BG62915B1

BG62915B1 - Биосъвместим хидрогел

Info

Publication number: BG62915B1
Application number: BG101251A
Authority: BG
Inventors: �� . ��
Original assignee: Малое Внедренческое Предприятие "Интерфалл"
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2000-11-30
Also published as: AU696773B2; BR9408609A; ATE190508T1; ES2145841T3; RU95100525A; JP3359036B2; PT742022E; UA10911C2; WO1996004943A1; NO970330L; CZ297126B6; DK0742022T3; RU2067873C1; JPH10503950A; CN1058639C; DE69423520D1; KR100316212B1; CA2195957C; EP0742022A4; US5798096A

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до биологично съвместими хидрогелове за медицински цели, които могат да се използват:

- в ендопротезирането чрез инжекционни насочени впръсквания за лечение, за предпочитане на дефекти при хора, които имат травматични вродени или възрастови деформации във формата и размерите или съответно са претърпели загуба в стабилността на формата на някои органи, съставени от меки тъкани, например при: пластичната хирургия за корекция на формата и размерите на лицето и други части на тялото и особено при мамопластиката (за предпочитане в случаите на аплазия на млечната жлеза или хипомастия), отоларингологията за лечение на ларингса чрез корекции във формата и размерите на гласните струни, мъжката сексология ( в случаите на слаба ерекция) за подобряване на потентността чрез инжектиране на еластична среда в порестата васкуларна мека тъкан на пениса;

- в ендопротезирането, комбинирано с кожна хирургия чрез моделиране на междинни ендопротези и имплантирането на същите в оперираното място;

- при продължителна терапия (например при абсцеси или тумори), за да се осигури един вътрешен запас от пролонгирано-действащо лекарство вътре или близко до болния орган;

- за запълване на кухини, получавани при различни заболявания (например туберколозни каверни) или наранявания;

- като физиологически неутрална електропроводима имерсионна среда между кожата на пациента и на електродите в случаите на: продължителен контрол на телесни електрофизиологични променливи (например при сърдечна и мозъчна дейност), подкожни електрофорезни лекарствени инжекции;

- като основа за профилактични кремове, съдържащи като дисперсна среда вода.

Предшестващо състояние на техниката

Опитите за подобряване на телесната форма и функции и други подобни случаи, както е отбелязано по-горе, придобиват широко разпространение, и то главно по желание на пациента. Широко разпространени са и изследванията при електрофизиологична диагностика, лекарствено третиране, включително чрез лекарства с деподействие, както и консервативното, физиологично-ефикасно тампониране на различни каверни. Ето защо, биосъвместимите материали, предназначени за посочените приложения, трябва да удовлетворяват няколко съществени изисквания, най-важните между които са: дълготрайно (за предпочитане дълголетно) запазване на формата и размерите на органа, който е ендопротезиран, респективно до възрастта на пациента, който е опериран; максимално възможна биологична съвместимост, т.е. отсъствие на карциногенност, алергични реакции (вкл. краткотрайни реакции), които се появяват веднага след инжектиране на избрания материал в тялото или поставянето му върху кожата, или в частност върху лигавицата; отсъствие на твърдо капсулиране или отхвърляне на ендопротезите, тампоните или деполекарството или отбелязани в незначителна степен; обезпечаване на незатруднени метаболични процеси в мястото, където е поставен биосьвместимият материал; минимум травматични случаи и най-краткото възможно въвеждане на биосъвместимия материал, по-специално при прилагането на големи дози (над 1000 ml).

Не е проблем за специалиста в областта да отговори на тези изисквания поотделно или в някаква комбинация.

Така паста от флуоропласт на основата на глицерол (тефлон) като биосъвместим материал за лечение на ларингса дава един значителен, стабилен клиничен ефект (виж: Beck Ch. L Unsere Erfahrungen mit der intralaryngealen Tefloninjektion // Laryngol. Rhinol. Otol., 1980, Bd. 59, № 11, s. 715, 718; Lewy R. B. Teflon injection of the vocal cord; Complications, errors and precautions // Ann. Otol. - 1983, v. 52, № 5, pp. 1, 473-474; Berghans A. Verfahren zur Unterfitterung von Stimmlippen / / H. N. O. - 1987, Bd. 35, № 6, s. 227-3).

Известно е, че глицеролът има по-висок вискозитет от водата, следователно пастата ще покаже по-голяма стабилност при съхранение. Когато се инжектира, глицеролът е ефективен лубрикант. Бидейки лесно разтворим във вода и водосъдържащите течности на организма, глицеролът обаче доста лесно (за няколко часа до един ден) се отделя от оперираното място. Освен това не е невъзможно тефлоновите микрочастици прогресивно да бъдат отнасяни от лимфния и кръвния поток от мястото на въздействие. Такова отнасяне като резултат намалява протезния обем и по същество води до ниска терапевтична ефикасност.

Освен това, въпреки че тефлонът е биохимически неактивен, операциите за поставяне на ендопротези, направени от тефлон, трябва да се повтарят при клинично установени интервали.

Също така, тъй като тефтоновите частици са твърди, те могат да нанесат механична повреда на тъканите, които са в контакт с ендопротезата, като предизвикат, обикновено при всички случаи, появата на асептична възпалителна реакция, а понякога и ларингостеноза с необходимост от спешна трахеотомия.

За да се изпълнят посочените изисквания, практически се използват гелоподобни биосъвместими материали.

Понастоящем минимална травма и възможно най-кратко въвеждане на биосъвместим материал при отсъствие на карциногенност и минимални алергични реакции се постига, като се използва воден разтвор на говежди колаген, високо пречистен и частично депалимеризиран продукт, който се превръща в еластичен и механично стабилизиран хидрогел при температура под 37°С, като се инжектира в органа, който се третира, за да се получи съответно по форма и размери (Ford Ch., Martin D. M., Warner Th. F Injectable collagen in laringeal reabilitation, Laringoscope, 1984, 94,513-518).

Колагенът като протеин, обаче, изцяло би се резорбирал в тялото на пациента в значително кратък период от време (по-малък от половин година). Той е подходящ за приложение в ендопротезната практика главно в случаите, когато е приемливо пълно заместване на свързващите тъкани с ендопротези или когато пациентът съгласно медицинските индикации са нуждае от определено временно ендопротезиране.

Трябва също да се отбележи, че говеждият колагенов разтвор поради неговата резорбционна способност и вътрешно- и междутъканна миграция е неподходящ за депо на лекарствени препарати, а тъй като е чувствителен към ензимно въздействие и има ниска електропроводимост, той практически е неподходящ за приложение като имерсионна среда.

Във връзка с горното, гелообразните биосъвместими материали на база синтетични полимери, са за предпочитане. Познат е биосъвместим гел под формата на хидрофилни естери на полигликоли и метакрилова киселина, който се прилага в ендопротезната практика (Kresa

L. , Rems Т., Wichterle О. Hydron gel implantat in vocal cord; Otolaryngol, Head Nech Surg., 1988,

V. 98, № 3, 242-245).

Необходимото количество от горния сух материал се имплантира чрез разрез в областта на козметичното или функционално третиране, след което оперативната рана се намокря. След това материалът набъбва от абсорбираната вода от прилежащите тъкани, чрез което се осигурява локално увеличаване в обема на коригирания орган, например гласната струна.

Този биосъвместим материал се характеризира с висока биохимическа стабилност.

При приложението му, обаче, траен терапевтичен ефект се получава за сметка на травмиращи хирургически интервенции, свързани с отоци и с асептични възпаления. Неговата употреба като материал за вътрешнотъканно депо за лекарства се придружава от значителни трудности, а и е непрактичен за прилагането му като основа за проводима имерсионна среда.

Най-обещаващи за ендопротезирането и за другите споменати приложения се оказват търговските инжекционни разтвори на биосъвместими гелоподобни материали.

Известни са биосъвместими гелове в разтвор, съдържащи водонеразтворими полимери, сред тях неомрежени акрилонитрилови полимери или техни кополимери, поливинилацетат, линеен или нискоразклонен полимер или кополимер на 2-хидроксиетил-акрилат и метил-акрилат, пали-п-винилиминокарбонил и диметил сулфоксид и други полярни, незабавно смесващи се с водата органични разтворители, описани от Stoy V., Chvapil

M. в US 4631188, 1986. В получаваните кополимери могат да се добавят мономери като акриламид (включително и N-субституиран), акрилхидразид (включително N-субституиран), акрилова киселина и акрилати, глутаримид и винилсулфон; като полярни, бързо смесващи се с вода разтворители могат да се приложат глицерол и неговите моно- или диацетати, метанол, етанол, пропанол и изопропанол, диметилформамид, гликоли и други подходящи разтворители.

Такъв материал е високоефективен при третирането на по-малки козметични или функционални дефекти, по-специално при устните или други части на лицето, както и гласни струни и др. подобни.

Обаче при запълване на обемни каверни или при корекция на гръдната форма и размери с ендопротези материалът, който е необходим, достига до 1 1, В тези случаи количеството на органичния разтворител, инжектиран заедно с гелоподобния полимер, надхвърля физиологически разрешения минимум и като резултат се получава еритема, а в някои случаи и алергичен шок. Също така, в зависимост от линеарната структура на използвания гелоподобен полимер, получените ендопротези имат ниска стабилност на формата, по-добра в обема и по-ниска в качеството. Ето защо по-предпочитани като търговски продукти са хидрогеловете, които не съдържат алергенти.

Сред тях най-близък до изобретението е биосъвместим хидрогел, съдържащ 3,0 % тегл. полимер на базата на акриламид, получен чрез използването на един свободен от радикална полимеризация инициатор (по-специално амониев персулфат) в дисперсна среда от типа на апирогенна двойно дестилирана вода (авторско свидетелство на СССР № 1697756).

Този хидрогел е изцяло биосъвместим с човешките тъкани и течности във всички споменати аспекти и освен това може да се използва в значително количество (до 1 1), като не предизвиква забележими негативни биохимически и биологични последващи ефекти. В мястото на инжектиране (поставянето на ендопротези, тампони и т.н.) той формира структура, която е лесно промокаема не само от вода, йони, кислород, но също и от нискомолекулни метаболици. Хидрогелните импланти се обхващат в значително висока степен (за 5 - 6 месеца) от новата фиброзна тъкан на реципиента. Този резултат е особено значим в (микро) алопластиката на ларингса.

Този хидрогел, обаче, има нисък вискозитет и следователно ниска еластичност и висока мобилност. Водосьдържанието в хидрогела е хлабаво свързано с макромолекулите на полиакриламида и лесно се отделя от имплантите, което води до свиването им и до значително намаляване на козметичния и лечебен ефект. Поради това, в случаи на обемисти (например вътрешногръдни) ендопротези, запълване на каверни и поставяне на междутьканни депо-резервоари за лекарства, имплантите показват ниска устойчивост на външни деформационни натоварвания и се свиват, колкото по-голям е техният първоначален обем. Във връзка с неговата висока неустановеност, хидрогелът има също ниска ефективност като електропроводима имерсионна среда за външни приложения.

Техническа същност на изобретението

Във връзка с посочените проблеми, изобретението има за обект биосъвместим хидрогел, който подобрявайки полиакриламидната композиция, осигурява еластичност, устойчивост на формата и стабилност на обемистите импланти, което от своя страна осигурява по-голям терапевтичен и козметичен резултат, особено в случаите на ендопротезиране.

Този проблем е решен чрез биосъвместим хидрогел, съдържащ полимер на основата на акриламид, получен чрез използване на инициатор за радикална полимеризация в апирогенна вода като дисперсна среда и който полимер съгласно изобретението е напречно свързан (омрежен) полиакриламид, получен чрез прилагане на биосъвместим омрежващ агент.

Бидейки проницаеми за вода, йони, кислород и нискомолекулни метаболици, както и за прилагане чрез инжектиране, хидрогелът съгласно изобретението има по-постоянна и с повече предимства водоустойчива структура, която го прави подходящ за обемисти, високоеластични и формоустойчиви импланти (например за вътрешногръдни ендопротези, за поддържане твърдостта на порестата васкуларна тъкан на пениса, за тампониране на белодробни каверни), които се обхващат от мека високоваскуларна съединителна тъкан при изключително ниска скорост (от месеци дори до години). Благодарение на структурните, биохимичните, анатомичните и физиологични предимства, както са описани погоре, се получава също съществен козметичен и/или терапевтичен ефект при ендопротезирането и тампонирането, както и нарастване продължителността на тези ефекти.

Съгласно първия характерен признак на изобретението (съгласно първата характерна особеност на изобретението) биосъвместимият хидрогел съдържа напречно свързан (омрежен) полиакриламид, получен при използването на метиленбис-акриламид като омрежващ (свързващ) агент и смес от амониев персулфат и тетраметилендиамин като инициатор на полимеризацията. Метилен-бис-акриламидьт е аналогичен на базовия мономер (акриламида) и по двете изисквания - композиция и биосъвместимост, докато приложението на гореспоменатата смес от инициатори на полимеризацията е благоприятна за получаване на правилно напречно свързани (омрежени) макромолекули на полиакриламидната верига, което води до еластична пространствена мрежа, подходяща за инжектиране на хидрогела. 5

Съгласно втората характерна особеност на изобретението биосъвместимият хидрогел съдържа от 3,5 до 9,0 % тегл. от споменатия омрежен полиакриламид. Тази граница от концентрации води до максимален терапевтичен или козметичен ефект при инжектиране на ендопротези или при тампониране. Концентрация под 3,5 % тегл. прави хидрогелът неустойчив и той може да се прилага само като основа на медицински мехлеми или като електропроводима имерионна среда за кардио- или енцефалографи. При концентрации над 9,0 % тегл. флуидността (течливостта) на хидрогела намалява практически до нула, за да се използва в някои случаи при производството на относително твърди (устойчиви), запазващи формати си твърди ендопротези, които изискват оперативен достъп до мястото на поставянето на ендопротезата.

Съгласно третата характерна особеност на изобретението биосъвместимият хидрогел съдържа физиологично неутрална водоразтворима сол, която се използва най-изгодно като електропроводима имерсионна среда.

По-нататък съгласно четвъртата характерна особеност на изобретението биосъвместимият хидрогел съдържа търговски приемливия натриев хлорид като физиологически неутрална водоразтворима сол.

Изобретението се разкрива чрез описанието на изходните реагенти, метода за получаване на новия биосъвместим хидрогел, примери за осъществяване на метода и резултатите от лабораторните изпитания на хидрогела, както и примери за състава на хидрогела, описание на методите и резултатите от химическите, биохимическите и медицинските изследвания на новия биосъвместим хидрогел, както и описание на начините за коригиране на козметичните и функционални дефекти на човешкото тяло, чрез целенасочено инжектиране на новия биосъвместим хидрогел и информация за неговите практически приложения.

Характеристиките на новия биосъвместим хидрогел съгласно изобретението и използваните реагенти са показани в таблица 1.

Таблииа 1 ·

Реагенти за получаване на нов биосъвместим хидрогел

Реагенти и емпирична формула	Количество на 10С g от хидрогела, g	Характеристика, гранични стойности
1	2	3
Акриламид C3H5NO	3.5-9	Точка на топене, °C. 84.5 £ 0.5; Относително тегло, g/cm'*, 1.122; Основен ингредиент, тегл.% - не помалко от 98.
Метилен-бисакриламид CsHfoNgO?	0.01 -1.00	Точка на топене, °C, 184 ± 1.0; Основен ингредиент не по-малко от 96 тегл.%
TMED - тетраметилетилендиамин	0.001-1.00	Относително тегло, g/cm³,0.78; Основен ингредиент не по-малко от 98 тегл.%
Амониев персулфат	0.001-1.00	Относително тегло, g/cm³,1.98; Точка на разлагане, °C, 120; Основен ингредиент не по-малко от 98 тегл.%
Двойно-дестилирана апирогенна вода	останалото	Рефракционен индекс, 1.3329.

Освен бидестилираната вода, реагентите, използвани в експериментите, са от типа на търговските продукти с марка REANAL (Унгария) и това са: акриламид и метилен-бис-акриламид под формата на бели кристали, тетраметилети- 5 лендиамин под формата на бяла маслоподобна течност и амониев персулфат под формата на безцветни кристали.

Обикновено новият биосъвместим гел се получава по следния метод. |θ

При асептични лабораторни условия определените количества от акриламид, разтворен във воден разтвор омрежващ агент (метил-бис-акриламвд) и инициатор на полимеризацията (амониев персулфат и TMED) се поставят в стерилен стъклен съд. Реагентите напълно се разбъркват, след което се разреждат с вода (алтернативно с физиологичен разтвор или с друг разреждащ воден разтвор на физиологично неутрална сол, например натриев ацетат); сместа след това се филтрира, като филтратът се оставя да престои, докато се получи хидрогел на омрежен (напречно свързан) полиакриламид (означен тук и по-нататък като CL РАА).

Получаването на CL РАА хидрогела се контролира от следните характеристики: външен 25 вид (хидрогелът трябва да бъде прозрачен, безцветен, свободен от онечиствания); рефракционен индекс (да бъде от 1,334 до 1,350); pH (да бъде от 7,0 до 9,0); съдържание на тежки ме-тали (да бъде не повече от 0,001 % тегл.) и стерилен. 30

Примерни изпълнения на изобретението

Изобретението се пояснява със следните примери.

Пример 1. Получаване на биосъвместим хидрогел с ниска концентрация.

20,3 g акриламид, 8,7 ml от 2 % воден разтвор на метил-бис-акриламид, 7,5 ml от 1 % воден разтвор на TMED и 15 ml 4 % воден разтвор на амониев персулфат се смесват в 11 стъклен съд. След това се добавя вода до получаване на общ обем от 580 ml. Сместа се филтрира през стъклен филтър и се оставя да престои за най-малко 20 min, докато се получи 3,5 % CL РАА хидрогел.

Пример 2. Получаване на биосъвместим хидрогел с висока концентрация.

34,2 g акриламид, 60 ml 1 % воден разтвор на метил-бис-акриламид, 6 ml 1 % воден разтвор на TMED и 25 ml от 0,48 % воден разтвор на амониев персулфат се смесват в 1 1 стъклен съд. Добавя се вода до получаване на общ обем от 380 ml, сместа се филтрира през стъклен филтър и филтратът се оставя да престои най-малко 20 min до получаване на 9 % CL РАА хидрогел.

Пример 3. Получаване на биосъвместим хидрогел със средна концентрация.

g акриламид, 50 ml 1 % воден разтвор на метил-бис-акриламид, 25 ml 1 % воден разтвор на TMED и 50 ml 1,3 % воден разтвор на амониев персулфат се смесват в 11 стъклен съд. След това се добавя вода до получаване на общ обем от 350 ml. Сместа след това се филтрира през стъклен филтър и филтратът се оставя да престои най-малко 20 min до получаване на 5 % хидрогел CL РАА.

Пример 4. Получаване на електропроводим биосъвместим хидрогел с ниска концентрация.

CL РАА хидрогелът се получава, както е посочено в пример 1, с изключение на това, че се използва физиологичен разтвор вместо вода.

Пример 5. Получаване на електропроводим биосъвместим хидрогел с висока концентрация.

CL РАА хидрогелът се получава, както е описано в пример 2, с изключение на това, че вместо вода се използва 9 % воден разтвор на амониев ацетат.

В редица експерименти са използвани различни рецептури на биосъвместимия хидрогел CL РАА (тук и по-нататък наречен ВСН), както е показано в таблица 2.

Таблица 2

Примери за различни рецептури на нови? -АА биосъвместим хидрогел

Инградиенти	Рецептури и концентрации, тегл.%
ВСН1	ВСН2	вснз	BCH4	ВСН5	ВСН6	ВСН7	ВСН8	ВСН9
CLPAA	3.0	3.5	6.0	9.0	9.5	4.0	7.0	5.0	8.0
NaCI	-	•	-	-	-	-	-	0.9	0.9
Na ацетат	-	-	-	-	-	0.9	0.9	•	-
Вода	останалото

Както може да се види в таблица 2, ВСН2, ВСНЗ и ВСН4, ВСН6, ВСН7, ВСН8 и ВСН9 имат предпочитани концентрации на CL РАА в хидрогела; ВСН2 и ВСН4 са съответно в предпочитаните граници на CL РАА в хидрогела, докато всички други рецептури отговарят на средни концентрации, които са и най-предпочитаните. В контраст на посоченото ВСН1 и ВСН5 рецептури са с концентрации на CL РАА хидрогел, които са полезни в много ограничени случаи на приложение.

Лабораторните изследвания на новия хидрогел са провеждани последователно за определяне на химическите, биохимическите, медицинските и биологичните му свойства. Тези изследвания не са стриктно описани и се основават на конвенционалните методи и техники.

Така сухият остатък е изследван по известното определяне за точната концентрация на едно вещество в един истински или колоиден разтвор.

След това сухият остатък е изследван съгласно държавен стандарт на СССР ГОСТ 15.01386 “Медицински средства”, последвано от техниката, изложена в практическото ръководство “ Метод bi анализа акрилатов и метакрилатов”, М., Химия, 1972.

Точната концентрация на CL РАА в хидрогела обикновено се определя от сухия остатък. Този метод се състои в теглене на хидрогелната проба и сушенето й до постоянно тегло (за около 20 h и 35°С при остатъчно налягане от 12 до 15 mm

Hg, последвано от обикновено изчисление на CL РАА % в хидрогела).

Този метод се използва за оценка на химическата стабилност на новия хидрогел. За 5 тази цел се приготвя хидрогел, който да съдържа относително хлабаво омрежен CL РАА (чрез въвеждане на 0,25 % тегл. метилен-бис-акриламид от акриламида) при изчислена концентрация около 5 %.

Пет проби от горния хидрогел, от около ml всяка, се подлагат на четири последователни теста, както следва:

Тест 1. Пробите се претеглят, изсушени при 35°С и остатъчно налягане 12-15 mm Hg до 15 постигане на постоянно тегло (за около 20 h);

Тест 2. Пробите се теглят, поставят се в бидестилирана вода, варят се 15 min и се сушат, както е посочено по-горе;

Тест 3. Пробите се теглят, поставят се в 20 бидестилирана вода, доведена до ниво 200 ml във всеки случай, оставят се във водата 7 дни, като водата се сменя всеки ден, след това се сушат както по-горе;

Тест 4. Пробите се теглят, оставят се във 25 вода 7 дни както в тест 3, след което се варят 15 min както в тест 2 и след това се сушат.

Процентът на полимера в основната маса на хидрогела се определя по известните методи за всичките примери. Резултатите са дадени в 30 таблица 3.

Таблица 3

Оценка на химическата стабилност на сух остатък от нов CL РАА биосъвместим хидрогел

Тест	Проба усреднено тегло, д (стойност + SD)
Преди третиране	След третиране
1	20.84 1 0.96	0.983 ± 0.0048
2	20.15 + 0.87	0.951 ± 0.0076
3	20.65 ± 0.83	0.923 + 0.0065
4	20.41 ± 0.63	0.9131 0.0095

Както се вижда от таблица 3, дори накисването, последвано от изваряване, не предизвиква деструкция в CL РАА хидрогел, което показва, че той може да бъде термично стерилизиран (всеки път, когато възниква такава необходимост) и има стабилност, въпреки хлабавото омрежване.

След това акриламидът е изследван за неговата способност да мигрира в биотъканите в зависимост от стабилността си на база CL РАА хидрогел съгласно изобретението във водна среда в съответствие с методиката, описана в “Руководящие методические материали по токсиколого гигиеническим исследованиям полимерних материалов и изделий для зндопротезирования”, Министерства здравоохранения СССР, 1987, 18-25.

Горната способност се определя чрез HPLC (високоскоростна течна хроматография), която включва абсорбционната крива на UV лъчението в границите на 190 — 210 пт, която е типична за мономера. Използван е Liquochrom Chromatograph (Унгария).

За този експеримент се получават екстракти от новия хидрогел чрез потапяне на пробите за период от 14 и 30 дни при температура 40°С и съотношение 100 ml разтворител (бидестилирана вода) на 1 ml хидрогел. Пробите за HPLC се приготвят, като се суши течността от екстрахирането в количество от 5 ml при стайна температура и остатъчно налягане 12-15 mm Hg и остатъкът се елуира веднъж при скорост от 0,2 ml/min с 2 ml смес на вода и метанол в съотношение 1 :1 в колона, която е дълга 150 mm, с диаметър 4 mm и е напълнена със сорбент Separon Cl8, със захранване от 20 μΐ елуат в инжекторната дюза.

Минималната определена концентрация на акриламида чрез HPLC е 0,000001 mg/l, като неговата максимална допустима концентрация във водния екстракт на материал от импланти е 0,02 mg/l.

Чрез HPLC не е отбелязан акриламид във воден екстракт, получен по метода, който е описан, което показва, че изцяло биосъвместимият хидрогел CL РАА е химически стабилен.

По отношение на медицинските и биологичните свойства пробите от CL РАА хидрогел се приготвят по описания метод и се изпитват при лабораторни условия за: биохимична и хе5 молитична активност, ембриотоксична активност, му-тагенна активност и карциногенна активност.

Биохимическата и хемолитичната активност се оценяват от измененията на химическата характеристика на плазмата и на кръвните клетки 10 в бели плъхове порода Wistar с телесно тегло 300 - 350 g за изпитанието и контролни групи от 16 животни всяка.

Преда експеримента доза от 5 ml 5 % хидрогел съгласно изобретението се инжектира 15 интраперитонеално във всеки от упоените плъхове от изследваната група.

Плъховете са хранени регулярно по еднакъв начин. Две седмици след инжектирането се взимат кръвни проби и се изследват за сьдър20 жание на йоните на Na, К, Са и С1, уреа, азот в кръвната уреа и пикочна киселина, креатинин и ензими (амилаза, алкална фосфатаза, аланини аспартат-аминотрансфераза, обозначени тук и по-нататък като А1АТ и AsAT съответно, 25 лактатдехидрогеназа, обозначена съответно с LDG, креа-тинин фосфокиназа). Използва се биохимически анализатор Koming (Швеция). В този случай съдържанието на К и уреа се определя чрез Lachema биотест (Чешка ре30 публика). Резултатите са показани в таблица 4.

Таблица 4

Ефект от имплантиране с биосъвместим хидрогел CL РАА върху биохимичните характеристики на кръвната плазма в плъхове

Биохимични характеристики и единици	Експериментални резултати
контрола	тест
1	2	3
Натрий, mmol/l	151	148
Калий, mmol/l	8.20	6.82
Калций, mmol/l	С.97	0.90
Хлориди, mmol/l	97.5	102.1
Уреа, mmol/l	4.8	4.8
Азот в кръвната уреа, mmol/l	2.2	2.2
Креатинин, mmol/l	0.05	0.05

Продължение

Амилаза, mg %	89.1	83.33
Алкална фосфатаза, mmol/1	84.5	55.9
AsAT, mmol/1	133	130
AIAT, mmol/1	41	51.7
LDG (общо), mmol/1	217	189
Креатин фосфокиназа, единици	596С	5685
Пикочна киселина, mmol/1	С.14	0.10

Както се вижда от таблица 4, основните характеристики на йонния обмен показват, че няма проявени увреждания (нарушения) на клетъчните мембрани. Аденозин трифосфатазната активност също е нормална.

Стабилността в характеристиките на азотния обмен показва нормален метаболизъм, вкл. при обмена на пурин, и заедно със стабилността на креатина, функционалната стабилност на урогениталната система е запазена в присъствието на CL РАА в човешкото тяло.

Нормалната активност на А1АТ и AsAT означава стабилност на чернодробната система и подходящо състояние на миокарда, което съдейки от активността на креатиновата фосфокиназа, е нормално, като те не са били подложени на забележимо претоварване.

Достатъчната активност на алкалната фос²θ фатаза е доказателство, че няма възпаление в ендотелиума на жлъчния канал.

Кръвната картина на изследваните плъхове е представена в таблица 5.

Таблица 5

Ефект от имплантирането на биосъвместим хидрогел CL РАА вьрху кръвните характеристики на плъхове

Характеристики на кръвните клетки, единици	Измерен резултат
контрола	тест
1	2	3
Левкоцити, thsd/mcl	3.5 + 0.2	5.4
Еритроцити, mln/mcl	6.86+ 0.43	7.02 + 0.31
Хемоглобин, g/l	125 + 12	139 + 9
Хематокрит, %	35 + 1.5	36.5 + 1.3
Еритроцити с основен диаметър, nm	51.0 + 0.2	52.0 + 1.5
Хемоглобин средно съдържание на еритроцити, pg	35.7 + 0.3	38.1 + 0.5
Тромбоцити, thsd/mcl	992 +12	694 + 50
Тромбоцити с основен диаметър, nm	8 + 1.5	14.25+ 1.6

Както се вижда от таблица 5, левкоцитите в експеримента несъществено превишават нормалното съдържание от 4,5 х 1000 mm³, докато еритроцитите и хемоглобинът в еритроцитите показва нормално кръвно окисление. По отношение на хематокрита може да се претендира за флуидния и електролитния баланс, че е приблизително нормален.

Наличните данни индиректно показват, че биохимическата стабилност и биосъвместимостта на хидрогела CL РАА съгласно изобретението е 50 доста приемлива.

Ембриотоксичната активност на хидрогела CL РАА е определена съгласно методиките, опи9 сани в “Руководящие методические материали по зкспериментальному и клиническому изучению новнх лекарственнх средств”, М., M3 СССР, 1975, 42 - 48, и в “Руководящие методические материали по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерних материалов и изделий для зндопротезирования”, М., M3 СССР, 1987.

Три групи от бели женски мишки (смесена порода) с телесно тегло 180 - 200 g са използвани за изследване, като всяка група съдържа по 16 животни.

Мишките от първата група се инжектират интраперитонеално с 2 ml 5 % хидрогел съгласно изобретението, като се оставят за една седмица.

Мишките от втората група се инжектират интраперитонеално също с 2 ml 5 % хидрогел съгласно изобретението на третия ден от бременността.

Третата група е от мишки, които са бременни, но не са инжектирани.

Две мишки от първата група не са бременни. 14 мишки от първата и 16 мишки от втората и от третата група са родили нормални здрави животни, което доказва, че новият гел не е ембриотоксичен.

Мутагенната активност на CL РАА хидрогелите се доказва съгласно методиката на Министерството на здравеопазването на СССР, описана в “Оценка мутагенной активности химических веществ микроядреннм методом” М., 1984, 14 върху ретикулярната тъкан на костен мозък на мишки тип СЗН1 (от двата пола) на двумесечна възраст в две групи от по 10 животни всяка.

Експерименталните животни се инжектират с 0,01 % по отношение на телесното тегло 30дневен воден екстракт, получен при 40°С и съотношение 100 ml екстрагент за 1 g гел от 9 % CL РАА хидрогел.

В 24-часов период експерименталните и неинжектирани мишки се умъртвяват чрез смяна на гръбначния мозък. По-нататък натривки от бедрен мозък се разреждат със серум от свежа нестабилизирана човешка кръв от група AB (ΐν), като по познат начин се обработват, за да се получи след това оцветяване Pappenheim.

Ретикулоцитите с микроядра в натривката се броят под микроскоп. Различия в ретикулоцитните бройки в мозъчните натривки на двете групи (експериментални и неинжектирани) мишки в 20 наблюдавани полета, съдържащи по 1000 клетки всяко, не са забелязани да надвишават 2,3 %. Това е доказателство, че хидрогелът CL

РАА има слаб мутагенен ефект.

Карциногенната активност на хидрогела CL РАА се оценява чрез имунното определяне на неподатливите туморно-свързани антигени. Този тип на оценка включва определяне на електрофорезната мобилност (обозначена тук и по-нататък ЕРМ) на стабилизирани и третирани с танин еритроцити, които са чувствителни към туморносвързания антиген на рабдомиосаркома и в допълнение, и към неподатливия ембрионален антиген. Последният показва прогресивното туморно нарастване, когато ЕРМ-тестьт е положителен. Обикновено ЕРМ-тестовете са положителни, когато електрофорезната мобилност на клетъчните индикатори е намалена с 20 % или повече.

бели плъха (смесена порода) с телесно тегло 180 - 200 g се използват в експеримента, като се образуват една експериментална група и една контролна група, всяка с по 6 животни.

Плъховете в експерименталната група се инжектират с 4 ml 6 % хидрогел CL РАА в бедрения мускул при местна упойка. След това плъховете от двете групи се хранят с обикновената си храна 18 месеца. След това кръвните проби на всички животни се оставят, за да се утаят, като еритроцитите се отделят от пробите и се очувствяват със споменатите антигени, за да се направят ЕРМ-тестовете.

Намалението в ЕРМ на очувствените еритроцити в сравнение с тези, които не са обработени, се наблюдава, както следва:

4,17±1,58 % за рабдомиосаркомния антиген и 1 ,67±0,95 % за неподатливия ембрионален антиген в тестваните животни, и

1,5 ±0,62 % за рабдомиобластомния антиген и 1,83±1,28 % за неподатливия ембрионален антиген в контролата.

Следователно, ЕРМ-тестьт е отрицателен за плъховете от двете групи, което показва, че новият хидрогел CL РАА не проявява карциногенна активност.

По-детайлни медицински биологични изследвания за отнасянията на новия биосъвместим хидрогел CL РАА в ендопротезната практика и тампонирането са извършени върху мъжки кучета от смесена порода с телесно тегло 25 - 30 kg на възраст 3-4 години. Кучетата са подложени на тест, като се поставят ендопротези при стерилни условия, последвано от дезинфекция на кожата, покриваща пениса с 10 % йодна тинктура и местна упойка, при което: 6 кучета се инжектират подкожно веднъж с 5 ml от 3,5 % хидрогел CL PAA; също 6 кучета се инжектират ендофасциално, като не се допуска проникване под tunica albuginea, с 9 % хидрогел CL РАА в три сегмента по дължината на пениса в противоположни страни в количество към 1,5 ml на сегмент, като общото количество е 8,0 ml, и други 6 кучета са инжектирани с 6 % хидрогел CL РАА интракавернозно, като не се допуска проникване под tunica albuginea и основно в trabecula corporum cavemosum, но без да се наранява уретра, в три сегмента по дължината на пениса в противоположни страни в количество от около

1,5 ml на сегмент, за да се получи общо количество от 8 ml.

Четвъртата група от три кучета е контролна.

Кучетата се умъртвяват едно след друго с интравенозна нембурална инжекция, при което: при тестваните животни на 1, 7 и 14 ден и на 1, 3 и 6 месец, след като хидрогелът CL РАА е имплантиран; контролните на 1,3 и 6 месец.

Изрязани късове от шахматно разположени отрязъци от пениса, от регионалните лимфни възли и белия дроб на кучетата, заедно с контролни отрязъци, се фиксират в 10 и 6 % неутрален формалин и в Карноитова течност, дехидратират се в алкохол за увеличаване на силата и се покриват с парафин.

Късовете се оцветяват с хематоксилин и еозин, оцветител на van Gison с пирофуксин, оцветител Weigert за еластичност и с толуидиново синьо при различните pH на оцветителната течност за определяне на гликозаминогликаните чрез химически и ензимни методи.

Гликопротеините и гликогенът се определят чрез макманусовата периодична реакция с шифова киселина (тук и по-нататък PAS-peakция); калциевите соли се определят по метода на von Koss, RNA се определя по метода на Вгаchet (с рибонуклеаза).

Изследвана е активността на следните ензими, обозначени, както следва: дехидрогеназен малат (MDG); дехидрогеназен сукцинат (SDG), определен по метода Nachlass; дехидрогеназен лактат (LDG); глюкоз-6-фосфат дехидрогеназа (G-6-PDG), NAD- и NADP-диафораза, определена по метода на Hess, Scarpelli и Pearce респективно; алкална фосфатаза (АР), определена по метода на Gomori, и аденозинтрифосфатаза (ATPase), определена по метода на WashteinMeisel.

Нервните тъкани са импрегнирани със сре бърен нитрат по метода на Bielschowsky-Gross.

Хистохимичните реакции са провеждани и контролирани, както се препоръчва от Е. Pearce “Histochemistry (издание на руски “Гистохимия”, превод на 2 изд., М., 1962).

Изследването протича по следния начин.

А. В случай на подкожно инжектиране на хидрогела CL РАА.

На следващия ден се забелязва около инжектираното място някаква подутина от мека еластична консистенция, върху която е опъната кожата (едно куче разви незначителна едема и хиперемия на тъканите, заобикалящи импланта с малко огнище на кръвотечение, което се затвори на 7 ден и което се счита за манипулационно нараняване).

На 7 ден не са забелязани забележими хемодинамични, променящи се и възпалителни реакции. На хистологичното изследване имплантьт показва една голяма светлосиня вакуола, заобиколена с тънка капсула от свързваща тъкан, отделяща хидрогела CL РАА, фасцията на пениса и покриващата кожа. Капсулата се състои от един или два пласта от нови фибробласти с нежни колагенови и еластични фибри, които се виждат наоколо. Пиронинофилия и активност на редоксензимите (SDG, MDG, NAD- и NADP-диафорезите, LDG) и АР са типични за цитоплазмата във фибробластите. Нарастването в активността на G-6-PDG разкрива активирането на пентозния метаболизъм. Една слаба инфилтрация на левкоцити и макрофаги се забелязва в пласта, близо до повърхността на хидрогела. Капсулата има периферия от зърниста тъкан със средно количество новообразувани съдове, покрити с набъбнали епителни клетки, лумените на които са локално уголемени и напълнени с кръвоформиращи елементи. Размножаващи се фибробласти, хистиоцити и отделни плазмени клетки са отчетени във външната обвивка на съдовете. Във всичките случаи не е забелязана голяма клетъчна реакция. Върху оцветените с толуидиново синьо използвани течности при всички pH не са отбелязани метахроматични петна. Малък брой от нервните фибри. импрегнирани със сребърен нитрат, показват различни промени като локално подуване на аксоните, загуби в тяхната фибрилна структура, образуване на вакуоли, варикозни разширения, хипо- или хиперимпрегнация. Понякога натрупването на оксоплазма по дължината на нервните фибри или в техния край се забелязва, частично като грапавини на миелиновата мембрана и ней ното разрушаване в къси или дълги фрагменти. Тези промени са типични за нервните фибри в тяхното компенсаторно-адаптивно преструктуриране в отговор на налягането от вакуолата върху хидрогела CL РАА.

След 14 дни макрофаго-левкоцитната реакция на тъканите, съседни с хидрогелния CL РАА имплант, незначително нараства, забелязва се обявената фибробластна реакция, включително продължаващото образуване на свързващо-тьканната капсула около вакуолата; в капсулата локално се явяват като случайно подредени колагенови и еластични фибри, които имат млади фибробласти и новообразувани между тях капиляри, докато при друго място, като по-развита, свързващата тъкан се състои от няколко реда колаген и еластични фибри, поставени един след друг, също както размножаващите се фибробласти. Съдържанието на RNA в цитоплазмата и ядрата нараства, както и активността на редокс и хидролизните ензими. Фибробластната цитоплазма се обогатява с метахроматични гранули, които са лесно откриваеми с толуидиново синьо при pH 2,8, което доказва нарастване в синтезата на гликозаминогликаните. Числото на новопоявилите се съдове отчетливо намалява в тъканите около капсулата, като хистогенните клетки, продуциращи гликозаминогликани и колаген преобладават на тяхно място. Гигантски клетки са извънредно редки. Промените в нервните фибри са, както е описано.

Един месец след инжектирането една зряла свързващо-тъканна капсула се развива около вакуолата от хидрогела CL РАА и се състои от кръгообразно подредени колаген и еластични фибри със зрели фибробласти, състоящи се от усреднено количество RNA и високосулфатни гликозаминогликани, определени с толуидиново синьо при pH 2,8. Активността на редокс и хидролизните ензими във фиброцитната цитоплазма е нормална. Клетъчната реакция, която се проявява като слабо-дифузна инфилтрация на макрофаги и клетъчна плазма, понякога се забелязва върху повърхността на хидрогела. Структурата на тъканите около импланта изцяло се нормализира и не е по-различна от тази на тъканите на нетретираните животни. Реактивните промени в чувствителните нервни фибри започват да затихват и да се появяват главно като нередовно увеличение или изтъняване на аксоните и техните фокусирани хипо- или хиперимпрегнации.

месеца по-късно се забелязва някакво удебеляване на хидрогела CL РАА по дължина с нарастване в базофилията и едно добре дефинирано отделяне на импланта от съседните тъкани чрез свързващата капсула, състояща се от колаген, еластични фибри и фиброцитни клетки. Структурни и хистологични промени в съседните тъкани не се забелязват, докато нервните фибри придобият своята нормална форма.

месеца по-късно формата и размерите на импланта остават практически такива, каквито са първите 24 h след инжектиране на хидрогела CL РАА. Хистологично имплантьт се явява като интегрална, добре капсулована вакуола. Капсулата се състои от една или две редици от фиброцити и подредени колаген и еластични фибри, в които не се забелязват соли на калция по метода на von Koss. Тъканите, обграждащи импланта, не проявяват реактивни, хемодинамични, дистрофни, некротични, възпалителни или други промени, включително тьканна и клетъчна неравномерност. При импрегниране със сребърен нитрат нервните фибри се проявяват нормално.

В. В случай на ендофасциална инжекция на хидрогела CL РАА.

На следващия ден и след 7 дни пенисът е равномерно увеличен и показва нарастваща еластичност. Телесната температура на кучетата е нормална, оцветяването на кожата около мястото на инжектирането е нормално, не са забелязани локални възпаления. Хистологично имплантите при инжектираните места се появяват като светлосини вакуоли. След 7 дни при хидрогелните CL РАА вакуоли се забелязва, че са обвити с тънкостенни капсули, основно състоящи се от един или два пласта от нови фибробласти и нежни свързващи фибри, както и новооб-разувани капиляри около фибробластните слоеве, докато левкоцитите и макрофагите се забелязват върху хидрогелната повърхност. RNA-съдържанието в цитоплазмата и ядрата нараства, също както и активността на SDG, MSG, NAD- и NADP-диафоразите, LDG е G-6-PDG в цитоплазмата. Свързващата тъкан, включваща капсулата, има новообразувани капиляри с леко разширение и кръвно-напълнени лумени и набъбнал ендотелиум. Размножаващи се фибробласти и плазмени клетки са намерени във външната обвивка на кръвните съдове. Хистохимичните реакции потвърждават, че дистрофни и още повече некробиотични промени не са отбелязани във фасциалната тъкан, обгръщаща имплантите, когато се отдели от имплантите.

Така върху оцветените късове с разтвор на толуидиново синьо при всяко pH, метахроматичните петна, които биха указали наличието на деструкция в хидрогела CL РАА, не са забелязани. Промокаемостта на съдовете остава нормална, тъй като PAS-положителният материал не е открит, а той стабилизира амилазата и в околосъдовите пространства, както и в стените на малките и средните съдове, докато АР и АТР активностите в стените на микроциркулиращото легло остават ниски. В същото време нервните фибри, импрегнирани със сребърен нитрат и проверени чрез метода на Spielmeyer, показват вълнообразна и спираловидна форма, а в други случаи те имат набъбване в краищата. Демиелинационните места са рядкост, както са рядкост и разпрострелите се нервни фибри под формата на затворена структура. Рядко се забелязва размножаването на хипертрофирани клетки на Schwann. Промените могат да се разглеждат като отговор на нервните фибри на налягането на имплантите.

След 14 дни макрофагната реакция близо до имплантите е малко по-интензивна, но гигантски клетки не са забелязани. Отчетена е отличителната фибробластна реакция и растеж на свързващата тъкан на капсулите около вакуолите; някои капсули се състоят от рандомизиран колаген и еластични фибри с нови фибробласти между една RNA с високо съдържание в цитоплазмата и повишената редокс-активност на ензимите. Поразвятата (по-зрялата) свързваща тъкан, състояща се от няколко пласта от колаген, еластични фибри и фибробластни клетки са намерени в други обекти (на други места). Нарастващо число от тъканообразуващи (хистогенни) клетки и намаляващо число на новоизградени съдове е забелязано в зърнестата тъкан, прилежаща до капсулите. Ендотелиумът и средните мембранни структури на външната обвивка на съдовете, както и хемодинамичните фактори не се променят, докато промените в нервните клетки са описани във връзка с предишния период.

След 1 месец имплантните капсули се състоят от клетъчни елементи на фибробластните серии, фиброцити с преобладаващо средна пиронинофилна цитоплазма. Оцветяването с метиленово синьо при pH 2,8 показва едно средно число от високосулфатни гликозаминокликани във фибробластите. Ензимната активност във фиброцитната цитоплазма съответства на контролата. Повърхностният пласт от хидрогела CL РАА е донякъде инфилтриран с макрофаги и клетъчна плазма. Не е забелязано кръвотечение, възпаление, дегенерация, нито никротиране в тъканите, прилежащи към имплантите. Промените в нервните фибри, отбелязани преди, все още се забелязват.

месеца след инжекцията е отбелязано нарастване на базофилията на хидрогела CL РАА. Гелните вакуоли са добре определени чрез съединителната тъканна ципа (фасция) от тънки свързващо-тьканни капсули на колаген и еластични фибри с фиброцити между тях. Кръвоносните съдове са нормални. Не е забелязана реакция на пенисните тъкани (фасцията в контролите се проявява като кръгообразно подредена с добре дефиниран колаген и еластични фибри без загуба на интегритет и без калциране на микро- и макрониво, като нервните фибри са нормални).

След 6 месеца пенисът по форма и размери при кучутата е визуално проверен, като е подобен на този, който е отбелязан на 14 ден. Хистоложки имплантите се очертават като интегрални добре капсулирани тъмносини вакуоли. Капсулите се състоят от един или два пласта от фиброцити и последователно подредени тънък колаген и еластични фибри, като никакъв калций не е открит, нито с микроскоп, нито по метода на von Koss. Нито една от реактивните хемодинамични, дегенеративни, некротични, възпалителни или други промени, вкл. тъканни и клетъчни ненормалности, не са открити в прилежащите към импланта тъкани. Нервните тъкани в експерименталните и в контролните животни се импрегнират със сребърен нитрат, след което се идентифицират визуално. В регионалните лимфни възли, в интратрабекуларните и трабекуларните пространства на кавернозното тяло на пениса, във вените и в белите дробове не са намерени частици от хидрогела.

С. В случай на интракавернозна инжекция на хидрогел CL РАА.

На 1 и 7 ден оцветяването с хематоксилин и еозин разкрива хидрогела CL РАА, който се появява като хомогенни светлосини вакуоли, които на 7 ден, заобиколени с тънки свързващотьканни капсули, което предизвиква едно променено леко налягане на трабекулите на кавернозния корпус на пениса и на tunica albuginea. Капсулите се състоят от тънки, основно колагенови, фибри и един или два пласта от фибробласти. Свързващата тъкан на трабекулите на кавернозния корпус на пениса, прилежаща към капсулите, е с обикновена структура, имаща ясно изразени гладки мускули с малък брой еластични фибри без следи от дегенерация и некрози върху хистохимичните и хистоложки експерименти. Маловажен приток на левкоцити и макрофаги се забелязва върху повърхността на хидрогелния CL РАА имплант. Интратрабекуларните пространства са напълнени с незначителни количества от кръв, а ендотелиумът е леко набъбнал. По-маловажните артерии и вени са умерено изпълнени с кръв и имат леко удебелени стени (преди всичко дължащо се на набъбналия ендотелиум и увеличението на фибробластите, хистиоцитите и клетъчната плазма във външната обвивка на мембраните). Забелязва се, че капсулите са обгърнати със зърнеста тъкан, която се състои от малък брой тънкостенни, новопоявили се съдове и различни клетки, основно от хистиогенен произход като фибробласти и хистиоцити. Някои нервни влакна, импрегнирани и изпитани по метода на Spielmeier, показват промени в аксона, в миелиновата мембрана и в клетките на Schwann. Няма забелязани гигантски клетки, появили се в резултат на разтварянето на чуждото тяло. Отбелязани са усукване, локално набъбване, неравномерни удебелявания в нервните тъкани, както и разширяване на вените и загуба на фиброзна структура в аксоните, сферичните и кръглооформени разширения в техния край. Отчита се реактивно нарастване на клетките на Schwann, някои от които са хипертрофирани.

На 14 ден левкоцитната и макрофагната реакция около хидрогелния CL РАА имплант става малко по-интензивна, но гигантски клетки, способни да разтворят чуждото тяло, както е отбелязано по-горе, не са намерени. Свързващотъканните капсули около имплантите са в някои случаи леко порьозни и се състоят от случайно разсеян колаген, еластични фибри и нови фибробласти, като някои от тях са по-развити (зрели) и се състоят основно от паралелни колагенови фибри, вкл. еластични фибри и фибробластни елементи. Периферната зърнеста тъкан се състои от малък брой плоски новопоявили се съдове и фибробласти, съдържащи умерено количество на RNA и гранули от високосулфатни гликозаминогликани. Промените в нервните тъкани се проявяват като локално набъбнали аксони, загуба на фиброзна структура в тях, образуване на вакуоли, разширяване на кръвоносните съдове, хипо- и хиперимпрегниране и понякога, локално натрупване на оксоплазма, или по дължината на нервните фибри, или в техния край, частична грапавост на миелиновата мембрана и нейното разделяне на къси и дълги фрагменти, които се явяват като компенсаторно-адаптивен отговор на налягането. В регионалните лимфни възли, в междутрабекуларните пространства на кавернозния корпус, във вените и белите дробове, частици от хидрогела CL РАА не са отчетени.

След 1 месец хидрогелните CL РАА импланти са заобиколени от тънки развити (зрели) свързващо-тьканни капсули, съдържащи кръгово подредени колаген и еластични фибри с развити фибробластни елементи, намиращи се между техните слоеве. Незначителна дифузия на микрофаги и клетъчна плазма е отбелязана в слоевете, прилежащи към повърхността на импланта. Свързващо-тъканните трабекули на кавернозния корпус не показват структурно различие с тези от контролите и са покрити с нормален ендотелиум. Малко количество кръв може да бъде открита в междутрабекуларните пространства. Стените на вените и артериите в кавернозния корпус не показват забележими структурни промени. Реактивните промени в нервните фибри, сравнени с предишния период, са по-незабележими и главно се проявяват като непостоянно удебеляване или изтъняване на аксоните и локалното хипо- или хиперимпрегниране.

След 3 месеца хидрогелът става по-дебел и базофилен. Имплантите са отделени от прилежащите тьканни тънкостенни капсули на паралелни колаген и еластични фибри с малък брой от фибробласти между тях. Клетъчни елементи върху имплантите не се забелязват. Прилежащите тъкани с кръвоносни съдове са с обикновена, нормална структура. Гликозаминогликаните в основната междинна субстанция, фиброзните образувания и клетъчните елементи от свързваща тъкан са видимо еднакви с тези в контролата. Промени в нервните фибри не са отбелязани.

След 6 месеца пенисът на кучетата по форма и размери визуално е подобен на този, който се наблюдава на 14-ия ден. Хистологичното изследване показва имплантите като интегрални добре капсуловани тъмносини вакуоли. Капсулите се състоят от един или два пласта на фиброцити и равномерно подредени тънки колагенови еластични фибри и никакви соли на калция не са намерени, нито чрез микроскоп, нито по метода на von Koss. Не се наблюдават никакви реактивни, хемодинамични, дегенеративни, некротични, възпалителни или други промени, вкл. тьканни и клетъчни ненормалности не са открити в при14 лежащите към импланта тъкани. Върху импрегнираните със сребърен нитрат нервни фибри те визуално са идентифицирани в експерименталните и в контролните животни. В регионалните лимфни възли, в междутрабекуларните пространства на кавернозния корпус и вените на пениса, както и в белите дробове, не са намерени частици от хидрогела CL РАА.

Подобни морфологични данни се получават при клиничния експеримент. Използваният в теста материал е биоптична проба от хиподермична клетъчна тъкан, взета от здрав доброволец, възраст 45, който 6 години преди биопсията е инжектиран интрадермално с 10 ml от новия хидрогел с 8 % концентрация на CL РАА.

Биоптичната проба се фиксира в 10 % формалин, дехидратира се в алкохоли за нарастване на силата й и се поставя в парафин. Издутините се оцветяват с хематоксилин и еозин; колагеновите фибри се определят по метода на van Gison, а еластичните фибри с резорцин-фуксин по метода на Weigert; гликозаминогликаните се определят с толуидиново синьо в разтвор при различни pH, прилагайки установените химически изисквания и ензимният контрол; гликопротеидната и гликогенната концентрации се определят със средствата на PAS-реакцията по метода на McManus.

Биоптичната проба макроскопично е овална по форма, меко-еластична, светлорозова на цвят без видими промени, които биха я разграничили от прилежащите тъкани. При микроскопското изследване всички проби показват хидрогела CL РАА, оцветен с хематоксилин и еозин в син цвят с различни степени на интензивност. Хидрогелният имплант е проникнат от добре кръвоснабдена нежна свързваща тъкан, която се състои главно от последователно подредени колаген и еластични фибри и основна субстанция, която включва незначително количество от клетъчни елементи (като правило, такива като неактивните фибробласти, тъй като при оцветяването с толуидиново синьо при pH 2,8 никакви особености в метахроматичното доказване на гликозаминогликани не е отбелязано в цитоплазмата на тези фибробласти, както и в единичните мононуклеарни макрофаги).

Тази свързваща тъкан има кръвоносни съдове, разположени на групи и със стени, които са с неравномерна дебелина с плосък ендотелиум.

Признаци на остро и хронично възпаление, като например полиморфонуклеарни левкоцити, епителоидни клетки, гигантски клетки, способни да разложат чуждата материя, както и лимфа и хистиоцитни инфилтрати, напълно липсват. Липсват и признаци на алергични реакции като лимфоцити, макрофаги и хистиоцити; липсват също и признаци на хемодинамични заболявания, като например плетора на съдовете, престаза, хемостаза, тромбоза и злокачественост, например клетъчни или тьканни нередности и клетъчна пролиферация. Не е отбелязана калциева сол в издутините, нито макро-, нито микроскопски. Изменения, т.е. дистрофни или некрозни промени, не се забелязват.

Фиброзна капсула, заобикаляща импланта. не се наблюдава.

Основният метод за коригиране на козметични и функционални дефекти на човешкото тяло чрез използване на нов, биосъвместим хидрогел, наречен CL РАА се състои в следното. Методът се състои от анамнеза, проучване и, ако се изисква, лабораторно изследване на генералната поносимост на пациентите към хирургическо въздействие (особено за индивидуалната реакция към антибиотици), и заключение, което се свежда до следното: първо се определя органът, който ще се третира, и по отношение на какво формата, размерите или функциите му, и второ, количеството, тактиката (начина) и формата на бъдещото въздействие (външно или вътрешно).

Преди инжектирането на новия хидрогел се препоръчва анестезия (като правило с локално въздействие).

Стерилният CL РАА хидрогел допълнително се насища с антибактериални средства и се инжектира бавно (обикновено на две или три степени) в мястото така, че да въздейства с температура, приблизително нормална за телесната топлина (36 - 37°С).

Този метод е най-приложим в мамопластиката (за предпочитане в случай на аплазия или хипомастия), в алопластиката, в случай на импотентност, проявяваща се като слаба ерекция, дължаща се на възрастта или предхождащо увреждане. Така в мамопластиката хидрогелът CL РАА, имащ предпочитана концентрация в границите 3,5-6,0 %, най-предпочитана концентрация в границите 5,0 - 6,0 %, се инжектира ретромамално, интракапсуларно и/или субфасциално на два или три етапа в зависимост от индивидуалните, анатомични, гръдни особености, обикновено в количество от 40 до 160 ml (но не повече от 200 ml) на етап.

При фалопластиката (пластичната операция на пенис) хидрогелът CL РАА, имащ предпочитана концентрация 4,5 - 6,0 %, най-предпочитана концентрация 5 %, се инжектира като правило интравенозно в три трабекуларни сегмента, по дължината на всяка страна на пениса. Общото количество на хидрогела CL РАА, необходим за една фалопластична операция, е за предпочитане в границите на 40 до 60 ml. Определеното количество хидрогел, който ще се инжектира, се изчислява според изискванията за желан обем и еластичност на пениса, като се изключва възможността за налягане върху уретра.

Новият биосъвместим хидрогел е изследван клинично. По-специално той е прилаган за козметична корекция на лицеви вродени дефекти и в мамопластиката в случаите на аплазия и хипомастия при жени.

Протоколи за пациентите и начинът на лечението са представени, както следва:

(1) Пациент М. (случай, протокол № 15D), роден 1965.

Диагноза: вродена долночелюстна черепна нервномускулна микрозома отдясно.

Третиране: (обща анестезия: интравенозно hNLA)

- първи етап (ноември 1993) - две инжекции по 10 ml от 3,5 % хидрогел CL РАА интрамускулно;

- втори етап (юни 1994) - инжекции и хидрогел по 15 ml както при първия етап.

Подобрението е отчетено, като дясната и лявата страна на лицето са симетрични.

(2) Пациент L. (случай, протокол № 12), родена 1967.

Диагноза: симетрична мамоаплазия.

Третиране в три етапа (местна анестезия: 0,5 % новокаинов разтвор, 80 ml):

- първи етап (януари 1991) - интрамускулни, ретромамални и субкапсулиращи инжекции от по 140 ml на 6,0 % хидрогел CL РАА в двете гърди;

- втори етап (март 1991) - инжекциите и хидрогелът (40 ml) са както по-горе;

- трети етап (май 1991) - инжекциите и концентрацията на хидрогела (60 ml) са както в първия етап.

Отчетено е подобрение, като гърдите на пациентката по форма и размери съответстват на физиката й, а тяхната твърдост е подобна на природните меки тъкани.

(3) Пациент N. (случай, протокол № 78), родена 1969.

Диагноза: симетрична хипомастия.

Третиране (местна анестезия с 0,5 % разтвор на новокаин, 80 ml):

- първи етап (февруари 1993) - интрамускулни, ретромамални и субкапсулиращи инжекции от по 130 ml на 6,0 % хидрогел CL РАА и в двете гърди;

- втори етап (март 1993) - инжекциите и хидрогелът (100 ml) са, както е описано в горния етап.

Отчетеното подобрение е както при предходния случай.

(4) Пациент К. (случай, протокол № 17L), родена 1967.

Диагноза: симетрична хипомастия.

- първи етап (януари 1994) - интрамускулни, ретромамални и субкапсулиращи инжекции от по 130 ml от 6,0 % хидрогел CL РАА се поставят в двете гърди;

- втори етап (юли 1994) - инжекциите и хидрогелът (60 ml) както в първия етап.

Отчетено е подобрение както при предишния случай.

Ефектът от третирането в този случай е допълнително оценяван от данните, получени чрез компютризирана аксиална томография на гърдите, извършена с томограф на Siemens (Германия) марка “SONATRON CR”, като се сканират всеки 8 mm дълбочина на мястото на третираната гърда в легнало положение. Две от многото томограми, които са направени, са показани на фиг. 1 и 2.

Фигура 1 илюстрира лявата гърда след третиране на малформация и корекция на размера;

фигура 2 - подобна форма и размер на корекцията при дясна гърда.

Както се вижда от илюстрациите в резултат на третирането и двете гърди се намират в нормално състояние и имат правилна форма. Дебелината на кожата не надминава 2,0 mm, зърната и ареолите са също нормални (нито деформация, нито свивания). Хипопластичната жлезиста тъкан на двете гърди е преместена напред от хидрогела CL РАА (с различна плътност в сравнение със споменатата тъкан), инжектиран в ретромамалното пространство. (Плътността на зърнестата тъкан е +3,0 до +4,0, плътността на хидрогела е +4,6 до +7,2 и плътността на подкожната мастна клетъчна тъкан е -73 до -95 единици Ни).

Размерите на гръдната жлеза след третирането са следните:

- преместване от 7,4 cm надясно и 8,0 cm наляво;

- предно-задно преместване около 5,0 cm надясно и наляво.

Регионалните лимфни възли не са увеличени, костните тъкани на гръдните кости и ребра са нормално структурирани.

Лабораторните, експериментални и клинични данни позволяват да се направи заключението, че новият хидрогел CL РАА е химически и биологически стабилен, инертен, биосъвместим и отлично подхождащ за имплантиране на ендопротези, за тампониране на каверни и за образуването на междутъканни депа за медицински средства с продължително действие.

Новият биосъвместим хидрогел е изпробван като среда за дълготрайна кардио- и енцефалография върху проби с концентрация на CL РАА в границата от 4,0 до 8,0 %, като се приготвя в 0,9 % воден разтвор на натриев хлорид и натриев ацетат.

Изпитанието се състои в следното.

Измерване на електрическото съпротивление на хидрогела, поставен в слой от 1 mm между дисковите електроди на електрографа (тип ЕКМК-6) 9 mm в диаметър и 3 mm в дебелина с контактна повърхност от калай, мед или алуминий.

Измерване на електрическото съпротивление, за да се определи 24-часовата стабилност.

Определяне на способността да се понася продължителното (при 1, 7 и 15 дни наблюдение) приложение на веществото към кожата на ръката, близо до лакътя на доброволци, включващи двама мъже и две жени.

Електрическото съпротивление е от 8,0 до 9,0 kOhm/cm за образци от ВСН6 и ВСН7 и от 10,0 до 20,0 kOhm/cm за образци ВСН8 и ВСН9 и то остава непроменено за всички образци за 24-часов период; измерванията са повторени и с паста, търговски известна от Siemens AG, която има електрическо съпротивление от около 8,0 kOhm/cm.

При всички случаи поляризуемостта на калаения електрод е около 450 mV, на медния електрод около 150 mV и на алуминиевия електрод от около 700 mV. При измерването на електрическото съпротивление никаква паразитна поля ризация не е отчетена.

При визуалното наблюдение нито едно от кожните приложения, по време на наблюдавания период, не показа видими възпаления (зачервявания или сърбеж) и което е по-важно, кожни увреждания (мацерация). На 15-ия ден при един случай кожата около пластира, покриващ хидрогелното приложение, стана розова при една от доброволките.

Спонтанно протичане на хидрогела CL РАА, имащ вискозитет 10-11 поаза, извън пространството между хоризонтално поставените измерващи електроди и под пластирите, не се забелязва.

Получените данни показват, че новият хидрогел CL РАА е приложим като имерсионна среда за измервания (мониторинг) на електрофизиолошчните параметри на човешкия организъм или за електрофорезно инжектиране на лекарства през кожата.

Claims

1. Биосъвместим хидрогел, съдържащ полимер на основата на акриламид, получен чрез използване на инициатор за радикална полимеризация в апирогенна вода като дисперсна среда, характеризиращ се с това, че полимерът е напречно свързан (омрежен) полиакриламид, получен при използването на биосъвместим напречно свързващ (омрежващ) агент.

2. Биосъвместим хидрогел съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържа напречно свързан (омрежен) полиакриламид, получен чрез прилагането на метилен-бис-акриламид като напречно свързващ (омрежващ) агент и смес от амониев персулфат и тетраметилендиамин като инициатор на полимеризацията.

3. Биосъвместим хидрогел съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се състои от 3,5 до 9,0 % тегл. от напречно свързан (омрежен) полиакриламид.

4. Биосъвместим хидрогел съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържа и физиологично неутрална водоразтворима сол.

5. Биосъвместим хидрогел съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че физиологически неутралната водоразтворима сол е натриев хлорид.