CN110195050B - 一种高纯度门冬酰胺酶的制备方法 - Google Patents

一种高纯度门冬酰胺酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高纯度门冬酰胺酶的制备方法。具体而言，该方法包括门冬酰胺酶溶液经阴离子层析柱、阳离子层析柱纯化的步骤，所得门冬酰胺酶纯度在99％以上，每1单位门冬酰胺酶中含内毒素的量小于0.015EU。本发明所述的制备工艺操作简单，回收率高，成本低，工艺衔接性好，适合工业化生产。

Description

一种高纯度门冬酰胺酶的制备方法
技术领域
本发明提供了一种高纯度门冬酰胺酶的制备纯化方法，属于生物工程领域。
技术背景
L-门冬酰胺酶(L-Asparaginase，L-ASP)，又名L-天冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，商品名为左旋门冬酰胺酶，是一种重要的抗肿瘤药物。目前在临床上可用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病(Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等，其中对ALL的诱导缓解期疗效最好。L-ASP单独使用对ALL的有效率为60％；与长春碱(Vincristine)及皮质留类药物(Corticosteroids)等药物联合使用时，对ALL的有效率高达95％，是临床治疗白血病的重要药物。
生产L-门冬酰胺酶的方法常采用大肠杆菌发酵技术，即通过发酵培养获得大量的菌体，通过破菌、提纯后获得高纯度的L-门冬酰胺酶。CN101063118B报道了一种纯化L-门冬酰胺酶的方法，包括通过溶菌酶破菌，利用MnCl2，硫酸铵两步分级沉淀后，透析脱盐，乙醇三步分级沉淀，再进行离子交换层析、疏水层析，浓缩脱盐，除菌及冷冻干燥的步骤。此方法存在诸多生产操作的不便，如1)工艺中使用了大量有机溶剂乙醇，放大生产时还需对车间加装防爆设施，增加建设成本；2)多次沉淀、复溶及脱盐，工艺繁杂，效率低下，工艺放大困难；3)纯化工艺繁琐，操作时间长势必影响溶液中门冬酰胺酶的稳定性。
CN101831417A报道了一种L-门冬酰胺酶的制备方法：酶破菌—阳离子层析—亲和层析。但此方法中CM-纤维素阳离子填料分离度较差，不利于门冬酰胺酶的纯化，所用亲和填料的配基易于脱落，也会影响所得门冬酰胺酶质量。另外，亲和填料市售价格偏高，必然无形增加生产纯化成本。
因此，技术人员迫切需要开发一种回收率高、衔接性好，同时能够工业化大规模生产高纯度的门冬酰胺酶的方法。
发明内容
本发明提供了一种制备门冬酰胺酶的方法，该方法包括：将门冬酰胺酶溶液经阴离子层析柱纯化的步骤，其中，所述阴离子层析柱填料选自Capto Q ImpRes填料、QSepharose XL填料或Diamond Q Mustang填料，优选Diamond Q Mustang填料；所述所述阳离子层析柱填料选自Capto SPImpRes填料、Diamond SP Mustang填料或SP Sepharose FF填料，优选Capto SPImpRes填料。
在一些实施方案中，用缓冲液洗脱阴离子层析柱，所述缓冲液pH为7.0～9.0，可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0，以防止洗脱过程由于层析柱pH急剧变化而导致门冬酰胺酶的聚集变质；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(如，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠组合、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾组合，等等)、三羟基氨基甲烷盐缓冲液(如，三羟甲基氨基甲烷-盐酸组合，等等)、甘氨酸盐缓冲液(如，甘氨酸-氢氧化钠组合，等等)、铵盐缓冲液(如，氯化铵-氨水组合，等等)，优选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液或氯化铵-氨水缓冲液，更优选三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
在优选实施方案中，所述缓冲液还含有盐，所述盐在溶液中浓度为0.3～1.0M(摩尔/升)，可以为0.30、0.32、0.34、0.36、0.38、0.40、0.42、0.44、0.46、0.48、0.50、0.52、0.54、0.56、0.58、0.60、0.62、0.64、0.66、0.68、0.70、0.72、0.74、0.76、0.78、0.80、0.82、0.84、0.86、0.88、0.90、0.92、0.94、0.96、0.98或1.00M；所述盐为本领域技术人员所熟知的，选自但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾中的至少一种。
优选地，经阴离子层析柱所得洗脱液中门冬酰胺酶纯度大于95.0％，可以为95.0、95.1、95.2、95.3、95.4、95.5、95.6、95.7、95.8、95.9、96.0、96.1、96.2、96.3、96.4、96.5、96.6、96.7、96.8、96.9、97.0、97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8或99.9％或更高。
本发明所述制备门冬酰胺酶的方法，还包括经阴离子层析柱所得洗脱液再经阳离子层析柱纯化的步骤，所得洗脱液(2)中门冬酰胺酶纯度大于99.0％，可以为99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％或更高；所述阳离子层析柱填料选自CaptoSPImpRes填料、Diamond SP Mustang填料或SP Sepharose FF填料，优选Capto SPImpRes填料。
在可选实施方案中，用缓冲液(2)洗脱阳离子层析柱，所述缓冲液(2)pH为3.0～5.0，可以3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0；所述缓冲液(2)选自乙酸盐缓冲液(如，乙酸钠-乙酸组合，乙酸钾-乙酸组合，等等)、柠檬酸盐缓冲液(如，柠檬酸钾-柠檬酸组合，柠檬酸钠-柠檬酸组合，等等)、磷酸盐缓冲液(如，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠组合、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾组合，等等)，优选自乙酸钠-乙酸缓冲液、乙酸钾-乙酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸钾-柠檬酸缓冲液或磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，更优选为乙酸钠-乙酸缓冲液。
在优选实施方案中，所述缓冲液(2)中还含有盐，所述盐在溶液中浓度为0.3～1.0M(摩尔/升)，可以为0.30、0.32、0.34、0.36、0.38、0.40、0.42、0.44、0.46、0.48、0.50、0.52、0.54、0.56、0.58、0.60、0.62、0.64、0.66、0.68、0.70、0.72、0.74、0.76、0.78、0.80、0.82、0.84、0.86、0.88、0.90、0.92、0.94、0.96、0.98或1.00M；所述盐为本领域技术人员所熟知的，选自但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾中的至少一种。
在优选实施方案中，本发明所述制备门冬酰胺酶的方法，包括：门冬酰胺酶溶液经阴离子层析柱纯化后，再将所得洗脱液经阳离子层析柱纯化的步骤。
在优选实施方案中，本发明所述制备门冬酰胺酶的方法还包括在门冬酰胺酶溶液经阴离子层析柱纯化之前，所述门冬酰胺酶溶液经弱阳离子复合填料的层析柱纯化的步骤，所述弱阳离子复合填料可高效的与门冬酰胺酶相结合，进而在随后洗脱过程中有效的去除如杂蛋白、色素、细胞壁等杂质；所述弱阳离子复合填料选自Capto MMC填料、
Figure BDA0001978670220000031
HCX填料、Bestarose Diamond MMC填料或UniMSP-30S填料，优选自Capto MMC填料或Bestarose Diamond MMC填料。
在另一些实施方案中，用碱性缓冲液洗脱弱阳离子复合填料，所述碱性缓冲pH为7.0～9.0，可为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0；所述缓冲剂浓度为20～150mM，可为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150mM。
进一步地，所述碱性缓冲液选自磷酸盐缓冲液(如，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠组合、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾组合，等等)、三羟基氨基甲烷盐缓冲液(如，三羟甲基氨基甲烷-盐酸组合，等等)、甘氨酸盐缓冲液(如，甘氨酸-氢氧化钠组合，等等)、铵盐缓冲液(如，氯化铵-氨水组合，等等)，优选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化铵-氨水缓冲液，更优选为三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
优选地，经弱阳离子复合填料层析柱所得洗脱液中门冬酰胺酶纯度大于90.0％，可以为90.0、90.2、90.4、90.6、90.8、91.0、91.2、91.4、91.6、91.8、92.0、92.2、92.4、92.6、92.8、93.0、93.2、93.4、93.6、93.8、94.0、94.2、94.4、94.6、94.8、95.0、95.2、95.4、95.6、95.8、96.0、96.2、96.4、96.6、96.8、97.0、97.2、97.4、97.6、97.8、98.0％或更高。
本发明所述制备门冬酰胺酶的方法，包括：
a)将门冬酰胺酶溶液经弱阳离子复合填料的层析柱纯化；
b)随后再经阴离子层析柱纯化；
c)再将步骤b)所得洗脱液经阳离子层析柱纯化，
其中，所述复合填料选自Capto MMC填料、
Figure BDA0001978670220000041
HCX填料、Bestarose DiamondMMC填料或UniMSP-30S填料，优选自Capto MMC填料或Bestarose Diamond MMC填料；所述阴离子层析柱填料选自Capto Q ImpRes填料、Q Sepharose XL填料或Diamond Q Mustang填料，优选Diamond Q Mustang填料；所述阳离子层析柱填料选自Capto SPImpRes填料、Diamond SP Mustang填料或SP Sepharose FF填料，优选Capto SPImpRes填料。
在一些实施方案中，用碱性缓冲液洗脱弱阳离子复合填料，所述碱性缓冲液pH为7.0～9.0；用缓冲液洗脱阴离子层析柱，所述缓冲液pH为7.0～9.0；用缓冲液(2)洗脱阴离子层析柱，所述缓冲液(2)pH为3.0～5.0。
本发明所述制备门冬酰胺酶的方法中门冬酰胺酶溶液由生产门冬酰胺酶的菌体在碱性条件下破壁后，经酸性条件沉淀，过滤的步骤所得(或生产门冬酰胺酶的菌体在碱性条件下破壁后，经酸性条件沉淀，过滤得清液(即门冬酰胺酶溶液)的步骤)；所述碱条件pH为10.0～12.0，可以为10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8或12.0；所述酸性条件pH为4.0～5.0，可以为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0；破壁时所使用碱性条件的试剂选自但不限于氢氧化钠、氢氧化钾或氨水等溶液中的至少一种；沉淀时所用酸性条件的试剂选自但不限于乙酸、盐酸、磷酸或枸橼酸中的至少一种。
本发明所述过滤方式为本领域技术人员所熟知的，选自但不限于离心过滤、死端过滤或切向流过滤
所述切向流过滤方式为中空纤维膜过滤和膜包过滤，优选中空纤维膜过滤；所述中空纤维膜过滤使用的中空纤维管内径包括但不限于0.5mm、0.75mm、1mm或1.75mm，优选1mm。
本发明所述死端过滤所用滤膜孔径可选0.22μm或0.45μm，所述滤膜材料选自但不限于聚偏氟乙烯或聚四氟乙烯。
进一步地，将前述步骤c)中经阴离子层析柱所得洗脱液冻干，即可获得门冬酰胺酶，所述门冬酰胺酶中每1单位门冬酰胺酶中含内毒素的量小于0.015EU。
本发明还提供一种制备门冬酰胺酶药物组合物的方法，包括：前述制备门冬酰胺酶方法的步骤，以及将前述步骤c)中经阴离子层析柱所得洗脱液冻干的步骤。
进一步地，制备门冬酰胺酶药物组合物的方法还包括将经阴离子层析柱所得洗脱液经置换后，加入甘露醇和无机盐混匀得门冬酰胺酶溶液(2)的步骤，所述无机盐选自但不限于磷酸盐(如磷酸钠等)或柠檬酸盐(如柠檬酸钠等)中的至少一种，优选自磷酸钠或柠檬酸钠。
在一些实施方案中，前述门冬酰胺酶溶液(2)中无机盐浓度为30～70mM，可以为30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70mM；门冬酰胺酶溶液(2)中门冬酰胺酶的浓度为10～35g/L，可以为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35g/L；门冬酰胺酶溶液(2)甘露醇和无机盐总质量与门冬酰胺酶的质量比为2:3～3:2，可以为2:3、5:6、1:1、6:5或3:2。
本发明还提供了一种门冬酰胺酶药物组合物，含有甘露醇和无机盐，所述无机盐浓度为30～70mM，可以为30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70mM；门冬酰胺酶的浓度为10～35g/L，可以为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35g/L；甘露醇和无机盐总质量与门冬酰胺酶质量比为2:3～3:2，可以为2:3、5:6、1:1、6:5或3:2。
进一步地，所述门冬酰胺酶药物组合物中所述无机盐选自但不限于磷酸盐(如磷酸钠等)或柠檬酸盐(如柠檬酸钠等)中的至少一种，优选自磷酸钠或柠檬酸钠。
本发明所述门冬酰胺酶为L-门冬酰胺酶。
本发明还提供了一种由前述药物组合物冻干所得门冬酰胺酶冻干粉，所述门冬酰胺酶纯度大于99.0％，可以为99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％或更高。
进一步地，本发明门冬酰胺酶冻干粉中每1单位门冬酰胺酶中含内毒素的量小于0.015EU。
同时，本发明所得门酰胺酶冻干粉在温度2-8℃的条件下放置3个月各项考核指标(如纯度、比活性等)均没有明显变化。
本发明所得门酰胺酶冻干粉在温度2-8℃的条件下放置6个月各项考核指标(如纯度、比活性等)均没有明显变化。
本发明所得门酰胺酶冻干粉在温度2-8℃的条件下放置12个月各项考核指标(如纯度、比活性等)均没有明显变化。
本发明所得门酰胺酶冻干粉在温度2-8℃的条件下放置24个月各项考核指标(如纯度、比活性等)均没有明显变化。
本发明方法中所用弱阳离子复合填料、阴离子层析柱填料、阳离子层析柱填料在使用前优选经相应缓冲液平衡后使用。平衡阴离子层析填料的缓冲液pH7.0～9.0，可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0；所述缓冲液浓度为20～150mM，可以为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150mM，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(如，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠组合、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾组合，等等)、三羟基氨基甲烷盐缓冲液(如，三羟甲基氨基甲烷-盐酸组合，等等)、甘氨酸盐缓冲液(如，甘氨酸-氢氧化钠组合，等等)或铵盐缓冲液(如，氯化铵-氨水组合，等等)，优选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液或氯化铵-氨水缓冲液，更优选为三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。平衡阳离子层析填料的缓冲液pH 4.0～5.0，可以为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0；所述缓冲液浓度为5～100mM，可以为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mM；所述缓冲液选自乙酸盐缓冲液(如，乙酸钠-乙酸组合，乙酸钾-乙酸组合，等等)、柠檬酸盐缓冲液(如，柠檬酸钾-柠檬酸组合，柠檬酸钠-柠檬酸组合，等等)或磷酸盐缓冲液(如，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠组合、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾组合，等等)，优选自乙酸钠-乙酸缓冲液、乙酸钾-乙酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸钾-柠檬酸缓冲液或磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，更优选为乙酸钠-乙酸缓冲液。
本发明还提供了一种培门冬酰胺酶的制备方法，包括由前述方法制备所得门冬酰胺酶或门冬酰胺酶药物组合物经聚乙二醇修饰的步骤。
本发明所述置换步骤可为通常意义上的除盐步骤，即可采用透析、超滤、脱盐柱层析等方式将门冬酰胺酶溶液中无机盐或酸等小分子量化合物去除，达到置换样品缓冲体系的目的。
本发明所述冻干工艺包括：
预冻：隔板温度-45℃，维持1～4h，可为1、2、3、4h；
第一次干燥：隔板维持温度-25℃，维持时间20～30h，具体可选20、25、30h，真空条件为10～40Pa，具体可选10、20、30、40Pa；隔板维持温度-10℃，维持时间20～30h，可为20、25、30h，真空条件为10～40Pa，可为10、20、30、40Pa；
第二次干燥：隔板维持温度25℃，维持时间5～15h，可为5、10、15h，真空条件为10～40Pa，可为10、20、30、40Pa。
本发明所述SEC-HPLC检测条件：
色谱柱：亲水改性硅胶为填充剂(如SKgel G3000SWXL柱，5μm，300mm×7.8mm)；流动相：磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH约6.7；柱温为25℃，等度洗脱，检测波长280nm。
本发明所述弱阳离子复合填料(如Capto MMC填料)、阴离子层析柱填料(如QSepharose XL)或阳离子层析柱填料(如Diamond SP Mustang)等填料可通过商业途径购买获得；所述超滤膜可购自默克密理博公司。
具体实施方式：
以下结合具体实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
实施例1:
称取10kg的菌体放入悬浮罐中(菌种为E.coli AS1.357，购自中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)，发酵工艺可参照《重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的中试工艺及其性质的研究》，中国药学杂志2000年4月第35卷第4期268-271页)加入20mM乙酸钠-乙酸溶液(pH4.0)90L，搅拌确保菌体得到充分悬浮；向其中加入25％浓度的氨水，调节pH至10.0，持续搅拌后，用盐酸调节pH至4.0，维持搅拌确保菌体碎片得到充分沉淀，离心过滤得上清液(即门冬酰胺酶溶液)。
实施例2:
将按实施例1方法所得上层清液(即门冬酰胺酶溶液)负载于已用20mM乙酸钠-乙酸溶液(pH4.0)平衡的Bestrose Diamond MMC层析柱上，随后用100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)溶液进行洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度93.45％，收率98.70％。
实施例3:
将按实施例1方法所得上层清液(即门冬酰胺酶溶液)负载于已用20mM乙酸钠-乙酸溶液(pH4.6)平衡的Capto Diamond MMC层析柱上，随后用100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.5)溶液进行洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度93.47％，收率98.73％。
实施例4:
将按实施例1方法所得上层清液(即门冬酰胺酶溶液)负载于已用20mM乙酸钠-乙酸溶液(pH4.6)平衡的
Figure BDA0001978670220000091
HCX层析柱上，随后用100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.5)溶液进行洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度92.17％，收率97.82％。
实施例5:
将按实施例1方法所得上层清液(即门冬酰胺酶溶液)负载于已用20mM乙酸钠-乙酸溶液(pH4.6)平衡的UniMSP-30S层析柱上，随后用100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.5)溶液进行洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度92.05％，收率97.63％。
实施例6:
将按实施例2方法所得洗脱液负载于已用30mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH8.0)平衡好的Q Sepharose XL层析柱上，随后用含30mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸的0.3mol/L NaCl溶液(pH8.0)梯度洗脱，收集洗脱液，经SEC-HPLC检测，纯度98.55％，收率90％；
将上一步所得洗脱液负载于已用30mM乙酸钠-乙酸(pH4.0)溶液平衡好的DiamondSP Mustang层析柱上，随后用含30mM乙酸钠-乙酸的0.3mol/L氯化钠溶液(pH4.0)梯度洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度99.82％，收率95％。
实施例7:
将按实施例2方法所得洗脱液负载于已用30mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH8.0)平衡好的Diamond Q Mustang层析柱上，随后用含30mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸的0.3mol/L NaCl溶液(pH8.0)梯度洗脱，收集洗脱液，经SEC-HPLC检测，纯度98.77％，收率90.30％。
实施例8:
将按实施例2方法所得洗脱液负载于已用30mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH8.0)平衡好的Capto Q ImpRes层析柱上，随后用含30mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸的0.3mol/L NaCl溶液(pH8.0)梯度洗脱，收集洗脱液，经SEC-HPLC检测，纯度96.64％，收率88.42％。
实施例9:
将按实施例6方法所得洗脱液负载于已用30mM乙酸钠-乙酸(pH4.0)溶液平衡好的Diamond SP Mustang层析柱上，随后用含30mM乙酸钠-乙酸的0.3mol/L氯化钠溶液(pH4.0)梯度洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度99.82％，收率95％。
实施例10:
将按实施例6方法所得洗脱液负载于已用30mM乙酸钠-乙酸(pH4.0)溶液平衡好的Capto SPImpRes层析柱上，随后用含30mM乙酸钠-乙酸的0.3mol/L氯化钠溶液(pH4.0)梯度洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度99.95％，收率95.25％。
实施例11:
将按实施例6方法所得洗脱液负载于已用30mM乙酸钠-乙酸(pH4.0)溶液平衡好的SP Sepharose FF层析柱上，随后用含30mM乙酸钠-乙酸的0.3mol/L氯化钠溶液(pH4.0)梯度洗脱，收集洗脱液，样品经SEC-HPLC检测，纯度94.35％，收率92.13％。
实施例12:
将按实施例9方法所得门冬酰胺酶液(即经Diamond SP Mustang层析柱的洗脱液)进行膜包超滤，加入1mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.8)和甘露醇，控制混合后溶液体系中磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的浓度为30mM，蛋白浓度为20g/L，甘露醇和磷酸盐总质量与门冬酰胺酶的质量比6:4，再经0.22μm滤器过滤，冷冻干燥得门冬酰胺酶冻干粉，样品经SEC-HPLC检测，纯度99.82％，每1单位门冬酰胺酶中含内毒素的量小于0.015EU。
冻干工艺如下：
预冻：隔板温度-45℃，维持2h；
第一次干燥，隔板维持温度-25℃，维持时间24h，真空条件为30Pa；隔板维持温度-10℃，维持时间24h，真空条件为30Pa；
第二次干燥：隔板维持温度25℃，维持时间10h，真空条件为10Pa。
稳定性实验：将门酰胺酶冻干粉放置在温度2-8℃的条件下考察其稳定、活性，具体数据如下：
表1
时间点 SEC-HPLC 比活(IU/mg) 干燥失重
0M 99.7％ 276 4.4％
3M 99.4％ 270 4.3％
6M 99.8％ 280 3.9％
9M 99.8％ 262 4.1％
12M 99.2％ 267 4.2％
24M 99.6％ 274 4.3％
结论：门酰胺酶冻干粉在温度2-8℃的条件下放置24个月各项考核指标(如纯度、比活性等)均没有明显变化，样品具有更优的稳定性。

Claims (21)

1.一种制备门冬酰胺酶的方法，包括：a)将门冬酰胺酶溶液经弱阳离子复合填料的层析柱纯化，所述复合填料选自Capto MMC填料或Bestarose Diamond MMC填料；b)随后再经阴离子层析柱纯化，所述阴离子层析柱填料选自Diamond Q Mustang填料；c)再将步骤b)所得洗脱液经阳离子层析柱纯化，所述阳离子层析柱填料选自Capto SPImpRes填料，
阴离子层析柱洗脱用缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟基氨基甲烷盐缓冲液、甘氨酸盐缓冲液、铵盐缓冲液，所述阴离子层析柱洗脱用缓冲液pH为7.0～9.0；
阳离子层析柱洗脱用缓冲液(2)选自乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液(2)pH为3.0～5.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阴离子层析柱洗脱用缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液、三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液或氯化铵-氨水缓冲液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阴离子层析柱洗脱用缓冲液中还含有盐，所述盐在溶液中浓度为0.3～1.0M。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液(2)选自乙酸钠-乙酸缓冲液、乙酸钾-乙酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸钾-柠檬酸缓冲液或磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液(2)中还含有盐，所述盐在溶液中浓度为0.3～1.0M。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠或硫酸钾。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用碱性缓冲液洗脱弱阳离子复合填料。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述碱性缓冲液pH为7.0～9.0。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述碱性缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟基氨基甲烷盐缓冲液、甘氨酸盐缓冲液或铵盐缓冲液。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述碱性缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述碱性缓冲液浓度选自20～150mM。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括生产门冬酰胺酶的菌体在碱性条件下破壁后，经酸性条件沉淀，过滤的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述碱性条件pH10.0～12.0；所述酸性条件pH4.0～5.0。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，过滤方式选自离心过滤、死端过滤或切向流过滤。
16.一种制备门冬酰胺酶药物组合物的方法，包括：权利要求1-15任意一项所述方法，以及将经阳离子层析柱所得洗脱液冻干的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，还包括将经阳离子层析柱所得洗脱液经置换后，加入甘露醇和无机盐混匀得门冬酰胺酶溶液(2)的步骤，所述无机盐选自磷酸盐或柠檬酸盐中的至少一种。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自磷酸钠或柠檬酸钠。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述门冬酰胺酶溶液(2)中无机盐浓度为30～70mM；门冬酰胺酶的浓度为10～35g/L；甘露醇和无机盐总质量与门冬酰胺酶的质量比为2:3～3:2。
20.根据权利要求1-19任意一项所述的方法，其特征在于，所述门冬酰胺酶为L-门冬酰胺酶。
21.一种培门冬酰胺酶的制备方法，包括由权利要求1-15任意一项所述的方法制备所得门冬酰胺酶经聚乙二醇修饰的步骤。
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