CN110205301A - 一种杂交瘤细胞克隆化的方法 - Google Patents

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Abstract

一种杂交瘤细胞克隆化的方法，属于单克隆抗体的制备技术，用有限稀释法对1个阳性孔进行1次克隆化操作需1～3块96孔细胞培养板，而用单细胞显微操作法进行克隆化时，每块96孔细胞培养板可克隆化3～6个阳性孔，节省实验材料；对于有限稀释法，一般需进行2～3次或更多次克隆化才能基本保证杂交瘤细胞株的单克隆性，而对于单细胞显微操作法，一般进行1次克隆化就能保证其单克隆性，节省了时间；与有限稀释法相比较，单细胞显微操作法显然更能确保杂交瘤细胞株的单克隆性，方法更为可靠；相较于流式细胞分选，该方法科学、合理，不需要特殊仪器，操作简单，更适合实验室制备一般用途单抗。

Description

一种杂交瘤细胞克隆化的方法
技术领域
本发明属于单克隆抗体的制备技术，涉及一种杂交瘤细胞克隆化的方法，具体的说是涉及一种利用显微操作技术对筛选的阳性孔杂交瘤细胞进行克隆化的方法。
背景技术
抗体是外来大分子、微生物等抗原性物质进入动物机体后，由体内B淋巴细胞的终端分化细胞(浆细胞)所产生的一类糖蛋白。1975年，Kohler和Milstein 发明了单克隆抗体技术之后，单抗在疾病诊断和治疗等临床方面发挥着重要作用；此外，抗体作为一种免疫试剂在一般性科学研究中有着广泛的应用，如免疫印迹、免疫组化、免疫荧光、免疫共沉淀。抗体是基础科研和临床分析最常用的工具之一。
目前，单克隆抗体制备及鉴定方法流程如图1所示。首先，将抗原注入动物体内进行免疫；取出被免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；然后，采用 ELISA法筛选融合孔细胞，并对筛选的阳性孔进行克隆化；进一步筛选克隆化的杂交瘤细胞，对筛选的阳性孔细胞进行扩大培养与冻存；接着，将杂交瘤细胞株注入动物体内诱生腹水来大量制备抗体，采用Protein A亲和层析纯化IgG1类抗体；最后，对抗体进行全面的鉴定，包括亚型、效价、特异性、灵敏度、亲和常数、抗体纯度及分子量。
单克隆抗体制备过程复杂，实验周期较长；其中杂交瘤细胞克隆化是单抗制备过程中最为繁琐且耗时最多的步骤。细胞克隆化的方法主要包括有限稀释法、流式细胞仪分选等。有限稀释法是目前最为常用细胞克隆化的方法，操作步骤是将细胞进行梯度稀释接种至96孔板。该方法对一个阳性孔细胞进行克隆化时，需要1-3块96孔板，而且一般需要进行2-3次克隆化才能确保细胞的单克隆性。因此，有限稀释法单克隆率低、工作量大、消耗时间长。流式细胞分选是一种高效的细胞克隆化方法，通过优化实验体系即可对细胞进行大批量克隆化筛选，适用于医药等领域对抗体的需求。然而，对于制备一般用途抗体时，应用该方法显然不划算，且对仪器设备和操作人员要求较高。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺点和不足，提出一种杂交瘤细胞克隆化的方法，通过该方法可简化杂交瘤细胞克隆化实验流程，减少工作量，提高单克隆率，缩短实验周期。
本发明的技术方案是：一种杂交瘤细胞克隆化的方法，其特征在于：所述克隆化的方法包括如下步骤：
(1)取一无菌平皿，加入3mL 37℃预热的DMEM完全培养基；
(2)用枪头轻轻吹吸，重悬细胞；吸取5～10μL细胞悬液加至平皿中；
(3)轻轻摇动平皿以混匀细胞，静置3min，将平皿放在倒置显微镜下观察，确保视野内只有1～2个可见的细胞；
(4)寻找亮而圆的细胞，用移液抢吸取单个细胞；
(5)将吸取的单个细胞加到铺有饲养层细胞的96孔板中；
(6)将步骤(5)中的单个细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养。
步骤(1)中所述的平皿是直径为6cm的圆形塑料皿，且对细胞没有吸附性。
步骤(2)中所述的细胞为细胞融合后筛选的阳性孔内的杂交瘤细胞。
步骤(3)中所述确保视野内只有1～2个可见的细胞是通过稀释细胞悬液直到视野内可见1～2个细胞为止。
步骤(4)中所述寻找亮而圆的细胞是为了保证挑选到的细胞是状态良好的杂交瘤细胞而不是饲养层细胞或者死细胞。
步骤(4)中所述的移液枪为10μL的移液枪。
本发明的有益效果为：本发明提出的一种杂交瘤细胞克隆化的方法，方法科学、合理，用有限稀释法对1个阳性孔进行1次克隆化操作需1～3块96孔细胞培养板，而用单细胞显微操作法进行克隆化时，每块96孔细胞培养板可克隆化3～6个阳性孔，节省实验材料；对于有限稀释法，一般需进行2～3次或更多次克隆化才能基本保证杂交瘤细胞株的单克隆性，而对于单细胞显微操作法，一般进行1次克隆化就能保证其单克隆性，节省了时间；与有限稀释法相比较，单细胞显微操作法显然更能确保杂交瘤细胞株的单克隆性，方法更为可靠；相较于流式细胞分选，该方法不需要特殊仪器，操作简单，更适合实验室制备一般用途单抗。
附图说明
图1为常用单抗制备与鉴定流程示意图。
图2为显微操作法克隆化杂交瘤细胞示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
一种杂交瘤细胞克隆化的方法包括如下步骤：
(1)取一无菌平皿，加入3mL 37℃预热的DMEM完全培养基；
(2)用枪头轻轻吹吸，重悬细胞；吸取5～10μL细胞悬液加至平皿中；
(3)轻轻摇动平皿以混匀细胞，静置3min，将平皿放在倒置显微镜下观察，确保视野内只有1～2个可见的细胞；
(4)寻找亮而圆的细胞，用移液抢吸取单个细胞；
(5)将吸取的单个细胞加到铺有饲养层细胞的96孔板中；
(6)将步骤(5)中的单个细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养。
步骤(1)中的平皿是直径为6cm的圆形塑料皿，且对细胞没有吸附性。
步骤(2)中的细胞为细胞融合后筛选的阳性孔内的杂交瘤细胞。
步骤(3)中确保视野内只有1～2个可见的细胞是通过稀释细胞悬液直到视野内可见1～2个细胞为止。
步骤(4)中寻找亮而圆的细胞是为了保证挑选到的细胞是状态良好的杂交瘤细胞而不是饲养层细胞或者死细胞。
步骤(4)中的移液枪为10μL的移液枪。
一种杂交瘤细胞克隆化的方法具体操作过程：
(1)细胞融合后，采用间接ELISA法筛选阳性孔，对阳性孔杂交瘤细胞进行克隆化。
(2)实验前1-3天，在96孔细胞培养板中铺制饲养层细胞，细胞数量为3× 10^4/0.2ml/孔。轻轻吹吸重悬阳性孔内的细胞，吸取5-10μL细胞悬液加至有3mL DMEM-10培养基的无菌平皿中；轻轻混匀，短暂静置后，放在倒置显微镜下观察；视野内可见1-2个细胞；寻找亮而圆的杂交瘤细胞，用移液器挑取细胞到铺有饲养层细胞的培养板中，每孔确保只挑到一个细胞，每个阳性孔挑取12-24个细胞，置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
表一.阳性孔杂交瘤细胞克隆化示意表。
(3)三天后，观察培养孔内细胞集落数；若没有表示为空孔，若为一个则表示为单克隆细胞，若有2个或以上细胞集落，则为多克隆孔，可弃去不筛选或着再克隆化一次。结果如下：
克隆化细胞孔数 空孔数 单克隆孔数 2个或以上细胞团孔数
192 61 125 6
(4)五天后开始半量换液，当细胞集落足够大时，将其吹散，继续培养；当细胞密度达到50％左右时，进行ELISA筛选，对阳性孔细胞逐步扩大培养，即获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(5)实验结果显示，采用本发明克隆化杂交瘤细胞的方法，使用一块96孔板即可至少对4个阳性孔杂交瘤细胞进行克隆化，一次克隆化即可得到单克隆杂交瘤细胞株；且可以得到31.8％的空孔，65.1％的单克隆孔，3.1％的多克隆孔。相较于现有的技术、步骤简化、工作量减少、操作简单。

Claims (6)

1.一种杂交瘤细胞克隆化的方法，其特征在于：所述克隆化的方法包括如下步骤：
(1)取一无菌平皿，加入3 mL 37 ℃预热的DMEM完全培养基；
(2)用枪头轻轻吹吸，重悬细胞；吸取5～10 μL细胞悬液加至平皿中；
(3)轻轻摇动平皿以混匀细胞，静置3 min，将平皿放在倒置显微镜下观察，确保视野内只有1～2个可见的细胞；
(4)寻找亮而圆的细胞，用移液抢吸取单个细胞；
(5)将吸取的单个细胞加到铺有饲养层细胞的96孔板中；
(6)将步骤(5)中的单个细胞置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞克隆化的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的平皿是直径为6 cm的圆形塑料皿，且对细胞没有吸附性。
3.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞克隆化的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的细胞为细胞融合后筛选的阳性孔内的杂交瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞克隆化的方法，其特征在于：步骤(3)中所述确保视野内只有1～2个可见的细胞是通过稀释细胞悬液直到视野内可见1～2个细胞为止。
5.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞克隆化的方法，其特征在于：步骤(4)中所述寻找亮而圆的细胞是为了保证挑选到的细胞是状态良好的杂交瘤细胞而不是饲养层细胞或者死细胞。
6.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞克隆化的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的移液枪为10 μL的移液枪。
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