CN110229871A

CN110229871A - 一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

Info

Publication number: CN110229871A
Application number: CN201910345696.4A
Authority: CN
Inventors: 赵琪; 金云舟; 王丽
Original assignee: Shanghai Jingquan Biomedical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Jingquan Biomedical Co Ltd
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2039-04-26
Also published as: CN110229871B

Abstract

本发明提供一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其包括如下步骤：(1)根据STR基因座设计并合成引物及质粒；(2)采用引物，以质粒作为扩增模板，进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行纯化，适当稀释后获得STR等位基因阶梯。本发明仅需要合成1个质粒、1次PCR反应，对PCR产物进行纯化稀释后即可得到相应STR基因座的allele ladder，大大简化了STR基因座allele ladder的制备流程、制备的人力成本、时间成本与经济成本。

Description

一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

技术领域

本发明涉及于基因工程技术领域，尤其涉及一种通用的短串联重复序列 (STR)等位基因阶梯((Allele Ladder)的制备方法及其试剂盒。

背景技术

在人以及各种基因组中均存在一种称为短串联重复序列(short tandem repeat，STR)的遗传标记。STR广泛应用与遗传学、法医学、肿瘤学等方面的研究，尤其是那些在人群中具有高度多态性的STR遗传标记。如Dib C与其同事于1996年(Nature.1996 Mar 14；380(6570):152-4.PMID:8600387)、Broman KW 等于1998年(Am J Hum Genet.1998 Sep；63(3):861-9.PMID:9718341)、Kong A 等于2002年(Nat Genet.2002 Jul；31(3):241-7.PMID:12053178)分别采用5236 个、8325个、5136个STR遗传标记进行了高分辨的人类基因组遗传作图。在法医学领域，STR标记更成为进行个体识别与亲权认定的标准遗传标记，国际上如美国应用生物系统公司(ThermoFisher公司子品牌， https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/industrial/forensics/human-identification.html)、Promega公司(https://www.promega.com.cn/)等旗下均有多种基于STR遗传标记的法医学身份识别产品。2017年，美国FBI对法医学领域的核心STR基因座进行了扩展(https://www.fbi.gov/about-us/lab/biometric-analysis/codis/ planned-process-and-timeline-for-implementation-of-additional-codis-core-loci,Hares DR,2015,Forensic Sci.Int.Genet.17:33-34.)。国内也有公司基于法医学领域常用STR基因座组合开发出不同的法医学产品并申请了相应的专利，如 CN105368958A、CN103789414B、CN104017895B、CN103789414B等。在医学领域，也出现了依据STR遗传标记进行疾病诊断等的专家共识(2016，荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用协组，中华妇产科杂志，51.5：321-324)。

在各种类型的STR遗传标记中，以3-5个碱基为核心重复单元的遗传标记最为常用，前述法医学领域中各STR基因型分型试剂盒均属此类。在各STR基因分型试剂盒中，一个关键的组份是等位基因阶梯(allele ladder)，其作用在于对样本进行相应STR分型时作为STR等位基因的标准参考品。以D13S317为例，其核心重复序列为[TATC]n，其常见的核心重复次数为5-15。那么当采用某一对 PCR引物对D13S317进行基因分型时，其相应的等位基因阶梯中就应该包含这些常见重复次数所对应长度的PCR扩增片段。当一个样本采用同样的PCR引物进行扩增时，扩增片段长度与等位基因阶梯的片段长度进行比对，若与核心重复次数10相应的片段长度相等，则该等位基因即命名为10。显然，对同一个STR 基因座，采用不同的PCR扩增引物，同样的等位基因的扩增长度极有可能是不同的，必须依据相同的PCR引物重新制备相应的等位基因阶梯。如此，才可以确保依据不同的产品对同一个样本的等位基因命名都是一致的，使结果具有可比性。由此，可以看出STR基因座的alleleladder的制备在相应STR分型产品中的重要性。

国内已有学者提出了不同的STR基因座allele ladder的制备方法并申请了相应的专利，如CN105886497A、CN1276427A、CN1233829C等。总结上述这些专利中所提出的STR基因座allele ladder的制备流程如下：

a)对于特定STR基因座(如D13S317)设计PCR引物。

b)采用设计的PCR引物对大量的样本进行检测与筛选，得到不同的等位基因的扩增产物或包含这些等位基因的基因组DNA样本。

c)将携带不同等位基因的基因组DNA样本进行等量混合后，以混合DNA 作为PCR模板采用相应的PCR引物进行扩增，对PCR产物进行纯化得到相应 STR基因座的alleleladder。或者：

d)将不同等位基因的PCR扩增产物进行基因克隆，得到每一个等位基因对应DNA片段的质粒(或直接采用全基因合成方案得到包含相应等位基因对应 DNA片段的质粒)，将携带不同等位基因的质粒进行等摩尔数混合，以混合质粒为模板采用相应的PCR引物进行扩增，扩增产物纯化后得到该STR基因座的 allele ladder。或者：

e)以b)或d)中的DNA样本或质粒为模板进行单一等位基因扩增，将PCR 产物进行纯化、定量和等摩尔数混合得到该STR基因座allele ladder。或者：

f)为提高相应allele ladder的产量，以c)、d)或e)得到的allele ladder为PCR模板，再次以相应的PCR引物进行扩增、纯化，得到足量的allele ladder。

采用上述工艺流程得到的allele ladder，均为该基因座上、与相应PCR引物对应的包含不同核心重复数的DNA片段的混合物，对一个特定的基因STR基因而言，此类DNA片段的结构可以以如下所示的统一形式进行表示。

其中F为与正向引物对应的DNA片段，b5为核心重复结构5'端侧翼序列对应DNA片段，b3为核心重复结构3'端侧翼序列对应DNA片段，Rc为反向引物 R的反向互补序列对应DNA片段。Allele ladder中所包含各等位基因的DNA片段的长度因n的不同而长度不等。PCR扩增时正向引物可采用FAM、HEX、JOE、 VIC、NED、TAMRA、ROX等荧光素进行标记。若采用反向PCR引物标记相应荧光素，则得到的如上所示DNA片段的反向互补序列对应的DNA片段。

采用上述技术方案制备的allele ladder的优点是，理论上allele ladder中所包含的每一个等位基因DNA片段，均与从样本中采用相同PCR引物扩增得到的相应等位基因的DNA片段，无论是在重复单元的次数上还是DNA序列上均完全一致。

然而，上述制备方案的缺点也是显而异见的，体现在(仍以D13S317基因座为例)：

(1)需要对足够数量的无关个体基因组DNA样本进行检测，才有可能得到该STR基因座尽可能全的包含该STR基因座不同等位基因的基因组DNA样本。

(2)即使得到了包含该STR基因座不同等位基因的基因组DNA样本，由于试剂盒产品的生产是持续的过程，也就需要持续不断地收集相应的基因组 DNA样本。

(3)虽然采用基因克隆的办法是一个解决需要持续收集不同DNA样本的方案，但对于一个包含有20个不同STR基因座的分型试剂盒来说，也往往需要完成数百个的等位基因克隆，工作量与成本均巨大。另外，对于一些少见的等位基因，获得等位基因克隆也是一个费时费力的过程，将大大延长STR多重分型试剂盒的研制过程。

(4)通过全基因合成是解决少见等位基因克隆的一个有效的解决方案，甚至在通过基因测序明确了一个STR基因座的重复结构后，也可考虑将数百个等位基因均采用全基因合成的方案进行合成。但该方案存在的问题是，一是全基因合成的成本高，二是对于重复结构的全基因合成的技术难度高，尤其是重复结构域长的STR基因，如FGA。

(5)即使是采用基因克隆或全基因合成获得全部等位基因的克隆后，一个更为复杂的流程是如何对数百个等位基因进行等量混合。在进行质粒混合时，不同等位基因质粒模板的微小差异经PCR扩增后也会导致得到的PCR产物中各个等位基因产量的显著偏差(如CN105886497A附图所见)。

(6)而如果采用单个等位基因克隆饱和PCR扩增后，不同等位基因PCR 产物纯化、定量再混合的方案，虽然可以减少allele ladder中不同等位基因片段含量的显著偏差，但由于这个过程中的工作量巨大，这个混合过程对于生产环境的影响(主要是PCR产物的污染可能)也是不容久忽视的问题。

针对以上存在的问题，在任何一个多重STR基因座分型试剂盒的研制与生产过程中，均需要一种更为简便的、成本更低的STR基因座allele ladder的制备技术。

发明内容

为了克服现有技术中多重STR分型试剂盒研制与生产过程中allele ladder制备中存在的问题，本发明提供一种全新的allele ladder的制备方法，该STR基因为设有核心重复单元为[repeat]n-m的一个STR，人群中最低重复次数为n(n>＝4)，最大重复次数为m，并依据基因组参考序列设计其扩增引物及质粒。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

本发明的第一个目的是一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其包括如下步骤：

(1)根据STR基因座设计并合成引物及质粒；

(2)采用引物，以质粒作为扩增模板，进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增产物进行纯化，适当稀释后获得STR等位基因阶梯；

其中，所述步骤(1)中的质粒包括如下所示的结构：

其中，根据STR基因组参考序列设计扩增引物：正向引物F、反向引物R 及长引物FPx；

repeat及P均表示核心重复结构域中的核心重复单元；

F为正向引物F对应的DNA片段；

b5为正向引物F与重复结构域间的侧翼序列；

Rc为反向引物R的反向互补序列对应的DNA片段；

b3为核心重复结构域与Rc间的侧翼序列；

虚线所示为质粒骨架序列；

长引物FPx中P的重复单元数为x：

当核心重复单元中的碱基数为4时：x可取值为4，5或6，

当核心重复单元中的碱基数为5时：x可取值为3，4或5；

repeat的重复单元数为z：

z＝y+x-1；其中，y为STR等位基因阶梯需包含的DNA片段数， y＝(m+1)-(n-1)+1＝m-n+3，n：核心重复结构域中的最小重复次数，m：核心重复结构域中的最大重复次数；

b5+b3序列中需随机散在插入的重复单元数：k＝m-z+1。

为了进一步优化上述制备方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述制备方法还包括多个STR基因座的总的等位基因阶梯的制备：其对每一STR基因均采用步骤(1)和步骤(2)获得每一STR基因座的扩增产物，对每一扩增产物进行纯化、定量，并进行浓度均一化，均一化后进行等份混合，适当稀释后获得总的等位基因阶梯。

进一步地，在步骤(2)中，正向引物F与反向引物R的工作浓度为常规PCR 反应的工作浓度，即200-500nmol/L，长引物FPx的工作浓度为正向引物F工作浓度的1/100至1/500；质粒的工作浓度为1×10⁵拷贝/μL至1×10⁹拷贝/μL。

进一步地，PCR扩增反应的条件为：先将退火温度设置在35-55度，共进行 8-16个循环，随后再以F与R引物设计退火温度进行PCR反应，总PCR循环数35-45。

进一步地，PCR扩增产物的稀释倍数为100-10000倍。

进一步地，所述STR基因座为D13S317基因座，P的重复单元数x为4，repeat 的重复单元数z为16，b5+b3序列中需随机散在插入的重复单元数为0；

其中，正向引物F序列如SEQ ID No.1所示，反向引物R序列如SEQ ID No. 2所示，反向互补序列Rc如SEQ ID No.3所示，b5序列如SEQ ID No.4所示， b3序列如SEQ ID No.5所示，引物FP4序列如SEQ ID No.6所示，质粒包含如 SEQ ID No.7所示的序列。

进一步地，正向引物F的5'末尾添加三碱基修饰，反向引物R的5'端采用荧光素修饰。更进一步地，所述三碱基修饰为ATT，所述荧光素修饰为FAM、HEX、 JOE、VIC、NED、TAMRA、ROX等。

进一步地，所述PCR扩增的热循环条件为：95℃15min，1个循环；94℃45s、 45℃60s、72℃60s，10个循环；94℃45s-、62℃60s、72℃60s，30个循环； 60℃30min，1个循环。

进一步地，以D13S317基因座为例通过下述内容显示本发明提出的allele ladder制备方案：

已知STR基因座D13S317的核心重复结构为：[TATC]_5-15，即通过大样本调查已知D13S317在人群中最短的等位基因为TATC重复5次，最长的为TATC 重复15次。则在制备D13S317的allele ladder时，为保证allele ladder的冗余，所包含的最短等位基因应至少比调查所得到的最小等位基因少1个重复，比所调查所得最大等位基因多1个重复，因而预期制备的D13S317的allele ladder应至少包括等位基因4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16共13个等位基因片段。

对上述结构A和B的解释如下：

依据D13S317基因座的参考序列(Hg19)设计该基因座重复结构域的PCR 扩增引物F和R，其中一条标记荧光素。

A所示结构即为采用PCR扩增引物F与R扩增人基因组DNA时所得到的不同等位基因正链结构的统一表达式。其中F即为正向引物序列对应的DNA片段，Rc为反向引物R的反向互补序列对应的DNA片段，b5为重复结构域5'端至F的3'端间的侧翼序列，b3为重复结构域3'端至Rc的5'端间的侧翼序列。

B所示结构为依据本发明方案所设计的D13S137人工合成质粒的结构。其中，相较于A结构，重复结构域移至5'起始端，b5与b3序列连接后接于重复结构序列3'端，b3的3'端连接引物R的反向互补序列Rc。虚线所示为质粒的骨架序列。

B所示结构同时说明了本发明方案的工作原理。在本发明方案中有三条PCR 引物参与D13S317的allele ladder的制备。正向引物F，反向引物R，正向引物 F与P4引物共同组合的长引物FP4。其中，P4为4个核心重复单元组成的DNA 片段，即P4＝TATCTATCTATCTATC。FP4引物通过P4段在重复结构域随机结合， 16个连续的重复单元共有13个不同的P4结合位置且每一个结合位置相差一个重复单元。FP4与R的扩增DNA片段最短包含4个重复单元，最长包含16个重复单元，且5'端均带有正向引物F的序列。随后FP4与R的扩增产物在F与R 的共同作用下扩增得到包含不同重复单元数的DNA片段，此即allele ladder。

采用常规PCR纯化试剂盒对扩增产物进行纯化后稀释至100-10000倍即得到包含该STR基因座13个等位基因片段的allele ladder。

本发明的第二个目的是提供一种由任一上述的制备方法制得的的短串联重复序列等位基因阶梯。

本发明的第三个目的是一种含有上述短串联重复序列等位基因阶梯的试剂盒。进一步地，该试剂盒还包括扩增引物、PCR反应各组分等。

可理解的是，上述引物及质粒的合成可根据本领域的常规方法制备。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

1)采用本发明提供的方案进行allele ladder制备，不再需要对每一个等位基因片段进行单独制备，只需要采用一次PCR反应即可得到该STR基因座所需要的全部等位基因片段，大大节约了研究的周期与成本。

2)采用本发明所提供的方案进行allele ladder制备，对于单个STR基因座而言，不再需要传统方案中对每一个等位基因片段或质粒进行纯化、定量、混合，因为依据本发明所提供方案，一次PCR反应得到的即为该STR基因座所需要的全部等位基因片段的混合物，且各片段由于采用的是同一对引物、在同一反应体系中PCR扩增所得，各片段浓度均衡性无需特别调整，大大节约了生产中的工作量以及生产成本，也大大节约了人力成本与时间成本。

3)采用本发明所提供的方案，所得到的等位基因片段不仅与传统方法得到的相同等位基因片段的长度相等，碱基构成也完全一致，核心重复单元数也一致。其差异仅在于核心重复结构域在DNA片段中所处的位置不同，而这一差别并不影响相同等位基因片段在毛细管电泳时电泳长度呈现。

附图说明

图1为本发明一实施例中D13S317基因座allele ladder毛细管电泳验证结果的示意图。

具体实施方式

本发明涉及一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其包括如下步骤：(1)根据STR基因座设计并合成引物及质粒；(2)采用引物，以质粒作为扩增模板，进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行纯化，适当稀释后获得STR等位基因阶梯；其中，下述结构式为本发明提出的制备STR基因座 allele ladder的人工合成质粒的一般结构式：

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例以D13S317为例进行制备STR基因座allele ladder。

(1)D13S317基因座allele ladder质粒的设计

在The Genome Browser数据库中(http://genome.ucsc.edu/，选择人类基因组参考序列版本为Hg19)，得到D13S317基因座以核心重复序列为中心的1000bp 的参考序列如下，其核心重复序列以阴影显示。

>D13S317_Hg19

核心重复序列上游下划线处为正向引物F的序列，下游为反向引物R的反向互补序列Rc。

以该参考序列设计D13S317基因座PCR扩增的正向引物F和反向引物R，其中正向扩增引物f与反向扩增引物r的序列分别为：

F＝ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA(SEQ ID No.1)

R＝GGCAGCCCAAAAAGACAGA(SEQ ID No.2)

反向引物R的反向互补序列RC为：

Rc＝TCTGTCTTTTTGGGCTGCC(SEQ ID No.3)

因此，可以得到b5和b3的序列分别为：

b5＝GAGTTCATTTCTTTAGTGGGCATCCGTGACTCTCTGGACTCTGACC CATCTAACGCCTATCTGTATTTACAAATACAT(SEQ ID No.4)；

b3＝AATCAATCATCTATCTATCTTTCTG(SEQ ID No.5)；

已知人群中D13S317最小等位基因n＝5，最大等位基因m＝15，则allele ladder设计包含片段数：y＝15-5+3＝13

取x＝4，则z＝13+4-1＝16

在b5+b3序列中需要随机散在插入的重复单元数：k＝15-16+1＝0。

据此可以得到制备D13S317基因座allele ladder的人工合成质粒的结构式所含序列(SEQ ID No.7)如下所示：

方框所示为16个核心重复单元，下线部分为b3序列，b3序列之后为Rc序列，b3序列之前为b5序列。虚线所示为质粒骨架序列。

(2)D13S317基因座allele ladder质粒合成与引物合成

委托第三方公司依据(1)中所述的序列合成D13S317基因座质粒并合成如下PCR扩增引物，其中正向引物F的5'末尾添加ATT三碱基修饰，反向引物R 的5'端采用ROX荧光素修饰。长引物FP4中下划线部分为4个核心重复单元所组成的p4。

F＝ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA(SEQ ID No.1)

R＝ROX-GGCAGCCCAAAAAGACAGA(SEQ ID No.2)

FP4＝ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGATATCTATCTATCTATC(SEQ ID No.6)

(3)D13S317基因座allele ladder制备

1.PCR扩增体系

质粒合成后，依据质粒的分子量，采用TE缓冲液稀释到2.85×10⁵拷贝/μL，作为PCR扩增的模板。采用以下体系进行PCR扩增(表1)：

表1-allele ladder的PCR扩增体系

反应组份	体积(μL)
		PCR缓冲液(10x)	3.0
TaqDNA聚合酶(5U/μL)	0.5
		正向引物F(5M)	2.0
反向引物R(5M)	2.0
		长引物FP4(0.5M)	2.0
质粒(2.85×10<sup>5</sup>拷贝/μL)	1.0
		ddH<sub>2</sub>O	19.5
总反应体系	30.0

2.PCR扩增的热循环条件(表2)：

表2-allele ladder的PCR热循环条件

3.PCR产物纯化与稀释：

采用商品化的PCR扩增产物纯化试剂盒，依据纯化试剂盒说明书对PCR产物进行纯化。纯化后产物采用TE稀释1000倍备用。

实施例2

本实施例为实施例1制备的D13S317基因座等位基因阶梯的有效性验证。

随机选择5例浓度为3ng/μL的人基因组DNA样本，采用下述PCR反应体系进行扩增(表3)：

表3-样本D13S317基因座PCR扩增体系

反应组份	体积(μL)
		PCR缓冲液(10x)	2.0
TaqDNA聚合酶(5U/μL)	0.5
		正向引物F(5M)	1.0
反向引物R(5M)	1.0
		人基因组DNA(3ng/μL)	1.0
ddH<sub>2</sub>O	14.5
		总反应体系	20.0

采用以下热循环条件进行扩增(表4)：

表4-样本D13S317基因座PCR热循环条件

采用毛细管电泳对制备的D13S317基因座allele ladder的有效性进行验证。

采用AB公司的LIZ500内标和Hi-Di以及3500Dx遗传分析仪和POP7胶 /50cm毛细管进行毛细管电泳。96孔板每孔中加入Hi-Di 9μL，LIZ500内标0.5μL，人基因组DNA扩增产物1μL或allele ladder稀释液1μL。按微卫星毛细管电泳推荐条件进行电泳。电泳结果采用GeneMaper 3.0软件进行分析。分析结果见图1。图1中第1行即为实施例所制备的D13S317基因座包含13个目标等位基因片段的allele ladder毛细管电泳结果。第2行-第6行为5个随机样本的采用与allele ladder制备用引物扩增产物同时毛细管电泳的结果。数据分析见表5。

表5-allele ladder与样本扩增的电泳结果

从图1中可以看到，D13S317基因座allele ladder期望的13个等位基因片段均扩增良好，峰高相对均衡。可用作D13S317基因座的allele ladder。

由表5可知，5例随机样本共出峰8个，8个出峰片段与相应的allele ladder 电泳长度的偏差，最大为0.19，均值为0.02，均远小于0.5的极限要求，表明采用本方案所制备的DNA片段组合可用作D13S317的allele ladder。

由上述实施例可知，以D13S317基因座为例，仅需要合成1个质粒、1次 PCR反应，对PCR产物进行纯化稀释后即可得到相应STR基因座的allele ladder，大大简化了STR基因座allele ladder的制备流程、制备的人力成本、时间成本与经济成本。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海晶准生物医药有限公司

<120> 一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

<130> IPI190691

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 正向引物F(Artificial Sequence)

<400> 1

attacagaag tctgggatgt ggagga 26

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 反向引物R(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcagcccaa aaagacaga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 反向互补序列Rc(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgtctttt tgggctgcc 19

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> b5序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagttcattt ctttagtggg catccgtgac tctctggact ctgacccatc taacgcctat 60

ctgtatttac aaatacat 78

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> b3序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatcaatcat ctatctatct ttctg 25

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 长引物FP4(Artificial Sequence)

<400> 6

attacagaag tctgggatgt ggaggatatc tatctatcta tc 42

<210> 7

<211> 186

<212> DNA

<213> 质粒所含序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc 60

tatcgagttc atttctttag tgggcatccg tgactctctg gactctgacc catctaacgc 120

ctatctgtat ttacaaatac ataatcaatc atctatctat ctttctgtct gtctttttgg 180

gctgcc 186

Claims

1.一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据STR基因座设计并合成引物及质粒；

(2)采用引物，以质粒作为扩增模板，进行PCR扩增反应；

其中，所述步骤(1)中的质粒包括如下所示的结构：

其中，根据STR基因组参考序列设计扩增引物：正向引物F、反向引物R及长引物FPx；

repeat及P均表示核心重复结构域中的核心重复单元；

F为正向引物F对应的DNA片段；

b5为正向引物F与重复结构域间的侧翼序列；

Rc为反向引物R的反向互补序列对应的DNA片段；

b3为核心重复结构域与Rc间的侧翼序列；

虚线所示为质粒骨架序列；

长引物FPx中P的重复单元数为x：

当核心重复单元中的碱基数为4时：x可取值为4，5或6，

当核心重复单元中的碱基数为5时：x可取值为3，4或5；

repeat的重复单元数为z：

z＝y+x-1；其中，y为STR等位基因阶梯需包含的DNA片段数，y＝(m+1)-(n-1)+1＝m-n+3，n：核心重复结构域中的最小重复次数，m：核心重复结构域中的最大重复次数；

b5+b3序列中需随机散在插入的重复单元数k＝m-z+1。

2.根据权利要求1所述的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括多个STR基因座的总的等位基因阶梯的制备：其对每一STR基因均采用步骤(1)和步骤(2)获得每一STR基因座的扩增产物，对每一扩增产物进行纯化、定量，并进行浓度均一化，均一化后进行等份混合，适当稀释后获得总的等位基因阶梯。

3.根据权利要求1所述的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，正向引物F与反向引物R的工作浓度为200-500nmol/L，长引物FPx的工作浓度为正向引物F工作浓度的1/100至1/500；质粒的工作浓度为1×10⁵拷贝/μL至1×10⁹拷贝/μL。

4.根据权利要求1所述的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应的条件为：先将退火温度设置在35-55度，共进行8-16个循环，随后再以F与R引物设计退火温度进行PCR反应，总PCR循环数35-45。

5.根据权利要求1所述的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，PCR扩增产物的稀释倍数为100-10000倍。

6.根据权利要求1所述的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，所述STR基因座为D13S317基因座，P的重复单元数x为4，repeat的重复单元数z为16，b5+b3序列中需随机散在插入的重复单元数为0；

其中，正向引物F序列如SEQ ID No.1所示，反向引物R序列如SEQ ID No.2所示，反向互补序列Rc如SEQ ID No.3所示，b5序列如SEQ ID No.4所示，b3序列如SEQ ID No.5所示，引物FP4序列如SEQ ID No.6所示，质粒包含如SEQ ID No.7所示的序列。

7.根据权利要求6所述的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，正向引物F的5'末尾添加三碱基修饰，反向引物R的5'端采用荧光素修饰。

8.根据权利要求6所述的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增的热循环条件为：95℃ 15min，1个循环；94℃ 45s、45℃ 60s、72℃ 60s，10个循环；94℃ 45s、62℃ 60s、72℃ 60s，30个循环；60℃ 30min，1个循环。

9.一种由权利要求1～8中任一项所述的制备方法制得的的短串联重复序列等位基因阶梯。

10.一种含有权利要求9所述的短串联重复序列等位基因阶梯的试剂盒。