CN110218686A - 富硒螺旋藻的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供富硒螺旋藻的培养方法，属于微藻培养技术领域，包括，将对数期螺旋藻接种到含有硫代琥珀酸的pH值为7.0‑9.0、温度为20‑35℃的培养基中培养5‑10d；向培养基中分批补加亚硒酸钠，其中，以Se4+计硒量，亚硒酸钠的添加的量是每天每升培养基补入200‑500mg/L，连续补加2‑5d，第一次补加亚硒酸钠后置于LED下培养，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物。本发明能够培养方法能够抵抗硒毒性，促进螺旋藻的生长，提高螺旋藻对硒的吸收和富集，该培养方法获得硒产率≥1827.55μg/L、有机硒比率≥89.48％的富硒螺旋藻培养物，且藻体中含有较高的藻胆蛋白。

Description

富硒螺旋藻的培养方法
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，具体涉及富硒螺旋藻的培养方法。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)，也称节旋藻，是一种古老的低等水生植物，具原核多细胞型丝状的微藻，属于蓝藻门、蓝藻纲、颤藻目、螺旋藻属或节旋藻属，现在已发现约有35个种。螺旋藻通常是指可食用的极大螺旋藻和钝顶螺旋藻，这两个品种是被研究最多的品种，也是目前在世界各国广泛用于产业化的品种。螺旋藻因其藻体呈螺旋状而得名，藻体单列细胞排列而成，无分枝。螺旋藻大多数生活在淡水中，只有少量品种生活在海水中，而用于产业化生产的极大螺旋藻和钝顶螺旋藻则主要生活在碱性水域中。螺旋藻富含多种营养物质及生物活性物质，如蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物元素、藻蓝蛋白、藻多糖和β-胡萝卜素等，是目前所知营养成分最全面、最均衡的天然食品之一，医学研究表明，螺旋藻具有降低胆固醇、降低高脂血症、调节血糖、抗肿瘤、防癌抑癌、清除自由基、促进机体新陈代谢、激活免疫系统功能、抗疲劳、耐缺氧以及调整肠道菌群结构、改善微生态环境等重要的生理功能。因此，其被视为一种理想营养源和潜在的药源，是一种新型药食同源产品，应用前景非常广阔。
此外，螺旋藻是一种经济价值很高的微藻，它具有光合效率高、生长繁殖快和对环境适应性强等特点，且其工业化生产技术成熟，是对特定矿物元素进行生物富集及有机化的理想载体。以螺旋藻为生物载体，在培养液中添加含有特定矿物元素的原料化合物，通过螺旋藻对特定矿物元素的生物富集和转化作用，获得富含有特定矿物元素的功能螺旋藻。硒在人体和动物机体中以硒代半胱氨酸(SeCys)的形式参与构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，在体内起抗氧化作用，可以清除体内过多的活性氧自由基；外源硒可诱导GSH-Px活性的增加及过氧化氢酶的活性。当机体处于缺硒状态时，GSH-Px活性降低，引起脂质自由基和过氧化物的积累，导致细胞膜破坏、组织损伤。无机硒有-2、0、+2、+4、+6等多种价态形式，在自然条件下，藻类会优先摄取Se(IV)，而几乎不利用Se(VI)；Na2SeO3具有低毒性和较快的吸收转化速率，因此常作为培养富硒螺旋藻的无机硒源，实现螺旋藻对硒的富集和有机化。硒经过各种生化过程与蛋白质和多糖化合物结合形成含硒化合物从而影响螺旋藻的生长。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种能够抵抗硒毒性，促进螺旋藻的生长，提高螺旋藻对硒的吸收和富集的富硒螺旋藻的培养方法，该培养方法获得的螺旋藻藻体中含有较高的藻胆蛋白。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
富硒螺旋藻的培养方法，将对数期螺旋藻接种到含有硫代琥珀酸的培养基中培养，在所述培养过程中补加亚硒酸钠。当外加硒的质量浓度较低时，藻类的富集硒的能力随硒质量浓度增高而增大；而在硒质量浓度较高的条件下，当硒质量浓度增加时，藻类的富硒量则明显下降，因此外加硒的质量浓度过高或过低都不利于藻类对硒的富集，这是因为硒对藻类具有生长促进与毒性抑制的二重性，即硒是谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，可以通过SOD和POD的活性来促进螺旋藻抗氧化能力的提高，但是硒含量较高时会导致强氧化物质的生成，进而损害藻内正常的生理活动。培养基中硫代琥珀酸的存在一方面能够显著增加螺旋藻内源H2S含量，提高GSH水平，抑制硒导致的ROS产生，维持氧化平衡，减缓硒对细胞膜的氧化损伤，最终帮助螺旋藻细胞抵抗硒毒性，避免高硒对螺旋藻的抑制作用，促进螺旋藻的生长，同时有利于硒的有机螯合，提高螺旋藻对硒的吸收和富集，获得高富硒量螺旋藻；另一方面避免过多的硒元素过多地取代了机体蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸或蛋氨酸的硫元素，维持酶的活性，进而保持螺旋藻的正常生命活动；此外，还能提高螺旋藻藻体中藻胆蛋白的含量。
在一个实施方案中，培养基中硫代琥珀酸的终浓度为5-100ppm，优选5-80ppm，更优选10-50ppm，进一步优选15-35ppm。培养基中硫代琥珀酸的终浓度为5ppm表示在体积为1000升的培养基中加入硫代琥珀酸的量为5mg。
可以用于本发明的培养方法中的补加亚硒酸钠方式为分批补加。富硒螺旋藻的培养一般采用在第1天添加硒，以期在长时间硒胁迫中获得高富硒量螺旋藻，但是当硒浓度≥200mg/L时，对藻的生长有抑制作用，所得螺旋藻硒含量一般只能达到400μg/g左右。而在螺旋藻对数生长期分批加硒，可避免高硒对螺旋藻的抑制作用，获得高富硒量螺旋藻，还能提高螺旋藻藻体中藻胆蛋白、光合色素等几种主要营养物质含量。
在一个实施方案中，分批补加是自螺旋藻接种到培养基中培养5-10d后分批补加亚硒酸钠，连续补加2-5d。培养5-10d的螺旋藻处在对数生长期后期，细胞生命力旺盛，藻密度大，对硒耐受力强，代谢机制活跃，利于螺旋藻藻体对硒的吸收和富集。例如，培养6d后分批补加亚硒酸钠，连续补加5d，或培养6d后分批补加亚硒酸钠，连续补加4d，或培养7d后分批补加亚硒酸钠，连续补加4d，或培养7d后分批补加亚硒酸钠，连续补加3d，或培养8d后分批补加亚硒酸钠，连续补加4d，或培养8d后分批补加亚硒酸钠，连续补加3d，或培养9d后分批补加亚硒酸钠，连续补加3d，或培养9d后分批补加亚硒酸钠，连续补加2d等等。
在一个实施方案中，分批补加，其添加硒的量，以Se4+计硒量，其添加的量是每天每升培养基补入200-500mg/L，优选250-500mg/L，更优选250-450mg/L，进一步优选300-400mg/L。
本发明的培养方法中的培养在光生物反应器中培养。光生物反应器指的是并入一个或多个光源向反应器中提供光子能量的生物反应器。在优选的实施方案中，使螺旋藻生长在对(外部)环境关闭的系统中。
在一个实施方案中，培养包括在补加亚硒酸钠后使所述螺旋藻在发光二极管(LED)下培养至结束。
在一个实施方案中，LED发射的红光和黄光的两个峰位于550-680nm PAR光谱内。LED发射的红光和黄光对螺旋藻生长和硒富集具有同步增长的作用。
在一个实施方案中，的LED的光照强度为4000-10000lx，优选5000-9000lx，更优选6000-9000lx，进一步优选7000-8000lx。
本发明的培养方法中的培养基的pH值为7.0-9.0，温度为20-35℃。
在一个实施方案中，富硒螺旋藻的培养方法，包括，
S1：将对数期螺旋藻接种到含有硫代琥珀酸的pH值为7.0-9.0、温度为20-35℃的培养基中培养5-10d；
S2：向培养基中分批补加亚硒酸钠，其中，以Se4+计硒量，亚硒酸钠的添加的量是每天每升培养基补入200-500mg/L，连续补加2-5d，第一次补加亚硒酸钠后置于LED下培养，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物，可用于制备食品或饲料添加剂。该培养方法能够减缓硒对细胞膜的氧化损伤，帮助螺旋藻细胞抵抗硒毒性，避免高硒对螺旋藻的抑制作用，促进螺旋藻的生长，同时有利于硒的有机螯合，提高螺旋藻对硒的吸收和富集，获得硒产率≥1827.55μg/L、有机硒比率≥89.48％的高富硒量螺旋藻；该培养方法能够避免过多的硒元素过多地取代了机体蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸或蛋氨酸的硫元素，维持酶的活性，进而保持螺旋藻的正常生命活动；该培养方法能够还能提高螺旋藻藻体中藻胆蛋白的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明培养方法能够减缓硒对细胞膜的氧化损伤，帮助螺旋藻细胞抵抗硒毒性，避免高硒对螺旋藻的抑制作用，促进螺旋藻的生长，同时有利于硒的有机螯合，提高螺旋藻对硒的吸收和富集，获得高富硒量螺旋藻；本发明培养方法能够避免过多的硒元素过多地取代了机体蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸或蛋氨酸的硫元素，维持酶的活性，进而保持螺旋藻的正常生命活动；本发明培养方法能够还能提高螺旋藻藻体中藻胆蛋白的含量。
本发明采用了上述技术方案提供富硒螺旋藻的培养方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1是本发明试验例1中吸光度A560与螺旋藻生物量的关系曲线图；
图2是本发明试验例1中螺旋藻的生长曲线；
图3是本发明试验例1中螺旋藻内有机硒和总硒富集量；
图4是本发明试验例1中螺旋藻中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的含量。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1：
富硒螺旋藻的培养方法，包括，
S1：将对数期螺旋藻接种到含有硫代琥珀酸的pH值为7.0、温度为20℃的Zarrouk培养基(成分如表1所示)中培养5d，培养基中硫代琥珀酸的终浓度为10ppm；
S2：向培养基中分批补加亚硒酸钠，第一次补加亚硒酸钠后立刻置于LED下培7d，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物。其中，以Se4+计硒量，亚硒酸钠的添加的量是每天每升培养基补入200mg/L，连续补加5d。
表1 Zarrouk培养基的成分
组分 浓度(g/L) 组分 浓度(g/L)
NaHCO<sub>3</sub> 16.8 FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.01
NaNO<sub>3</sub> 2.50 Na<sub>2</sub>EDTA 0.08
NaNO<sub>3</sub> 1.00 CaCl<sub>2</sub> 0.08
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 1.00 A<sub>5</sub>溶液 1mL/L
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.20 B<sub>5</sub>溶液 1mL/L
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.50
表2 A5溶液的成分
组分 H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> MoO<sub>3</sub> MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
浓度(g/L) 2.86 0.01 1.80 0.22 0.08
表3 B5溶液的成分
组分 NH<sub>4</sub>VO NaWO<sub>4</sub> Ti<sub>2</sub>(SO<sub>4</sub>)<sub>3</sub> NiSO<sub>3</sub>·7H<sub>2</sub>O Co(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
浓度(g/L) 22.90 17.90 40.00 47.80 4.40
实施例2：
富硒螺旋藻的培养方法，包括，
S1：将对数期螺旋藻接种到含有硫代琥珀酸的pH值为9.0、温度为35℃的Zarrouk培养基中培养10d，培养基中硫代琥珀酸的终浓度为35ppm；
S2：向培养基中分批补加亚硒酸钠，第一次补加亚硒酸钠后立刻置于LED下培养2d，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物。其中，以Se4+计硒量，亚硒酸钠的添加的量是每天每升培养基补入500mg/L，连续补加2d。
实施例3：
富硒螺旋藻的培养方法，包括，
S1：将对数期螺旋藻接种到含有硫代琥珀酸的pH值为8.0、温度为28℃的Zarrouk培养基中培养6d，培养基中硫代琥珀酸的终浓度为30ppm；
S2：向培养基中分批补加亚硒酸钠，第一次补加亚硒酸钠后立刻置于LED下培养6d，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物。其中，以Se4+计硒量，亚硒酸钠的添加的量是每天每升培养基补入400mg/L，连续补加4d。
实施例4：
藻胆蛋白是螺旋藻中一种重要的捕光色素蛋白，其包含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，不仅能够直接捕捉吸收光能，参与叶绿体中的光能电子链传递，而且可以藻体的储备蛋白，增强藻类的环境适应能力，且可提高机体的免疫能力，具有抗氧化能力，保护DNA和神经组织免受氧化损伤，可促进动物血细胞再生和抑制溶血，另外藻蓝蛋白还具有抗炎、抗辐射和抗肿瘤作用，可用于保健食品和药物来开发应用，而硒可通过硫的代谢途径进入生物体，并取代有机体细胞中蛋白质结构中的部分硫，影响蛋白质合成机制，从而导致蛋白质尤其是藻胆蛋白的含量降低，为了进一步提高富硒螺旋藻中藻胆蛋白的含量，本实施例还采取如下措施：培养基中含有10-50μmol/L 2,6-二氨基庚二酸，2,6-二氨基庚二酸进入细胞后能够提高细胞中的色素质量比及酶的水平而促进细胞的生长，从而能积累更多藻胆蛋白；同时，2,6-二氨基庚二酸还可以作为螺旋藻生长的备用氮源，保护合成的藻胆蛋白不会因氮源的缺少而被降解利用，促进细胞中积累更多的藻胆蛋白。富硒螺旋藻的培养方法，包括，
S1：将对数期螺旋藻接种到含有终浓度为15-35ppm硫代琥珀酸和20μmol/L 2,6-二氨基庚二酸、pH值为8.0、温度为28℃的Zarrouk培养基中培养6d；
S2：向培养基中分批补加亚硒酸钠，第一次补加亚硒酸钠后立刻置于LED下培养6d，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物。其中，以Se4+计硒量，亚硒酸钠的添加的量是每天每升培养基补入400mg/L，连续补加4d。
对比例1：
螺旋藻的培养方法，包括，
S1：将对数期螺旋藻接种到pH值为8.0、温度为28℃的Zarrouk培养基中培养6d；
S2：在LED下继续培养6d，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物。
对比例2：
富硒螺旋藻的培养方法，包括，
S1：将对数期螺旋藻接种到pH值为8.0、温度为28℃的Zarrouk培养基中培养6d；
S2：向培养基中分批补加亚硒酸钠，第一次补加亚硒酸钠后立刻置于LED下培养6d，光暗时间对比为每天12h:12h，即得到富硒螺旋藻培养物。其中，以Se4+计硒量，亚硒酸钠的添加的量是每天每升培养基补入400mg/L，连续补加4d。
试验例1：
1.试验方法
1.1生物量得测定
1.1.1吸光度A560与螺旋藻生物量的关系
分别取3份1000.00m L藻液，用已称干重的滤纸过滤，用蒸馏水冲洗所滤得的藻泥数次，沥干后放入电热鼓风干燥箱105℃干燥至恒重，用电子分析天平称量，3份试验样品取平均值，计算得到藻液的螺旋藻生物量。取100.00mL藻液，根据倍比稀释分别稀释成不同倍数的系列溶液，采用光密度法，使用722S分光光度计，以Zarrouk培养液作空白，取混匀的藻液在560nm波长下测定吸光度(A560)，以A560为横坐标，螺旋藻生物量W(g/L)为纵坐标，绘制A560与螺旋藻生物量关系图(如图1)，线性回归方程为：y＝-0.02629+0.71068x。
1.2生物量测定和生长曲线绘制
培养过程中每天定时取样测定并记录A560值，重复3次取平均值，利用1.1.1所得的A560与螺旋藻生物量的线性方程，将每天测定的藻液A560换算成生物量W(g/L)。以培养时间t为横坐标，生物量W为纵坐标，绘制螺旋藻生长曲线。
1.2有机硒和无机硒的分析测定
1.2.1无机硒含量测定
离心收集藻细胞样品，60℃烘箱干燥24h。称取0.005g样品，分别加入10mL ddH2O中，使用可控温电热炉进行加热至近沸，保持10min。冷却后，转入10mL容量瓶中定容。摇匀，干过滤，取滤液7mL，加入10mL环己烷萃取，水相转入15mL离心管，使用ICP-MS测定无机硒含量。
1.2.2总硒含量测定
离心收集藻细胞样品，60℃烘箱干燥24h。称取0.005g样品，放入消解罐内，再加入6mL硝酸和2mL过氧化氢溶液，按照消解程序进行消解。将消解后样品倒入烧杯内，保持近沸赶走多余的硝酸。ddH2O定容到10mL。使用ICP-MS测定总硒含量。总硒量减去无机硒量得到有机硒的含量。
1.3.藻胆蛋白含量的测定
取10mL螺旋藻培养液，离心后加入10mLPBS缓冲溶液，超声波破壁，总蛋白测定用考马斯亮蓝法，藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白浓度参照张学成等(不同产地龙须菜光合色素的比较研究[J].海洋湖沼通报,1993,1:52-59.Zhang Xuecheng,Wang Yongxu,Wu Xiaonan,etal.Different areas Gracilariopsislemaneiformis photosyntheticpigmentscomparative study[J].Trans OceanolLimnol,1993,1:52-59)的方法测定。整个测定过程在0～4℃下进行且尽量避光。用721分光光度计测定在498、614和651nm波长下的吸光度，分别计算各藻胆蛋白和总藻胆蛋白的含量(g/L,鲜质量)。
2.试验结果
2.1图2为螺旋藻的生长曲线，可以看出，实施例1-3螺旋藻的生长曲线均好于对比例1-2，这表明硒对藻类具有生长促进与毒性抑制的二重性，而培养基中硫代琥珀酸的存在能够显著增加螺旋藻内源H2S含量，提高GSH水平，抑制硒导致的ROS产生，维持氧化平衡，减缓硒对细胞膜的氧化损伤，最终帮助螺旋藻细胞抵抗硒毒性，避免高硒对螺旋藻的抑制作用，促进螺旋藻的生长，且避免过多的硒元素过多地取代了机体蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸或蛋氨酸的硫元素，维持酶的活性，进而保持螺旋藻的正常生命活动；实施例4的生长曲线好于实施例3，这说明2,6-二氨基庚二酸对螺旋藻的生长具有促进作用，这可能使因为2,6-二氨基庚二酸能够促进细胞中积累更多的藻胆蛋白，增强藻类的环境适应能力，进而促进螺旋藻的生长。
2.2图3为螺旋藻内有机硒和总硒富集量，可以看出，实施例1-3螺旋藻中有机硒和总硒的富集量均高于对比例1-2，这说明培养基中硫代琥珀酸的存在有利于硒的有机螯合，提高螺旋藻对硒的吸收和富集，获得高富硒量螺旋藻；实施例4中有机硒和总硒的富集量与实施例3相当，这说明2,6-二氨基庚二酸对螺旋藻的富硒作用影响不明显。
2.3图4为螺旋藻中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的含量，可以看出，实施例1-3螺旋藻中藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的含量均高于对比例1-2，亦即实施例1-3螺旋藻中藻胆蛋白的含量均高于对比例1-2，这说明培养基中硫代琥珀酸的存在能够提高螺旋藻藻体中藻胆蛋白的含量；实施例4螺旋藻中藻蓝蛋白含量达到0.18g/L，别藻蓝蛋白含量达到0.11g/L，即藻胆蛋白含量达到0.29g/L，且藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的含量均高于实施例3，亦即实施例4螺旋藻中藻胆蛋白的含量高于实施例3，这说明2,6-二氨基庚二酸进入细胞后能够提高细胞中的色素质量比及酶的水平而促进细胞的生长，从而能积累更多藻胆蛋白；同时，2,6-二氨基庚二酸还可以作为螺旋藻生长的备用氮源，保护合成的藻胆蛋白不会因氮源的缺少而被降解利用，促进细胞中积累更多的藻胆蛋白。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：将对数期螺旋藻接种到含有硫代琥珀酸的培养基中培养，在所述培养过程中补加亚硒酸钠。
2.根据权利要求1所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的培养基中硫代琥珀酸的终浓度为10-100ppm。
3.根据权利要求1所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的补加亚硒酸钠方式为分批补加。
4.根据权利要求1所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的分批补加是自螺旋藻接种到培养基中培养5-10d后分批补加亚硒酸钠，连续补加2-5d。
5.根据权利要求3或4所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的分批补加，其添加硒的量，以Se4+计硒量，其添加的量是每天每升培养基补入200-500mg/L。
6.根据权利要求1所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的培养包括在补加亚硒酸钠后使所述螺旋藻在LED下培养至结束。
7.根据权利要求6所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的LED发射的红光和黄光的两个峰位于550-680nm PAR光谱内。
8.根据权利要求6或7所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的LED的光照强度为4000-10000lx。
9.根据权利要求1所述的富硒螺旋藻的培养方法，其特征在于：所述的培养基的pH值为7.0-9.0，温度为20-35℃。
10.一种权利要求1-9任一项所述的富硒螺旋藻的培养方法得到的富硒螺旋藻培养物，其特征在于：所述的富硒螺旋藻培养物硒产率≥1827.55μg/L、有机硒比率≥89.48％。
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