CN110200928A - 染料木素纳米冻干粉在抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了染料木素纳米冻干粉在抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中的应用，染料木素纳米冻干粉对3T3细胞(成纤维细胞)、B16细胞(黑色素瘤细胞)具有抑制作用，有抑制成纤维细胞、黑色素瘤细胞增殖的作用，对羟自由基的清除作用高，具有抗衰老、抑制肿瘤生长、预防辐射损伤等作用，将染料木素纳米冻干粉应用于抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中时，可与其他药物或者药物载体复合制成药膏、药液等药剂，直接涂布于患处，具有抑制皮肤疤痕形成的效果。也可将染料木素纳米冻干粉与海藻糖、玻尿酸、熊果苷、纯露、霍霍巴油、维生素E、甘油、乳化剂、双蒸水等护肤成分制成肤护品，具有改善皮肤微环境，防止疤痕形成，同时增强美白、保湿效果。

Description

染料木素纳米冻干粉在抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中的 应用

技术领域

本发明涉及纳米药物制剂技术领域，具体涉及染料木素纳米冻干粉在抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中的应用。

背景技术

皮肤瘢痕形成是皮肤纤维化的表现，主要是成纤维细胞的异常增生，胶原的过度沉积。目前临床上导致皮肤瘢痕形成的原因有：外伤、烧伤、外科手术、放疗后、晒伤、激光手术后等。

目前抗疤痕的药物主要有类固醇激素和细胞毒性药物，均存在副作用。疤痕的治疗不应只针对胶原细胞，而是调整皮肤微环境，从而达到减缓瘢痕的目的。

染料木素是一种安全性较高的天然产物单体，但是由于其水溶性差，故生物利用度很低，皮肤难以吸收。现有技术中，有染料木素制备成胶束纳米化后，以提高其溶解度和生物利用率。参见专利号CN201710974436公布的一种染料木素纳米共聚物胶束冻干粉的制备方法和应用，其公布了染料木素的制备方法包括如下步骤：步骤1：取一定量的PEG-PLA加入一定体积的丙酮中溶解，用丙酮作为溶剂，配制一定浓度PEG-PLA丙酮溶液；步骤2：将一定量染料木素加入步骤1配制的丙酮溶液中，形成染料木素、PEG-PLA丙酮混合溶液，涡旋混匀，使其充分溶解；步骤3：将一定量Tween80加入步骤2配制的丙酮混合溶液中，形成染料木素、PEG-PLA、Tween80丙酮混合溶液，涡旋混匀，使其充分溶解；步骤4：通过注射器将步骤3配置好的混合溶液加入含聚乙烯醇(PVA)的水溶液，该过程在搅拌状态下进行；步骤5：将步骤4中的溶液体系，用超声波细胞破碎仪超声一定时间；步骤6：将步骤5中的溶液体系维持搅拌，使丙酮挥发完全；步骤7：步骤6进行完的混悬液经高压锅高压，冷却，得到带蓝色乳光的胶体溶液，用光束透射，可观察到丁达尔现象；步骤8：将步骤7得到的胶体溶液经微孔滤膜过滤，得到染料木素纳米共聚物胶束；步骤9：将步骤8收集的产物以海藻糖为冻干保护剂冻干，即获得染料木素纳米共聚物胶束冻干粉。其还公布了染料木素纳米共聚物胶束冻干粉可作为抗肝纤维化药物。科研人员经过进一步研究发现，该染料木素纳米共聚物胶束冻干粉还具有抑制皮肤瘢痕形成的作用，因此将染料木素纳米共聚物胶束冻干粉应用于抑制皮肤瘢痕形成药物以及护肤品具有很大的药用价值。

发明内容

本发明克服了现有技术中抗疤痕的药物主要有类固醇激素和细胞毒性药物，均存在副作用的技术问题，提供染料木素纳米冻干粉在抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中的应用，辅助改善皮肤微环境、调整皮肤水油比例、润肤、美白等功效。

为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：

染料木素纳米冻干粉在抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中的应用。

其中，所述染料木素纳米冻干粉由如下制备方法得到：

S1：取一定量的PEG-PLA加入一定体积的丙酮中溶解，配制成PEG-PLA浓度为 4-20mg/mL的丙酮溶液；

S2：将一定量染料木素加入步骤1配制的丙酮溶液中，形成染料木素、PEG-PLA丙酮混合溶液，混匀，使其充分溶解；所述配制的染料木素、PEG-PLA丙酮混合溶液中，染料木素的含量为0.0833-3.33mg/mL；

S3：将一定量表面活性剂加入步骤2配制的丙酮混合溶液中，形成染料木素、PEG-PLA、 Tween80丙酮混合溶液，混匀，使其充分溶解；所述配制的染料木素、PEG-PLA、Tween80丙酮混合溶液中Tween80浓度为0-82.5mg/mL；

S4：将S3配置好的混合溶液加入双蒸水中，该过程在搅拌状态下进行；

S5：将S4中的溶液体系维持搅拌，使丙酮挥发完全；

S6：S5进行完的混悬液经高压灭菌锅高压，冷却，得到染料木素胶束；

S7：将S6收集的产物加入冻干保护剂冻干，即获得染料木素纳米冻干粉。

本发明的另一目的还在于保护一种护肤品，其含有上述染料木素纳米冻干粉。

一种含有上述染料木素纳米冻干粉的护肤品，其由质量百分含量的如下组分组成：

优选的，所述护肤品由质量百分含量的如下组分组成：

其中，上述护肤品的制备方法，包括如下步骤：

S1：按配比将海藻糖、玻尿酸、染料木素胶束冻干粉、熊果苷、纯露和水混合，制备出水相；

S2：按配比将霍霍巴油、维生素E、甘油混合，制备出油相；

S3：将水相和油相混合，再加入乳化剂，混匀即制成所述护肤品。

本发明的另一目的还在于保护一种抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化的药物组合物，其含有上述的染料木素纳米冻干粉。

将染料木素纳米冻干粉应用于抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化时，可将染料木素纳米冻干粉制成护肤品或药剂，例如凝胶、软膏、乳膏、药液、爽肤水、面霜、面膜、精华液、敷贴或透皮剂等等可直接涂抹于患处的用剂。当然，含有染料木素纳米冻干粉的用于抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化的用剂不限于上述几种形式。

本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：

(1)本发明的染料木素纳米冻干粉无细胞毒性作用，对3T3细胞具有抑制作用，有抑制成纤维细胞增殖的作用。同时本发明的染料木素纳米冻干粉相比于普通的染料木素对羟自由基(·OH)的清除作用高，具有抗光皮肤老化、抑制肿瘤生长、预防辐射损伤、雌激素缺乏症皮肤等作用，能抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化，修复皮肤损伤，可应用于抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中。

(2)本发明的护肤品种含有染料木素纳米冻干粉的乳液PH值为6.0±0.5，针对亚洲人肤质，无皮肤敏感性及其他副作用，为O/W包裹，整体不油腻，截止目前出现过敏案例，对皮肤具有长久的保湿、护肤效果。本发明的护肤品中的染料木素纳米冻干粉采用冷冻干燥法处理，最大程度保存其性状，且测试表明染料木素纳米冻干粉性质稳定，便于保存；高溶解度，纳米级颗粒分散均匀，能快速深入皮肤内，对抗羟自由基具有清除作用，从而达到抗氧化和抗成纤的效果，护肤品中还添加熊果苷和玻尿酸达到美白、保湿效果，护肤品中，染料木素纳米冻干粉除了能促进熊果苷和玻尿酸等物质的吸收，增强护肤效果。初期本品具有长久保湿护肤的作用，最长保湿时间可长达8小时。当然可根据地域气候调整配方比例，也可根据皮肤特性进行个性化定制，研制成不同含有染料木素纳米冻干粉的护肤品，含有染料木素纳米冻干粉的护肤品具有抑制皮肤瘢痕形成的作用外，还可促进其他护肤成分的吸收，护肤效果显著。

(3)本发明中的染料木素具有类雌激素作用，可绑定雌激素受体并刺激它们的活性，对人体雌激素受体的激活具有双向调节的作用。故可安全应用于更年期皮肤老化、男士护肤品，也可避免女性因为使用护肤品而导致内分泌紊乱。这也是染料木素纳米冻干粉具有改善皮肤微环境的原因之一。

(4)将染料木素纳米冻干粉应用于抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中时，可与其他药物或者药物载体复合制成药膏、药液、医用敷贴等药剂，直接涂布于患处，具有抑制皮肤疤痕形成的效果。

附图说明

图1为染料木素纳米冻干粉与染料木素游离药物组对羟自由基的清除作用的测定结果图；

图2为染料木素胶束冻干粉和染料木素游离药物组对3T3细胞处理24小时后的抑制作用效果图；

图3为染料木素胶束冻干粉和染料木素游离药物组对3T3细胞处理48小时后的抑制作用抑制作用效果图；

图4为染料木素胶束冻干粉和染料木素游离药物组对3T3细胞处理72小时后的抑制作用抑制作用效果图；

图5为染料木素胶束冻干粉和染料木素游离药物组对B16细胞处理24小时后的抑制作用效果图；

图6为染料木素胶束冻干粉和染料木素游离药物组对B16细胞处理48小时后的抑制作用抑制作用效果图；

图7为染料木素胶束冻干粉和染料木素游离药物组对B16细胞处理72小时后的抑制作用抑制作用效果图。

图8为本发明护肤品保湿持久性测试中额头、脸颊、手背测试部位示意图；

图9为本发明护肤品保湿持久性测试中手掌测试部位示意图；

图10为本发明所采用数字皮肤水份检测笔的检测界面图；

图11为本发明所采用数字皮肤水份检测笔的弹性值说明图。

具体实施方式

下面结合实施例和试验对本发明作进一步说明。

实施例1

一种含有染料木素纳米冻干粉的护肤品，其由质量百分含量的如下组分组成：

其制备方法，包括如下步骤：

S1：按配比将海藻糖、玻尿酸、染料木素胶束冻干粉、熊果苷、纯露和水混合，制备出水相；

S2：按配比将霍霍巴油、维生素E、甘油混合，制备出油相；

S3：将水相和油相混合，再加入乳化剂，混匀即制成所述护肤品。

实施例2

一种含有染料木素纳米冻干粉的护肤品，其由质量百分含量的如下组分组成：

其制备方法同实施例1。

实施例3

一种含有染料木素纳米冻干粉的护肤品，其由质量百分含量的如下组分组成：

其制备方法同实施例1。

对照组1

对照组1与实施例1的配方基本相同，区别在于，对照组1不含有染料木素纳米冻干粉，其他成分不变。

对照组2

对照组2与实施例1的配方基本相同，区别在于，对照组2将染料木素纳米冻干粉替换成普通的染料木素(普通燃料木素即为染料木素纳米冻干粉制备方法中，S2中未经任何处理的染料木素)。

1、护肤品控油、保湿测试：

选取20～40岁女性30人，随机平均分成5组，分别使用实施例1～实施例3以及对照组1、对照组2的护肤品，使用方法为：早晚各将护肤品涂抹于面部，且不用其他护肤品。采用数字皮肤水份检测笔(数字皮肤水份检测笔如图10所示，其由深圳市美思诚科技有限公司生产，型号1504.SK-IV)测定使用护肤品0周、2周、4周、6周、8周后的试验人员面部的水份、油份以及弹性值(如图11所述，弹性值从左到右依次为1、2、3、4、5)，水份测试结果如下表1、油份测试结果如下表2、弹性值测试结果如下表3。

表1持续使用不同时间长度的水份值(％)

表2持续使用不同时间长度的油份值(％)

表3持续使用不同时间长度的弹性值

由表1可知，本发明实施例1～实施例3的护肤品使用8周后的皮肤保湿效果由37％左右提高至50％左右，而对照组1、对照组2护肤品使用8周后皮肤保湿效果仅提高至40％。说明染料木素纳米冻干粉能促进熊果苷和玻尿酸等物质的吸收，增强保湿效果，而普通染料木素则没有此效果。由表2可知，本发明实施例1～实施例3的护肤品使用8周后的皮肤控油效果由29％左右降低20％左右，而对照组1、对照组2使用8周后皮肤控油效果仅降低至25％左右；说明染料木素纳米冻干粉能增强控油效果，而普通染料木素则没有此效果。由表3可知，未使用任何护肤品前，测试人员的皮肤弹性值主要集中在2～3之间，使用本发明实施例 1～实施例3护肤品八周之后皮肤弹性值在3～4之间，弹性值上升了一个幅度，而对照组1、对照组2使用八周后弹性值依然还是3，说明染料木素纳米冻干粉能增强皮肤弹性，增强护肤效果，而普通染料木素则没有此效果。

2、护肤品保湿持久性测试：

选取20～40岁男性3人、女性3人作为测试对象。采用数字皮肤水份检测笔检测护肤品使用前、护肤品刚使用后以及使用后4小时、使用后8小时皮肤水份、油份以及弹性值，测试部位为脸颊、额头、手背、手掌(检测部位如图8、图9所示)，结果取平均值，水份测试结果如下表4、油份测试结果如下表5、弹性值测试结果如下表6。

表4测试各部位使用前后水份值(％)

表5测试各部位使用前后油份值(％)

表6测试各部位使用前后弹性值

由表4、表5、表6可知，本发明护肤品使用后8个小时，脸颊、额头、手背、手心皮肤中的水份以及皮肤弹性值均在较高水平，油份上升不快，说明本发明护肤品在使用后较长时间内依然具有很好保湿控油效果，本发明护肤品保湿持久性高。

3、染料木素纳米冻干粉与染料木素游离药物组对羟自由基的清除作用的测定

根据Fenton反应原理产生·OH，H₂O₂的量和Fenton反应产生的·OH量成正比。取10mg 染料木素溶于200μLDMSO或含10mg染料木素的染料木素纳米冻干粉溶于200μL水中，分别配置成含1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μg/mL染料木素的溶液。吸取60μL不同浓度样品于96孔板中，加入60μL 10mmol/L的FeSO₄，再加入60μL 10mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，最后加入20μL 8.8mmol/L的H₂O₂启动反应，37℃反应30分钟，以蒸馏水作参比，测定不同样品在510nm下的吸光值。结果如图1所示(注：图1中GS-ML冻干粉为染料木素纳米冻干粉，GS为染料木素游离药物组)。

由图1可知，染料木素纳米冻干粉、染料木素游离药物组的浓度大于10μg/mL时，染料木素纳米冻干粉对羟自由基的清除作用高于染料木素游离药物组的清除作用，浓度大于20μg/mL时，P<0.01，具有显著差异，说明染料木素纳米冻干粉对羟自由基的清除作用远远高于染料木素游离药物组。

4、染料木素胶束冻干粉对3T3细胞(成纤维细胞)的抑制作用

(一)、依照如下步骤，测定染料木素胶束冻干粉对3T3细胞的抑制作用：

(1)接种细胞

0.25％胰蛋白酶消化液消化细胞，计数，用10％FBS培养液配成5×10⁴个/mL的细胞悬液，按每孔100μL加入96孔板中，每组、每时间段设5个复孔，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中培养。选择MTT实验的细胞3T3生长处于对数期。MTT细胞在复苏后2-3次分瓶的时候用于实验较好。

(2)药物作用

培养24小时，当细胞贴壁时，快速倒去培养液，无尘纸吸干。对照组各孔加入10％FBS 的DMEM高糖培养液100μL，处理组各孔分别加入不同浓度的药物各100μL。在37℃、5％CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中培养24小时、48小时、72小时。

(3)显色

快速倾倒培养液，药物浑浊时PBS洗涤后无尘纸吸干。加入含10％DMEM液100μL。混匀后培养箱继续培养4小时。快速倾倒培养液，吸干，每孔加入DMSO 100μL裂解细胞，在水平摇床上摇1分钟，20分钟内测定OD值，测定波长为490nm。

二、实验分组

调零组：DMEM液，即为阴性对照组

对照组：DMEM培养液+细胞+稀释药物介质，即为细胞对照组

处理组：DMEM培养液+细胞+不同浓度药物

三、计算

计算处理组细胞生长抑制率的平均值(排除最大值和最小值，其余数值取平均)，计算公式如下：

用药物抑制浓度计算软件(IC50)计算出药物作用细胞24小时、48小时、72小时该细胞存活率为50％的药物浓度。

染料木素胶束冻干粉对3T3细胞的抑制作用结果如图2、图3、图4所示(注：图2中GNP为染料木素纳米冻干粉，G为染料木素纳米冻干粉制备方法中，S2中未经任何处理的染料木素游离药物组)。

由图2、图3、图4可知，染料木素纳米冻干粉和染料木素游离药物组对3T3细胞均有一定的抑制作用，染料木素纳米冻干粉在40μg/mL浓度下处理24小时即可杀死50％细胞，或者在5μg/mL浓度下处理72小时也可杀死50％细胞。当药物处理24小时，浓度大于20μg/mL，两种药品具有统计学差异，药物处理48小时，浓度大于10μg/mL，药物处理72小时，药物浓度浓度大于10μg/mL两种药品即具有显著的差异，说明染料木素纳米冻干粉与染料木素游离药物相比对3T3细胞的抑制作用更稳定，更强。

5、染料木素胶束冻干粉对B16细胞(黑色素瘤细胞)的抑制作用

(一)、依照如下步骤，测定染料木素胶束冻干粉对B16细胞的抑制作用：

(1)接种细胞

0.25％胰蛋白酶消化液消化细胞，计数，用10％FBS培养液配成5×10⁴个/mL的细胞悬液，按每孔100μL加入96孔板中，每组、每时间段设5个复孔，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中培养。选择MTT实验的细胞B16生长处于对数期。MTT细胞在复苏后2-3次分瓶的时候用于实验较好。

(2)药物作用

培养24小时，当细胞贴壁时，快速倒去培养液，无尘纸吸干。对照组各孔加入10％FBS 的DMEM培养液100μL，处理组各孔分别加入不同浓度的药物各100μL。在37℃、5％CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中培养24小时、48小时、72小时。

(3)显色

快速倾倒培养液，药物浑浊时PBS洗涤后无尘纸吸干。加入含10％DMEM液100μL。混匀后培养箱继续培养4小时。快速倾倒培养液，吸干，每孔加入DMSO 100μL裂解细胞，在水平摇床上摇1分钟，20分钟内测定OD值，测定波长为490nm。

二、实验分组

调零组：DMEM液，即为阴性对照组

对照组：DMEM培养液+细胞+稀释药物介质，即为细胞对照组

处理组：DMEM培养液+细胞+不同浓度药物

三、计算

计算处理组细胞生长抑制率的平均值(排出最大值和最小值，其余数值取平均)，计算公式如下：

用药物抑制浓度计算软件(IC50)计算出药物作用细胞24小时、48小时、72小时该细胞存活率为50％的药物浓度。

染料木素胶束冻干粉对B16细胞的抑制作用结果如图5、图6、图7所示(注：图中GNP为染料木素纳米冻干粉，G为染料木素纳米冻干粉制备方法中，S2中未经任何处理的染料木素游离药物组)。

由图5、图6、图7可知，采用不同的浓度的染料木素纳米冻干粉处理B16细胞24小时、48小时、72小时，染料木素纳米冻干粉在48小时大于40μg/mL浓度和72小时大于5μg/mL浓度时对B16细胞均有一定的抑制作用，而染料木素游离药物组在低于2.5μg/mL浓度时对B16细胞没有抑制作用，甚至有一定的增殖作用。说明染料木素纳米冻干粉对B16细胞具有抑制作用，而染料木素游离药物却没有明显的B16细胞抑制作用。由此可知染料木素纳米冻干粉较染料木素对黑色素瘤细胞有一定的抑制作用。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (6)

1.染料木素纳米冻干粉在抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化中的应用。

2.一种护肤品，其特征在于，其含有权利要求1所述的染料木素纳米冻干粉。

3.一种含有权利要求1所述的染料木素纳米冻干粉的护肤品，其特征在于，其由质量百分含量的如下组分组成：

4.根据权利要求3所述的护肤品，其特征在于，其由质量百分含量的如下组分组成：

5.一种权利要求2-4所述的护肤品的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1：按配比将海藻糖、玻尿酸、染料木素胶束冻干粉、熊果苷、纯露和水混合，制备出水相；

S2：按配比将霍霍巴油、维生素E、甘油混合，制备出油相；

S3：将水相和油相混合，再加入乳化剂，混匀即制成所述护肤品。

6.一种抑制皮肤瘢痕形成和皮肤纤维化的药物组合物，其特征在于，其含有权利要求1所述的染料木素纳米冻干粉。