CN113322310A

CN113322310A - 一种新的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

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Publication number: CN113322310A
Application number: CN202011507658.3A
Authority: CN
Inventors: 李湘萍; 胡博; 谢龙旭; 李烈军; 邱美兰
Original assignee: Beijing Kaipu Medical Laboratory Co ltd; Hybribio Ltd; Guangzhou Kaipu Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Kaipu Medical Laboratory Co ltd; Hybribio Ltd; Guangzhou Kaipu Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN113322310B

Abstract

本发明公开了一种新的短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)等位基因阶梯的制备方法。该方法主要根据基因座上的STR信息设计并合成PCR扩增引物和质粒，以合成的质粒作为PCR扩增模板，把同一基因座的所有等位基因进行一管扩增，再根据差异情况进行分组扩增，最后进行纯化和适当稀释后获得制备好的短串联重复序列等位基因阶梯。本发明实现了用较少的PCR反应次数得到均衡性较好的等位基因阶梯的目的，可保证每个等位基因片段产物量的均衡而无需进行特别调整，节省了制备过程中的生产成本、人力成本和时间成本，大大提高了工作效率。

Description

一种新的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

技术领域

本发明属于基因检测技术、基因工程领域，更具体地，涉及一种新的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法。

背景技术

短串联重复序列(Short Tandem Repeats,STR)是由2-6bp重复单位构成的核心序列，是一种广泛分布在人类基因组中的DNA片段，主要由核心重复序列拷贝数的变化产生长度多态性，遵循孟德尔遗传规律，遗传稳定，是目前普遍应用的遗传标记，被广泛地应用在遗传学、法医学、临床医学、肿瘤学、基因诊断中的个体识别、亲权鉴定、肿瘤诊断等领域。

STR在法医学个体识别和亲权鉴定中，最常用的方法是先通过PCR扩增STR基因座，再通过毛细管电泳平台对不同大小的片段进行分离，最后样品峰与标准参照物比对确定等位基因，在这个过程中实现准确分型的标准参照物就是等位基因阶梯，由此可见，等位基因阶梯在STR最终分型结果判读中具有重要作用。

国内已有的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法一般有以下几种：

(1)从人的有核细胞中提取DNA，根据STR基因座设计并合成PCR扩增引物,用PCR方法扩增STR基因座，通过大量样本来筛选寻找各基因座的等位基因型，对各基因座的等位基因片段进行序列分析，测定各片段的碱基数和串联单位数，以获得不同等位基因型的DNA样本或扩增产物，对不同等位基因型的DNA样本进行混合，以混合的DNA样本作为扩增模板，采用相应的PCR引物进行PCR扩增，对扩增的产物进行纯化定量得到等位基因阶梯。

(2)从人有核细胞中提取DNA，用PCR方法扩增STR基因座以得到各基因座对应的等位基因型，对不同等位基因的PCR产物进行基因克隆以获得每一个等位基因对应的质粒，或者采用全基因合成得到各基因座所有等位基因对应的质粒。将具有不同等位基因的质粒进行等量混合，以混合质粒为扩增模板，采用相应的PCR引物进行PCR扩增，对扩增的产物进行纯化定量得到等位基因阶梯。

(3)或者以上述(2)的DNA样本或质粒为模板，采用相应的PCR引物对单个等位基因进行扩增，对PCR扩增产物进行纯化定量后混合各个等位基因得到STR基因座的等位基因阶梯。

(4)又或者将上述的扩增产物为模板进行稀释后再次进行PCR扩增，以第二次扩增的产物为STR基因座的等位基因阶梯。

上述制备方案的缺点主要体现在：

采用上述方案制备等位基因阶梯，从人有核细胞中提取DNA进行扩增，提取样本过程不仅繁琐、工作量大，还会出现部分等位基因难以收集齐全的情况，且还需要对大量样本进行筛选，这个过程费时费力，不适合大批量生产。而且为了生产能够延续下去，需要一直收集DNA样本，不同模板的质量差异会使不同批次的等位基因出现质量差异。采用样本DNA或质粒作为模板对单个等位基因进行扩增后对产物进行纯化定量混合，则需要对两、三百个片段进行几百次扩增，工作量过大，不同等位基因间的微小差异经过扩增后会出现显著差异，难以准确进行定量混合，而准确定量混合难度大且麻烦，造成不同等位基因间均衡性较差，同时对生产车间的环境要求高。而全部等位基因一起扩增虽然可以大大减少工作量，扩增过程中片段较短的可以得到较好的扩增，但是长片段的产物不容易等量扩增，使扩增产物的量差异较大，甚至有少数等位基因无扩增产物，造成最终制备的等位基因阶梯的各个等位基因均衡性差。

为解决上述制备等位基因阶梯方法的不足，专利CN110229871A公开了“一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法”，该发明所提供的技术方案虽说通用于所有的基因座，但有可能会改变等位基因的序列，导致制得的等位基因片段的核心重复结构域和DNA片段中所处的位置不同，其特异性和专属性差；且考虑引物的效率和随机结合的过程，基因座的等位基因不一定能够全部均衡扩增出来。目前，缺少一种既能提高工作效率又能保证等位基因序列准确、齐全以及具备良好的均衡性和专属性的等位基因阶梯制备方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中等位基因阶梯制备方法的不足与缺陷，提供一种新的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法。采用本发明方法制备得到的等位基因阶梯均衡性好，性能稳定，纯度高，易于批量生产。

本发明的第一个目的是提供一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法。

本发明的第二个目的是提供由上述等位基因阶梯制备方法制备的短串联重复序列等位基因阶梯。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明提供一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，该方法在PCR反应时，先把所有等位基因进行一管扩增，再根据差异情况进行分组扩增，既减少了PCR反应次数，又保证各个基因座等位基因阶梯保持均衡，大大节省了人力物力和时间。

因此，本发明要求保护一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，包括以下步骤：

S1.设计并制备扩增基因座上的短串联重复序列的引物，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的5’端采用荧光基团标记；

S2.制备含有目的片段的质粒，所述目的片段由步骤S1所述引物扩增，各目的片段分别含有基因座上不同的等位基因；

S3.以步骤S1的引物PCR扩增步骤S2的质粒，进行毛细管电泳，检测带有不同等位基因的质粒的扩增产物的荧光信号强度；

S4.根据荧光信号强度值，对步骤S2的质粒进行分组：

(1)取步骤S3质粒的PCR扩增产物的最大的荧光信号强度值FSI_max-1，将扩增产物的荧光信号强度值在FSI_max-1×(84％～95％)～FSI_max-1范围内的质粒分为一组；

(2)再取其余未分组质粒的扩增产物的最大的荧光信号强度值FSI_max-2，将扩增产物的荧光信号强度值在FSI_max-2×(84％～95％)～FSI_max-2范围内的质粒另分为一组；

(3)重复上一步骤，直至所有质粒都被分组；

(4)分别混合各组内的质粒，各质粒等量添加；

S5.以步骤S4分组后的各组质粒作为模板，以步骤S1的引物进行PCR扩增，进行毛细管电泳，检测各质粒的扩增产物的荧光信号强度值；

S6.确定各组质粒的扩增产物在该基因座短串联重复序列等位基因阶梯中的份数：

(1)当该组只有一种质粒，则该组的扩增产物在短串联重复序列等位基因阶梯中的份数为组内质粒的扩增产物的荧光信号强度值的倒数；

(2)当该组多于一种质粒，则该组的扩增产物在短串联重复序列等位基因阶梯中的份数为组内各质粒的扩增产物的荧光信号强度值倒数的平均数；

S7.按照步骤S6的份数混合各组扩增产物，即得到短串联重复序列等位基因阶梯。

优选地，所述不同的等位基因为基因座上不同重复数的核心重复单元。

优选地，步骤S1所述荧光染料为6’-FAM、VIC、NED或PET之一。

优选地，步骤S4(4)中，分别混合各组内的质粒，当组内只有一种质粒时，质粒的添加量为48～51pg，当组内有多于一种质粒时，组内各质粒等量添加48～51pg。

优选地，步骤S3和S5所述引物的终浓度为0.09～1.2μM。

更优选地，步骤S3和S5所述PCR扩增的体系为：含15mM MgCl₂的10×PCR Buffer 3μL，25mMMgCl₂0.12μL，25mM dNTP mix0.24μL，上述引物，5U/μL HotStarTaq DNAPolymerase 0.432μL，每个质粒48pg，ddH₂O补足30μL。

更优选地，步骤S3和S5所述PCR扩增的热循环程序为：95℃15min；94℃45s，60℃45s，72℃1min，30个循环；72℃30min；4℃保存。

优选地，步骤S7所述的短串联重复序列等位基因阶梯还进行纯化和稀释。

更优选地，所述纯化的方法为磁珠纯化。

更优选地，将制备得到的短串联重复序列等位基因阶梯用缓冲液稀释10～20倍。

更优选地，将制备得到的短串联重复序列等位基因阶梯用TE缓冲液稀释20倍。

优选地，步骤S1所述基因座为D16S539、D7S820、D22S1045、Penta E、D1S1677、D17S1301、D13S317、vWA、D18S51、TH01、CSF1PO、D14S1434、D19S433、FGA、D20S482、D5S818、D3S1358、D6S1043、TPOX、D9S1122、D8S1179、D10S1435、Penta D或Amelogenin之一。

更优选地，所述短串联重复序列等位基因阶梯的核心重复单元包括三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列和五核苷酸重复序列。

因此，本发明还要求保护一种由以上任一所述等位基因阶梯制备方法所制备的短串联重复序列等位基因阶梯。

同时，一种含有上述短串联重复序列等位基因阶梯的试剂盒也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用全基因合成质粒得到的等位基因片段核心重复单元数一致、序列准确，可以保证所有等位基因齐全，避免部分少见等位基因缺乏，大大节省时间和人力，同时避免不同批次的模板质量差异，适于批量生产。

(2)在PCR反应时，先把所有等位基因进行一管扩增，再根据荧光强度值的差异情况进行分组扩增，既减少了每个基因座需要进行的PCR反应次数，同时又保证各等位基因片段产物量的均衡，避免了各等位基因片段产物量相差较大、均衡性差的问题，操作简便，节省人力物力。

(3)无需对均衡性进行特别的调整，得到的等位基因阶梯纯度高，性能保持稳定，实现了用较少的PCR反应数得到均衡性较好的等位基因阶梯的目的，均衡性差异在20％以内；避免了把所有等位基因进行扩增时，片段较短的得到较好的扩增，而长片段的产物不容易等量扩增，甚至有少数等位基因无扩增产物，使扩增产物的量差异较大，造成最终制备的等位基因阶梯的各个等位基因均衡性差的问题。

(4)避免了传统方法采用单个片段进行扩增的繁琐过程，缩短生产周期，也避免了扩增后对数百个片段定量混合的复杂过程，节省了制备过程中的生产成本、人力成本和时间成本，大大提高了工作效率。

附图说明

图1为实施例1中vWA基因座制备的等位基因阶梯的毛细管电泳图谱。

图2为实施例2中D7S820基因座制备的等位基因阶梯的毛细管电泳图谱。

图3为实施例3中D8S1179基因座制备的等位基因阶梯的毛细管电泳图谱。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1以vWA基因座为例制备等位基因阶梯

一、实验方法

1、根据vWA基因座的参考序列设计并合成PCR扩增引物，参考序列如SEQ ID NO：1所示。

引物包括正向引物F和反向引物R；其中，正向引物F的5’端采用VIC荧光染料进行修饰。引物序列如下：

正向引物F：5’-TGACTTGGCTGAGATGTG-3’；

反向引物R：5’-GGTTAGATAGAGATAGGACAGA-3’。

2、根据vWA基因座的参考序列设计等位基因序列，并委托第三方公司根据设计的序列进行质粒的合成。根据vWA基因座总共合成13个质粒，核心单元[TCTA]重复数分别为：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22。

3、质粒合成后，采用TE缓冲液将其稀释至100ng/μL，然后用Tris-HCl稀释至40pg/μL作为扩增模板。PCR扩增时，先把13个质粒进行一管扩增，再进行毛细管电泳，得到各个含有不同重复数质粒的扩增产物的荧光信号强度数值FSI(Fluorescence signalintensity)，如表1所示：

表1各个重复数的荧光信号强度数值

4、根据各个等位基因扩增产物的差异情况，选取扩增产物的最大的荧光信号强度值FSI(Fluorescence signal intensity)_max，将扩增产物的荧光信号强度值在FSI_max×(84％～95％)～FSI_max范围内的质粒分为一组：

(1)从表1中选取扩增产物的最大的荧光信号强度值FSI_max-1＝5127RFU，计算在84％差异内的荧光信号强度值范围：5127×84％＝4306.68，将荧光信号强度值在4306.68～5127范围内的质粒分为一组，在此范围内的荧光信号强度数值只有重复数为10，因此将重复数为10的质粒单独分为一组；

(2)继续选取表1未分组中剩下数值中的最大的荧光信号强度值FSI_max-2＝4161RFU，计算在84％差异内的荧光信号强度值范围：4161×84％＝3495.24，将荧光信号强度值在3495.24～4161范围内的质粒分为一组，在此范围内的荧光信号强度数值有重复数为11和12，因此将重复数为11和12的质粒分为一组；

(3)继续选取表1未分组中剩下数值中的最大的荧光信号强度值FSI_max-3＝3179RFU，计算在84％差异内的荧光信号强度值范围：3179×84％＝2670.36，将荧光信号强度值在2670.36～3179范围内的质粒分为一组，在此范围内的荧光信号强度数值有重复数为13、15和16，因此将重复数为13、15和16的质粒分为一组；

(4)再继续选取表1未分组中剩下数值中的最大的荧光信号强度值FSI_max-3＝2452RFU，计算在84％差异内的荧光信号强度值范围：2452×84％＝2059.68，将荧光信号强度值在2059.68～2452范围内的质粒分为一组，在此范围内的荧光信号强度数值有重复数为14、17、18、19、20；再进一步计算在95％差异内的荧光信号强度值范围：2452×95％＝2329.4，将荧光信号强度值在2329.4～2452范围内的质粒另分为一组，在此范围内的荧光信号强度数值有重复数为14、17、18，因此将重复数为14、17、18的质粒分为一组，重复数为19、20的质粒分为一组；

(5)再继续选取表1未分组中剩下数值中的最大的荧光信号强度值FSI_max-3＝2001RFU，计算在84％差异内的荧光信号强度值范围：2001×84％＝1680.84，将荧光信号强度值在1680.84～2001范围内的质粒分为一组，在此范围内的荧光信号强度数值只有重复数为21，因此将重复数为21的质粒分为一组，最后将单独剩下重复数为22的质粒分为一组。

将质粒全部分组，经过优化最终分为10；11、12；13、15、16；14、17、18；19、20；21；22，共七组产物进行分组扩增，其中每组内的质粒以每个48pg等量添加，具体PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增的热循环程序如下：

6、PCR分组扩增完成后，扩增产物包括核心单元重复数分别为10；11、12；13、15、16；14、17、18；19、20；21；22的7种产物，每组产物中取2μl用TE缓冲液稀释20倍，将产物混合后再上机进行毛细管电泳，得到各个重复数扩增产物的荧光信号强度数值，如表2所示：

表2.分组扩增稀释后的各个重复数扩增产物的荧光信号强度数值

按照得到的荧光信号强度数值，确定各组质粒的扩增产物在该基因座短串联重复序列等位基因阶梯中混合的份数；每组扩增产物混合的份数计算方法为：

(1)当该组只有一种质粒，则该组质粒在短串联重复序列等位基因阶梯中的体积份数为扩增产物的荧光信号强度值的倒数：重复数为10的一组扩增产物的份数比例为1/1415＝0.000707；重复数为21的一组扩增产物的份数比例为1/1225＝0.000816，重复数为22的一组扩增产物的份数比例为1/1087＝0.000920；。

(2)当该组有不止一种质粒，则该组质粒在短串联重复序列等位基因阶梯中的体积份数为组内各质粒扩增产物的荧光信号强度值的倒数的平均数：重复数为11、12的一组扩增产物的份数比例为(1/718+1/730)/2＝0.00208；重复数为13、15、16的一组扩增产物的份数比例为(1/517+1/487+1/470)/3＝0.00204；重复数为14、17、18的一组扩增产物的份数比例为(1/504+1/467+1/509)/3＝0.00203；重复数19、20的一组扩增产物的份数比例为(1/697+1/709)/2＝0.00142；

7组扩增产物混合的体积份数换算为：10：11、12：13、15、16：14、17、18：19、20：21：22＝0.707：0.816：0.920：2.08：2.04：2.03：1.42，按该份数将7组扩增产物混合，混合后的产物采用磁珠按说明书进行纯化，纯化后的产物采用TE进行20倍稀释，即为vWA基因座制备好的短串联重复序列等位基因阶梯。

二、实验结果

实验结果如图1和表3所示，以vWA为例制备等位基因阶梯共有13个质粒，只需进行7次PCR扩增。PCR产物混合后进行磁珠纯化，再进行适当稀释就可以得到等位基因阶梯，以此方案制备的vWA等位基因阶梯均衡性较好，无需进行特别调整。本实施例中总共13个质粒，只需要进行7次PCR反应，最终把等位基因阶梯间的均衡性差异控制在15％以内，节省了制备过程中的生产成本、人力成本和时间成本，提高了工作效率。

表3.纯化稀释后各个等位基因的荧光信号强度和均衡性差异

实施例2以D7S820基因座为例制备等位基因阶梯

一、实验方法

1、根据D7S820基因座的参考序列设计并合成PCR扩增引物，参考序列如SEQ IDNO：2所示。

引物包括正向引物F和反向引物R；其中正向引物F的5’端采用FAM进行修饰。引物序列如下：

正向引物F：5’-CAGGCTGACTATGGAGTTAT-3’；

反向引物R：5’-ATCCTCATTGACAGAATTGC-3’。

2、根据D7S820基因座的参考序列设计等位基因序列，并委托第三方公司根据设计的序列进行质粒的合成。D7S820基因座总共合成12个质粒，核心单元[TCTA]重复数为：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。

3、质粒合成后，采用TE缓冲液将其稀释至100ng/μL，然后用Tris-HCl稀释至40pg/μL作为扩增模板。PCR扩增时，先把12个质粒进行一管扩增，再进行毛细管电泳，得到各个重复数的荧光信号强度数值如表4所示：

表4各个重复数的荧光信号强度数值

4、按照实施例1的方法，根据各个等位基因扩增产物的差异情况，选取扩增产物的最大的荧光信号强度值FSI_max，将扩增产物的荧光信号强度值在FSI_max×(84％～95％)～FSI_max范围内的质粒分为一组；经过计算最终分为5、6、7；8；9、10、15；11、14；12、13、16，共五组产物进行分组扩增，其中每组内的质粒以每个48pg等量添加，具体PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增的热循环程序如下：

6、PCR分组扩增完成后，扩增产物包括核心单元重复数分别为5、6、7；8；9、10、15；11、14；12、13、16的5组产物，每组产物中取2μl用TE缓冲液稀释20倍，将产物混合后再上机进行毛细管电泳，得到各个重复数扩增产物的荧光信号强度数值，如表5所示：

表5.分组扩增稀释后的各个重复数的荧光信号强度数值

按照实施例1的方法，计算每组扩增产物在该基因座短串联重复序列等位基因阶梯中混合的份数。各组扩增产物以计算出的体积份数进行产物混合，混合后的产物采用磁珠按说明书进行纯化，纯化后的产物采用TE进行20倍稀释，即为D7S820基因座制备好的等位基因阶梯。

二、实验结果

实验结果如图2和表6所示，以D7S820为例制备等位基因阶梯共有12个质粒，只需进行5次PCR扩增。PCR产物混合后进行磁珠纯化，再进行适当稀释就可以得到等位基因阶梯，以此方案制备的D7S820等位基因阶梯均衡性较好，无需进行特别调整。总共12个质粒，只需要进行5次PCR反应，最终把等位基因阶梯间的均衡性差异控制在15％以内，节省了制备过程中的生产成本、人力成本和时间成本，提高了工作效率。

表6.纯化稀释后各个等位基因的荧光信号强度和均衡性差异

实施例3以D8S1179基因座为例制备等位基因阶梯

一、实验方法

1、根据D8S1179基因座的参考序列设计并合成PCR扩增引物，参考序列如SEQ IDNO：3所示。

引物包括正向引物F和反向引物R；其中正向引物F的5’端采用PET荧光染料进行修饰。引物序列如下：

正向引物F：5’-CACGGCCTGGCAACTTATATG-3’；

反向引物R：5’-GGATGTGGAGAAACTGAAACCCT-3’。

2、根据D8S1179基因座的参考序列设计等位基因序列，并委托第三方公司根据设计的序列进行质粒的合成。D8S1179基因座总共合成13个质粒，核心单元[TCTA]重复数为：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。

3、质粒合成后，采用TE缓冲液将其稀释至100ng/μL，然后用Tris-HCl稀释至40pg/μL作为扩增模板PCR扩增时，先把12个质粒一管扩增，再进行毛细管电泳，得到各个重复数的荧光信号强度数值如表7所示：

表7各个重复数的荧光信号强度数值

4、按照实施例1的方法，按照实施例1的方法，根据各个等位基因扩增产物的差异情况，选取扩增产物的最大的荧光信号强度值FSI_max，将扩增产物的荧光信号强度值在FSI_max×(84％～95％)～FSI_max范围内的质粒分为一组；经过计算最终分为7；8、18；9、10；11；12、13；14、15；16、17、19，共七组产物进行分组扩增，其中每组内的质粒以每个48pg等量添加，具体PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增的热循环程序如下：

6、PCR分组扩增完成后，扩增产物包括核心单元重复数分别为7；8、18；9、10；11；12、13；14、15；16、17、19的7种产物，每组产物中取2μl用TE缓冲液稀释20倍，将产物混合后再上机进行毛细管电泳，得到各个重复数扩增产物的荧光信号强度数值，如表8所示：

表8.分组扩增稀释后的各个重复数的荧光信号强度数值

按照实施例1的方法，计算每组扩增产物在该基因座短串联重复序列等位基因阶梯中混合的份数。混合后的产物采用磁珠按说明书进行纯化，纯化后的产物采用TE进行20倍稀释，即为D8S1179基因座制备好的等位基因阶梯。

二、实验结果

实验结果如图3和表9所示，以D8S1179为例制备等位基因阶梯共有13个质粒，只需进行7次PCR扩增。PCR产物混合后进行磁珠纯化，再进行适当稀释就可以得到等位基因阶梯，以此方案制备的D8S1179等位基因阶梯均衡性较好，无需进行特别调整。总共13个质粒，只需要进行7次PCR反应，最终把等位基因阶梯间的均衡性差异控制在20％以内，节省了制备过程中的生产成本、人力成本和时间成本，提高了工作效率。

表9.纯化稀释后各个等位基因的荧光信号强度和均衡性差异

以上每一个实施例都是一个完整的技术方案。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广州凯普医药科技有限公司

北京凯普医学检验实验室有限公司

广东凯普生物科技股份有限公司

<120> 一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gtccgtgaat tcagagctga tggaattacg gttagcatgg caggaaatca ttagtgcctt 60

tgtcccagtc ctgtccagtg tgtttattgc ttgtacagat gaagacctaa agcacaggct 120

tgtacaattt gcagtgatgc agatattgaa gggagagcag atagatcagg ggacagtcca 180

aggaactaaa agaaaatcat ataatcggag aaacttattt gtactcatga aattgatcag 240

aaataaatag aagtcctgta ggggagggag atgtggcttg agaacaatta atgtaaagga 300

ggtcttagaa tgttagcagt agagagaact agagggatca tttacttcaa gcccctcatt 360

ttatagacat tactagtctc ctacaatgtg ccgggcactt tgcccttatt attttgtgaa 420

ctcctcagac tgatcctata aggtagagtt cccaccttcc agaagaagaa acaggtctag 480

aggatccaag ttgacttggc tgagatgtga aagccctagt ggatgataag aataatcagt 540

atgtgacttg gattgatcta tctgtctgtc tgtctgtctg tctatctatc tatctatcta 600

tctatctatc tatctatcta tctatccatc tatccatcca tcctatgtat ttatcatctg 660

tcctatctct atctaaccta tgtatctatt tatcatctat cctgtctcta tctatcctat 720

gtatctatca tctatcctat ctctatctaa gctatatatc tatttatcat ctatcctcta 780

tcatctatct atctatctat ctatctctat tgtatctagt tatctatcct atatctatgt 840

atgtatctat ctgtctgtct aatctatcta acctgtgtat ctatttataa tctatcctat 900

ctctatctaa cctatgtatc tatcatctat cctatctctg tctaacatat gtatctatca 960

tctatt 966

<210> 2

<211> 2277

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

aaaataaaaa aaaaaacctt catgttactt gctggccctg ataaattcat gacttcacat 60

tatcattaac tcagaaggtt taacgttttt catttttttt aaaagaaagg gactgcatat 120

tctgtccacc ttcccctctt tgtagaaact cagaactatc tgccactgta catagtacat 180

agtgaacagc cactttaaat tgtttaccaa ggtcttaaag gtaaaatatt cataaaatta 240

ttattcacat tttagtgctt aatacaatta tggtgatact aaaagattgt ttctacatct 300

acagaggcat ttcattctaa ctgttacatc ttgcaagaac agcaatttaa aaaaaaatct 360

ttttccgtac ctttttattt ttaagtaatt taaaagaagt agagtgatgt ttttggaagc 420

actgatcttt acaaatgtat ttctctccag gaaatattac acataaatcc tgtcaaatag 480

ctaaacaagt tagatgcaaa actcctacat aaagctctgt cattctaccc ttgacttact 540

tccaagagag ctaacatagt aattgtgggg gaaataaaat tagaacacca cctcttcata 600

ccagtagaga aaagctttcc aacattaagg caatttgcag ttggtgaagc atgctactta 660

atgatactat aattcaatca cagaataaac cataaaaaaa aatagttaga cccttagctc 720

ttgatgcagt ctcaggatta atgcttctta taatttgagg actggaaaga tccaattttg 780

ccattagttt tagaaaatga cttatatgct aactggatgt gaacaattgt gttctaatga 840

gcttaatatg agtttcataa tttgtgcatt ttgctgttaa aaagccagaa aacaaaacaa 900

aacaaaatac tgaaaccagt gtgaacaaga gttacacgat ggaaggcatc agttttcaca 960

ccagaaggaa taaaaacagg caaaaatacc ataagttgat cctcaaaata tgattgattt 1020

taagccttat gagataattg tgaggtctta aaatctgagg tatcaaaaac tcagagggaa 1080

tatatattct taagaattat aacgattcca catttatcct cattgacaga attgcaccaa 1140

atattggtaa ttaaatgttt actatagact atttagtgag ataaaaaaaa actatcaatc 1200

tgtctatcta tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatcgtta 1260

gttcgttcta aactatgaca agtgttctat catacccttt atatatatta accttaaaat 1320

aactccatag tcagcctgac caacatggtg aaaccccgtc tctaaaaaaa atacaaaaat 1380

tagctggatg cagtagcaca tgcctgtagt cccagctact caggaggctg gggcaggaga 1440

accacttgac ccaagaagcg gaggttgcag tgagccgaga tcgcaccact gcactccagc 1500

ctgggtgaca gagtgagact ccatctcaag ataaagaaat aaataaaaac aaacaaacaa 1560

aaaaattcca tagggggtca ggtgcggtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag 1620

gccgaagcag gtggatcact tgaggtagga gtctgagatc agcctggcca acatggtgaa 1680

accctgtctc tactaataat acaaaaaaat tacttggggg tggtggcatg tgcctgtaat 1740

cccaggtact tgggaggctg aggcaggaga attgcttgaa cccgggagga ggaggttgcg 1800

gtgagccgag atcccgccat tgcactccag cctgggcaac aagagtgaaa ctccatctca 1860

aaaaataaat aaataaataa aataaaataa ttccatagga taggtagtat tatttctact 1920

ttattgatag gaagacagga cccttatcac aactgcactt tctgtgagcc tcaacaggca 1980

tggtcaccag aattaggatg aaaggttgtt gttgcatgag tagaagagga taatactttt 2040

tatttaagaa ttttaaaatt taggccgggc gtggtgtctc atgcctgtaa tcccagcact 2100

ttgggaggcc gaggtgggct gatcacgagg tcaggagatg gagaccatcc tggctaacac 2160

ggtgaaaccc tgtctctact aataatgcaa aaattagcca ggtgttgtgg cgggctcctg 2220

taatcccagc tactcaggag gctgaggcag gagaatcact tgaacccggg aggtgga 2277

<210> 3

<211> 1173

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

ccaaatagct gggatcacag gcacgcacca ccgtgcccag ctagctaatt tttgtatttt 60

tagtagagac atggttttgc catgttggtc aggccggtct caaactcctg acctcaggtg 120

atccaaagtg gatcctcagc ctcccaaagt gctggaatta cagccgtgag ccaccgcacc 180

cagcctgtta ttactattac tatcattatt gctcctcctc ctcctatact acagcaagag 240

cgcttgaacc agatgtaggg gagatagcag ctggagagca taacagaggc actgacgtgt 300

gagcagctaa cgaggccttt tacaagacat ctgtgaccac acggccaagt agaagaaagc 360

cgttaaaagc atcaaggtag ttaggtaaag ctgagtctga agtaagtaaa acattgttac 420

aggatccttg gggtgtcgct tttctggcca gaaacctctg tagccagtgg cgcctttgcc 480

tgagttttgc tcaggcccac tgggctcttt ctgcccacac ggcctggcaa cttatatgta 540

tttttgtatt tcatgtgtac attcgtatct atctatctgt ctatctatct atctatctat 600

ctatctatct atctatctat ctattcccca cagtgaaaat aatctacagg ataggtaaat 660

aaattaaggc atattcacgc aatgggatac gatacagtga tgaaaatgaa ctaattatag 720

ctacgtgaaa ctatactcat gaacacaatt tggtaaaaga aactggaaac aagaatacat 780

acggtttttg acagctgtac tattttacat tcccaacaac aatgcacagg gtttcagttt 840

ctccacatcc ttgtcaacat ttgttatttt ctgggttttt gataatagct gtgaaaggaa 900

aataaaaact tgggccgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc 960

aaggcgggca gatctcaagg tcgggagatt gagaccatcc tggctaacat ggtgaaaacc 1020

catctctact aaaaatacaa aaacaaaaaa ttagccgggc gtggtgacgg gcgcggtggc 1080

gggcgcgtgt agttccagct actcgggagg ctgaggcagg aaaatagcat caacccggga 1140

ggcggcgctt gcagtgagcc aagatcgcac cac 1173

Claims

1.一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4.根据荧光信号强度值，对步骤S2的质粒进行分组：

(3)重复上一步骤，直至所有质粒都被分组；

(4)分别混合各组内的质粒，各质粒等量添加；

2.根据权利要求1所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，步骤S1所述荧光基团为6’-FAM、VIC、NED或PET之一。

3.根据权利要求1所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，步骤S3和S5所述引物的终浓度为0.09～1.2μM。

4.根据权利要求3所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，步骤S3和S5所述PCR扩增的体系为：含15mM MgCl₂的10×PCR Buffer 3μL，25mMMgCl₂0.12μL，25mM dNTP mix0.24μL，权利要求3所述引物，5U/μL HotStarTaq DNA Polymerase 0.432μL，每个质粒48pg，ddH₂O补足30μL。

5.根据权利要求1所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，步骤S3和S5所述PCR扩增的热循环程序为：95℃15min；94℃45s，60℃45s，72℃1min，30个循环；72℃30min；4℃保存。

6.根据权利要求1所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，步骤S7所述的短串联重复序列等位基因阶梯进行纯化和稀释。

7.根据权利要求6所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为磁珠纯化。

8.根据权利要求4所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，将制备得到的短串联重复序列等位基因阶梯用缓冲液稀释10～20倍。

9.根据权利要求1所述等位基因阶梯的制备方法，其特征在于，所述基因座为D16S539、D7S820、D22S1045、Penta E、D1S1677、D17S1301、D13S317、vWA、D18S51、TH01、CSF1PO、D14S1434、D19S433、FGA、D20S482、D5S818、D3S1358、D6S1043、TPOX、D9S1122、D8S1179、D10S1435、Penta D或Amelogenin之一。

10.权利要求1～9中任一所述等位基因阶梯的制备方法所制备的短串联重复序列等位基因阶梯。