。随后，如上述实验例3，进行噻唑蓝反应，在570nm下测定吸光度并计算细胞生存率。
其结果，与顺铂联用处理，用本发明的第一组至第九组的双靶siRNA同时抑制mTOR及STAT3时，细胞存活率减少至约50～70％，相对于对照组，具有显著差异。因此，确认在与抗癌剂联用处理过程中，同时抑制两种基因时细胞凋亡效果显著提高(图5)。
4-2.与紫杉醇(paclitaxel)联用处理
以5×103细胞/孔将人肺癌细胞株A549细胞接种于96-孔板后，用脂质体3000将双靶siRNA(同时敲除mTOR及STAT3)转染到各个细胞中。在转染48小时后，处理5μM的顺铂来培养10小时。随后，如上述实验例3，进行MTT反应，在570nm下测定吸光度并计算细胞生存率。
其结果，与紫杉醇联用处理，用本发明的第一组至第九组的双靶siRNA同时抑制mTOR及STAT3时，细胞存活率减少至约30～50％，相对于对照组，具有显著差异。因此，确认在与抗癌剂联用处理过程中，同时抑制两种基因时细胞凋亡效果显著提高(图6)。
4-3.与5-氟尿嘧啶联用处理
以5×103细胞/孔将人肺癌细胞株A549细胞接种于96-孔板后，用脂质体3000将双靶siRNA(同时敲除mTOR及STAT3)转染到各个细胞中。在转染48小时后，处理1μM的5-氟尿嘧啶来培养10小时。随后，如上述实验例3，进行MTT反应，在570nm下测定吸光度并计算细胞生存率。
其结果，与5-氟尿嘧啶联用处理，用本发明的第一组至第九组的双靶siRNA同时抑制mTOR及STAT3时，细胞存活率减少至约30％，相对于对照组，具有显著差异。因此，确认在与抗癌剂联用处理过程中，同时抑制两种基因时细胞凋亡效果显著提高(图7)。
实验例5.包含双靶siRNA的shRNA的mTOR及STAT3抑制效果
利用脂质体e3000将在上述实施例2中制备的包含序列20的TTGGATCCAA环shRNA序列或序列21的TTCAAGAGAG环shRNA的载体分别以0μg、1μg及2μg转染到A549细胞中。在转染48小时后，利用实验例1中描述的实施聚合酶链式反应分析方法来确认mTOR与STAT3的基因表达减少程度。
其结果，mTOR及STAT3的表达在包含本申请的双靶siRNA的两种shRNA均减少，与shRNA的DNA量成比例，减少至20％左右(图8)。
<110> 株式会社库利金
<120> 同时抑制mTOR基因及STAT3基因表达的核酸
<130> PCT
<150> KR 10-2017-0013661
<151> 2017-01-31
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<151> 2018-01-17
<160> 27
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第一组的反义_mTOR
<400> 1
gactgtggca tccacctgca t 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第一组的反义_STAT3
<400> 2
atgcaggtag gcgcctcagt c 21
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第二组的反义_mTOR
<400> 3
gactgtggca tccacctgca 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第二组的反义_STAT3
<400> 4
tgcaggtagg cgcctcagtc 20
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
>223> 第三组的反义_mTOR
<400> 5
gactgtggca tccacctgc 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第三组的反义_STAT3
<400> 6
gcaggtaggc gcctcagtc 19
<210> 7
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第四组的反义_mTOR
<400> 7
gactgtggca tccacctg 18
<210> 8
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第四组的反义_STAT3
<400> 8
caggtaggcg cctcagtc 18
<210> 9
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第五组的反义_mTOR
<400> 9
caagctgctg tggctga 17
<210> 10
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第五组的反义_STAT3
<400> 10
tcagctacag cagcttg 17
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第六组的反义_mTOR
<400> 11
tgctgggccg catgcgctgc 20
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第六组的反义_STAT3
<400> 12
gcagccactg cggcccagca 20
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第七组的反义_mTOR
<400> 13
gctgggccgc atgcgctgc 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第七组的反义_STAT3
<400> 14
gcagccactg cggcccagc 19
<210> 15
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第八组的反义_mTOR
<400> 15
ctgggccgca tgcgctgc 18
<210> 16
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第八组的反义_STAT3
<400> 16
gcagccactg cggcccag 18
<210> 17
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第九组的反义_mTOR
<400> 17
tgggccgcat gcgctgc 17
<210> 18
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第九组的反义_STAT3
<400> 18
gcagccactg cggccca 17
<210> 19
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> U7启动子
<400> 19
cctagagtcg acactagata acaacatagg agctgtgatt ggctgttttc agccaatcag 60
cactgactca tttgcatagc ctttacaagc ggtcacaaac tcaagaaacg agcggtttta 120
atagtctttt agaatattgt ttatcgaacc gaataaggaa ctgtgctttg tgattcacat 180
atcagtggag gggtgtggaa atggcacctt gatctcaccc tcatcgaaag tggagttgat 240
gtccttccct ggctcgctac agacgcactt ccgcaa 276
<210> 20
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码TTGGATCCAA环shRNA的核酸分子
<400> 20
gactgtggca tccacctgca tttggatcca aatgcaggta ggcgcctcag tctt 54
<210> 21
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码TTCAAGAGAG 环shRNA的核酸分子
<400> 21
gactgtggca tccacctgca tttcaagaga gatgcaggta ggcgcctcag tctt 54
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mTOR siRNA_有义链
<400> 22
guggaaacag gacccauga 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mTOR siRNA_反义链
<400> 23
ucaugggucc uguuuccac 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> STAT3 siRNA_有义链
<400> 24
uguucucuga gacccauga 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> STAT3 siRNA_反义链
<400> 25
ucaugggucu cagagaaca 19
<210> 26
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UUGGAUCCAA环shRNA
<400> 26
gacuguggca uccaccugca uuuggaucca aaugcaggua ggcgccucag ucuu 54
<210> 27
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UUCAAGAGAG环shRNA
<400> 27
gacuguggca uccaccugca uuucaagaga gaugcaggua ggcgccucag ucuu 54

Claims (9)

1.一种核酸分子，同时抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因及信号传导与转录激活因子3基因的表达，
其特征在于，上述核酸分子同时包含序列1及2的碱基序列；并且
在上述序列1与序列2被表达时，形成具有部分互补结合的双链短发夹核糖核酸。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，由上述序列1表达的碱基序列通过核糖核酸干扰来抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因表达。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，由上述序列2表达的碱基序列通过核糖核酸干扰来抑制信号传导与转录激活因子3基因表达。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，编码上述短发夹核糖核酸的核酸序列由序列20或序列21的碱基序列表示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1的核酸分子。
6.一种重组微生物，其特征在于，引入权利要求5的重组表达载体。
7.一种抗癌用药学组合物，其特征在于，包含权利要求1的核酸分子作为有效成分。
8.根据权利要求7所述的抗癌用药学组合物，其特征在于，上述核酸分子还包含抗癌剂。
9.根据权利要求8所述的抗癌用药学组合物，其特征在于，上述抗癌剂为选自由顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿霉素、道诺红菌素、阿糖胞苷、依托泊甙、米尔法兰、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、长春地辛、丝裂霉素、博来霉素、三苯氧胺及紫杉酚组成的组中的一种以上抗癌剂。
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