CN110193006B - 盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶及其制备方法和用途，该智能水凝胶包含：P407、P188、水、NaHSO3、NaHCO3和盐酸氨基葡萄糖；其中，所述P407的质量分数为20％～24％，所述P188的质量分数为2％～8％；所述NaHSO3的质量分数为1％～2％；所述盐酸氨基葡萄糖的质量分数为3％～8％；所述NaHCO3调节pH为5～7。本发明的智能水凝胶通过关节腔局部给药，使氨基葡萄糖有效地靶向到关节软骨，并在体温作用下实现胶凝转变，延长氨基葡萄糖在体内的释放时间，减少药物的注射刺激减轻对机体的刺激性，从而实现了对骨关节炎的治疗作用。

Description

盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种智能水凝胶，具体涉及一种盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是骨骼与关节疾病的总称，是一种由创伤、关节先天性异常、关节畸形、软骨破裂或破坏等原因造成的慢性、渐进性疾病，其也是宠物犬常发的一种关节疾病。骨关节炎发病机制目前尚未明确，众多因素均可诱导其发生，因此治疗方法也各有不同。
骨关节炎治疗原则是减缓疼痛，控制炎症及促进软骨愈合，一般包括物理疗法(运动，减肥，按摩等)、药物治疗、手术治疗，营养疗法等。药物治疗中上医生往往使用抗炎药达到消炎镇痛的效果，非甾体类抗炎药通常是抗炎药的首选，如美国辉瑞公司生产的Rimadyl(力莫敌)，是可以缓解犬骨关节炎疼痛的一种非甾体类消炎镇痛剂，其作用类似于阿司匹林和布洛芬。虽然非甾体类抗炎药在镇痛抗炎上很有效，但不能治疗疾病或修复关节异常，且长期使用非甾体类抗炎药会对胃肠道造成不良反应。此外，它对心脑血管和肾的危害也值得关注。
无论是非选择性或者是选择性非甾体类抗炎药都有发生类似不良反应的风险，因此开发一种能有效治疗骨关节炎，缓解疼痛且修复软骨组织的药物成为兽药行业的需求。
氨基葡萄糖(Glucosamine)是一种从天然甲壳素中提取的氨基己糖，其在体外以硫酸盐或盐酸盐的形式存在，进人人体后在胃内转化成游离的氨基葡萄糖而被身体利用。氨基葡萄糖主要存在于机体的关节软骨中，是关节软骨基质合成蛋白聚糖必需的重要物质，能够选择性地作用于骨关节，在一定程度上阻断骨性关节炎的病理发展过程，从而起到了抗炎、缓解骨性关节炎的疼痛症状、改善关节功能，以及阻止骨性关节炎病程进展的功能。
在欧洲，氨基葡萄糖已经作为一种治疗关节炎的处方药，而在美国，氨基葡萄糖被作为保健品食用。目前，氨基葡萄糖主要以口服胶囊或者片剂在临床使用，尚未见氨基葡萄糖的局部用药的剂型。
发明内容
本发明的目的是提供一种盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶及其制备方法和用途，该智能水凝胶解决了现有盐酸氨基葡萄糖未有局部用药剂型的问题，能够通过关节腔局部给药，使盐酸氨基葡萄糖有效地靶向到关节软骨，并延长盐酸氨基葡萄糖在体内的释放时间。
为了达到上述目的，本发明提供了一种盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶，该智能水凝胶包含：P407、P188、水、NaHSO3、NaHCO3和盐酸氨基葡萄糖；其中，所述P407的质量分数为20％～24％，所述P188的质量分数为2％～8％；所述NaHSO3的质量分数为1％～2％；所述盐酸氨基葡萄糖的质量分数为3％～8％；所述NaHCO3调节PH为5～7。
本发明通过构建盐酸氨基葡萄糖的骨关节智能水凝胶溶液，通过关节腔局部给药，使盐酸氨基葡萄糖有效地靶向到关节软骨，并在体温作用下实现胶凝转变，延长氨基葡萄糖在体内的释放时间，减少频繁注射对机体的刺激性，从而实现对骨关节炎的治疗作用。
优选地，所述骨关节智能水凝胶的凝胶温度为32℃～38℃。本发明的智能水凝胶具有受热反向胶凝，其凝胶温度使得其在体内能够由液体变为凝胶状态，延长氨基葡萄糖在体内的释放时间，减少频繁注射对机体的刺激性，从而实现对骨关节炎的治疗作用。
优选地，所述P407的质量分数为22％，所述P188的质量分数为4％；或所述P407的质量分数为24％，所述P188的质量分数为8％；或所述P407的质量分数为23％，所述P188的质量分数为6％；或所述P407的质量分数为20％，所述P188的质量分数为2％。
本发明还提供了一种所述的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶的制备方法，该方法包含：将P407和P188于水中溶胀，得到聚合物溶液，在该聚合物溶液中依次加入盐酸氨基葡萄糖、NaHSO3和NaHCO3溶解，溶胀，得到所述盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶。
优选地，所述将P407和P188于水中4℃下溶胀；所述聚合物溶液中依次加入盐酸氨基葡萄糖、NaHSO3和NaHCO3溶解，置于4℃下，得到所述盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶。
本发明还提供了一种所述的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶的用途，该骨关节智能水凝胶作为用于制备治疗骨关节炎药物的用途。
优选地，所述骨关节智能水凝胶通过关节注射给药。
优选地，所述注射给药剂量为0.2～0.3mL/kg。
优选地，所述骨关节包括：膝关节。
优选地，该骨关节智能水凝胶作为用于制备治疗动物骨关节炎药物的用途，包括：犬类、兔。
本发明的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶及其制备方法和用途，解决了现有盐酸氨基葡萄糖未有局部用药剂型的问题，具有以下优点：
(1)本发明的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶通过关节腔局部给药，使氨基葡萄糖有效地靶向到关节软骨，并在体温作用下实现胶凝转变，延长氨基葡萄糖在体内的释放时间，减少频繁注射对机体的刺激性，从而实现对骨关节炎的治疗作用；
(2)本发明的智能水凝胶用于关节腔注射，关节周围的血管少，氨基葡萄糖和泊洛沙姆通过血液循环进入其他组织的量很少，减少盐酸氨基葡萄糖的消耗，降低泊洛沙姆可能引起的全身毒副作用；
(3)本发明选用P407和P188制备凝胶，其他常用胶凝材料，如木聚糖，制作凝胶相转变温度低不便于室温处理和给药，纤维素衍生物的胶凝温度通常高于体温导致其不利于在体温下实现胶凝，本发明选用P407和P188其凝胶相转变温度适宜，且材料易得，去无毒、无刺激性，制备凝胶操作简单。
附图说明
图1为本发明实验例3的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝的释放情况结果图。
图2为所有组兔子关节形态图。
图3为所有组兔软骨HE染色图。
图4为所有组兔软骨阿利辛蓝染色图。
图5为所有组兔软骨番红-O染色图。
注：图2中，股骨髁：A(生理组)、B(高剂量组)、C(中剂量组)、D(低剂量组)、E(水溶液组)、F(空白凝胶组)、G(模型对照组)；胫骨平台：H(生理组)、I(高剂量组)、J(中剂量组)、K(低剂量组)、L(水溶液组)、M(空白凝胶组)、N(模型对照组)；图3～5中，A(生理组)、B(高剂量组)、C(中剂量组)、D(低剂量组)、E(水溶液组)、F(空白凝胶组)、G(模型对照组)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶的制备
精密称取适量P407(Poloxamer407，泊洛沙姆407)和P188(Poloxamer188，泊洛沙姆188)置于烧杯中，加入一定量注射用水，随后放入4℃冰箱中24h，P407和P188完全溶胀后得到澄清透明可流动的聚合物溶液，即为空白智能水凝胶。
在空白凝胶中依次加入不同量的盐酸氨基葡萄糖(GlcN·HCl)、NaHSO3、NaHCO3，并搅拌至完全溶解均匀，置于4℃冰箱中得到澄清透明溶液，得到不同成分含量的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶。其中，NaHSO3提高盐酸氨基葡萄糖在水溶液中的稳定性，NaHCO3作为pH调节剂。
本发明将可供人体注射用的具有受热反向胶凝性质的辅料与其他成分(如药物、添加剂)和水在4℃下混合直至得到同质溶液，低温条件有利于泊洛沙姆充分溶胀，使药物分散均匀且低温能提高氨基葡萄糖在水中的稳定性。
实验例2盐酸氨基葡萄糖、P407和P188含量对本发明的胶凝温度的影响
试管倒置法：取3mL凝胶置于15mL的试管中，水浴锅缓慢升温，每次升高1℃，待温度稳定后将装有凝胶的试管放入水浴锅中5min，观察凝胶状态。倒置试管，当凝胶由流动的液体变为不流动的半固体时即为胶凝，记录此时的温度。平行测定3组，取其平均值，即为凝胶的胶凝温度。
(1)P407含量对胶凝温度的影响
精密称取适量P407置于20mL水中，置于4℃条件，分别得到质量分数(w/v)为18％、20％、22％、24％、26％、28％和30％的P407溶液，采用上述试管倒置法测胶凝温度。
如下表1所示，为P407含量对胶凝温度的影响，从表中可以看出，胶凝温度(Tsol-gel，相转变温度)和P407呈现浓度依赖性，P407浓度的增大，胶凝温度降低。
表1 P407含量对胶凝温度的影响
Figure BDA0002069115630000051
注：表中的含量为该成分的质量分数。
(2)P188含量对胶凝温度的影响
称取22g P407和适量P188同时置于20mL水中，置于4℃条件，分别得到组成为22％P407+2％P188，22％P407+4％P188，22％P407+6％P188，22％P407+8％P188的混合溶液。用同样的方法配置24％P407+2％P188，24％P407+4％P188，24％P407+6％P188，24％P407+8％P188的混合溶液，所有溶液均用倒置法测胶凝温度。
如下表2所示，为P188含量对胶凝温度的影响，从表中可以看出，加入P188后，胶凝温度升高，P188同样和胶凝温度呈现浓度依赖性，P188含量越高，胶凝温度越高。
表2为P188含量对胶凝温度的影响
Figure BDA0002069115630000061
注：表中的含量为该成分在凝胶中的质量分数；表格中的百分数均为含量。
(3)盐酸氨基葡萄糖对胶凝温度的影响
精密称取适量盐酸氨基葡萄糖置于20mLP407和P188的混合溶液中，得到组合为：22％P407+4％P188，22％P407+4％P188+5％GlcN·HCl，22％P407+4％P188+10％GlcN·HCl，22％P407+4％P188+15％GlcN·HCl；以及24％P407+8％P188，24％P407+8％P188+5％GlcN·HCl，24％P407+8％P188+10％GlcN·HCl，24％P407+8％P188+15％GlcN·HCl的混合溶液，倒置法测胶凝温度。
如下表3所示，为氨基葡萄糖对胶凝温度的影响，由表中可以看出，加入氨基葡萄糖后凝胶的胶凝温度下降，且GlcN·HCl加入量越多，胶凝温度下降越多。
表3为氨基葡萄糖对胶凝温度的影响
Figure BDA0002069115630000062
注：表中的含量为该成分在凝胶中的质量分数；表格中的百分数均为含量。
实验例3智能水凝胶胶凝特性及释放情况
(1)胶凝特性
采用实验例1的方法制备本发明的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝，其成分为：23％P407+6％P188+5％盐酸氨基葡萄糖+0.2％NaHSO3，NaHCO3调节pH＝6。
上述制备的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶，在室温下为无色透明可流动的粘稠液体状态，在生理温度(37℃)下放置5～10min，为无色透明不可流动的半固体凝胶态。
(2)智能水凝胶体外释放
采用有膜法测量体外释放情况，具体如下：
将本实验例制备的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶放入分子截留量为8000～12000Da的透析袋中，PBS(Phosphate Buffered Solution，磷酸盐缓冲液)释放介质，分别与0.5、1、1.5、2、3、5、7、9、12、15、18和24h用注射器取3mL释放介质，同时补充等量新鲜介质(37.5℃)。取出的介质用0.22μm微孔滤膜过滤后，用HPLC检测氨基葡萄糖浓度。
如图1所示，为本发明实验例3的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝的释放情况结果图，可以看出本发明实验例3的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝在9h时能够达到和水溶液中的氨基葡萄糖释放率达到一致。
(3)智能水凝胶的粘度和针通性
用数字粘度计NDJ-5S测定温度在10、15、20、25、30℃下本发明实验例3的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝的粘度值，每个样测3次，取其平均值，具体结果如下表4所示。
表4本发明实验例3的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝的粘度(n＝3)
Figure BDA0002069115630000071
(4)智能水凝胶的针通性
用1mL注射器吸取适量本发明实验例3的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝，依次给注射器安装4、4.5、5、6、8号针头，挤推注射器观察盐酸氨基葡萄糖智能水凝胶是否可以顺利通过针头，具体结果如下表5所示。
表5本发明实验例3的盐酸氨基葡萄糖智能水胶凝的针通性
Figure BDA0002069115630000081
注：“+”表示凝胶可通过针头
实验例4盐酸氨基葡萄糖智能水胶凝对骨关节炎的药效研究
1、骨关节炎动物模型制备
制备含有2％的木瓜蛋白酶和0.03mmom/L的L-半胱氨酸的混合溶液，搅拌30min后静置一段时间，用微孔滤膜(0.22um)过滤，得到黄色澄清透明的木瓜蛋白酶混合液，置于4℃冰箱中备用。
随机挑选30只兔子进行OA(Osteoarthritis，骨关节炎)造模，分别在第1、3、7d，按0.1ml/kg的量，于膝关节腔内注射上述木瓜蛋白酶混合液。剩余兔子作为生理空白组不做任何处理。造模后第2周随机处死1只兔子观察造模是否成功。
2、分组及给药
以下给药实验采用的本发明实验例3制备的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水胶凝。
生理对照组(Ⅰ组)：未造模的5只兔子；
高剂量组(Ⅱ组)：造模后的30只兔子平均分为6个组，其中一组注射高剂量的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶；
中剂量组(Ⅲ组)：造模后的30只兔子平均分为6个组，其中一组注射中剂量的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶；
低剂量组(Ⅳ组)：造模后的30只兔子平均分为6个组，其中一组注射低剂量的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶；
氨基葡萄糖水溶液组(Ⅴ组)：造模后的30只兔子平均分为6个组，其中一组注射5％(W/V)的氨基葡萄糖水溶液；
空白凝胶组(Ⅵ组)：造模后的30只兔子平均分为6个组，其中一组注射空白智能水凝胶；
模型对照组(Ⅶ组)：造模后的30只兔子平均分为6个组，其中一组注射生理盐水0.2mL/kg。
其中，空白智能水凝胶为不含盐酸氨基葡萄糖的凝胶，具体制备如下：
精密称取适量P407和P188置于烧杯中，加入适量注射用水，随后放入4℃冰箱中24h，P407和P188完全溶胀后得到澄清透明可流动的聚合物溶液，再聚合物溶液中加入NaHSO3、NaHCO3，溶解置于4℃即为空白智能水凝胶。P407、P188、NaHSO3、NaHCO3用量与该实验中采用的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶中的一致。
上述所有组具体给药情况如下表6，均为关节腔注射给药，1此/周，连续4周。
表6为所有组具体给药情况
Figure BDA0002069115630000091
3、本发明的盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶对动物膝关节宽度的影响
如表7所示，为整个实验期间所有组的兔子膝关节宽度变化，造模前各组间兔子膝关节宽度无显著差异。造模一周后膝关节宽度显著增长，之后有所缓解。
治疗结束后，注射盐酸氨基葡萄糖骨关节智能水凝胶高剂量组(20.38±1.39mm)和中剂量组(20.29±0.66mm)膝关节宽度显著低于模型对照组(21.36±0.16mm)(P＜0.05)，其他实验组虽然和模型对照组差异不显著，但有下降的趋势，说明关节腔注射氨基葡萄糖智能水凝胶可抑制OA模型中膝关节宽度的增长。
表7为整个实验期间所有组的兔子膝关节宽度变化(n＝10)
Figure BDA0002069115630000101
注：表中数据为平均值±标准差；同一列中相同字母表示组间差异不显著，P＞0.05；不同字母表示组间差异显著，P＜0.05。
4、本发明的盐酸氨基葡萄糖智能水凝胶对关节液中IL-1β、TNF-α、PGE2和NO的含量影响
实验给药周期结束后，固定兔子，先向关节腔内注射1mL灭菌处理过的蒸馏水，反复屈膝数次，后抽取关节液0.5～0.8mL，观察关节液外观，12000r/min离心10min，取上清，-20℃保存待用。
用ELISA试剂盒检测IL-1β(采用购自上海酶联的兔IL-1βELISA试剂盒)、TNF-α(采用购自上海酶联的兔TNF-αELISA试剂盒)、PG E2含量(采用购自上海酶联的兔PG E2ELISA试剂盒)，NO硝酸还原酶检测试剂盒(购于南京建成)检测NO含量，具体操作如下：
IL-1β、TNF-α、PG E2检测操作，具体如下：
(1)标准品(标准品为试剂盒中自带的IL-1β、TNF-α、PG E2标准品)和待测样品加样，并在每孔中加入40μL样品稀释液(样品稀释液为试剂盒自带)；
(2)每孔加入100μL酶标试剂(辣根过氧化物酶标记的检测抗体)；
(3)封板37℃孵育60min；
(4)甩干孔中液体，重复洗涤5次，拍干；
(5)加入显色剂(TMB，3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，37℃避光孵育15min；加入终止液后，15min内测定每孔在450nm处的OD450值；
(6)以标准品的浓度为横坐标，所对应的OD450值为纵坐标建立标准曲线，根据样品的OD450值计算测试样品的浓度，再乘以稀释倍数得到样品的实际浓度。
NO检测操作(采用购于南京建成的NO硝酸还原酶检测试剂盒)，具体如下(参照试剂盒中说明书实施操作)：
(1)将表8中的试剂混匀，37℃孵育60min，表6如下：
表8为NO检测采用的试剂
Figure BDA0002069115630000111
注：标准品应用液为NO2 -溶液；混合试剂为试剂盒提供的试剂1和试剂2按照说明书所述配置而成的。
(2)再加入如下表9中的试剂：
表9为NO检测采用的试剂
Figure BDA0002069115630000112
注：试剂三和试剂四均为试剂盒中提供的。
(3)充分漩涡混匀30s，室温静置40min，3500-4000r/min离心10min，取各管中上清0.5mL，均加入0.6mL显色剂(参照试剂盒中说明书)，混匀后在室温下静置10min，用双蒸水调零，于550nm波长下测定各管吸光度值。
NO含量计算公式如下：
Figure BDA0002069115630000121
如表10所示，为所有组兔子关节液中NO、PG E2(前列腺素E2)、IL-1β(白细胞介素-1β)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的含量，从表中可以看出，造模后关节液中NO、PG E2、IL-1β和TNF-α的含量显著升高，氨基葡萄糖可抑制关节液中NO，PG E2，IL-1β和TNF-α的表达。
表10为所有组兔子关节液中NO、PG E2、IL-1β和TNF-α的含量
Figure BDA0002069115630000122
注：表中数据为平均值±标准差；同一列中相同字母表示组间差异不显著，P＞0.05；不同字母表示组间差异显著，P＜0.05。
5、盐酸氨基葡萄糖智能水凝胶对关节软骨中糖胺聚糖含量的影响
上述采用木瓜蛋白进行OA造模，可显著降低软骨中糖胺聚糖(GAG)的含量。
关节软骨中GAG的含量采取1，9-二甲基亚甲蓝(DMMB)方法进行测定，具体如下：
DMMB溶液配制：称取16mg DMMB、2.37gNaCl和3.04g甘氨酸溶于1000mL水中，用HCl调节pH＝3，过滤，避光保存。
软骨消化液配制：称取1.86g EDTA-2Na、0.606g L-赖氨酸、0.3g木瓜蛋白酶，溶于pH＝6.8的磷酸盐缓冲液中，过滤，低温保存。
分离兔子的膝关节股骨髁和胫骨平台，取关节股骨髁和胫骨平台软骨若干，称取重量，剪成小块，放入20mL软骨消化液中，在60℃中消化24h。配置500μg/mL硫酸软骨素标准品母液，按表11所示在96孔板中加入不同浓度硫酸软骨素标准品，建立标准曲线。每孔加入处理过软骨的软骨消化液20μL，再加入200μL DMMB溶液，用酶标仪测量525nm处每孔的OD525值。
表11为硫酸软骨素标准品浓度稀释
Figure BDA0002069115630000131
如表12所示，为所有组兔子关节软骨中糖胺聚糖的含量，从表中可以看出，生理组(0.98±0.11μg/mg)和模型对照组(0.65±0.1μg/mg)差异显著。而氨基葡萄糖对GAG合成有促进作用。所有给予氨基葡萄糖的实验组中GAG的含量均高于模型对照组，其中高剂量组、中剂量组、水溶液组和模型对照组相比差异显著，低剂量组和模型对照组差异不显著。空白凝胶组和模型对照组GAG含量相似，说明智能水凝胶中使用的基质材料对GAG的生成没有影响。
表12为所有组兔子关节软骨中GAG的含量(n＝5)
Figure BDA0002069115630000132
注：表中数据为平均值±标准差；同一列中相同字母表示组间差异不显著，P＞0.05；不同字母表示组间差异显著，P＜0.05。
实验例5盐酸氨基葡萄糖智能水凝胶对软骨大体形态学的影响
观察各组兔子股骨髁和胫骨平台，如图2所示，为所有组兔子关节形态图，具体如下：
Ⅰ组：正常关节软骨表面为亮白色、完整、光滑且有光泽的状态，参见图中A，股骨髁，图中H，胫骨平台；
Ⅱ～Ⅴ组：氨基葡萄糖治疗过的兔子关节软骨呈现不同程度的黄白色和损伤，光泽程度比生理组低，损伤破坏程度比模型对照组和空白凝胶组低，参见图中B～E，股骨髁，图中I～L，胫骨平台；
Ⅵ～Ⅶ组：模型对照组(参见图中G，股骨髁；图中N，胫骨平台)和空白凝胶组(参见图中F，股骨髁；图中M，胫骨平台)关节软骨表面为黄白色，无光泽，肉眼可见明显的裂缝和溃疡。
实验例6软骨切片
(1)常规HE染色
正常兔软骨的组织学观察可见软骨结构完整，表面完整无缺失，软骨细胞排列整齐，无或者偶见细胞克隆，基质染色正常，潮线清晰。
如图3所示，本发明的模型组和给药组的兔软骨，具体如下：
模型对照组(Ⅶ组)：软骨表面局部缺失，表面不平整，有的软骨过渡带到放射带出现裂隙，同时可见细胞克隆甚至细胞巢；
给药组(Ⅰ～Ⅴ组)：软骨出现不同程度的软骨结构缺失，细胞克隆和基质染色减少。通过Makin评分反应损伤情况，分值越高损伤越严重，如下表13。
(2)阿利辛蓝染色和番红染色
正常软骨组织的阿利辛蓝染色和番红-O染色着色深且均匀。
如图4和5所示，本发明的模型组和给药组的兔软骨，具体如下：
模型对照组和空白凝胶组：软骨染色浅甚至于不着色；
给药组(Ⅰ～Ⅴ组)：软骨染色比生理组差，但比模型对照组和空白凝胶组好，组间的染色情况深浅不一。
光密度值(见表13)可以反应染色强度，染色强度可以反应软骨中蛋白多糖和酸性黏蛋白的含量。
表13为Makin分值和光密度值
Figure BDA0002069115630000151
综上所述，本发明选择比较合适的胶凝温度为35℃，所制得的凝胶可用于动物，如犬类，犬类的正常体温在37.5～39.5℃，且多数在38℃以上，高于所制得的凝胶的胶凝温度，环境温度越高，胶凝时间越短，故该智能水凝胶能在犬类体内快速胶凝，且关节腔是一个空腔，里面仅有少量关节液，释放介质少，使得本凝胶具有很好的缓释作用。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (5)

1.一种治疗骨关节炎的盐酸氨基葡萄糖水凝胶，其特征在于，该水凝胶由以下组分组成：P407、P188、水、NaHSO3、NaHCO3和盐酸氨基葡萄糖；其中，所述P407的质量分数为23%，所述P188的质量分数为6%；所述NaHSO3的质量分数为0.2%；所述盐酸氨基葡萄糖的质量分数为5%；所述NaHCO3调节pH为6；
所述水凝胶的凝胶温度为32℃~38℃；该水凝胶具有受热反向胶凝性质；所述水凝胶通过关节注射给药；
该水凝胶是通过以下方法获得：将P407和P188于水中4℃溶胀，得到聚合物溶液，在该聚合物溶液中依次加入盐酸氨基葡萄糖、NaHSO3和NaHCO3溶解，置于4℃下溶胀，得到所述盐酸氨基葡萄糖水凝胶。
2.一种如权利要求1所述的治疗骨关节炎的盐酸氨基葡萄糖水凝胶的用途，其特征在于，该水凝胶作为用于制备治疗骨关节炎药物的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，水凝胶的注射给药剂量为0.2~0.3mL/kg。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述骨关节包括：膝关节。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的用途，其特征在于，该水凝胶作为用于制备治疗动物骨关节炎药物的用途。
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