CN110191947A - 工程化肠组织和其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了使用三维工程化生物打印的生物肠组织模型评价候选治疗剂逆转、降低或预防潜在毒性剂所致的肠损伤的能力的方法。还公开了评价剂对肠功能的影响的方法，该方法包括使该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触。

Description

工程化肠组织和其用途
发明背景
发明领域
本发明属于肠组织模型和其在测定中的用途的领域。公开了使用三维工程化生物打印的生物肠组织模型评价候选治疗剂逆转、降低或预防潜在毒性剂所致的肠损伤的能力的方法。还公开了评价剂对肠功能的影响的方法，该方法包括使该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触。
背景技术
肠黏膜在调控吸收、首过代谢、清除、药物-药物相互作用中起着关键作用，并且可以是药物诱导毒性的部位。目前的在药物开发中使用的体外系统和临床前模型不能充分地重现(recapitulate)天然人类肠组织的复杂性，导致低的安全性和效力可预测性以及药物开发中的损耗(attrition)。
目前的临床前模型在其捕获人类肠组织的复杂性和功能的能力方面是有限的[1-5]。全身的可利用度、减少的效力和脱靶效应仍然是对成功预测候选药物的挑战，并且促成在药物开发中的损耗。许多预测性挑战可以归因于缺乏模拟体外肠功能的复杂性的临床前工具[1-3]。口服递送是用于药物施用的最常用的方法。肠在口服施用的药物的吸收的程度和首过代谢中起着关键作用。肠还用作诸如NSAIDS[4]和化学治疗剂[5]的化合物的脱靶毒性的关键部位，并且用作药物-药物相互作用的部位[2,6]。标准2D系统缺乏精确地模拟诸如低生物可利用度的结果的复杂性，低生物可利用度是肠上皮中低渗透率以及代谢酶与流入和流出转运蛋白的相互作用的组合的结果[3]。被用于研究肠生物可利用度和毒性的主要体外模型包括肠微粒体(microsomes)和2D单层。微粒体是用于初始评价代谢的方便的工具，但不能模拟细胞水平结果。
2D细胞单层模型缺乏细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用的天然环境，并且在表型上受限，而动物模型的遗传差异可能不提供与人类结果的高度相关性[16]。目前的体外肠模型包括起源于结肠直肠肿瘤和十二指肠肿瘤的细胞系(例如，Caco-2、HT-29、HT29-18N2和HuTu80)的2D细胞单层模型。然而，与正常组织相比，在肿瘤细胞中改变的代谢是这些模型的主要缺点。并且，这些肿瘤模型不代表天然肠上皮的特征。Caco-2细胞系是被用于模拟被动转运和预测肠吸收的最确定的细胞模型。Caco-2模型的限制包括缺乏P-450代谢酶表达和活性、缺乏稳健的肠转运蛋白表达和功能、传代数目的变异和品系中的克隆之间的不一致性。其它2D模型包括肠上皮细胞，所述肠上皮细胞连同其它细胞系可能具有有限的肠上皮功能，这部分是由于它们与其它特化的(specialized)上皮细胞类型(例如，杯状细胞、潘氏细胞(Paneth cells))以及在肠壁中存在的其它支持性细胞类型的分离。
常用的细胞系的限制已经激发了使用人类原代肠细胞的方法的开发。原代肠上皮细胞的单一培养物更接近于体内组织，但部分由于其与在肠壁中存在的其它支持性细胞类型的分离，可能具有有限的肠上皮功能。此外，在分离的上皮单一培养物中的测试阻止观察对在天然组织中存在的间质细胞和免疫细胞的作用的能力。
更复杂的3D结构包括肠区段(intestinal segments)和来源于整个组织或活组织检查的肠类器官(organoids)。扩增人类原代肠细胞[9,10]或分化多能干细胞[11]的类器官的发现，揭示了体外模拟肠的另一条途径。类器官可以来源于肠道的所有区域[12]，并且已经被应用于肠研究的许多领域，包括器官发育、疾病模拟和再生医药[13,14]。这些结构遭受低可利用度(来自人类)、有限的体外存活寿命，并且可能缺乏体内器官生理学(physiology)。特别地，在肠类器官中闭合的腔和上皮细胞的向内取向使顶端表面对于它们将通常在体内经历的直接刺激相对地难以接近，并且使类器官与大多数标准ADME/Tox测定不相容。
来源于人类组织的肠切片可以提供正确的细胞结构和复杂性以及天然组织的代谢活性的水平。然而，肠切片具有有限的离体存活力，并且仅在约24小时内起作用。此外，这些组织与冷冻保存不相容，这限制了它们的短期研究的用途[15]。
动物模型频繁地被用于估计化合物生物可利用度，然而遗传差异可导致与人类相比的代谢酶和转运蛋白的表达的差异，这可导致不良预测[2,3,16]。
为了克服目前的体外系统的现有限制，自动化的生物打印平台被用于开发高度可重复的细胞3D原代人类组织模型，以重现天然肠黏膜的结构的关键方面。与标准2D单层培养物相比，3D生物打印的肠组织模型创建了生理学上更相关的环境，允许细胞建立在天然组织中发现的细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用。掺入了通过间质组织层支持的极化的肠上皮的该模型，与组织学和标准生物化学ADME/Tox读出(readout)是相容的。
3D生物打印的肠组织表现出天然样层状结构，包括在培养物中维持超过两周的极化的上皮形态学和生理学屏障功能。3D生物打印的肠组织以与天然肠相比的类似内源性水平表达关键P450代谢酶和转运蛋白，并且显示出CYP2C9和CYP3A4酶以及P-gp和BCRP流出转运蛋白(efflux transporters)二者的有功能的活性。此外，生物打印的肠组织对已知毒物吲哚美辛(indomethacin)和TNFα有响应，具有降低的屏障功能、增的加细胞毒性、和基因表达和细胞形态学的改变。完全人类原代细胞来源的组织组合生物打印平台的可重复性和与标准测定方法的相容性，使该系统成为用于跨药物开发的ADME/Tox应用的新的且实用的体外工具。
发明概述
本发明提供了肠组织模型，该肠组织模型通过在肠间质组织层上面提供肠上皮细胞层提供优于现有体外测定系统的优点，所述肠间质组织层包含肌成纤维细胞和，任选地，其它关键细胞类型诸如髓样免疫细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和神经元。这些肠组织模型允许人们在更全面的系统中观察治疗的影响。并且，肠组织模型在培养中持续延长的时间段支持上皮形态学和功能，从而使治疗的慢性研究(chronic studies)实现。肠组织构建体因其多细胞性和结构提供了研究多方面过程(包括分泌、转运、细胞-细胞相互作用和致病过程，包括炎症和癌症)的独特系统。
肠组织模型是在制药行业中的动物模型的有价值替代物，用于在药物开发的先导优化阶段(lead optimization stage)以及跨药物发现的所有阶段的疾病模拟中的ADME-TOX应用。在一个实施方案中，本文描述的肠组织模型掺入上皮和固有层二者以近似肠黏膜。在另一个实施方案中，组织构建体在上皮区室中包含人类原代肠上皮细胞，该上皮区室通过在间质区室中的人类原代肌成纤维细胞支持。通过将另外的特化的细胞类型(例如，肠内分泌细胞)掺入到上皮层中以模拟内分泌功能，同时可以添加杯状细胞以模拟黏膜屏障功能来任选地增加模型的复杂性。通过添加免疫细胞或包含内皮细胞和平滑肌细胞的黏膜下区室(submucosal compartment)来实现另外的复杂性。公开的肠组织构建体的优点是与具有二维环境的组织构建体相比，它们是生理学上更相关的。组织的多细胞性和结构提供以三维构造研究复杂多方面细胞过程(包括分泌、转运、细胞-细胞相互作用和致病过程)的独特机会。通过这些相互作用，三维组织以与二维单层培养的细胞不同的方式分化，活化新的信号传导途径和胞外基质相互作用。
本文描述的肠组织模型提供了精确地研究化合物如何影响肠组织以及模拟在肠中的致病过程的机会。本文公开的肠组织模型可用于在药物开发过程的较早期预测药物化合物的毒性。通过将患病(例如发炎组织或肿瘤组织)和正常细胞区室二者掺入到相同的组织中，治疗剂对健康组织和患病组织二者的影响可以在相同的组织系统中被评价。包含原代细胞的肠组织构建体特别可用于个性化医药。
出乎意料地，本文描述的仅用在肠上皮细胞层中的原代上皮细胞制备的肠组织模型表达嗜铬粒蛋白A、分泌胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和黏液，显现出杯状细胞的形成和天然肠组织的二级结构特征、在培养物中的组织增厚、和CYP3A4活性。这指示出产生了有功能的肠内分泌细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了三维工程化生物打印的生物肠组织模型，所述三维工程化生物打印的生物肠组织模型包含：
(i)包含肌成纤维细胞的肠间质组织层；和
(ii)在肠间质组织层上的肠上皮细胞层，以形成三维工程化生物肠组织模型。
在一些实施方案中，肠间质组织层的至少一层包含肌成纤维细胞，并且肠上皮细胞层还包含至少一种类型的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是髓样细胞。在一些实施方案中，髓样细胞是单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞或巨核细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴样细胞。在一些实施方案中，免疫细胞存在于以下的至少一种中：(a)间质层、(b)上皮细胞层、(c)在间质层和上皮细胞层之间、(d)在上皮细胞层上面和(e)在间质细胞层下面。
在一些实施方案中，肠上皮细胞层包含来自健康供体的原代上皮细胞。在一些实施方案中，肠上皮细胞层包含来自患病供体的原代上皮细胞。在一些实施方案中，患病供体具有乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、痔、憩室炎、炎性肠病、显微镜下结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、内分泌障碍、代谢障碍、肥胖、糖尿病、血脂异常、肠癌或结肠直肠癌。
在一些实施方案中，肠上皮细胞层还包含至少一种干细胞群。在一些实施方案中，至少一种干细胞群能够分化。在一些实施方案中，肠组织模型还包含肿瘤(tumor(s))、肿瘤碎片(tumor fragment(s))、肿瘤细胞或永生化细胞。在一些实施方案中，肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞是结肠直肠的肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞。在一些实施方案中，肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞存在于肠组织模型中的层或区室中。
在一些实施方案中，肠上皮细胞层和间质组织层包含来自健康供体的原代上皮细胞。在一些实施方案中，肠上皮细胞层和间质组织层包含来自患病供体的原代上皮细胞。
在一些实施方案中，肠组织模型表现出以下的至少一种：
(a)绒毛蛋白的顶端染色；
(b)紧密连接；
(c)顶端刷状缘；
(d)在上皮表面上的绒毛样结构；
(e)在间质组织层和上皮细胞层之间的基底层；
(f)分泌黏液；
(g)表达CYP3A4；
(h)表达p-糖蛋白；
(i)表达胰高血糖素样肽-1；
(j)表达BCRP；
(k)包含肠内分泌细胞；和
(l)包含杯状细胞。
在一些实施方案中，组织模型不包含完全成熟、可灌注的血管系统。在一些实施方案中，组织模型不包含红细胞。在一些实施方案中，组织模型不受例如中枢神经系统支配。
在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的肠间质组织层和/或肠上皮细胞层基本上是单层。在一些实施方案中，肠组织模型还包含与肠组织层接触的生物相容性膜。在一些实施方案中，模型是至少2个细胞层厚。
在一些实施方案中，肠组织模型包括多于一个(a plurality of)肠组织模型，该多于一个肠组织模型被配置成形成阵列。在一些实施方案中，阵列存在于微量滴定板的孔中。在一些实施方案中，肠模型在培养物中经受静态培养条件。在一些实施方案中，肠模型在培养物中经受非静态培养条件。
在一些实施方案中，肠组织模型包含至少一个包含正常的肠间质组织和肠上皮细胞的层的第一区域和至少一个包含肠间质组织和肠上皮细胞的层的第二区域，其中第二区域的层的至少一层包含来自患病供体的细胞。
还提供了肠障碍或损伤的非人类动物模型，所述非人类动物模型包括在其中植入肠组织模型的非人类动物。在一些实施方案中，非人类动物是免疫缺陷啮齿动物。
还提供了评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力的方法，该方法包括：
(a)使肠组织模型或非人类动物模型与候选治疗剂接触，其中肠组织模型具有肠障碍或损伤的表型；
(b)确定肠组织细胞的存活力或功能性；和
(c)基于与未与候选治疗剂接触的对照肠组织模型相比的确定的肠组织细胞的存活力或功能性，评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力。
在一些实施方案中，肠障碍或损伤的表型通过使肠组织模型与引起表型的治疗、化合物、或传染原(infectious agent)接触来诱导。在一些实施方案中，肠障碍或损伤的表型是在肠组织模型中肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞的存在。在一些实施方案中，候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力是降低的肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞侵袭或转移。
还提供了评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力的方法，该方法包括：
(a)使肠组织模型或非人类动物模型与候选治疗剂接触；
(b)确定肠组织细胞的存活力或功能性；和
(c)基于与未与候选治疗剂接触的对照肠组织模型相比的确定的肠组织细胞的存活力或功能性，评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力。
在一些实施方案中，肠组织模型的上皮细胞和/或肌成纤维细胞从患病供体获得。在一些实施方案中，患病供体具有乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、痔、憩室炎、炎性肠病、显微镜下结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、内分泌障碍、代谢障碍、肥胖、糖尿病、血脂异常、肠癌或结肠直肠癌。在一些实施方案中，肠障碍或损伤是炎症。在一些实施方案中，肠障碍或损伤是物理损伤，并且肠组织模型在与候选治疗剂接触前经受物理破坏。在一些实施方案中，肠障碍或损伤是纤维化障碍。在一些实施方案中，肠障碍或损伤是传染病。在一些实施方案中，肠障碍或损伤是癌症。在一些实施方案中，癌症是结肠直肠癌。
在一些实施方案中，肠组织模型在与候选治疗剂接触前与潜在毒性剂接触。在一些实施方案中，潜在毒性剂是毒素、治疗剂、抗微生物剂、金属、微生物(例如细菌、病毒、寄生虫、真菌)、或环境因素(environmental agent)。在一些实施方案中，潜在毒性剂是抗病毒剂、镇痛剂、抗抑郁剂、利尿剂、或质子泵抑制剂。在一些实施方案中，潜在毒性剂是细胞因子、趋化因子、小分子药物、大分子药物、蛋白或肽。在一些实施方案中，潜在毒性剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，潜在毒性剂是布洛芬、对乙酰氨基苯酚、锂、阿昔洛韦、两性霉素B和氨基糖苷类、β内酰胺类、膦甲酸钠(foscavir)、更昔洛韦、喷他脒、喹诺酮、磺酰胺、万古霉素、利福平、阿德福韦、茚地那韦、didofovir、替诺福韦(tenofovir)、甲氨蝶呤、兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑、别嘌呤醇、苯妥英、异环磷酰胺(ifosfamide)、庆大霉素或唑来膦酸(zoledronate)。在一些实施方案中，潜在毒性剂是辐射。在一些实施方案中，潜在毒性剂是免疫活化剂或免疫调节剂。
在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过测量代谢活性的指示物来确定。在一些实施方案中，代谢活性的指示物是与对照相比的在肠组织模型中的刃天青还原、四氮唑盐还原或ATP水平。在一些实施方案中，肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的屏障功能。在一些实施方案中，肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的药物流出。在一些实施方案中，肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的细胞色素P4503A4(CYP3A4)活性。在一些实施方案中，肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的RNA表达或蛋白表达。在一些实施方案中，肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的肽分泌。在一些实施方案中，肽是细胞因子。在一些实施方案中，肠组织模型的存活力或功能性通过与对照相比的组织学来确定。在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过鉴定与对照相比的肠组织细胞的再生来确定。在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的黏液分泌来确定。在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的转运蛋白活性来确定。在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的酶活性来确定。在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的甘油三酯合成来确定。在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的乳糜微粒分泌活性来确定。在一些实施方案中，肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的胶原蛋白产生来确定。在一些实施方案中，肠组织上皮细胞的存活力或功能性随时间来测量。在一些实施方案中，提供了逆转或降低毒性剂所致的损伤的方法，并且使肠组织模型首先与毒性剂接触，并且然后与候选治疗剂接触。在一些实施方案中，提供了降低或预防毒性剂所致的损伤的方法，并且使肠组织模型首先与候选治疗剂接触，并且然后与毒性剂接触。
在一些实施方案中，肠组织模型在与候选治疗剂和毒性剂接触前已经在细胞培养基中培养。在一些实施方案中，肠组织模型已经在细胞培养基中培养至少3天。
还提供了评价潜在毒性剂对肠功能的影响的方法，该方法包括：
(a)使该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量该剂对肠组织模型细胞的存活力或功能性的影响。
在一些实施方案中，提供了逆转或降低毒性剂所致的损伤的方法，并且使肠组织模型首先与毒性剂接触，并且然后去除潜在毒性剂。
还提供了评价剂的肠吸收的动力学的方法，该方法包括：
(a)使该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量肠组织模型吸收的动力学。
还提供了预测候选治疗剂的有效给药浓度和给药方案的方法，该方法包括：
(a)使不同浓度或量的该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量该剂对肠组织模型细胞的存活力或功能性随时间的影响；和
(c)测量肠组织模型细胞的随时间恢复，以确定提供效力的剂量之间的最小定时(minimum timing)。
在一些实施方案中，该方法还包括：
(d)去除该剂；和
(e)评价该剂的不存在是否引起改善的肠组织模型的存活力或功能性。
还提供了制备肠组织模型的方法，该方法包括：
(a)使包含肠肌成纤维细胞的层沉积到生物相容性表面上；和
(b)使肠上皮细胞层沉积到肠肌成纤维细胞层上。
在一些实施方案中，肠肌成纤维细胞和肠上皮细胞的至少一种通过生物打印被沉积。在一些实施方案中，肠肌成纤维细胞和肠上皮细胞的至少一种通过喷墨打印被沉积。在一些实施方案中，肠肌成纤维细胞和肠上皮细胞的至少一种通过挤出(extrusion)被沉积。在一些实施方案中，肠肌成纤维细胞和肠上皮细胞的至少一种通过微阀打印(microvalveprinting)(MSV)被沉积。在一些实施方案中，肠肌成纤维细胞和肠上皮细胞的至少一种通过喷墨打印被沉积。在一些实施方案中，肠肌成纤维细胞和肠上皮细胞的至少一种作为生物墨(bio-ink)的部分被沉积。在一些实施方案中，生物墨包含水凝胶。在一些实施方案中，水凝胶是胶原蛋白。在一些实施方案中，该方法还包括使免疫细胞沉积。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞作为肠组织层的至少一层的部分被沉积。在一些实施方案中，免疫细胞在以下的至少一种中被沉积：(a)间质层、(b)上皮细胞层、(c)在间质层和上皮细胞层之间、(d)在上皮细胞层上面和(e)在间质细胞层下面。在一些实施方案中，免疫细胞作为层或区室被沉积。在一些实施方案中，肠组织模型被沉积到微量滴定板的孔中。在一些实施方案中，该方法还包括在细胞培养基中培养肠组织模型。在一些实施方案中，肠组织模型在细胞培养基中培养至少3天。在一些实施方案中，生物相容性表面位于微量滴定板的孔中。
附图简述
图1A-1B说明了在第7天(完全培养时间11天)时具有单独的肌成纤维细胞(IMF)组织、2D Caco-2/STC-1单层、和包含两层(IMF+Caco-2/STC-1)的3D组织的生物打印的肠组织构建体通过H&E染色(图1A)和三色染色(图1B)的组织学比较。单独接种后，IMF和上皮细胞(Caco-2/STC-1)二者在11天内在培养物中形成单层。当被一起生物打印时，上皮细胞形成二级结构，并且IMF产生更多胶原蛋白，如在三色染色中观察到的(蓝色)。
图2A-2F是显示出具有Caco-2的3D打印的组织的显微照片，显示出Caco-2生物打印的3D肠组织的关键结构和组织特异性特征。图2A显示出通过H&E染色的双层状结构；图2B显示出3D生物打印的组织的三色染色；图2C显示出CK19(上皮)和波形蛋白(成纤维细胞)共染色；图2D显示出CK19和胶原蛋白IV共染色；图2E显示出鉴定刷状缘的绒毛蛋白染色；图2F显示出对上皮细胞的E-钙黏蛋白染色，指示紧密连接。基底层可以在图2B中的三色染色(箭头)和在图2D中的胶原蛋白IV染色中被观察到。
图3A-3C是显示出生物打印的3D Caco-2组织在培养物中随时间增厚并且维持关键结构特征的图。图3A显示出具有支持Caco-2/STC-1上皮细胞的IMF间质的3D生物打印的组织的组织学时间过程。图3B显示出PCNA和CK19共染色。PCNA染色显示出细胞正在增殖，指示出3D Caco-2组织在培养物中是高度存活的。图3C显示出分别通过阿尔新蓝/PAS染色和黏蛋白2/CK19共染色的黏蛋白产生的缺乏。
图4是显示出通过跨内皮电阻(TEER)测量的2D单层和3D生物打印的Caco-2组织的屏障功能比较的条形图。TEER被用于评价在包含Caco-2/STC-1的2D共培养物和3D组织中肠上皮屏障的质量。在14天培养时间段中，随着时间过程跟踪屏障功能。数据证明了在3D组织中屏障功能随时间增加。在3D组织中屏障功能的值落在生理学范围中，而2D单层的值可以是不自然地(artificially)高的。正常小肠TEER值是50-100Ω.cm2(Srinivasan B.,KolliA.R.,Esch M.B.,Abaci H.E.,Shuler M.L.,Hickman J.J.(2015)).TEER measurementtechniques for in vitro barrier model systems.J Lab Autom 20(2),107-126)。
图5是显示出通过萤光黄(Lucifer Yellow)测量的2D单层和3D生物打印的Caco-2组织的渗透率比较的条形图。萤光黄被用于证明在培养物中在多个时间点的屏障完整性。对3D打印的组织测量渗透率，并且与单独的Caco-2/STC-1细胞和间质的2D上皮单层进行比较。生物打印的3D构建体和2D单层二者表现出在可接受的范围中的低渗透率(在培养的后期时<3％)。数据表明3D组织具有足够的低被动渗透率以用于转运测定。
图6A-6B是显示出在多个实验中平均的TEER(图6A)和渗透率(图6B)数据的图。
图7是显示出来自生物打印的Caco-2组织的肠内分泌细胞GLP-1分泌的功能测定验证的条形图。
图8是显示出2D单层和3D生物打印的Caco-2组织的时间过程的基因表达比较的条形图。在3D组织vs.2D培养物中观察到转运蛋白/酶的组(panel)的持续的基因表达。与转运蛋白相比，CYP3A4表达是低的。在第14天时，在3D组织中检测到痕量(0.000004)。
图9A-9B是显示出2D单层和3D生物打印的Caco-2组织的P-gp表达比较的条形图和显微照片。P-糖蛋白(P-gp)是在肠上皮的顶端表面上的流出转运体。尽管在第7天在2D单层和3D生物打印的Caco-2组织中P-gp基因表达是类似的(图9A)，但是通过免疫组织化学染色在3D生物打印的Caco-2组织中观察到改善的P-gp蛋白表达，在培养的后期具有增强的表达(图9B)。
图10是显示出打印表面、在胶原蛋白中的原代肠肌成纤维细胞层和人类原代肠上皮细胞上层的示意图。
图11A-11D是显示出生物打印的3D原代肠上皮细胞(IEC)组织表达天然组织的关键特征的组织学图。在第9天、第10天和第17天的组织学组显示出3D人类原代肠上皮细胞(hIEC)组织表达天然组织的关键特征。组织表现出正确的结构，上皮细胞形成紧密连接并且以类似于天然组织的表达模式极化。图11A显示出使用原代hIEC实现的具有正确的结构的3D双层状组织。在培养第9天的图像揭示了具有二级结构形成的不同的上皮层。图11B显示出在3D双层状组织中的上皮细胞形成紧密连接并且以类似于天然组织的表达模式极化。图11C显示出在上皮中具有原代hIEC的生物打印的肠组织证明了正确的结构。具有正确的IMF和hIEC标志物的表达模式的双层状组织维持超过17天的培养时间段。图11D显示出生物打印的肠组织具有持续的存活力并且类似于天然肠。
图12是显示出生物打印的3D原代IEC组织产生黏液的组织学图组。黏蛋白-2染色可以在具有原代肠上皮细胞的组织中被观察到，但在3D Caco-2组织中未被观察到。染色证明了极化的上皮，具有顶端刷状缘形成、杯状细胞、和黏液产生。Caco-2组织不包含杯状细胞或产生黏液。
图13A-13B是显示出生物打印的3D原代IEC组织表达关键转运蛋白和酶的条形图。当组织成熟时诱导该组中被分析的所有基因的表达值。图13A显示出，在培养9天的具有人类原代肠上皮细胞的3D组织中，当3D组织成熟时，所有被分析的转运蛋白和酶被诱导至比原代IEC更高的水平。P-gp在原代IEC中表现出最高的基线表达，而P-gp和CYP3A4是在第9天时的3D组织中最高表达的基因。图13B是以与CK19表达的比例(例如，2-(ΔΔCt)PGP/2-(ΔΔCt)CK19)(以去除在总细胞数中的任何差异)显示出基因表达的条形图。比较在第9天与第0天表达的相对倍数变化显示出当3D组织成熟时在所有基因的诱导。生物打印方法创建了具有低构建体可变性(n＝3)/时间点的可重复的组织。
图14是显示出在具有原代IEC的3D组织中转运蛋白和代谢基因表达与3D Caco-2组织相比更高的条形图。3D Caco-2组织的基因表达在多个时间点与在第9天时的原代组织进行比较。除MRP3外，在原代IEC组织中的整体转运蛋白基因表达比3D Caco-2组织高得多。代谢酶CYP3A4的表达在原代组织中非常高，并且在3D Caco-2组织中缺失。
图15是显示出肠上皮随时间分化的条形图组。用原代肠上皮细胞制备的组织表达在天然肠中发现的关键特化细胞类型。肠内分泌细胞标志物是CHGA，杯状细胞标志物是MUC2。观察到CHGA和MUC2的增加以及LGR5的减少，表明上皮细胞正在分化。值表示为与CK19的比例，以可视化对组织中上皮细胞群特异性的变化。
图16A-16B是显示出在不具有原代肠上皮细胞的上皮层中用100％STC-1细胞打印的3D组织的显微照片。组织显示出双层状结构。小鼠STC-1细胞缺乏上皮紧密连接，并且形成侵袭性聚集物，该侵袭性聚集物可以破坏周围的上皮并且增加屏障功能可变性。基于该细胞系来源于的转基因小鼠系，SV40被用作用于STC-1细胞的标志物。图16A显示出了通过将小鼠STC-1细胞系掺入至生物打印的3D肠组织模拟肠内分泌功能。分泌肠激素CCK、GLP-1、GLP-2、GIP和PYY的小鼠肠细胞系来源于SV40大T抗原和多瘤病毒小T抗原的双转基因小鼠的肿瘤。小鼠STC-1细胞系被添加至3D组织上皮以模拟肠肠内分泌功能。STC-1细胞的行为不像上皮细胞。单独的STC-1细胞形成厚层，缺乏上皮标志物和紧密连接形成。图16B显示出当掺入有原代肠细胞时，STC-1细胞形成侵袭性聚集物。STC-1细胞可以破坏周围的上皮。
图17A-17B是显示出将STC-1细胞与原代肠上皮细胞掺入到组织上皮中的组织的组织学显微照片。组织形成正确的双层状结构，表现得类似于天然组织，并且产生黏液。图17A显示出，尽管行为异常，具有STC-1细胞的组织维持正确的结构和表达模式。图17B显示出具有STC-1细胞的组织还发育出黏膜屏障。箭头指示出顶端刷状缘，并且星号(*)指示出杯状细胞和黏液。
图18A-18B是显示出在用原代肠上皮细胞制备的3D生物打印的组织中的GLP-1分泌的条形图。在饥饿2小时后测量组织的基础GLP-1分泌。测量蛋白含量以使GLP-1水平归一化(图18A)。基线GLP-1分泌通过掺入小鼠肠内分泌细胞系STC-1来增强，并且通过在饥饿后通过50mM毛喉素(Forskolin)+10uM IBMX+10mM葡萄糖的混合物的刺激来进一步增强(图18B)。GLP-1可以在不具有STC-1细胞的组织中被检测并被诱导，表明肠内分泌细胞在hIEC分离物中存在并且是有功能的。
图19A-19C是显示出在用原代肠上皮细胞制备的3D组织中的屏障功能的条形图。在上皮接种后10天测量TEER和萤光黄渗透率。屏障功能需要原代肠上皮细胞(hIEC)。仅具有肌成纤维细胞(IMF)和STC-1细胞的组织未显示出屏障功能。
图20A-20E是显示出Taqman阵列卡(Taqman array card)分析的图。图20A-20B显示出，关键转运蛋白在培养物中存在并且当组织成熟时随时间被诱导。调控药物处置(drugdisposition)的转运蛋白(P-gp和BCRP)和关键胆汁酸转运蛋白ASBT高度表达并且随时间增加。数据显示出3D hIEC组织优于具有金标准Caco-2的组织的明显优点(图20B)。调控药物处置的转运蛋白(P-gp和BCRP)和关键胆汁酸转运蛋白ASBT高度表达。顶端流出转运蛋白BCRP和流入转运蛋白PEPT1随时间被高度上调(图20C)。图20C显示出关键代谢酶随时间被诱导。高度表达的CES2是在肠中的主要酶，并且负责多种异生物质(xenobiotic)的代谢。主要I相(Phase I)细胞色素P450酶CYP3A4随时间被高度诱导(150×)，具有持续的表达。在原代IEC中的CYP3A4表达优于Caco-2细胞(Caco-2细胞不表达CYP3A4)。主要II相酶UGT1A1也高度表达并且随时间被诱导。图20D显示出脂质生物学的基因表达。除了负责游离胆固醇摄取的NPC1L1，用于脂肪酸和胆固醇的转运蛋白在低水平被表达。参与脂肪加工的酶高度表达，并且从第0天开始增加，然后维持至第17天。图20E显示出，关键内分泌标志物存在并且随着组织成熟被诱导。关键分泌的肽CCK、GCG、GIP、PYY、和SST被表达并且随时间增加。这些标志物也在缺乏STC-1细胞的组织中存在，表明肠内分泌细胞在hIEC组织中存在。
图21A-21B显示出3D肠组织具有可以被药物调节的持续的CYP3A4功能。CYP3A4活性对原代肠上皮细胞是特异性的。构建体在培养物中维持有功能的CYP3A4活性持续>2周(图21A)。如预测的，显著的CYP3A4活性可以被利福平诱导，并且被酮康唑抑制(图21B)。
图22A-22I显示出3D生物打印的肠组织的结构。图22A显示出通过生物打印包含成人肠肌成纤维细胞(IMF)的间质层随后是成人肠上皮细胞(hIEC)实现的双层状结构。图22B-22C显示出表达波形蛋白的间质细胞和表达CK19的上皮区室在培养物中保持分离超过17天。图22D-22E显示出针对紧密连接E钙黏蛋白(图22D)和顶端绒毛蛋白(图22E)染色的上皮细胞。图22F-22G显示出在整个培养过程中观察到来自杯状细胞的黏液产生。图22H-22I显示出还存在溶菌酶染色的潘氏细胞(图22H)和表达嗜铬粒蛋白的肠内分泌细胞(图22I)。
图23A-23C显示出天然肠、3D生物打印的肠组织、和Caco-2单层的基因表达比较。图23A显示出用于肠上皮谱系(LGR5,CDX2)和紧密连接的一般肠标志物在三个组中是类似的。上皮亚型标志物对于天然和3D生物打印的肠组织是最高的。药物诱导型转录因子VDR、NR1I2(PXR)和NR1I3(CAR)对于正常肠组织功能和3D肠组织是类似的。图23B显示出天然和3D生物打印的肠组织表达所有被分析的代谢酶，包括I相细胞色素P450，Caco-2细胞缺乏大多数的I相细胞色素P450。调控脂肪酸代谢的基因DGAT1、MOGAT1和MTTP在正常肠组织功能和3D生物打印的肠组织中是接近等同的。图23C显示出转运蛋白被所有三个组表达，具有水平差异。对于流出转运蛋白，3D生物打印的肠组织最类似于正常肠组织功能，而Caco-2降低表达ABCB1(P-gp)和ABCG2(BCRP)，而过表达ABCC2(MRP2)和ABCC3(MRP3)。摄取转运蛋白SLC15A1(PEPT1)和SLCO2B1(OATP2B1)被天然和3D生物打印的肠组织类似地表达，而不被Caco-2单层表达。对于所有三个组胆汁酸转运蛋白不同。
图24A-24B显示出3D生物打印的肠组织的屏障功能。图24A显示出从第6天至第21天测量3D生物打印的肠组织的跨上皮电阻(TEER)，显示出在培养物中早期增加，在第10天后屏障功能维持在生理学水平(虚线)内(n＝24)。在第21天时Caco-2单层具有高于生理学值的TEER。图24B显示出在顶端至基底方向测量测试化合物的渗透率，并且显示出在低渗透率化合物(萤光黄、米托蒽醌)、中等渗透率化合物(地高辛)和高渗透率化合物(普萘洛尔)之间的不同。
图25A-25D显示出在3D生物打印的肠组织中的P-gp和BCRP转运蛋白功能。图25A-25B显示出P-gp和BCRP顶端地定位在3D生物打印的肠组织中，类似于正常肠组织功能。在Caco-2单层中的表达在顶端表面呈斑块状(in patchy)。图25C显示出P-gp底物地高辛在B至A方向具有更大的渗透率，具有2.1的流出比(efflux ratio)。在P-gp抑制剂Zosuquidar存在时，地高辛的流出比被降低至1.2。图25D显示出在对照条件下BCRP/P-gp底物拓扑替康具有8.8的流出比。通过Ko143抑制BCRP降低B至A转运并且流出比减少至3.6。P-gp和BCRP的双重抑制导致转运的消融(ablation of transport)，具有1.4的流出比。显著性的水平：通过双向ANOVA，****P<0.0001。
图26A-26E显示出在3D生物打印的肠组织中的细胞色素P450代谢。图26A显示出CYP2C9基础活性通过萤光素活性测定被验证，并且被抑制剂磺胺苯吡唑降低。图26B-26C显示出CYP3A4活性通过萤光素活性测定(图26B)和咪达唑仑羟基化(图26C)被显示出，二者都被酮康唑抑制。图26D显示出通过利福平治疗的CYP3A4诱导通过增加的咪达唑仑代谢来检测。图26E显示出利福平治疗增加了PXR调控的CYP、ABCB1(P-gp)和UGT1A1的基因表达，但没有增加对照基因CK19和ECAD的表达。显著性的水平：通过双向ANOVA，****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01。
图27A-27D显示出在3D生物打印的肠组织中的吲哚美辛毒性。图27A显示出与媒介物或不同剂量的吲哚美辛(Indo)24小时孵育后组织的TEER测量，显示出随着吲哚美辛增加，TEER剂量响应减少。图27B显示出随着吲哚美辛剂量增加LDH活性增加，表明增加的细胞毒性。图27C显示出对于所有测试的吲哚美辛剂量，前列腺素E2(prostaglandin E2)合成减少至类似的水平，确认了药物活性。图27D显示出吲哚美辛治疗的组织的组织学，其显示出在较高剂量的吲哚美辛下上皮的破坏和扭曲的核染色，伴随着屏障功能的标志物E-钙黏蛋白的降低。显著性的水平：通过单向ANOVA，****P<0.0001。
图28A-28C显示出在3D生物打印的肠组织中的TNFα诱导的毒性。图28A显示出，用TNFα处理24小时的3D生物打印的组织与对照相比显示出增加的上皮解体。图28B显示出与TNFα治疗后细胞形态学的改变相关的增加的LDH活性。图28C显示出与炎症相关的基因的子集，COX2、IL8和TNFα响应于TNFα治疗被上调。显著性的水平：通过双向ANOVA，在B中，***P<0.001，通过t检验；在C中，**P<0.01，****P<0.0001。
图29显示出Caco-2组织学。对第21天Caco-2细胞单层进行一般的和特化的细胞亚型上皮标志物染色。Caco-2跨单层表达CK19、E-钙黏蛋白和绒毛蛋白。未观察到针对嗜铬粒蛋白、溶菌酶或黏蛋白-2的染色。
图30显示出米托蒽醌的BCRP流出。观察到米托蒽醌(BCRP底物)A至B的低渗透率，在B至A方向具有高得多的渗透率，流出比＝190。在BCRP抑制剂Ko143存在时，米托蒽醌渗透率B至A减少并且流出比降低至145。注意：A至B的样品接近或低于检测极限(limit ofdection)。(n＝4)显著性的水平：通过双向ANOVA，***P<0.001。
图31显示出MRP2和MRP3转运蛋白表达。比较天然肠、3D生物打印的肠组织和Caco-2单层的MRP2(ABCC2)和MRP3(ABCC3)的表达。在正常肠组织和3D生物打印的肠组织之间观察到类似水平的MRP染色，在Caco-2单层中观察到更高水平。
图32显示出3D生物打印的肠组织的咪达唑仑代谢的个体间可变性。
发明详述
某些定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确地指示，否则如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。除非另有说明，否则本文对“或(or)”的任何引用意图于涵盖“和/或(and/or)”。
如本文使用的，“约”意指叙述的值的±10％。例如，约10包括9-11。
如本文使用的，“阵列”意指科学工具，包括空间上布置的多个元件的缔合，以允许对样品进行多于一个测试、对多于一个样品进行一个或更多个测试、或二者。在一些实施方案中，多于一个肠组织模型被配置成形成阵列。在一些实施方案中，阵列适于筛选方法和设备或与筛选方法和设备是相容的，所述筛选方法和设备包括与中等或高通量筛选相关的那些筛选方法和设备。在另外的实施方案中，阵列允许同时地进行多于一个测试。在另外的实施方案中，阵列允许多于一个样品同时地被测试。在一些实施方案中，阵列是细胞微阵列。在另外的实施方案中，细胞微阵列是允许多重询问(multiplex interrogation)在固体支持物的表面上的活细胞的实验室工具。在其它实施方案中，阵列是组织微阵列。在另外的实施方案中，组织微阵列包括以阵列组装的多于一个单独的组织或组织样品，以允许进行多种生物化学、代谢、分子或组织学分析。在一些实施方案中，阵列存在于微量滴定板的孔中。微量滴定位置是从Sigma Aldrich和其它供应商处商购可得的，并且以6个、12个、24个、48个、96个、384个和1546个以矩形矩阵布置的样品孔格式可用，尽管更高数目的孔也是可能的。
如本文使用的，“测定”意指用于测试或测量在有机样品或生物样品(例如，细胞聚集物、组织、器官、生物体等)中的物质(例如，化学品(chemical)、分子、生物化学品(biochemical)、蛋白、肽、激素或药物等)的存在或活性的程序。
如本文使用的，“基底层”意指在肠间质组织层和上皮细胞层之间包含胶原蛋白的层。其它层也可以存在于肠组织模型中。
如本文使用的，“生物相容性膜”意指对组织是无毒性的膜。
如本文使用的，“生物墨”意指用于在生物打印中使用的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨包含细胞溶液、细胞聚集物、包含细胞的凝胶、多细胞体或组织。在一些实施方案中，生物墨另外地包含提供使生物打印实现的特定生物力学特性的非细胞材料。在一些实施方案中，生物墨包含挤出化合物(extrusion compound)。在一些情况下，挤出化合物被工程化以在生物打印过程后被去除。在其它实施方案中，打印后，挤出化合物的至少一些部分保持夹带有细胞(entrained with the cells)，并且不被去除。
如本文使用的，“生物打印”意指通过与自动化的或半自动化的计算机辅助的三维原型设计设备(例如，生物打印机)相容的方法使用三维、精确的使细胞(例如，细胞溶液、包含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集物、多细胞体等)沉积。合适的生物打印机包括来自Organovo,Inc.(San Diego,CA)的Novogen和在美国专利第9,149,952号和美国公布申请第2015/0093932号、第2015/0004273号、和第2015/0037445号中描述的那些生物打印机。
生物打印可以通过喷墨打印(见，美国专利7,051,654)和/或通过挤出打印(见，美国专利第9,149,952号、第8,931,880号、第9,227,339号、第8,143,055号、第8,728,807号和第9,315,043号和美国公布申请第2013/0190210号、第2013/0164339号、第2015/0282885号、第2016/0040132号、第2016/0097039号和第2016/0122723号)进行。在另一个实施方案中，生物打印可以通过微阀打印，例如，用包含微阀的微流体设备进行。见，例如，Beebe,D.J.,Moore,J.S.,Bauer,J.M.,Yu,Q.,Liu,R.H.,Devadoss,C.,Jo,B.,2000,"Functionalhydrogel structures for autonomous flow control inside microfluidicchannels",Nature 404,588-590；和美国专利第6,663,821号。
如本文使用的，“层”意指在X和Y平面中的为一个或多个细胞厚的细胞缔合。在一些实施方案中，本文描述的肠组织模型包含至少两层。在其它实施方案中，本文描述的肠组织模型包含两层的倍数。在多个实施方案中，层形成连续的、基本上连续的或非连续的细胞片(sheet)。在一些实施方案中，本文描述的肠组织模型的每一层在X、Y和Z轴上包含多个细胞。
如本文使用的，“极化的”意指空间上不对称的。
如本文使用的，“支架”指的是合成支架诸如聚合物支架和多孔水凝胶、非合成支架诸如预成型的胞外基质层、死细胞层和脱细胞的(decellularized)组织、和任何其它类型的与工程化组织的物理结构成一体的并且不能够在不损伤/破坏所述组织时从组织中去除的预成型的支架。在另外的实施方案中，脱细胞的组织支架包括以任何方式通过培养的细胞产生的脱细胞的天然组织或脱细胞的细胞材料；例如，被允许死亡或被脱细胞的细胞层，留下它们当活着时产生的胞外基质(ECM)。因此，术语“无支架的(scaffoldless)”意图于暗示预成型的支架在使用的时间不是工程化组织的成一体的部分，或者已经被去除或者作为工程化组织的惰性组分保留。“无支架(scaffoldless)”与“无支架(scaffold-free)”和“不含预成型的支架(free of preformed scaffold)”可互换地被使用。
如本文使用的，“受试者”是任何哺乳动物物种的生物体，包括但不限于人类、灵长类动物、猿、猴、犬、猫、小鼠、大鼠、兔、猪、马和其它。受试者可以是任何活的或死亡的哺乳动物物种。受试者包括近期地死亡的受试者或从活的受试者中获取的活组织检查样品。
“非人类动物”可以是除人类以外的任何物种。在一个实施方案中，非人类动物是哺乳动物。在另一个实施方案中，非人类动物是脊椎动物。在另一个实施方案中，非人类动物选自由鼠(murine)、绵羊类(ovine)、犬科动物(canine)、牛科动物(bovine)、猪类(porcine)和非人类灵长类动物组成的组。
如本文使用的，“治疗性物质”意指被批准以治疗疾病、根据研究治疗疾病、或引发生物响应诸如在DNA、RNA、肽、多肽或蛋白中的改变的任何分子、生物品(biologic)、化合物或组合物。
如本文使用的，“组织”意指细胞的聚集物。
如本文使用的，“存活的”意指至少50％的细胞是活的。在其它实施方案中，存活的细胞是如通过至少一种存活力测试确定的在生物墨或组织层中的至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或更多的细胞。用于存活力的测试在本领域中是已知的，并且包括根据制造商的方案进行的alamarBlueTM测定(Thermo Fisher,Carlsbad,CA)。
肠组织模型的组成
在一些实施方案中，在组织模型中的细胞被空间上组织以重现肠组织的层状结构；极化的上皮存在于包含肠肌成纤维细胞的间质组织层上面。在一些实施方案中，肠组织模型在上皮细胞上还包含刷状缘。
在特定的、非限制性实施方案中，本文描述的工程化肠组织包含两个主要部分：1)包含肌成纤维细胞的间质层；和2)包含上皮细胞的极化的上皮层。层可以通过任何已知的生物打印的方法，包括通过喷墨、挤出、微阀打印(MSV)、基于激光的生物打印和细胞的手动放置被沉积。在一个实施方案中，使用Novogen MMX生物打印机以使得上皮层在肌成纤维细胞层顶端的方式使细胞沉积。在另一个实施方案中，通过与随时间降解的热响应性水凝胶(2.0)混合的细胞的空间上受控的沉积和/或用通过压缩气体推进(喷墨喷雾)的雾化的细胞材料的沉积创建结构。在该实施方案中，两层一起模拟肠组织的壁。该配置对于模拟体内组织和预测天然组织响应是关键的。上皮层的响应可预测天然组织对药物、化学品、营养物或生物剂(biological agent)的响应，并且可以提供与毒性、效力、吸收、炎症或自身平衡相关的信息。
在特定实施方案中，使用连续沉积技术生物打印肌成纤维细胞层。在该实施方案中，使用喷墨、微阀或挤出沉积技术将上皮层生物打印到肌成纤维细胞层上。基本上连续上皮层是与体内组织一致的，并且对于复制生理学上相关的结构是关键的。喷墨和微阀沉积技术提供了使一层或更多层薄的上皮细胞层沉积到肌成纤维细胞层的潜在地不规则表面的能力。在此类实施方案中，上皮层的喷墨或微阀沉积任选地在生物打印肌成纤维细胞层后或在肌成纤维细胞层已经被允许成熟后立即进行。
在一些实施方案中，细胞是生物打印的。在另外的实施方案中，生物打印的细胞被粘附以形成工程化肠组织模型。还在另外的实施方案中，工程化肠组织模型在制备的时间或使用的时间不含或基本上不含预成型的支架。在一些情况下，生物打印允许制备模拟天然组织的适当细胞结构(cellularity)的组织。
在一些实施方案中，本文描述的三维工程化肠组织模型与通过现有技术制备的组织区别在于它们是三维的、不含预成型的支架、主要地由细胞组成、和/或具有高细胞密度(例如，大于30％的细胞、大于40％的细胞、大于50％的细胞、大于60％的细胞、大于70％的细胞、大于80％的细胞、大于90％的细胞、或大于95％的细胞)。
在一些实施方案中，本文描述的三维工程化肠组织模型与天然(例如，非工程化)组织区别在于它们是非神经支配的(例如，基本上不含神经组织)、基本上不含成熟血管系统、和/或基本上不含血液组分。例如，在多个实施方案中，三维工程化肠组织模型不含血浆、红细胞、血小板等和/或内源性地产生的血浆、红细胞、血小板等。
在一些实施方案中，模型在形状上不像天然地存在的肠组织那样是管状的，而是平面的或片状的，这有利地允许用于体外测定和分析。在一些实施方案中，上皮细胞不是人类来源的。在某些实施方案中，工程化肠组织模型缺乏未分化的细胞。在某些实施方案中，工程化肠组织模型缺乏未分化的肠细胞。在一些实施方案中，本文描述的三维工程化肠组织模型与天然肠组织区别在于三维工程化肠组织模型基本上是平面的。在某些实施方案中，本文描述的三维工程化肠组织模型具有优于天然肠组织的功能的改善；一个实例是在培养物中持续高达14天或在培养物中更长时间的持续量的时间后的高存活力。在一些实施方案中，在肠组织模型中使用的细胞是转化的或永生化的。在一些实施方案中，在肠组织模型中使用的细胞是转基因的，并且包含具有荧光蛋白的蛋白融合物，所述荧光蛋白如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、或青色荧光蛋白(CFP)。在一些实施方案中，在肠组织模型中使用的细胞是转基因的，并且包含具有荧光蛋白如EGFP、GFP、RFP、YFP、CFP；或发光蛋白如萤火虫萤光素酶或海肾萤光素酶的报道物构建体。在某些实施方案中，任何细胞包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个基因或更多个基因的缺失或插入。在一些实施方案中，3D肠组织模型是嵌合体(chimeras)，其中至少一种细胞来自与3D肠组织模型的任何其它细胞不同的哺乳动物物种。在一些实施方案中，3D肠组织模型是嵌合体，其中至少一种细胞来自与3D肠组织模型的任何其它细胞不同的人类供体。在另一个实施方案中，肠组织模型包含来源于肿瘤和/或来源于诱导多能细胞(iPSC)和/或胚胎干细胞的细胞。可以在肠组织模型中的肿瘤细胞的实例包括结肠直肠肿瘤细胞。
在本发明的肠组织模型和目前的体外模型之间存在关键差异。Caco-2细胞系是用于模拟被动转运和预测肠吸收的最确定的细胞模型，并且被认为是体外模拟肠屏障的金标准。Caco-2模型的限制包括缺乏P-450代谢酶活性(包括关键肠代谢酶CYP3A4)、缺乏黏液产生从而阻止精确的模拟黏膜屏障、传代数目的差异和在细胞系的克隆之间的不一致性(表1)。其它2D模型可以包含原代肠上皮细胞，所述原代肠上皮细胞连同细胞系部分由于其与其它特化的上皮细胞类型或与在肠壁中存在的其它支持性细胞类型的分离可能具有有限的肠上皮功能。此外，在分离的上皮单一培养物中的测试阻止观察对在天然组织中存在的间质细胞和免疫细胞的作用的能力。
表1.证明3D组织模型与传统的2D Caco-2单层模型相比的优越性的关键差异。
特征 2D Caco-2单层 3D组织模型
组织样细胞密度 是 是
上皮紧密连接形成 是 是
屏障功能 是的(虚假地高的) 是(生理学水平)
上皮极化 是 是
转运蛋白表达 是(有限的) 是(高)
黏液产生 否 是
杯状细胞的存在 否 是
肠内分泌细胞的存在 否 是
黏膜间质细胞的存在 否 是
免疫细胞的存在 否 是
GLP-1分泌 否 是
代谢酶(CYP3A4)表达 否 是
代谢酶(CYP3A4)活性 否 是
包括来源于整个组织或活组织检查的肠区段和肠类器官的更复杂的3D结构，当来源于人类组织时具有有限的可利用度，具有有限的体外存活的寿命，并且可能缺乏体内器官生理学。特别地，这些组织的结构不是层状的，并且在肠类器官中的上皮的向内取向使顶端表面对于直接刺激或对于评价吸收相对地难以接近。3D生物打印的肠组织通过将多种细胞类型(包括肠上皮细胞层)掺入到肠间质组织层上面提供了优于现有体外测定系统的优点，所述肠上皮细胞层包含肌成纤维细胞和任选地免疫细胞、平滑肌细胞、内皮细胞或神经元。此外，模型在培养物中在延长的时间中显示出组织样3D结构和功能性，从而使更多具有临床上相关的终点的慢性研究实现。通过包含人类原代细胞，肠组织模型可以用作动物研究的重要附助物(adjunct)，或者在一些情况下代替动物研究，在动物研究中物种在功能中的差异阻碍了解释。
在组织构建体和天然组织之间存在关键差异。生物打印的组织构建体与包含中枢神经支配的神经组织和血管组织的天然肠不同。生物打印的组织构建体与其它可以使用支架的3D工程化方法不同，因为使用支架阻止了组织样密度和3D尺寸的实现，并且这些系统具有有限的空间组织。生物打印的组织构建体与被离体培养的组织外植体/切片/肠区段不同之处在于掺入血液、成熟可灌注的血管组分、和附属物。组织外植体具有包含黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜以及附属物的所有常驻细胞类型(resident cell type)的优点；然而，对于实验操纵宿主遗传学以及此类组织样品的有限可利用度存在有限的选择。此外，离体组织切片在培养物中仅存活<14天，并且生物打印的组织构建体可以被维持大于14天。
表2. 2D、3D生物打印的组织和体内组织的比较
细胞输入
在一些实施方案中，本文描述的工程化组织、阵列和方法包括多于一种细胞类型。在一些实施方案中，肠组织模型包含哺乳动物间质组织层(包含肌成纤维细胞)和哺乳动物上皮细胞层。在多个实施方案中，合适的上皮细胞来源于人类肠(见，例如，PLoS ONE 6.11:e26890(2011),PMC.Web 28Sept.2016、或Sato等人,Nature 459:262-5(2009))、或来自诱导多能干细胞(iPSC)或人类胚胎干细胞的定向分化。
在一些实施方案中，肌成纤维细胞是肠组织肌成纤维细胞。在多个实施方案中，肠组织肌成纤维细胞来源于从人类肠分离的原代细胞。在一些实施方案中，肌成纤维细胞起源于皮肤或血管。在一些实施方案中，一种或更多种细胞组分来源于非人类哺乳动物。在其它实施方案中，一种或更多种细胞组分来源于人类。在其它实施方案中，肌成纤维细胞来源于正常组织、患病组织或肿瘤组织(例如结肠直肠肿瘤组织)。
肠上皮细胞可以从包括十二指肠、空肠、回肠和结肠的肠的多个区域分离，以更精确地模拟特定肠区域的功能。另外的细胞类型可以被掺入到肠构建体中，以提供另外的有功能的特征。细胞类型可以包括替代的人类肠细胞系(例如HT-29、HT29-18N2、和/或HuTu80细胞系)。此类细胞系可以被考虑用于包括96孔平台的高通量应用。在一个实施方案中，这些细胞系作为上皮层代替原代肠上皮细胞或与原代肠上皮细胞组合被添加。
在一个实施方案中，通过添加原代髓样细胞(例如单核细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞)和/或淋巴样细胞/白细胞(例如PBMC、中性粒细胞、T细胞和/或B细胞等)，免疫组分被掺入到肠组织模型中。此类肠组织模型可以被用于模拟疾病表型(IBD、结肠炎、克罗恩病)和炎症以及免疫肿瘤学模型。通过与肌成纤维细胞生物墨直接地混合、通过作为单层添加至打印表面随后是在上面打印间质组织、通过作为与间质层相邻的或被嵌入间质层中的打印的层或区室添加、和/或作为上皮中的混合物添加，免疫细胞可以被掺入到肌成纤维细胞间质层中。在一个实施方案中，淋巴样细胞作为正好在上皮层下方的区室化聚集物(compartmentalized aggregate)被生物打印，以模拟派尔斑块(Peyer’s patch)的天然肠生理学。在另一个实施方案中，特化的肠上皮细胞(例如肠内分泌细胞、杯状细胞、M细胞和/或潘氏细胞)被掺入到上皮中以模拟特定肠功能。在另一个实施方案中，肠内分泌细胞被添加或从干细胞产生，以模拟内分泌功能(例如GLP-1、PYY、CCK和/或SST肽分泌)。在另一个实施方案中，杯状细胞被添加以模拟黏膜屏障功能，用于吸收、分布、代谢和排出(ADME)和/或毒理学测试和/或微生物组相互作用(microbiome interaction)的研究。在另一个实施方案中，M细胞和潘氏细胞被添加以调节免疫功能。在另一个实施方案中，人类原代内皮细胞(例如HUVEC)被添加以模拟肠微血管系统，并且被掺入到间质层中或作为另外的黏膜下层。在另一个实施方案中，肠组织模型包含在间质组织层和上皮细胞层的一个或二者中或者作为一个或更多个单独的层的另外的细胞诸如淋巴内皮细胞(lymphatic endothelialcell)和/或平滑肌细胞。在另一个实施方案中，神经元细胞被掺入到黏膜下层中以模拟肠神经系统。特化的细胞可以来源于在原代分离物中的干细胞群的定向分化或来源于iPS细胞。此外，原代细胞或iPS细胞可以来源于患病供体以模拟肠疾病(例如，解决IBD、结肠炎和克罗恩病的遗传基础)。
在另一个实施方案中，肠组织模型可以包含跨x-y轴的多个区室，例如，其中一个区室包含正常组织，并且相邻的区室包含具有患病细胞的组织，所述患病细胞例如从具有肠疾病或障碍的个体获得的细胞。此类多区室肠组织构建体允许在可以在单个组织孔中的同一构建体中测试针对正常和患病组织的候选治疗性治疗(therapeutic treatment)。
在另一个实施方案中，肠组织模型是层状的，但是包含模拟绒毛和/或隐窝(crypt)的二级结构。在其它实施方案中，肠组织模型包含腔样结构或管，所述腔样结构或管不包含组织但可以包含细胞培养基。
在另一个实施方案中，肠组织模型可以在肠组织模型的一个或更多个层或区室中包含肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞。此类组织构建体允许对肿瘤或细胞测试候选治疗性治疗(therapeutic treatment)以及对肿瘤细胞侵袭和转移的研究。肿瘤和肿瘤细胞的实例包括肠腺癌细胞、肠肉瘤细胞、胃肠基质细胞、类癌癌细胞(carcinoid cancercell)、和肠淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤和肿瘤细胞包括但不限于Caco-2、HT-29、HT29-18N2、HuTu80和STC-1细胞。
在另一个实施方案中，包含肿瘤细胞的肠组织模型可以被用作可以作为癌症的体内模型被植入非人类动物中的患病组织模型。在一个实施方案中，肿瘤细胞是结肠直肠细胞。在另一个实施方案中，非人类动物选自由可以是任何物种包括但不限于鼠、绵羊类、犬科动物、牛科动物、猪类和非人类灵长类动物组成的组。在特定实施方案中，非人类动物是啮齿动物。在另一个特定实施方案中，非人类动物是免疫缺陷啮齿动物。在更具体的实施方案中，动物是NOD SCIDγ小鼠。肠组织模型可以被植入非人类动物的任何部位中。在一个实施方案中，肠组织模型被植入非人类动物的腹膜中。
与特定细胞类型相关表达的标志物可以包括但不限于：髓样细胞标志物(CD14、CD68、CD206)、淋巴样细胞标志物(CD4、CD8、CD19、CD15)、肠内分泌标志物(CHGA、GLP-1、PYY、CCK)、杯状细胞标志物(MUC2)、血管标志物(CD31)和在原代分离物中的干细胞标志物(LGR5)。
在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层基本上是单层。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层包含高于其表面面积的95％的单层。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层包含高于其表面面积的90％的单层。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层包含高于其表面面积的80％的单层。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于1个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于2个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于3个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于4个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于5个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于10个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于20个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于50个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于100个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层是2-100个细胞厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于20μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于30μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于40μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于50μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于100μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于200μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于500μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于600μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层大于1000μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层是20μm-1000μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于20μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于30μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于40μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于50μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于100μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于200μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于500μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于600μm厚。在一些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织层少于1000μm厚。
在一些实施方案中，肠组织模型包含上皮组织层，所述上皮组织层包含哺乳动物上皮细胞。在另外的实施方案中，上皮细胞是肠组织上皮细胞(例如，人类肠上皮细胞)。还在另外的实施方案中，合适的肠组织上皮细胞是原代分离物或来源于干细胞的定向分化的细胞(例如，iPSC来源的和/或人类胚胎干细胞(hES)来源的)。在一些实施方案中，肠组织上皮细胞是永生化人类细胞。产生永生化肠上皮细胞的方法在以下中被描述：例如，Paul EC,Hochman J,Quaroni A(1993).Conditionally immortalized intestinal epithelialcells:novel approach for study of differentiated enterocytes.Am J Physiol.265(1Pt 1):C266-78和Whitehead RH,VanEeden PE,Noble MD,Ataliotis P,Jat PS(1993).Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from bothcolon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.Proc Natl AcadSci USA.90(2):587-91。在其它实施方案中，肠组织上皮细胞是永生化细胞诸如Ca Ski或HT-29细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞来源于非人类哺乳动物诸如，例如，大鼠、小鼠、猪或灵长类动物。在其它实施方案中，上皮细胞来源于人类。
在一些实施方案中，上皮组织层主要地由肠组织上皮细胞组成。在一些实施方案中，上皮组织层主要地由原代肠组织上皮细胞组成。在一些实施方案中，上皮组织层主要地由肠组织上皮细胞组成。在一些实施方案中，上皮组织层主要地由原代肠组织上皮细胞组成。在一些实施方案中，肠组织层基本上是单层。在一些实施方案中，肠组织上皮细胞是存在于肠上皮组织层中的唯一细胞。在一些实施方案中，上皮组织层包含肿瘤细胞。在一些实施方案中，上皮组织层包含肠癌细胞、肠肉瘤细胞、肠淋巴瘤细胞和/或肠腺癌细胞。在一些实施方案中，上皮组织层包含高于其表面面积的95％的单层。在一些实施方案中，上皮组织层包含高于其表面面积的90％的单层。在一些实施方案中，上皮组织层包含高于其表面面积的80％的单层。在一些实施方案中，上皮组织层大于1个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于2个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于3个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于4个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于5个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于10个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于20个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于50个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于100个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层是2-100个细胞厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于20μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于30μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于40μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于50μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于100μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于200μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于500μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于600μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层大于1000μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层是20-1000μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于1000μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于600μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于500μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于200μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于100μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于50μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于40μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于30μm厚。在一些实施方案中，上皮组织层少于20μm厚。
任选地，肠组织模型包含其它细胞类型(例如，产生GPL-1的细胞、免疫细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经元细胞等)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是树突状细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是巨噬细胞。
广泛范围的细胞比率是合适的。在一些实施方案中，上皮层包含肠组织上皮细胞、由肠组织上皮细胞组成、或主要地由肠组织上皮细胞组成。在一些实施方案中，肌成纤维细胞是存在于肌成纤维细胞间质组织层中的唯一细胞。在一些实施方案中，肌成纤维细胞和上皮细胞以特定比率存在于肠模型中。合适比例的肌成纤维细胞包括，通过非限制性实例的方式，约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％和约95％肌成纤维细胞，包括其中的增量。合适比例的上皮细胞包括，通过非限制性实例的方式，约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％和约95％上皮细胞，包括其中的增量。在某些实施方案中，肌成纤维细胞与上皮细胞的比率是至少5:95、至少10:90、至少15:85、至少20:80、至少25:75、至少30:70、至少35:65、至少40:60、至少45:65、至少50:50、至少55:45、至少60:40、至少65:35、至少70:30、至少75:25、至少80:20、至少85:15、至少90:10或至少95:5，包括其中的增量。在某些实施方案中，肌成纤维细胞与上皮细胞的比率是5:95至95:5。在某些实施方案中，肌成纤维细胞与上皮细胞的比率不多于5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:65、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10或95:5，包括其中的增量。在某些实施方案中，肌成纤维细胞与上皮细胞的比率是约50:50。在某些实施方案中，肌成纤维细胞与上皮细胞的比率是从约60:40至约40:60。
广泛范围的细胞浓度适于生物墨。合适地，生物墨被制备用于连续沉积生物打印技术，其中细胞的浓度包括，通过非限制性实例的方式，约1百万个、约2百万个、约3百万个、约4百万个、约5百万个、约6百万个、约7百万个、约8百万个、约9百万个、约1千万个、约2千万个、约3千万个、约4千万个、约5千万个、约6千万个、约7千万个、约8千万个、约9千万个、约1亿个、约1.1亿个、约1.2亿个、约1.3亿个、约1.4亿个、约1.5亿个、约1.6亿个、约1.7亿个、约1.8亿个、约1.9亿个、约2亿个、约2.25亿个、约2.5亿个、约2.75亿个、约3亿个、或更多百万个细胞/毫升生物墨。在一个特定实施方案中，用于连续沉积生物打印制备的生物墨包含约1亿个-2亿个细胞/mL。合适地，生物墨被制备用于喷墨沉积生物打印技术，其中细胞的浓度包括，通过非限制性实例的方式，约25万个、约50万个、约1百万个、约2百万个、约3百万个、约5百万个、约1千万个、约1500万个或更多百万个细胞/毫升生物墨。在特定实施方案中，用于喷墨沉积生物打印制备的生物墨包含约1百万个-5百万个细胞/mL。在特定实施方案中，用于喷墨沉积生物打印制备的生物墨包含约1百万个-4百万个细胞/mL。在特定实施方案中，用于喷墨沉积生物打印制备的生物墨包含约1百万个-3百万个细胞/mL。在特定实施方案中，用于喷墨沉积生物打印制备的生物墨包含约1百万个-2百万个细胞/mL。
在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和10亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千百万个和9亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和8亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和7亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和6亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和5亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和4亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和3亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在5千万个和2亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在7500万个和6亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在1亿个和6亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在1亿个和5亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在1亿个和4亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在1亿个和3亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在1亿个和2亿个之间的细胞/毫升。在某些实施方案中，肠组织生物墨包含在1亿个和1.5亿个之间的细胞/毫升。
在某些实施方案中，生物墨是黏性液体。在某些实施方案中，生物墨是半固体。在某些实施方案中，生物墨是固体。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于100厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于200厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于500厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于,1000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于2,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于5,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于10,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于20,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于50,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度大于100,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于100厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于200厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于500厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于1,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于2,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于5,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于10,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于20,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于50,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度小于100,000厘泊。在某些实施方案中，生物墨的黏度是100-100,000厘泊。
肠组织模型的结构特征
本公开内容的肠模型可以在结构上以许多配置被布置。在某些实施方案中，上皮组织和包含肌成纤维细胞的间质组织是单独的结构上不同的层，所述单独的结构上不同的层呈直接接触或间隔1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm或更多，包括其中的增量。在某些实施方案中，分离是由于胶原蛋白在两层之间的分泌和沉积形成基底层，出于本公开内容的目的，这被认为是接触。在正常生理学组织中，细胞和细胞层被极化成具有顶端(面向腔)表面和面向其它细胞或组织基质的基底外侧表面(basolateralsurface)。出于本文公开的肠组织模型的目的，基底外侧表面指的是面向另一种细胞、胞外基质或生物相容性膜或培养容器的表面。出于本文公开的肠组织模型的目的，顶端表面指的是背离生物相容性膜的表面或培养容器的表面。在一些实施方案中，肠组织上皮细胞是极化的。在一些实施方案中，肠组织层具有顶端表面和基底外侧表面。
在一个实施方案中，一种或更多种生物墨可以包含一定比例的肠肌成纤维细胞、肠上皮细胞、Caco-2上皮细胞和STC-1肠内分泌细胞的细胞混合物，并且可以包含生物材料支持物。在另一个实施方案中，包含在中的原代肠肌成纤维细胞的生物墨被打印以产生模拟黏膜间质层的组织。在另一个实施方案中，包含在胶原蛋白中的原代肠肌成纤维细胞的生物墨被打印以产生模拟黏膜间质层的组织。在另一个实施方案中，包含原代肠上皮细胞、Caco-2细胞、STC-1细胞或这些细胞类型的混合物的细胞悬浮液被添加以产生模拟上皮的组织。在一个实施方案中，细胞悬浮液被手动地添加到打印的黏膜间质组织上面以创建层状结构。在另一个实施方案中，手动添加细胞悬浮液是自动化的，并且作为喷雾(例如，通过喷墨沉积(见美国专利7,051,654)或通过微电磁(MSV))生物打印或挤出到打印的组织上。上皮层可以作为单细胞悬浮液或作为细胞聚集物被沉积。上皮层可以被沉积在生长培养基中或在包含基质材料的生物墨中。在一个实施方案中，细胞与包含胶原蛋白4、层黏连蛋白和硫酸肝素蛋白多糖(heparin sulfate proteoglycans)的基底膜组分混合，以改善上皮层和间质层之间的接触。在另一个实施方案中，在使基底膜组分层沉积后，上皮层可以被沉积在生长培养基中或在包含基质材料的生物墨中。
在一些实施方案中，肠组织模型还包含生物相容性膜。在某些实施方案中，包含肌成纤维细胞的间质组织的基底外侧表面是附着至生物相容性膜或培养容器的表面；并且包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面是不附着至生物相容性膜或培养容器的表面。在某些实施方案中，上皮组织层被沉积到包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面上并且在包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面上形成层，从而形成两个结构上不同的层。在某些实施方案中，上皮组织和包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，在99％-100％之间的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，在95％-100％之间的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，在90％-100％之间的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，50％-99％的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，在80％-100％之间的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，在70％-100％之间的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，在60％-100％之间的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，在50％-100％之间的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，小于99％的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，小于98％的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，小于97％的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，小于95％的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，小于90％的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，小于80％的上皮组织层与包含肌成纤维细胞的间质组织连续接触。在某些实施方案中，上皮组织层完全覆盖包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在99％-100％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在95％-100％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在90％-100％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在80％-100％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在70％-100％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在60％-100％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在50％-100％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖小于99％的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖小于98％的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖小于97％的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖小于95％的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖小于90％的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖小于80％的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖小于70％的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。在某些实施方案中，上皮组织层覆盖在50％-99％之间的包含肌成纤维细胞的间质组织的顶端表面。
如本文描述的产生的肠组织构建体包括以下特征的一个或更多个：
·它包含双层结构，所述双层结构包含肠上皮细胞层、包含肌成纤维细胞的肠黏膜间质支持层，所述肠上皮细胞层在包含肌成纤维细胞的肠黏膜间质支持层上面，一层或两层任选地还包含一种或更多种其它细胞，包括免疫细胞。
·它包含肠上皮细胞标志物CK8、CK18和CK19的一种或更多种。用于检测CK8、CK18和CK19标志物的方法被以下公开：Notohara K,Hamazaki S,Tsukayama C,Nakamoto S,Kawabata K,Mizobuchi K,Sakamoto K,Okada S(2000).Solid-pseudopapillary tumorof the pancreas:immunohistochemical localization of neuroendocrine markersand CD10.Am J Surg Pathol.24(10):1361-71。
·它包含肠肌成纤维细胞标志物波形蛋白和α-sma的一种或更多种。用于检测波形蛋白和α-sma标志物的方法被以下公开：Essawy M,Soylemezoglu O,Muchaenta-KubaraEC,Shortland J,Brown CB,el Nahas AM(1997).Myofibroblasts and the progressionof diabetic nephropathy.Nephrol Dial Transplant.12(1):43-50。
·它表现出肠上皮细胞的极化，形成胞内紧密连接。紧密连接通过检测E-钙黏蛋白和/或ZO-1来鉴定。用于检测钙黏蛋白和/或ZO-1的方法被以下公开：RadhakrishnaK.RAO,Shyamali BASUROY,Vijay U.RAO,Karl J.KARNAKY,Jr and Akshay GUPTA(2002).Tyrosine phosphorylation and dissociation of occludin-ZO-1 and E-cadherin-β-catenin complexes from the cytoskeleton by oxidative stress.Biochem.J.368:471-481。
·它表现出在上皮细胞上的基底外侧标志物。用于检测基底外侧标志物的方法被以下公开：Parton RG,Prydz K,Bomsel M,Simons K,Griffiths G.(1989).Meeting ofthe apical and basolateral endocytic pathways of the Madin-Darby caninekidney cell in late endosomes.J Cell Biol.109(6Pt2):3259-72。
·它表现出刷状缘形成(绒毛蛋白)。用于检测刷状缘形成的方法被以下公开：Chantret I,Barbat A,Dussaulx E,Brattain MG,Zweibaum A.(1988).Epithelialpolarity,villin expression,and enterocytic differentiation of cultured humancolon carcinoma cells:a survey of twenty cell lines.Cancer Res.198848(7):1936-42。
·它表现出黏膜屏障形成。用于检测黏膜屏障形成的方法被以下公开：DorofeyevAE1,Vasilenko IV,Rassokhina OA,Kondratiuk RB(2013).Mucosal barrier inulcerative colitis and Crohn's disease.Gastroenterol Res Pract.Epub2013May 7。
·它表达转运蛋白/酶P-gp/MDR1、CYP3A4、BCRP、MRP2、MRP3、PEPT1、OATPB1、ASBT、MDT1、OCTN2、OSTα、OSTβ、CES2、CYP2C19、CYP2C8、CYP2C9、CYP2J2、CYP2S1、CYP4F12、GSTP1、UGT1A1的一种或更多种。用于检测P-gp/MDR1、CYP3A4、BCRP、MRP2、MRP3、PEPT1和OATPB1的方法被以下公开：Taipalensuu J,H,Lindberg G,Einarsson C,F,Melhus H,Garberg P,B,Lundgren B,Artursson P(2001).Correlation ofgene expression of ten drug efflux proteins of the ATP-binding cassettetransporter family in normal human jejunum and in human intestinal epithelialCaco-2 cell monolayers.J Pharmacol Exp Ther.299(1):164-70；Sticova E,Lodererova A,van de Steeg E,Frankova S,Kollar M,Lanska V,Kotalova R,Dedic T,Schinkel AH,Jirsa M(2015).Down-regulation of OATP1B proteins correlates withhyperbilirubinemia in advanced cholestasis.Int J Clin Exp Pathol.8(5):5252-5262；和Kudo M,Katayoshi T,Kobayashi-Nakamura K,Akagawa M,Tsuji-Naito K(2016).H+/peptide transporter(PEPT2)is expressed in human epidermal keratinocytesand is involved in skin oligopeptide transport.Biochem Biophys Res Commun.475(4):335-341。
·它表现出在上皮细胞层和间质层之间的基底层，如通过胶原蛋白IV染色证明的。染色胶原蛋白IV的方法被以下公开：Sanes JR,Engvall E,Butkowski R,Hunter DD(1990).Molecular heterogeneity of basal laminae:isoforms of laminin andcollagen IV at the neuromuscular junction and elsewhere.J Cell Biol.111(4):1685-99。
·它表现出具有渗透率/吸收特征的屏障。渗透率/吸收特征可以通过确定跨内皮电阻(TEER)值或萤光渗透率来鉴定。用于确定TEER值或萤光渗透率的方法被以下公开：Akbari P,Braber S,Alizadeh A,Verheijden KA,Schoterman MH,Kraneveld AD,GarssenJ,Fink-Gremmels J(2015).Galacto-oligosaccharides Protect the IntestinalBarrier by Maintaining the Tight Junction Network and Modulating theInflammatory Responses after a Challenge with the Mycotoxin Deoxynivalenol inHuman Caco-2 Cell Monolayers and B6C3F1Mice.J Nutr.145(7):1604-1613和Venugopal R,Galam L,Cox R,Fukumoto J,Cho Y,Parthasarathy PT,Lockey RF,Kolliputi N(2015).Inflammasome Inhibition Suppresses Alveolar CellPermeability Through Retention of Neuregulin-1(NRG-1).Cell Physiol Biochem.36(5):2012-24。
·它表现出通过肠转运蛋白和代谢酶的主动转运。肠转运蛋白的实例包括HPT1、PEPT1、BCRP、MRP2、MDR1、OATP1A3、OATP2B1、OATP1B1、OATP1B3、SVCT1、GLUT2、GLUT5和SGLT1。用于检测肠转运蛋白的活性的方法被以下公开：例如，Hilgendorf C,Ahlin G,Seithel A,Artursson P,Ungell AL,Karlsson J(2007).Expression of thirty-sixdrug transporter genes in human intestine,liver,kidney,and organotypic celllines.Drug Metab Dispos.35(8):1333-40。
·当它包含髓样免疫细胞时，它表现出髓样活化(myeloid activation)。在一个实施方案中，髓样活化通过用LPS和/或干扰素-γ治疗来诱导。用于诱导髓样活化的方法被以下公开：Greifenberg V,Ribechini E,S,Lutz MB(2009).Myeloid-derivedsuppressor cell activation by combined LPS and IFN-gamma treatment impairs DCdevelopment.Eur J Immunol.39(10):2865-76。
·它表现出与表达的标志物对应的基因表达。此类基因的实例包括CYP3A4、CK19、CHGA和MUC2。用于检测此类基因表达的方法被以下公开：Taipalensuu J,H,Lindberg G,Einarsson C,F,Melhus H,Garberg P,B,Lundgren B,Artursson P(2001).Correlation of gene expression of ten drug efflux proteinsof the ATP-binding cassette transporter family in normal human jejunum and inhuman intestinal epithelial Caco-2 cell monolayers.J Pharmacol Exp Ther.299(1):164-70；Chang SK,Dohrman AF,Basbaum CB,Ho SB,Tsuda T,Toribara NW,Gum JR,Kim YS(1994).Localization of mucin(MUC2and MUC3)messenger RNAand peptideexpression in human normal intestine and colon cancer.Gastroenterology.107(1):28-36；和Kelly OG,Chan MY,Martinson LA,Kadoya K,Ostertag TM,Ross KG,Richardson M,Carpenter MK,D'Amour KA,Kroon E,Moorman M,Baetge EE,Bang AG(2011).Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell typesderived from human embryonic stem cells.Nat Biotechnol.29(8):750-6。
·它响应于营养物刺激表现出肠内分泌功能和肠肽的产生。肠内分泌功能和/或肠肽的产生可以通过检测胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、PYY和/或胆囊收缩素(CCK)、生长抑素(SST)、肽YY(PYY)和抑胃肽(GIP)水平的改变来确定。用于检测GLP-1、PYY和CCK的水平的方法被以下公开：Egerod KL,Engelstoft MS,Grunddal KV,MK,Secher A,SakataI,Pedersen J,JA,Füchtbauer EM,Olsen J,Sundler F,Christensen JP,Wierup N,Olsen JV,Holst JJ,Zigman JM,Poulsen SS,Schwartz TW(2012).A majorlineage of enteroendocrine cells coexpress CCK,secretin,GIP,GLP-1,PYY,andneurotensin but not somatostatin.Endocrinology.153(12):5782-95。
·它表现出与另外的任选的细胞类型相关的另外的标志物的表达，包括淋巴样细胞标志物(CD4、CD8、CD19和CD15)、肠内分泌标志物(CHGA、GLP-1、PYY、CCK)、杯状细胞标志物(MUC2)、血管标志物(CD31)和干细胞标志物(LGR5)。用于检测CD4、CD8、CD19、CD15、CHGA、GLP-1、PYY、CCK、MUC2、CD31和LGR5的方法被以下公开：Reading CL,Estey EH,Huh YO,Claxton DF,Sanchez G,Terstappen LW,O'Brien MC,Baron S,Deisseroth AB(1993).Expression of unusual immunophenotype combinations in acute myelogenousleukemia.Blood.81(11):3083-90；Zhao X,Zhao Q,Luo Z,Yu Y,Xiao N,Sun X,Cheng L(2015).Spontaneous immortalization of mouse liver sinusoidal endothelialcells.Int J Mol Med.35(3):617-24；Fan XS,Wu HY,Yu HP,Zhou Q,Zhang YF,Huang Q(2010).Expression of Lgr5 in human colorectal carcinogenesis and itspotential correlation with beta-catenin.Int J Colorectal Dis.25(5):583-90；和以上引用的参考文献。
·它表现出黏液分泌/黏膜屏障的形成。黏液分泌/黏膜屏障的形成可以通过检测黏蛋白2(MUC2)来确定。用于检测黏蛋白2的方法被以下公开：Chang SK,Dohrman AF,Basbaum CB,Ho SB,Tsuda T,Toribara NW,Gum JR,Kim YS(1994).Localization ofmucin(MUC2and MUC3)messenger RNA and peptide expression in human normalintestine and colon cancer.Gastroenterology.107(1):28-36。
·它表现出脂质代谢/转运。用于检测脂质代谢/转运的方法被以下公开：例如，Welti R,Wang X(2004).Lipid species profiling:a high-throughput approach toidentify lipid compositional changes and determine the function of genesinvolved in lipid metabolism and signaling.Curr Opin Plant Biol.7(3):337-44和Pfeffer PE,Douds Jr DD,Becard G,Shachar-Hill Y.Carbon uptake and themetabolism and transport of lipids in an arbuscular mycorrhiza.PlantPhysiol.1999Jun；120(2):587-98。
·它表现出炎症和免疫应答。组织的炎症和免疫应答以及用于检测的方法被以下综述：例如，Pantenburg B,Dann SM,Wang HC,Robinson P,Castellanos-Gonzalez A,Lewis DE,White AC Jr(2008).Intestinal immune response to humanCryptosporidium sp.infection.Infect Immun.76(1):23-9和Trine H.Mogensen(2009)Pathogen Recognition and Inflammatory Signaling in Innate ImmuneDefenses.Clin Microbiol Rev.22(2):240-273。在该实施方案中，组织构建体可以被用于模拟肠损伤(急性、亚慢性和/或慢性)和恢复。在另一个实施方案中，组织构建体可以被用于模拟肠疾病诸如炎性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩病。在另一个实施方案中，组织构建体可以被用于评价免疫调节对正常肠组织或患病肠组织的影响。
·当受损时，组织构建体表现出纤维化和纤维化瘢痕形成。纤维化是由慢性组织炎症引起的，并且以胞外基质(ECM)组分(诸如胶原蛋白)的过度沉积为特征。肠纤维化的机制在以下中被讨论：Silvia Speca,Ilaria Giusti,Florian Rieder,and GiovanniLatella(2012).Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis.WorldJ Gastroenterol.18(28):3635-3661。
当髓样免疫细胞存在时，它包含髓样细胞标志物CD14、CD206和CD68的一种或更多种。用于检测CD14、CD206和CD68标志物的方法被以下公开：Catherine E.Angel,Chun-JenJ.Chen,Oliver C.Horlacher,Sintia Winkler,Thomas John,Judy Browning,DuncanMacGregor,Jonathan Cebon and P.Rod Dunbar(2009)Distinctive localization ofantigen-presenting cells in human lymph nodes.Blood 2009(113):1257-1267。B细胞可以通过HLA-DR、CD19和CD20的细胞表面表达来检测。活化的B细胞可以通过CD19、CD25和CD30的细胞表面表达来检测。效应B细胞可以通过CD138的细胞表面表达来检测。T细胞可以通过CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD38和CD54等的细胞表面表达来检测。活化的T细胞可以通过CD25、s CD25、CD27、CD30、CD69、CD71、CD154(CD40L)和CD278(ICOS)的细胞表面表达来检测。NK细胞可以通过CD56的细胞表面表达来检测。在人类中，主要的树突状细胞(DC)亚群包括常规DC(conventional DC)(cDC)和浆细胞样DC(plasmacytoid DC)(pDC)，它们在表面标志物、Toll样受体(TLR)的表达方面和在活化后产生的细胞因子方面不同。cDC对于CD11c是阳性的，并且携带CD1c(BDCA1)或CD141(BDCA3)。CD1c+cDC表达TLR1至TLR8和TLR10，并且CD1c-CD141+cDC表达TLR1、TLR2、TLR3、TLR6、TLR8和TLR10。pDC表达TLR1、TLR6和TLR10。检测可以通过流式细胞术免疫表型分型(flow cytometry immunophenotyping)完成。免疫表型分型可以在异质细胞群中或在逐个细胞(cell-by-cell basis)的基础上(单细胞分析)完成。适于检测淋巴细胞特异性细胞表面标志物的抗体是商购可得的，诸如来自Abcam和R&DSystems,Inc。淋巴细胞表面标志物和用于检测的方法在以下中提供：Andrade MC,Ferreira SB,LC,De-Paula AM,de Faria ES,Teixeira-Carvalho A,Martins-Filho OA(2013).Cell surface markers for T and B lymphocytes activation andadhesion as putative prognostic biomarkers for head and neck squamous cellcarcinoma.Hum Immunol.74(12):1563-74；Kragh M,Larsen JM,Thysen AH,RasmussenMA,Wolsk HM,Bisgaard H,Brix S(2016).Divergent response profile in activatedcord blood T cells from first-born child implies birth-order-associated inutero immune programming.Allergy.71(3):323-32；Oboshi W,Aki K,Tada T,WatanabeT,Yukimasa N,Ueno I,Saito K,Hosoi E(2016).Flow Cytometric Evaluation ofSurface CD56Expression on Activated Natural Killer Cells as FunctionalMarker.J Med Invest.63(3-4):199-203；Meixlsperger S,Leung CS,PC,Pack M,Vanoaica LD,Breton G,Pascolo S,Salazar AM,Dzionek A,Schmitz J,Steinman RM,Münz C(2013).CD141+dendritic cells produce prominent amounts of IFN-αafterdsRNArecognition and can be targeted via DEC-205in humanized mice.Blood.121(25):5034-44。
在某些实施方案中，肠上皮层的至少50％的肠上皮细胞与其它肠上皮细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，肠上皮层的至少70％的肠上皮细胞与其它肠上皮细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，肠上皮层的至少90％的肠上皮细胞与其它肠上皮细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，肠上皮层的50％-90％的肠上皮细胞与其它肠上皮细胞形成紧密连接。
上皮组织层的结构
通常，上皮组织细胞与相邻细胞形成紧密连接。紧密连接是以被称为钙黏蛋白的跨膜蛋白家族为标志的。这些的一种，E-钙黏蛋白，在肠组织中在紧密连接处特别地显著，并且标志紧密连接的形成。在某些实施方案中，上皮组织层仅包含形成紧密连接的细胞(即，“由形成紧密连接的细胞组成”)。在某些实施方案中，在上皮组织层中的基本上所有细胞与至少一个相邻细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的在99％-100％之间的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的在95％-100％之间的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的在90％-100％之间的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的在80％-100％之间的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的在70％-100％之间的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的在60％-100％之间的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的在50％-100％之间的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。在某些实施方案中，在上皮组织层中的50％-99％的细胞与至少一个其它细胞形成紧密连接。
在另一个实施方案中，上皮组织层表现出刷状缘，其以如存在于天然肠组织上的微绒毛为特征。刷状缘可以通过绒毛蛋白的顶端染色来检测。
细胞层的存活力和密度
通过本公开内容的方法生物打印的优点是细胞可以以高密度和高存活力被打印。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度大于1×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是至少5×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是至少10×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是至少20×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是至少50×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是至少100×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是至少200×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是至少500×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是在约100×106个细胞/mL和约900×106个细胞/mL之间。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是在约100×106个细胞/mL和约700×106个细胞/mL之间。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是在约100×106个细胞/mL和约600×106个细胞/mL之间。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是在约100×106个细胞/mL和约500×106个细胞/mL之间。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是在约100×106个细胞/mL和约300×106个细胞/mL之间。在某些实施方案中，上皮/间质细胞层的密度是在约100×106个细胞/mL和约200×106个细胞/mL之间。在某些实施方案中，上皮/间质组织层或上皮组织层按体积计在70％-100％活细胞之间。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计大于99％活细胞。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计大于95％活细胞。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计大于90％活细胞。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计大于80％活细胞。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计大于70％活细胞。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计大于60％活细胞。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计大于50％活细胞。在某些实施方案中，上皮/间质组织层的存活力按体积计是50％-99％活细胞。在某些实施方案中，该存活力在打印后被维持至少8小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、或更多小时。在某些实施方案中，该存活力在打印后被维持至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天、或更多天。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少0.1×105个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少1×105个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少5×105个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少1×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少5×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少10×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少20×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少50×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少100×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少200×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是至少500×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度小于1×105个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度小于2×105个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度小于5×105个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度小于1×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度小于5×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度小于10×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮细胞层的密度是10×106个细胞/mL。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计大于99％活细胞。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计大于95％活细胞。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计大于90％活细胞。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计大于80％活细胞。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计大于70％活细胞。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计大于60％活细胞。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计大于50％活细胞。在某些实施方案中，上皮组织层的存活力按体积计是50％-99％活细胞。在某些实施方案中，该存活力在打印后被维持至少8小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或至少96小时。在某些实施方案中，该存活力在打印后被维持至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天。
生物墨和细胞层的非细胞组分
被生物打印的细胞或生物墨通常包含改善其用于生物打印的合适性的赋形剂或挤出化合物。挤出化合物的实例包括，但不限于凝胶、水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇(例如，Pluronic F-127或PF-127)、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胞外基质组分(和其衍生物)、胶原蛋白、明胶、其它生物相容性天然或合成聚合物、纳米纤维和自组装纳米纤维。在一些实施方案中，挤出化合物包含合成聚合物。在一些实施方案中，挤出化合物包含通常不与哺乳动物组织缔合的非合成聚合物。在一些实施方案中，挤出化合物在通过物理、化学或酶促手段生物打印后被去除。在一些实施方案中，本公开内容的生物墨包含按重量计1％或更多挤出化合物。在一些实施方案中，本公开内容的肠组织模型包含按重量计大于1％挤出化合物。在一些实施方案中，本公开内容的生物墨包含按重量计小于5％挤出化合物。在一些实施方案中，本公开内容的生物墨包含按重量计在0％-2％之间挤出化合物。在一些实施方案中，本公开内容的生物墨包含按重量计小于1％挤出化合物。在一些实施方案中，本公开内容的肠组织模型包含按重量计在0％-5％之间挤出化合物。在一些实施方案中，本公开内容的肠组织模型包含按重量计小于2％挤出化合物。在一些实施方案中，本公开内容的肠组织模型包含按重量计小于1％挤出化合物。在一些实施方案中，上皮生物墨不含水凝胶。在一些实施方案中，上皮生物墨不含挤出化合物。在一些实施方案中，上皮生物墨不含被用作赋形剂或挤出化合物的合成聚合物。在一些实施方案中，肠组织模型不含被用作赋形剂或挤出化合物的合成聚合物。在一些实施方案中，上皮细胞层不含被用作赋形剂或挤出化合物的合成聚合物。在一些实施方案中，间质细胞层不含被用作赋形剂或挤出化合物的合成聚合物。
打印表面
本文提供了附着至生物相容性表面的肠组织模型。在某些实施方案中，间质组织层被打印到生物相容性表面上。在某些实施方案中，生物相容性表面是具有0.4μm至10μm的孔径的膜。在某些实施方案中，生物相容性表面具有约1μm的孔径。在一个实施方案中，生物相容性表面包括具有3μm尺寸的孔的聚四氟乙烯膜。
在某些实施方案中，生物相容性表面用组合物包被以改善细胞黏附性或存活力。在某些实施方案中，肠组织模块被打印到6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔或1546孔板中。在某些实施方案中，肠组织模块被打印到具有60mm、100mm或150mm或更大的直径的组织培养板中。在此类实施方案中，肠组织模型的表面面积可以与组织培养板的孔的直径一样大。在某些实施方案中，肠组织模块被打印到组织培养瓶中或到微流体芯片上。在某些实施方案中，肠组织模型被打印到Transwell插入物(Transwell inserts)中/上。
在某些实施方案中，肠组织模型在静态条件下，例如在组织培养板的孔中，在培养基中培养。在另一个实施方案中，肠组织模型在非静态，例如，流动条件下培养。
在某些实施方案中，肠组织模型具有平面的表面。在其它实施方案中，肠组织模型的表面是非平面的。在其它实施方案中，肠组织模型的表面是水凝胶或支架材料。在其它实施方案中，肠组织模型的表面包含生物打印的组织。在其它实施方案中，肠组织模型的表面是细胞单层。
用于产生肠组织模型的方法
本公开内容提供了用于制备肠组织模型的方法和过程。在某些实施方案中，三维工程化生物肠组织模型的产品通过生物打印过程产生。在某些实施方案中，三维工程化生物肠组织模型的产品的至少一种组分通过生物打印的过程产生。在某些实施方案中，制备三维工程化生物肠组织模型的方法包括：制备包含肌成纤维细胞的肠间质生物墨；制备肠上皮生物墨；使肠间质肌成纤维细胞生物墨和肠上皮生物墨沉积，使得肠上皮生物墨在肠间质肌成纤维细胞生物墨层的至少一个表面上形成层；和使沉积的生物墨在细胞培养基中成熟，以允许细胞凝聚以形成三维工程化生物肠组织模型。在某些实施方案中，肠间质肌成纤维细胞组织生物墨形成具有顶端表面和基底外侧表面的组织层。在某些实施方案中，肠上皮生物墨被沉积成与肠间质肌成纤维细胞组织层的顶端表面接触。在某些实施方案中，肠上皮生物墨主要地由肠上皮细胞组成。
在一个实施方案中，连续沉积被用于产生模拟黏膜和/或上皮的单层或多层。另外的层可以通过连续沉积被打印以模拟黏膜下层、肌层、和浆膜。生物打印的方法包括喷墨沉积、挤出、微电磁沉积(MSV)，并且生物分散(biodispense)方法也可以被用于添加层、细胞和/或基质，具有如一个细胞层薄的更精细的分辨率。喷雾方法也可以与其它方法组合使用，以使细胞材料嵌入到打印表面、组织或基质材料中。生物打印提供目前的体外肠模型的优点，因为它使细胞能够被放置在精确的几何形状内，并且能够使用多种生物墨制剂(包括但不限于Novogel 2.0、3.0和胶原蛋白)。连续沉积可以将多种生物材料掺入到Novogel制剂和多种打印表面中，以促进基质产生和分化。该打印方法使用具有多种孔径的多种打印表面，所述多种打印表面可以用基质支持材料诸如胶原蛋白包被。例如，连续沉积可以被用于将层状组织打印到胶原蛋白包被的打印表面上。水凝胶也可以被添加以支持生物材料或构成其中不存在细胞的空间保留区域(space-reserving region)。
在某些实施方案中，肠上皮生物墨主要地由原代肠上皮细胞组成。在某些实施方案中，原代肠上皮细胞是从非患病组织分离的。在某些实施方案中，被用于制备肠组织构建体的细胞(例如，原代肠上皮细胞、肌成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞等)是从具有影响肠功能的疾病的受试者分离的，所述疾病例如乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、痔、憩室炎、炎性肠病、显微镜下结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、内分泌障碍、代谢障碍、肥胖、糖尿病、血脂异常、结肠直肠癌以及其他。在某些实施方案中，原代肠上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有乳糜泻的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有克罗恩病的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有溃疡性结肠炎的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有肠易激综合征的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有痔的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有憩室炎的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有炎性肠病的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有显微镜下结肠炎的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有淋巴细胞性结肠炎的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有胶原性结肠炎的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有内分泌障碍的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有代谢障碍的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有肥胖的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有糖尿病的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有血脂异常的受试者分离的。在某些实施方案中，原代肠组织上皮细胞和/或肌成纤维细胞是从具有结肠直肠癌的受试者分离的。
在某些实施方案中，肠上皮细胞系从商业来源(诸如ATCC、Creative Bioarray、和Lonza)获得，包括Caco-2、HT-29、HT29-18N2和HuTu80细胞系、HIEC-6(正常)、FHs 74Int(正常)、CloneticsTM肠上皮细胞(Lonza的原代肠上皮细胞)和人类小肠上皮细胞(来自Creative Bioarray)。
在某些实施方案中，肠肌成纤维细胞系从商业来源(诸如ATCC、CreativeBioarray和Lonza)获得。
在某些实施方案中，生物墨还包含免疫细胞。在某些实施方案中，生物墨包含淋巴样细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、中性粒细胞、T细胞和B细胞。免疫细胞可以是来自患者活组织检查或细胞系的原代免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞系从商业来源(诸如Creative Bioarray、PrecisionForMedicine、BioreclamationIVT和Lonza等)获得。
在某些实施方案中，生物墨还包含特化的肠上皮细胞，诸如肠细胞(enterocytes)、杯状细胞(goblet cell)、肠内分泌细胞、潘氏细胞、微皱褶细胞(microfold cells)、杯状细胞(cup cell)和/或簇细胞(tuft cell)。在某些实施方案中，特化的肠上皮细胞系根据本领域中已知的方法获得。在其它实施方案中，特化的细胞从在合同基础上分离此类细胞的公司获得。
在某些实施方案中，一种或更多种生物墨包含肠癌细胞。在某些实施方案中，肠上皮生物墨包含肠肉瘤细胞。在某些实施方案中，肠上皮生物墨包含肠淋巴瘤细胞。在某些实施方案中，肠上皮生物墨包含肠腺癌细胞。细胞可以是来自患者活组织检查或细胞系的原代细胞。在某些实施方案中，癌、肉瘤、淋巴瘤和腺癌细胞系从商业来源诸如ATCC获得。
在某些实施方案中，一种或两种生物墨可以还包含特化的细胞诸如神经元细胞。在某些实施方案中，神经元细胞系从商业来源诸如Creative Bioarray获得。
在某些实施方案中，一种或两种生物墨可以还包含特化的细胞诸如内皮细胞。在某些实施方案中，内皮细胞系从商业来源诸如获得。
在某些实施方案中，一种或两种生物墨可以还包含特化的细胞诸如平滑肌细胞。在某些实施方案中，平滑肌细胞系从商业来源诸如获得。
在某些实施方案中，一种或两种生物墨可以还包含可以通过干细胞群的定向分化获得的特化的细胞。干细胞群可以是原代分离物或是商购可得(例如，来自ATCC)的那些。在一个实施方案中，干细胞是从Lonza、StemGent和iXCells商购可得的iPS细胞。
在某些实施方案中，上皮细胞是来自患病供体的原代细胞，所述患病供体例如具有乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、痔或憩室炎的受试者。具有来自患病供体的细胞的肠组织构建体可以被用于各自疾病的模型中。这些疾病模型可以被用于测试候选治疗性治疗在各自疾病的治疗中的效力。
在某些实施方案中，肠上皮生物墨以单层沉积。在某些实施方案中，间质肌成纤维细胞组织生物墨以单层沉积。在某些实施方案中，生物墨还包含挤出化合物。在某些实施方案中，肠上皮组织层被沉积成与肠间质肌成纤维细胞组织层连续接触。在某些实施方案中，肠上皮生物墨形成覆盖肠间质肌成纤维细胞组织层的顶端表面的在50％-100％之间的层。在某些实施方案中，肠上皮生物墨形成覆盖肠间质肌成纤维细胞组织层的顶端表面的在70％-100％之间的层。在某些实施方案中，上皮生物墨形成覆盖肠间质肌成纤维细胞组织层的顶端表面的在90％-100％之间的层。在某些实施方案中，肠上皮生物墨形成覆盖肠间质肌成纤维细胞组织层的顶端表面的50％-90％的层。
在某些实施方案中，肠组织模型是在50μm和500μm之间厚。在某些实施方案中，肠组织模型是约100μm厚。在某些实施方案中，肠上皮生物墨还包含挤出化合物。在某些实施方案中，肌成纤维细胞和上皮细胞以约95:5至约5:95的肌成纤维细胞与上皮细胞的比率存在于生物墨中。在某些实施方案中，肌成纤维细胞和上皮细胞以约75:25至约25:75的肌成纤维细胞与上皮细胞的比率存在于生物墨中。在某些实施方案中，肌成纤维细胞和上皮细胞以约60:40至约40:60的肌成纤维细胞与上皮细胞的比率存在于生物墨中。在某些实施方案中，肌成纤维细胞和上皮细胞以约50:50的肌成纤维细胞与上皮细胞的比率存在于生物墨中。在某些实施方案中，生物墨还包含分泌细胞。
在某些实施方案中，模型被制备成基本上不含预成型的支架。在某些实施方案中，肌成纤维细胞和上皮细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨或上皮生物墨的任一个在沉积后形成平面的层。在某些实施方案中，肠组织模型具有均匀的厚度。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨被沉积到生物相容性膜上。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨被沉积到具有大于0.4μm的孔径的生物相容性膜上。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨被沉积到具有约1μm的孔径的生物相容性膜上。在某些实施方案中，三维工程化生物肠组织模型被沉积为形成阵列。
在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨按体积计在30％-100％活细胞之间。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨按体积计在70％-100％活细胞之间。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨按体积计在90％-100％活细胞之间。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨通过挤出生物打印被沉积。在某些实施方案中，上皮生物墨通过喷墨生物打印被沉积。在某些实施方案中，肌成纤维细胞生物墨不通过喷墨生物打印被沉积。在某些实施方案中，肠组织模型的任何层在培养3天后在体外培养物中是存活的。在某些实施方案中，肠组织模型的任何层在10天后在体外培养物中是存活的。
在某些实施方案中，本文公开的3D肠组织模型通过增材制备过程(additivemanufacturing process)产生。本文用于3D肠组织模型的增材制备过程允许出于体外目的的3D肠组织模型的定制制备。这是重要的，因为组织是由于用户指定的设计而制备的。在某些实施方案中，3D肠组织模型仅包含用户指定的细胞。在某些实施方案中，3D肠组织模型仅包含用户指定的细胞类型。在某些实施方案中，3D肠组织模型仅包含用户指定的细胞数目或细胞浓度。在某些实施方案中，3D肠组织模型包含在制备前或制备期间已经用小分子、治疗性分子、或治疗性物质处理的细胞。治疗性分子或治疗性物质是意图于治疗疾病或引发生物响应的任何分子。在某些实施方案中，3D肠组织模型包含生物相容性或组织培养塑料、生物相容性合成聚合物、可交联的凝胶、可逆地交联的凝胶和其它非细胞组分。
肠组织模型的成熟
在某些实施方案中，本公开内容的肠组织模型在生物打印后成熟一定量的时间。在某些实施方案中，模型在使用前成熟1-24小时，例如，在使用前成熟至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少16小时、至少18小时、至少24小时或更长时间。在某些实施方案中，模型在使用前成熟1-30天，例如，在使用前成熟至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天或更长时间。在一些实施方案中，运送或转移组织是使用。在某些实施方案中，本公开内容的肠组织模型的间质肌成纤维细胞层在生物打印后在添加上皮层前成熟一定量的时间。在某些实施方案中，间质肌成纤维细胞层在使用前成熟1-24小时，例如，在使用前成熟至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少16小时、至少18小时、至少24小时或更长时间。在某些实施方案中，间质肌成纤维细胞层在使用前成熟1-30天，例如，在使用前成熟至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天或更长时间。在一些实施方案中，运送或转移组织是使用。在一些实施方案中，在生物打印间质肌成纤维细胞层后立即或，例如，在生物打印间质肌成纤维细胞层后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、16小时、18小时、24小时，上皮层被生物打印到间质肌成纤维细胞层上。在一些实施方案中，运送或转移组织是使用。在一些实施方案中，在生物打印间质肌成纤维细胞层后1-30天内，例如在生物打印间质肌成纤维细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天内，上皮层被生物打印到间质肌成纤维细胞层上。
在一些实施方案中，肠组织模型在具有或不具有按定义的方案更换细胞培养基的情况下在静态条件下在细胞培养基中成熟。在其它实施方案中，肠组织模型在非静态条件下在细胞培养基中成熟。非静态条件包括使细胞培养基跨越肠组织模型的顶端表面和/或基底外侧表面流动。
任何哺乳动物组织培养基可以被用于培养肠组织模型。实例包括BGJb、BME、Brinster’s BMOC-3、CMRL、CO2非依赖性培养基、DMEM培养基、DMEM/F-12培养基、F-10营养物混合物、F-12营养物混合物、Glasgow(Glasgow)(G-MEM)、改良MEM、Iscove’s(IMDM)、Leibovitz’s L-15、McCoy’s 5A、MCDB 131、培养基199、最低必需培养基(MinimumEssential Media)(MEM)、改良Eagle培养基(MEM)、I、Fischer’s培养基、MEMRega-3、NCTC-135培养基、RPMI培养基1640、Waymouth’s MB752/1、和Williams’培养基E(ThermoFisher Scientific,Grand Island,New York)。
组织构建体的用途
本文描述的肠组织构建体可以被用于多种应用。在一个实施方案中，组织屏障可以被用于毒理学和ADME应用。在一个实施方案中，组织构建体的有功能的特征包括建立屏障并证明渗透率/吸收(如通过TEER和萤光黄渗透率证明的)。这些特征允许用于渗透动力学(Papp)和流入/流出(ab,ba)研究。在另一个实施方案中，分别地通过关键转运蛋白和代谢酶进行的主动转运和代谢的研究可以通过基于孔的测定或通过质谱检测底物和其代谢物来进行。这些相同的技术可以被用于评价多种药物和应用的化合物的主动转运和代谢的机制。因此，可以使用测试物质的转运动力学、流出速率和渗透系数使测试物质与FDA推荐的参考药物相关联。通过屏障功能和渗透动力学，组织构建体可以被用于预测口服递送的化合物的吸收或预测是否存在化合物通过类似于天然组织的肠转运蛋白的主动转运、预测化合物破坏肠屏障和/或诱导肠炎症的能力、和/或预测化合物调节炎症的效力。在另一个实施方案中，黏膜屏障发育和应用的化合物对屏障功能的影响也可以通过黏液分泌(通过检测MUC2)来评价。在另一个实施方案中，脂质代谢、吸收、和转运可以通过检测乳糜微粒分泌(例如，通过apoB-48ELISA)和甘油三酯合成(13C油酸酯，D20)作为终点来模拟。在另一个实施方案中，肠内分泌功能可以通过检测响应于营养物刺激(例如，GLP-1、PYY、CCK、和/或SST)的肠肽分泌来评价。运动或响应于运动诸如蠕动可以通过添加流动组分、流动或基于细胞的运动、和/或通过添加其它细胞类型如平滑肌细胞和神经元来模拟。
本文公开的包含免疫细胞的组织构建体的主要应用是炎症和炎性疾病的模拟、以及免疫调节对癌症的影响。在一个实施方案中，免疫细胞是髓样细胞或淋巴样细胞。在另一个实施方案中，将疾病模型与正常组织模型并排比较，所述疾病模型例如，缺乏免疫细胞的肠组织模型、包含免疫细胞但未被刺激活化免疫细胞(静息(quiescent))的肠组织模型、或缺乏免疫细胞并用细胞因子刺激以模拟免疫应答的肠组织模型。在该实施方案中，组织构建体可用于评价炎症和对疾病诸如炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、和克罗恩病的免疫应答。包含免疫细胞的组织构建体也可以被用于研究急性响应，例如肠炎，或慢性响应诸如炎性肠病。包含免疫细胞的组织构建体也可以被用于模拟损伤和恢复，包括急性、亚慢性、或慢性给药候选药物化合物或治疗。在另一个实施方案中，包含免疫细胞的组织构建体被用于评价伤口愈合和纤维化。例如，纤维化瘢痕形成是IBD、溃疡性结肠炎和克罗恩病的常见并发症，但在克罗恩病中更普遍得多。此外，包含免疫细胞的组织构建体可以被用于模拟微生物/微生物组相互作用(致病微生物如艰难梭菌(Clostridium Difficile)或共生细菌)、或肠感染(细菌或病毒)。组织构建体的3D性质允许对病原体侵袭和易位的增强的观察。包含免疫细胞的组织构建体可以通过以下来刺激：细胞因子(例如IL-17)、细菌组分或产物、化学破坏以产生伤口(例如右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎)、模拟肠损伤的物理破坏(例如刮擦)、或化学破坏(例如2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的IBD)。在一个实施方案中，组织随后用候选药剂或治疗进行处理，以逆转或控制炎性作用。在一个实施方案中，追踪拮抗剂诸如抗TNFα的影响用于校正损伤的表型。可以被检测的炎性信号包括细胞因子(例如IL-8、TNFα、IL-4、IL-19、IL-13、IL-17、和/或IFN-γ)、抗微生物肽(例如β防御素、溶菌酶、和/或sIgA)、内分泌产物诸如生长抑素的释放，炎性途径(例如JAK/STAT、和/或NFkB)的活化，响应于炎症的屏障破坏的评价(组织学、TEER、萤光黄、尤斯室(Ussing chamber)、和/或其它基于孔的测定)，黏液分泌或基因调控或杯状细胞的损失的评价，评价对稳态上皮调控、离子、营养物和水转运、胆汁再吸收的影响，测量增殖、细胞毒性、组织损伤、或凋亡(胱天蛋白酶8或Tunel)或受伤区域的自噬或再上皮化(re-epithelialization)、和响应于刺激被上调的关键标志物和受体(TLR、Myd99、HNF4α、MLCK、Muc2、TFF3)的表达。对于描述的任何表型，3D肠模型可以被用于证明开始的动力学和幅度以及从扰动恢复。例如，人们可以用治疗剂向组织给药并且测量吸收的动力学且并行地测量组织损伤的开始的动力学，并且然后去除测试剂并测量组织中分子的清除的动力学以及从损伤恢复的动力学。分析这些参数可以能够预测用于进入临床的化合物的适当的给药水平和给药方案。
肠组织模型也可以在评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力的方法中使用，该方法包括：
(a)使肠组织模型或非人类动物模型与候选治疗剂接触，其中肠组织模型具有肠障碍或损伤的表型；
(b)确定肠组织细胞的存活力或功能性；和
(c)基于与未与候选治疗剂接触的对照肠组织模型相比的确定的肠组织细胞的存活力或功能性，评价候选治疗剂逆转、降低或预防肠障碍或损伤的能力。
在一些实施方案中，肠障碍或损伤的表型通过使肠组织模型与引起表型的治疗、化合物、或传染原接触来诱导。在一些实施方案中，肠障碍或损伤的表型是在肠组织模型中肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞的存在。在一些实施方案中，候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力是降低的肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞侵袭或转移。
肠组织模型也可以在评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力的方法中使用，该方法包括：
(a)使肠组织模型或非人类动物模型与候选治疗剂接触；
(b)确定肠组织细胞的存活力或功能性；和
(c)基于与未与候选治疗剂接触的对照肠组织模型相比的确定的肠组织细胞的存活力或功能性，评价候选治疗剂逆转、降低或预防肠障碍或损伤的能力。
在一个实施方案中，肠障碍或损伤的表型通过使肠组织模型与引起表型的治疗、化合物、或传染原接触来诱导。此类治疗的实例包括放射治疗和物理损伤(physicalinjury)。化合物的实例包括已知对肠组织有害的任何化合物，包括NSAID诸如阿司匹林、布洛芬(ibuprophen)、萘普生钠、塞来昔布(celecoxib)、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬(flurbirofen)、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康、舒林酸和托美丁。传染原的实例包括沙门菌属(salmonella)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、梭菌属(clostridium)、弯曲菌属(campylobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弧菌属(vibrio)、蓝氏贾第鞭毛虫(giardia lamblia)、肠蠕虫和艰难梭菌。
在一些实施方案中，可以研究候选化学治疗或免疫调节剂的影响。在一些实施方案中，肠组织模型包含肿瘤细胞，并且使用于治疗肿瘤的候选治疗剂或免疫调节剂与肠组织模型接触。
在其它实施方案中，肠组织模型通过以下在研究肠的微生物组的方法中使用：使肠组织模型与肠微生物组的生物体接触并且与未与该生物体接触的对照肠组织模型相比确定肠组织细胞的存活力或功能性。在一个实施方案中，肠组织模型包含患病肠组织细胞。在其它实施方案中，肠组织模型包含正常肠组织细胞。在另外的实施方案中，使肠组织模型与候选治疗剂或治疗接触以评价治疗剂或治疗对肠微生物组的影响。
在一些实施方案中，本文公开的肠组织模型和阵列用于在体外测定中使用。在一些实施方案中，“测定”是用于测试或测量在有机样品或生物样品(例如，细胞聚集物、组织、器官、生物体等)中的物质(例如，化学品、分子、生物化学品、药物等)的存在或活性的程序。在另外的实施方案中，测定包括定性测定和定量测定。还在另外的实施方案中，定量测定测量在样品中的物质诸如化学品或生物分子的量。
在多个实施方案中，肠组织模型和阵列用于在，通过非限制性实例的方式，基于图像的测定、分泌蛋白的测量、标志物的表达、和蛋白或mRNA的产生中使用。在多个另外的实施方案中，肠组织模型和阵列用于在检测或测量以下一个或更多个的测定中使用：分子结合(包括放射性配体结合)、分子摄取、活性(例如，酶促活性和受体活性、代谢物产生等)、基因表达、蛋白表达、蛋白修饰(非限制性实例包括：磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化、脂质化等)、受体激动、受体拮抗、细胞信号传导、凋亡、化学敏感性、转染、细胞迁移、趋化性、细胞存活力、细胞增殖、安全性、效力、代谢、毒性、传染性、免疫活化、免疫调节和滥用倾向(abuse liability)。在多个实施方案中，肠组织模型用于毒理学、药学或毒性测试。
在一些实施方案中，肠组织模型和阵列用于在免疫测定中使用。免疫测定包括，例如，流式细胞术、高通量或低通量图像分析、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白印迹、同质测定(homogenous assays)诸如AlphaLISATM和依赖于时间分辨荧光或荧光共振能量转移(FRET)的相关的技术。在另外的实施方案中，免疫测定是竞争性免疫测定或非竞争性免疫测定。例如，在竞争性免疫测定中，在样品中的抗原与标记的抗原竞争以与抗体结合，并且然后测量与抗体位点结合的标记的抗原的量。例如，在非竞争性免疫测定(也被称作为“夹心测定”)中，在样品中的抗原与抗体位点结合；随后，标记的抗体与抗原结合，并且然后测量在该位点上标记的抗体的量。
在一些实施方案中，肠组织模型和阵列用于在ELISA中使用。在另外的实施方案中，ELISA是用于检测在样品中抗体或抗原的存在的生物化学技术。例如，在ELISA中，使用对特定抗原具有特异性的至少一种抗体。通过另外实例的方式，具有未知量的抗原的样品非特异性地(通过吸附至表面)或特异性地(在“夹心”ELISA中，通过被对同一抗原特异性的另一种抗体捕获)被固定在固体支持物(例如，聚苯乙烯微量滴定板)上。还通过另外实例的方式，在抗原被固定后，添加检测抗体，与抗原形成复合物。检测抗体，例如，共价地连接至酶，或者自身被通过生物缀合(bioconjugation)连接至酶的二抗检测。
在其它实施方案中，肠组织模型经受质谱分析以确定肠组织模型的组分。此类组分包括候选治疗性治疗(therapeutic treatments)的代谢物、蛋白、细胞因子、RNA、DNA等。
例如，在一些实施方案中，细胞、多细胞聚集物或组织的阵列、微阵列或芯片被用于药物筛选或药物发现。在其它实施方案中，组织的阵列、微阵列或芯片作为用于药物筛选或药物发现的试剂盒的一部分被使用。在一些实施方案中，每个肠组织模型存在于生物相容性多孔容器的孔中，其中该容器与一个或更多个自动化的药物筛选程序和/或设备是相容的。在另外的实施方案中，自动化的药物筛选程序和/或设备包括计算机或机器人辅助的任何合适的程序或设备。
在另外的实施方案中，用于药物筛选测定或药物发现测定的阵列被用于研究或开发潜在地可用于任何治疗领域的药物。还在另外的实施方案中，合适的治疗领域包括，通过非限制性实例的方式，传染病、血液学、肿瘤学、儿科学、胃肠病学(gastroenterology)、疼痛控制、疫苗、伤口愈合、生理学、药理学、基因治疗、毒理学、毒性和免疫学。
在一些实施方案中，肠组织模型和阵列用于在基于细胞的筛选中使用。在另外的实施方案中，基于细胞的筛选用于一种或更多种传染病诸如病毒、真菌、细菌或寄生虫感染。在另外的实施方案中，基于细胞的筛选用于结肠癌。
在一些实施方案中，构建体或其阵列用于在评价生物制品(biologics)的性能中使用，所述生物制品包括抗体、哺乳动物细胞、细菌、生物活性蛋白、激素、肽、小分子等。在其它实施方案中，肠组织模型或其阵列可用于包含构建体的哺乳动物肠组织模型和一种或更多种另外的细胞类型之间的细胞-细胞相互作用和细胞-组织相互作用的研究中，所述一种或更多种另外的细胞类型包括但不限于携带病原体的细胞(pathogen-bearing cell)、活的致病细胞、癌细胞、免疫细胞、血细胞、干细胞/祖细胞、或遗传操作的细胞(genetically-manipulated cell)。
在一些实施方案中，阵列包含肠组织模型和另外的组织构建体。在另外的实施方案中，肠组织构建体与另外的组织构建体在一个或更多个表面上直接接触。还在另外的实施方案中，肠组织模型通过流体路径或常见流体贮存器(common fluid reservoir)被连接至一个或更多个另外的组织构建体或细胞。还在另外的实施方案中，接触工程化肠组织构建体的液体培养基包含活的哺乳动物细胞诸如免疫细胞、血液来源的细胞、或肿瘤来源的细胞。在其它实施方案中，接触肠组织的液体培养基包含传染原诸如细菌、真菌、病毒、寄生虫或其它病原体。
在某些实施方案中，三维工程化生物打印的生物肠组织模型包含肠间质肌成纤维细胞层和肠上皮组织层。在其它实施方案中，肠间质肌成纤维细胞层和肠上皮组织层的至少一层包含另外的细胞类型，诸如髓样细胞、淋巴样细胞/白细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞、M细胞、神经元细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、特化的细胞，所述特化的细胞来源于来自患病供体(例如，来自具有IBD、结肠炎或克罗恩病的受试者)的iPS细胞的定向分化和/或原代细胞或iPS细胞。
在一个实施方案中，肠组织构建体可以被用于测试用于治疗肠纤维化和纤维化瘢痕形成的候选药物。用于检测肠纤维化和瘢痕形成的方法被以下综述：例如，FlorianRieder,Sean Kessler,Miquel Sans,and Claudio Fiocchicorresponding(2012).Animalmodels of intestinal fibrosis:new tools for the understanding of pathogenesisand therapy of human disease.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.303(7):G786-G801。
肠组织构建体也可以在测试用于肠创伤愈合的候选治疗剂的方法中使用。在该实施方案中，肠组织结构受损(例如，切割、等分(bisected)、穿孔、刺破、磨损、刮擦、暴露于引起损伤的化学品等)，受损组织构建体用候选治疗剂处理，并且与未与候选治疗剂接触的对照构建体的愈合的证据相比，检测到愈合的证据。在另一个实施方案中，损伤剂本身被简单地去除，并且将愈合的动力学和程度与先前尚未受损的对照构建体的动力学和程度进行比较。
肠组织构建体还可以被用于模拟微生物/微生物组相互作用(致病细菌或共生细菌)、和肠感染(细菌或病毒)。
肠组织构建体还可以被用于通过添加流动组分和/或包含平滑肌细胞和神经元模拟蠕动。在该实施方案中，肠组织构建体在生物反应器中经受培养基的流动。
在一些实施方案中，肠组织模型是至少2个细胞层厚。在一些实施方案中，肠组织模型是2个或更多个细胞层厚。在一些实施方案中，当肠上皮细胞不完全覆盖肠间质组织时，未被覆盖的间质组织在未被覆盖的区域中可以是少至一个细胞层厚。同样地，当间质组织层不完全覆盖打印表面时，覆盖肠上皮细胞层在不具有肠间质组织的打印表面上可以是少至一个细胞层厚。
在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少20μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少100μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少200μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少300μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少400μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少500μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少600μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少700μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少800μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少900μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是至少1000μm。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在50μm和3000μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在75μm和1000μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在100μm和1000μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在200μm和1000μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在500μm和1000μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在50μm和500μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在50μm和300μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在50μm和200μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在50μm和150μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在50μm和125μm之间。在一些实施方案中，肠组织模型的平均厚度是在75μm和100μm之间。
在一些实施方案中，打印表面面积是在0.01cm2和100cm2之间。打印表面可以是微量滴定板的孔，其范围可以从6个至384个孔或更多。在一些实施方案中，对于24孔板，打印表面面积是2cm2。
潜在毒性剂是可能对肠组织的结构或功能具有影响的任何物质。在一些实施方案中，潜在毒性剂是毒素、治疗剂、抗微生物剂、金属、微生物(例如细菌、病毒、寄生虫、真菌)或环境因素。在其它实施方案中，潜在毒性剂是抗病毒剂、镇痛剂、抗抑郁剂、利尿剂或质子泵抑制剂。
在其它实施方案中，潜在毒性剂是细胞因子、趋化因子、小分子药物、大分子药物、蛋白或肽。
在其它实施方案中，潜在毒性剂是化学治疗剂，其是芳香酶(aromatase)抑制剂；抗雌激素；抗雄激素；戈那瑞林(gonadorelin)激动剂；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂；烷化剂；类视黄醇、类胡萝卜素、或生育酚；环氧合酶抑制剂；MMP抑制剂；mTOR抑制剂；受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、抗代谢物；铂化合物；甲硫氨酰氨肽酶(methionine aminopeptidase)抑制剂；二膦酸盐；抗增殖抗体；乙酰肝素酶(heparanase)抑制剂；Ras致癌同种异型的抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；在治疗血液恶性肿瘤(hematologic malignancies)中使用的化合物；Flt-3抑制剂；Hsp90抑制剂；驱动蛋白纺锤体蛋白(kinesin spindle protein inhibitor)抑制剂；MEK抑制剂；抗肿瘤抗生素；亚硝基脲；靶向/减少蛋白或脂质激酶活性的化合物、靶向/减少蛋白或脂质磷酸酶活性的化合物、或抗血管生成化合物。在其它实施方案中，潜在毒性剂是化学治疗剂，其是柔红霉素、阿霉素、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、伊达比星、顺铂、碳铂、PKC412、6-巯基嘌呤(6-MP)、氟达拉滨磷酸盐、奥曲肽、SOM230、FTY720、6-硫代鸟嘌呤、克拉屈滨、6-巯基嘌呤、喷司他丁、羟基脲、2-羟基-lH-异吲哚-1,3-二酮衍生物、l-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪、l-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸盐、angiostatin、endostatin、邻氨基苯甲酸酰胺、ZD4190、ZD6474、SU5416、SU6668、贝伐单抗(bevacizumab)、rhuMAb、rhuFab、macugon、FLT-4抑制剂、FLT-3抑制剂、VEGFR-2IgGI抗体、RPI 4610、贝伐单抗、卟吩姆钠、阿奈可他(anecortave)、曲安西龙、氢化可的松、11-α-表氢化可的松、11-脱氧皮醇、17α-羟孕酮、皮质酮、去氧皮质酮、睾酮、雌酮、地塞米松、氟轻松(fluocinolone)、植物生物碱、激素化合物和/或拮抗剂、生物响应调节剂，诸如淋巴因子或干扰素、反义寡核苷酸或寡核苷酸衍生物、shRNA、siRNA，或其药学上可接受的盐。
在其它实施方案中，潜在毒性剂是布洛芬、对乙酰氨基苯酚、锂、阿昔洛韦、两性霉素B和氨基糖苷类、β内酰胺类、膦甲酸钠、更昔洛韦、喷他脒、喹诺酮、磺酰胺、万古霉素、利福平、阿德福韦、茚地那韦、didofovir、替诺福韦(tenofovir)、甲氨蝶呤、兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑、别嘌呤醇、苯妥英、异环磷酰胺(ifosfamide)、庆大霉素或唑来膦酸(zoledronate)。
在一些实施方案中，潜在毒性剂是辐射。在一些实施方案中，辐射可以包括X射线、γ射线、UV和其它。在一些实施方案中，辐射单独使用或与另一种毒性剂或更多种毒性剂组合使用。在一些实施方案中，辐射可以包括光子放射治疗、粒子束放射治疗、其它类型的放射治疗和其组合。
在一些实施方案中，毒性剂被溶解在生物相容性溶剂中。当潜在毒性剂是非水溶性的时，潜在毒性剂可以用极性非质子有机溶剂诸如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)溶解，并且然后用水溶液诸如9g/L氯化钠(盐水)在蒸馏水中、水性Tween、培养基或另一种生物相容性溶剂中稀释。
在一些实施方案中，毒性剂是免疫系统的调节剂。在一些实施方案中，免疫调节剂可以包括toll样受体(TLR)激动剂如LPS或咪喹莫特、TLR拮抗剂、类固醇或检查点抑制剂如抗PD1、抗PDL1或抗CTLA4。
在一些实施方案中，肠上皮细胞的存活力或功能性通过测量代谢活性的指示物来确定。在一些实施方案中，代谢活性可以通过alamarBlueTM测定(Thermo Fisher,Carslbad,CA)、乳酸脱氢酶(LDH)活性测定或另一种测定来测量。在一些实施方案中，代谢活性的指示物是与对照相比的在肠组织模型中的刃天青还原或四氮唑盐还原。在一些实施方案中，刃天青还原使用alamar blue测定来测量(Rampersad,S.N.,(2012),Multiple applicationsof alamar blue as an indicator of metabolic function and cellular health incell viability bioassays.Sensors 12(9):12347-12360)。在一些实施方案中，四氮唑盐包括3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)；3’-[1-苯基氨基)-羰基]-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基苯)磺酸钠水合物(XTT)；4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑基]-1,3-苯二磺酸盐、水溶性四氮唑盐(WST-1)；和其它(Rampersad,2012)。
在一些实施方案中，肠上皮细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的以下来确定：乳酸脱氢酶(LDH)活性、γ谷氨酰转移酶(GGT)活性、蛋白酶活性、ATP利用率、ATP水平及其改变、葡萄糖摄取活性、钠-葡萄糖共转运蛋白-1(SGLT1)活性、任何肠特异性蛋白或肽的分泌或RNA表达。在一些实施方案中，肠上皮细胞的存活力或功能性通过测量碱性磷酸酶活性或胱天蛋白酶活性来确定。在一些实施方案中，蛋白酶活性通过使用合成肽底物测量胱天蛋白酶活性来确定(Kumar(2004)第2章:Measurement of caspase activity incells undergoing apoptosis.Methods in Molecular Biology,第228卷.Totowa,NJ:Humana Press Inc.)。在一些实施方案中，细胞内ATP使用ATP测定试剂盒来测量(Weng,Z.,Patel,A.B.,Panagiotidou,S.,and Theoharides,T.C.(2015).The novel flavonetetramethoxyluteolin is a potent inhibitor of human mast cells.J Allergy ClinImmunol 135(4),1044-1052)。一种商购可得的用于测量ATP水平的试剂盒是来自PromegaCorporation的可得的
在其它实施方案中，肠上皮细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的在模型中的转运分子活性来确定。在其它实施方案中，转运分子活性是至少一种大分子的排泄和/或摄取。在其它实施方案中，大分子是胶原蛋白。
在其它实施方案中，上皮细胞的存活力或功能性通过鉴定与对照相比的上皮细胞的再生来确定。在一个实施方案中，再生通过视觉上检查上皮细胞并鉴定存活的细胞的数目的增加来鉴定。
在其它实施方案中，上皮细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的肠组织模型的跨上皮电阻(TEER)或被动渗透率来确定
在其它实施方案中，肠上皮细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的以下来确定：离子交换的改变、pH的改变、酸/碱平衡的改变、屏障功能的改变或在生理学中的改变、在病理学中的改变、分子的转运的改变、钠-葡萄糖共转运蛋白-1(SGLT1)活性的改变、间质纤维化组织的量或肠组织模型的再生。
在其它实施方案中，肠上皮细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的肠纤维化组织的量来确定。在一些实施方案中，肠纤维化组织使用三色或阿尔新蓝/PAS纤维化测量、胶原蛋白III免疫组织化学、天狼星红(Sirius Red)染色或另一种类型的测定来测量(Farris A.B.,Adams C.D.,Brousaides N.,Della Pelle P.A.,Collins A.B.,MoradiE.,Smith R.N.,Grimm P.C.,和Colvin R.B.(2011).Morphometric and visualevaluation of fibrosis in renal biopsies.J Am Soc Nephrol 22(1),176-86)。在一些实施方案中，肠上皮细胞的存活力或功能性随时间来测量。
在一些实施方案中，肠组织模型首先与潜在毒性剂接触并且然后与候选治疗剂接触。在其它实施方案中，肠组织模型首先与候选治疗剂接触并且然后与潜在毒性剂接触。在一些实施方案中，肠组织模型在与候选治疗剂和潜在毒性剂接触前已经在细胞培养基中培养。在一些实施方案中，肠组织模型已经在细胞培养基中培养至少3天。
还提供了评价剂对肠功能的影响的方法，该方法包括使该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触和测量该剂对肠功能、肠上皮细胞的存活力或功能性的影响。在一些实施方案中，三维工程化生物打印的生物肠组织模型包含肌成纤维细胞组织层；和上皮组织层，上皮组织包含肠上皮细胞；条件是肌成纤维细胞组织包含生物墨，则上皮组织包含上皮生物墨，并且形成三维工程化生物肠组织模型。
还提供了评价潜在毒性剂对肠功能的影响的方法，该方法包括：
(a)使该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量该剂对肠组织模型细胞的存活力或功能性的影响。
在一些实施方案中，提供了逆转或降低毒性剂所致的损伤的方法，并且使肠组织模型首先与毒性剂接触，并且然后去除潜在毒性剂。
还提供了评价剂的肠吸收的动力学的方法，该方法包括：
(a)使该剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)通过肠组织模型测量吸收的动力学。
还提供了预测候选治疗剂的有效给药浓度和给药方案的方法，该方法包括：
(a)使不同浓度或量的剂与三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量该剂对肠组织模型细胞的存活力或功能性随时间的影响；和
(c)测量肠组织模型细胞随时间的恢复，以确定提供效力的剂量之间的最小定时。
在一些实施方案中，该方法还包括：
(d)去除该剂；和
(e)评价该剂的不存在是否引起改善的肠组织模型的存活力或功能性。
本文公开内容包括商业方法。在一些实施方案中，本文公开的技术和方法的速度和可扩展性被用于设计、构建和操作用于生产用于在用于研究和开发的基于细胞的工具(诸如体外测定)中使用的肠组织模型的工业和/或商业设备。在另外的实施方案中，肠组织模型和其阵列作为，例如，用于生物测定和高通量药物筛选的细胞阵列(例如，微阵列或芯片)、组织阵列(例如，微阵列或芯片)和试剂盒被生产、储存、分销、营销、广告和销售。在其它实施方案中，工程化肠组织模型和其阵列作为服务被生产和用于进行生物测定和/或药物筛选。
验证
理想的工程化肠组织模型是完全人类和多细胞的，包含肠上皮细胞和肠肌成纤维细胞、和任选地另外的细胞诸如髓样细胞。此外，工程化肠组织表现出以下一个或更多个特征：
·正确的组织结构，如通过H&E染色显示出双层状结构证明的。
·对于以下的免疫组织化学：上皮细胞标志物(CK19)、肌成纤维细胞标志物(波形蛋白)和髓样细胞标志物(CD14、CD68和CD206)以及被掺入到组织中的任何其它特化的细胞类型(诸如淋巴样免疫细胞(CD4、CD8、CD19等)、内皮细胞(CD31)或神经元)的标志物。
·屏障功能，如通过基于孔的TEER研究和/或通过萤光黄的渗透率/吸收证明的。
·细胞因子产生(例如，IL-1、IL-6和TNFα，例如通过ELISA测量的)。
·上皮紧密连接形成(例如E-钙黏蛋白，ZO-1)、刷状缘形成(绒毛蛋白)、关键转运蛋白表达(例如P-gp/MDR1、BCRP)和基底膜形成(例如胶原蛋白IV)。
·转运蛋白/代谢酶活性(例如：P-gp和CYP3A4)。
·刺激(例如，用LPS)后诱导型细胞因子产生。
·在培养物中的可持续性和存活力(例如组织学、MTT或Alamar Blue)。
·黏液产生(例如MUC2，例如通过ELISA)、杯状细胞的存在。
·内分泌肽分泌(例如，GLP-1、PYY、CCK)、肠内分泌细胞的存在。
·脂质吸收/转运(例如乳糜微粒分泌，apoB-48，例如，通过ELISA)、甘油三酯合成(例如13C油酸酯，D2O)。
·除了分化和迁移外，通过等分/切割/穿孔/用化学损伤剂处理的纤维化瘢痕形成，通过免疫组织化学(IHC)染色鉴定的(例如CK19、波形蛋白)。
·响应于促纤维化刺激物诸如TGF-β或其它纤维化化合物的诱导型胶原蛋白或其它纤维化ECM产生(例如组织学和基因表达)。
·炎症(急性(例如，肠炎)或慢性(例如，IBD))的诱导。炎性刺激可以包括细胞因子(例如，IL-17)、细菌组分或产物、产生伤口的化学破坏(例如，右旋糖酐硫酸钠)、物理破坏(例如，切割、等分、磨损、刮擦、刺破)、TLR激动剂(例如LPS、RNA、咪喹莫特)或化学品(例如，使用2,4,6-三硝基苯磺酸以诱导IBD的模型)。
·细胞因子(例如，IL-8、TNF-α、IL-4、IL-19、IL-13、IL-17、IFN-γ)、抗菌肽(例如，β防御素、溶菌酶、slgA)和内分泌产物(例如，生长抑素)的释放。
·炎症途径的活化(例如，JAK/STAT、NFκB)。
·响应于炎症响应的屏障破坏(例如，通过组织学、TEER、萤光黄)。
·响应于炎性刺激物的在黏液分泌/基因调控/杯状细胞的损失中的改变。
·增殖/凋亡(例如，通过检测胱天蛋白酶8或通过检测DNA片段化的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(Tunel))。
·响应于刺激的标志物和受体(TLR、Myd99、HNF4α、MLCK、Muc2或TFF3)的上调。
在一些实施方案中，与已经被在培养物中维持长于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天或1周、2周、3周或4周的2D共培养物或组织外植体相比，本公开内容的肠模型显示出增加的特定功能。在一些实施方案中，与已经被在培养物中维持长于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天或1周、2周、3周或4周的2D共培养物或组织外植体相比，本公开内容的肠组织模型显示出2倍的增加的特定功能。在一些实施方案中，与已经被在培养物中维持长于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天或1周、2周、3周或4周的2D共培养物或组织外植体相比，本公开内容的肠组织模型显示出5倍或更多的增加的特定功能。在一些实施方案中，与已经被在培养物中维持长于14天或更多天的2D共培养物或组织外植体相比，本公开内容的肠组织模型显示出2倍或更多的增加的特定功能。在一些实施方案中，与已经在培养物中被维持长于>14天的2D共培养物或组织外植体相比，本公开内容的肠组织模型显示出5倍或更多的增加的特定功能。在一些实施方案中，与已经在培养物中被维持长于14天或更多天的2D共培养物或组织外植体相比，本公开内容的肠组织模型显示出2倍或更多的增加的特定功能。在一些实施方案中，与已经在培养物中被维持长于14天或更多天的2D共培养物或组织外植体相比，本公开内容的肠组织模型显示出5倍或更多的增加的特定功能。
实施例
以下说明性实施例代表本文描述的软件应用、系统和方法的实施方案，并且不意指以任何方式是限制的。
实施例1
手动地创建的三维肠组织模型
人类肠组织是用人类原代肠细胞和肠细胞系通过使用包含明胶的间质生物墨的连续沉积和上皮悬浮液的手动的沉积制备的。
生物墨是通过2千万个细胞/毫升的浓度的在8％明胶中的100％成人原代肠肌成纤维细胞(IMF)的细胞混合物产生的。三维生物墨构建体是通过使用Novogen MMX的连续沉积打印的。在24孔板中，每个transwell打印一个组织。transwell打印表面包含聚四氟乙烯(PTFE)膜，所述聚四氟乙烯(PTFE)膜用I型和III型胶原蛋白(牛)的等摩尔混合物包被，具有3μm尺寸的孔。打印后，组织被允许在生长培养基中在加湿的培养箱中成熟4天。将组织在100％IMF培养基中培养并且每天更换培养基。孵育后，将间质组织构建体从培养箱中取出并且放置在BSC罩中。将培养基吸出(aspirated)，然后立即施加上皮细胞。上皮细胞以75％Caco-2细胞和25％STC-1细胞的细胞悬浮液混合物添加。Caco-2细胞是人类结肠直肠腺癌上皮细胞系。STC-1细胞是小鼠肠内分泌肠细胞系。在一些孔中，上皮细胞未被添加至打印的IMF层，并且这些孔被用作对照用于比较研究。在一些孔中，将上皮细胞添加至不具有IMF层的空transwell作为另外的2D对照。沉积后，将培养基添加至transwell篮(transwell basket)的外部区域。每天更换培养基持续高达18天。完全培养时间段是IMF间质组织孵育的4天加上添加上皮细胞后的4天、7天或14天。从而，将实验标记成第4天、第7天和第14天，其分别地对应于完全培养时间的第8天、第11天和第18天。
在添加上皮细胞后4天、7天和14天进行实验时间进程研究。测量组织向上清液中的GLP-1分泌。还通过TEER或萤光黄(非裂解测定)在多个时间点测量组织的屏障功能。孵育后，将组织在多聚甲醛(PFA)中固定用于组织学或将组织裂解用于提取RNA。
结果
生物打印的肠组织构建体在静态培养基条件中孵育后维持黏性结构(cohesivestructure)并且实现双层状结构。将组织垂直于transwell的平面横切，以显示出间质层和上皮层。出乎意料的发现是，在3D组织的培养物中，Caco-2上皮层的厚度随时间增加，并且这在所研究的时间段中在Caco-2上皮细胞的2D单层培养物中未被观察到。数据表明在打印的间质肌成纤维细胞层和上皮层之间的通讯(cross talk)，该通讯指导组织上皮的分化和二级结构形成。该数据表明，打印的间质层是组织增厚和二级结构形成所需要的。此外，数据表明适当的二级结构形成既不需要流动条件，也不需要机械刺激(图1A-1B)。
组织表达正常天然肠组织的标志物。H&E染色显示出上皮层随时间增厚，同时波形蛋白+肌成纤维细胞和CK19+上皮细胞的双层状结构被维持(图2A)。每一层表达正确的标志物，基底层通过在IMF层的胶原蛋白IV和在上皮层的E-钙黏蛋白染色，指示紧密连接的存在。紧密连接的存在是关键发现，其指示在上皮内屏障正在形成。在培养物中在早期观察到上皮细胞的正确极化(通过绒毛蛋白的顶端染色显示出的)，其中当组织随时间增厚时存在一些解体。极化的上皮也是关键发现，其表明当组织成熟时细胞正在空间上组织(图2B-2F)。PCNA染色证明了组织在培养物中是高度存活的并且正在增殖。对这些组织进行MUC2和阿尔新蓝/PAS染色，指示这些组织不表达黏蛋白，这是预期到的，因为Caco-2细胞不产生黏液是已知的(图3A-3C)。
SV40 T抗原被用于鉴定STC-1细胞，并且显示出在早期时间点与Caco-2细胞的聚集和分离，随后在后期时间点侵袭到间质中。3D系统允许可视化STC-1细胞行为，这在2D共培养物中是不可能的，并且表明STC-1细胞呈现类似于它们所初始分离自的肿瘤组织的表型。这表明该模型系统可以被用于研究肿瘤细胞与健康组织微环境的相互作用，包括评价对肿瘤生长和侵袭/转移的影响。虽然与天然组织或原代上皮细胞相比，两种细胞系都可以具有不自然地高的生长率，但观察到Caco-2细胞在培养物中随时间在上皮层中占优势(图3A-3C)。
生物打印的组织发育出屏障，如通过TEER和萤光黄测量的。如从关于Caco-2细胞的历史文献预期的，在Caco-2/STC-1 2D单层培养物中的屏障形成是不自然地高的。关键发现是在3D组织中屏障功能是在生理学范围内，表明3D环境比2D单层在生理学上是更相关的并且可以产生更类似天然的组织。也要注意到，TEER和渗透率数据跨多个实验是可重复的，突显了生物打印的方法的可重复性(图4、5和6A-6B)。
生物打印的组织在添加上皮层后7天产生GLP-1。这表明STC-1细胞存在于组织中且是有功能的，因为已知单独的Caco-2细胞不能够产生GLP-1。3D组织在相同的时间点比2D单层产生更多的GLP-1。该发现是出乎意料的，并且可以再次支持3D环境对细胞行为的有益影响。它也可以反映3D组织的增加的厚度和随着其在培养物中成熟存在于3D上皮中的细胞的潜在地增加的数目。(图7)
3D Caco-2组织以类似于2D单层的模式表达关键转运蛋白，如通过qPCR显示的。在所研究的不同时间点，模式可能不同，但数据共同显示出，2D和三维组织二者在类似的范围内表达相同的标志物。组织学指示，在3D组织中，P-gp可能被更加上调，其是未出乎意料的发现。也对上皮的顶端侧进行P-gp染色，再次支持类似于天然组织的上皮细胞的适当极化和顶端流出转运蛋白的适当定位。(图8和9A-9B)。
实施例2
生物打印的三维肠组织模型
人类肠组织构建体是用100％成人原代肠细胞生物通过使用包含胶原蛋白的间质生物墨的连续沉积随后是上皮悬浮液的沉积打印制备的。
生物墨是通过2千万个细胞/毫升的浓度的在100％牛I型胶原蛋白中的100％成人原代肠肌成纤维细胞(IMF)的细胞混合物产生的。三维生物墨构建体是通过使用NovogenMMX在基底层中连续沉积打印的，以创建间质结构。在24孔板中，每个transwell打印一个组织。transwell打印表面包含聚四氟乙烯(PTFE)膜，所述聚四氟乙烯(PTFE)膜用I型和III型胶原蛋白(牛)的等摩尔混合物包被，具有3μm尺寸的孔。打印后，组织被允许在100％IMF培养基中在加湿的37℃培养箱中成熟4天并且每天更换培养基。孵育后，将间质组织构建体从培养箱取出，并且放置在BSC罩中。将培养基吸出，然后立即施加上皮细胞。上皮细胞以100％成人原代肠上皮细胞的细胞悬浮液分散到打印的间质层上。使用的培养基包含100％原代肠上皮细胞生长培养基。在一些孔中，上皮细胞未被添加至打印的IMF层，并且这些孔被用作对照用于比较研究。沉积后，将培养基添加至transwell篮的外部区域。每24-28小时更换培养基持续高达21天。完全培养时间段是IMF间质组织孵育的4天加上添加上皮细胞后的9天、10天或17天。从而，将实验标记成第9天、第10天和第17天，其分别地对应于完全培养时间的第13天、第14天和第21天。
在添加上皮细胞后0天、9天、10天和17天进行实验时间进程研究。在第10天和第17天，测量组织向上清液中的GLP-1分泌。还通过TEER或萤光黄(非裂解测定)在多个时间点测量组织的屏障功能。孵育后，将组织在多聚甲醛(PFA)中固定用于组织学或将组织裂解用于提取RNA。
结果
生物打印的肠组织在培养基中孵育后维持黏性结构并且实现双层状结构。将组织垂直于transwell的平面横切，以显示出间质层和上皮层(图10)。关键的发现是，在间质和上皮二者中仅用原代肠细胞打印的组织表现出类似于天然组织的正确的结构和表达模式。紧密连接指示上皮细胞形成屏障。上皮细胞层是有组织的且极化的，绒毛蛋白的清晰顶端染色表明形成刷状缘。关键的发现是3D组织在整个17天的培养时间段中是存活的(PCNA染色)。组织还以正确的顶端表达模式表达P-gp和BCRP，P-gp和BCRP是流出转运蛋白。同样重要的是指出该层状结构与体外培养原代肠上皮细胞的替代非生物打印的方法形成对比，体外培养原代肠上皮细胞的替代非生物打印的方法产生圆形聚集物，其中上皮细胞向内地朝向中央(肠类器官)定向。在圆形的构造中，顶端表面不被暴露并且不能够被用于化合物的直接刺激，其也不允许从肠壁的顶端和基底外侧二者收集样品，这是对于吸收/渗透率评价所需要的。(图11A-11D)
组织的明场成像显示出在上皮表面上形成二级绒毛样结构。这是重要的，因为它支持生物打印的组织的整体形态学类似于天然组织。这也在培养的第9天被观察到，指示通过生物打印提供的3D环境可以增强组织分化。(图11A和11C)。
组织显示出内分泌细胞的标志物嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性细胞的存在。该发现是重要的，因为它证明了在天然组织中通常发现的特化的上皮细胞类型的存在也可以在具有原代肠上皮细胞的生物打印的组织中被发现。这是关键的发现，因为它表明干细胞群可以存在于原代上皮细胞中并且该群能够在3D组织环境中分化。这是关键的发现，也因为单独的Caco-2细胞不具有内分泌功能或CHGA阳性细胞。(图11A和11C)。
用原代肠上皮细胞制备的3D组织产生黏液和顶端刷状缘。该发现突显了一个事实，即生物打印的肠组织以类似于天然组织的方式组织和起作用。这是关键的发现，因为金标准Caco-2组织不产生黏液并且因此不能够被用作用于黏膜屏障的模型。杯状细胞存在。这是关键的，因为Caco-2细胞不具有杯状细胞或杯状样细胞。它再次表明干细胞群可以存在于原代上皮细胞中并且该群能够分化。此外，通过修改打印方法和培养条件指导该分化也可以是可能的。(图12)。
生物打印的组织表达关键的转运蛋白和代谢酶CYP3A4。基因表达分析显示出在9天培养时间段中随着组织成熟，所有测试的标志物被上调，再次支持组织在培养物中是存活的。表达值相对于上皮特异性标志物CK19的归一化，显示出表达的上调对上皮细胞是特异性的，类似于天然组织。生物学重复(n＝3)的分离(Separation of biologicalreplicates)也突显了在生物打印的组织之间的可重复性。(图13A-13B)。
在原代肠上皮细胞中的转运蛋白和代谢酶表达比3D Caco-2组织高得多并且因此优于3D Caco-2组织。用原代肠上皮细胞制备的组织的非常重要的区别是关键的P450代谢酶CYP3A4表达在原代IEC中是非常高的并且在Caco-2组织中完全缺乏。CYP3A4活性是用于研究药物代谢的关键代谢酶。众所周知，Caco-2细胞由于其缺乏CYP3A4表达而不能够被用作研究CYP3A4活性的体外模型。该数据突显了生物打印的肠组织构建体优于常规体外模型的关键优点。(图14)。
肠干细胞标志物LGR5在第0天(当添加上皮细胞时)被表达，表明原代肠上皮细胞群包含干细胞亚群。干细胞标志物LGR5的表达在培养物中随时间减少，而包括肠内分泌细胞(CHGA)和杯状细胞(MUC2)的特化的上皮细胞的标志物增加。这表明干细胞在上皮中存在并且正常分化，而组织在培养物中成熟以产生特化的细胞类型。原代肠内分泌细胞和原代杯状细胞是非商购可得的。这使该发现是重要的，因为它告诉我们，我们可以产生包含天然细胞类型的3D组织并且还可以潜在地驱动组织向特定细胞类型的分化以实现特定表型。再次，数据突显了生物打印的肠组织优于常规体外模型的关键优点。(图15)。
实施例3
包含肠内分泌细胞的生物打印的三维肠组织模型
人类肠组织构建体是用成人原代肠细胞和小鼠肠内分泌细胞系STC-1通过使用包含胶原蛋白的间质生物墨的连续沉积和上皮悬浮液的手动沉积制备的。
间质层是以与实施例2相同的方式产生的。生物墨是通过2千万个细胞/毫升的浓度的在牛I型胶原蛋白中的100％成人原代肠肌成纤维细胞(IMF)的细胞混合物产生的。三维生物墨构建体是通过使用Novogen MMX 在基底层中连续沉积打印的，以创建间质结构。在24孔板中，每个transwell打印一个组织。transwell打印表面包含聚四氟乙烯(PTFE)膜，所述聚四氟乙烯(PTFE)膜用I型和III型胶原蛋白(牛)的等摩尔混合物包被，具有3μm尺寸的孔。打印后，组织被允许在加湿的37℃培养箱中成熟4天。将组织在100％IMF培养基中培养并且每天更换培养基。孵育后，将间质组织构建体从培养箱中取出，并且放置在BSC罩中。将培养基吸出，然后立即施加上皮细胞。上皮细胞以99％成人原代肠上皮细胞和1％小鼠STC-1细胞的细胞悬浮液混合物手动地分散到打印的间质层上。在一些孔中，上皮细胞未被添加至打印的IMF层，并且这些孔被用作对照用于比较研究。在其它对照孔中，将100％STC-1细胞添加到不具有原代肠上皮细胞的上皮中。沉积后，将培养基添加至transwell篮的外部区域。每24-48小时更换培养基持续高达21天。完全培养时间段是IMF间质组织孵育的4天加上添加上皮细胞后的9天、10天或17天。从而，将实验标记成第9天、第10天和第17天，其分别地对应于完全培养时间的第13天、第14天和第21天。
在添加上皮细胞后0天、9天、10天和17天进行实验时间进程研究。在第10天和第17天，测量组织向上清液中的GLP-1分泌。还通过TEER或萤光黄(非裂解测定)在多个时间点测量组织的屏障功能。孵育后，将组织在多聚甲醛(PFA)中固定用于组织学或将组织裂解用于提取RNA。
结果
当在原代上皮细胞不存在的情况下，单独的STC-1细胞被添加到生物打印的肌成纤维细胞间质层上面时形成厚层，表明3D环境可以给予它们聚集的信号(cues)。STC-1细胞不具有上皮表型，因为它们不表达上皮标志物CK19并且它们也不形成紧密连接。当与原代肠上皮细胞组合时，它们未均匀地掺入到上皮中而是形成侵袭间质层的聚集物。3D系统的益处是它允许我们观察该STC-1细胞功能。此外，这表明该模型系统可以被用于研究肿瘤细胞与健康组织微环境的相互作用，包括评价对肿瘤生长和侵袭/转移的影响。聚集物形成和侵袭在2D单层共培养物中不能够被可视化。(图16A-16B)。
用在上皮中的1％STC-1和99％原代肠上皮细胞制备的生物打印的肠组织在组织学组中表现得类似于100％原代肠上皮细胞打印的组织。尽管STC-1细胞具有异常行为，但类似的双层状结构、表达模式、存活力和黏膜屏障染色都可以被观察到。与实施例2相比，在实施例3中数据的相似性突显了3D生物打印的肠组织构建体表型的可重复性和模型的稳健性。(图16A-16B和17A-17B)。
GLP-1分泌以基础水平在3D打印的组织中被检测到。如预期的，GLP-1分泌通过STC-1细胞的存在加强。如预期的，分泌通过用已知的GLP-1刺激物(包括葡萄糖、毛喉素和IBMX)的混合物刺激进一步被加强。出乎意料的是，单独的原代肠上皮细胞可以产生GLP-1。这表明肠内分泌细胞不仅存在而且是有功能的，并且这支持组织学染色，该组织学染色显示出在组织上皮中的CHGA阳性细胞。还出乎意料的是，来自原代细胞的GLP-1分泌也可以在STC-1细胞不存在的情况下被刺激。这指示肠内分泌细胞存在于具有原代肠上皮细胞的组织中，它们是有功能的，并且该功能是诱导型的。(图18A-18B)。
在用原代肠上皮细胞制备的组织中还显示出屏障功能。屏障功能通过TEER和萤光黄渗透率二者测量。重要的是注意到，在该模型中屏障形成需要原代肠上皮细胞(原代肠上皮细胞对于细胞角蛋白18染色将是阳性的)的存在。数据显示出单独的间质层(IMF)不形成屏障，并且STC-1细胞不形成屏障。将1％STC-1细胞掺入到原代上皮细胞中不破坏屏障，但可以增加组织的可变性。该数据与组织学上显示出的E-钙黏蛋白染色是一致的。E-钙黏蛋白是紧密连接标志物并且是屏障形成所需要的，并且仅存在于具有原代肠上皮细胞的组织中。(图19A-19C)。
在Taqman阵列卡中的基因表达组显示出关键基因存在于培养物中并且在17天时间过程中当组织成熟时被诱导并且分化。将基因表达模式通过生物学重复以热图成簇，指示组织是高度可重复的(n＝3个生物学重复/组)。对2个单独的实验进行比较：一个仅具有原代肠上皮细胞，一个具有原代肠上皮细胞和1％STC-1细胞二者，并且显示出类似的趋势。这指示实验结果在实验之间是可重复的，再次支持生物打印的肠组织的可重复性。
Taqman阵列显示出关键的转运蛋白、I相和II相代谢酶、脂质生物学标志物和肠内分泌标志物存在并且被上调。同样，重要的是注意到，关键的转运蛋白和代谢酶CYP3A4的表达在用原代细胞制备的组织中优于用Caco-2细胞制备的那些组织中的。随着组织在培养物中成熟，它们高度表达并增加。同样重要的是注意到，关键的内分泌基因存在于缺乏STC-1细胞的组织中并且在培养物中随时间增加。内分泌基因再次支持肠内分泌细胞在原代肠上皮细胞中的存在并且这些细胞除了先前证明的GLP-1分泌外可以能够具有多种功能，包括CCK、PYY和SST分泌。(图20A-20E)。
代谢酶CYP3A4不仅被表达，而且酶促功能持续至少17天的时间段。该有功能的活性是关键且出乎意料的发现，因为它不仅显示出组织代谢能力持续大于2周，而且突显了用目前的金标准Caco-2模型无法实现的终点(Caco-2组织缺乏CYP3A4表达)。此外，已知在天然肠中刺激(利福平)和抑制(酮康唑)CYP3A4活性的良好确定的药物在3D生物打印的肠组织模型中也以类似的方式起作用。Caco-2细胞不能够表现出药物诱导的CYP3A4活性。此外，在没有液体流动或机械刺激的存在的情况下，出乎意料地观察到该CYP3A4功能持续大于14天，表明液体流动或机械刺激都不是重现在肠组织中的生理学功能需要的。MDCK细胞系通常被用作用于药物代谢研究的体外替代物(surrogate)，但MDCK细胞系是犬科动物肾细胞，并且因此是完全不同的系统。(图21A-21B)。
实施例4
生物打印的三维肠组织模型。
人类肠组织构建体是通过使用包含胶原蛋白的间质生物墨的连续沉积随后是上皮悬浮液的沉积，用100％成人原代肠细胞生物打印制备的。
生物墨是通过2千万个细胞/毫升(20M/mL)的浓度的在100％牛I型胶原蛋白中的100％成人原代肠肌成纤维细胞(IMF)的细胞混合物产生的。三维生物墨构建体是通过使用Novogen MMX在基底层中连续沉积打印的，以创建间质结构。在24孔板中，每个transwell打印一个组织。transwell打印表面包含聚四氟乙烯(PTFE)膜，所述聚四氟乙烯(PTFE)膜用I型和III型胶原蛋白(牛)的等摩尔混合物包被，具有3μm尺寸的孔。打印后，组织被允许在100％IMF培养基中在加湿的37℃培养箱中成熟4天并且每天更换培养基。孵育后，将间质组织构建体从培养箱中取出，并且放置在BSC罩中。将培养基吸出，然后立即施加上皮细胞。上皮细胞以100％成人原代肠上皮细胞的细胞悬浮液分散到打印的间质层上。使用的培养基包含100％原代肠上皮细胞生长培养基。在一些孔中，上皮细胞未被添加至打印的IMF层，并且这些孔被用作对照用于比较研究。沉积后，然后将组织在包含具有补充物的改良的DMEM/F12(Advanced DMEM/F12)(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的3D肠培养基中培养。每天更换培养基，持续高达21天。
为了显示出生物打印的三维肠组织模型优于Caco-2单层的技术进步，还进行Caco-2单层研究。简而言之，将细胞以30,000个细胞/cm2/孔接种到标准24孔可渗透支持物上，并且在具有L-谷氨酰胺(Gibco,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)+10％FBS(VWR,Radnor,PA)的DMEM中在空气-液体界面培养，每48小时更换培养基。使单层生长持续21天，然后适于TEER使用(785±56Ω*cm2)。
实施例4的3D生物打印的人类肠组织的组织学表征。
组织学表征证明了，具有绒毛蛋白的顶端表达、紧密连接形成的极化的上皮细胞和特化的上皮细胞类型(包括杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞)的存在。实施例4的3D生物打印的肠组织被设计成具有双层状结构，由人类肠肌成纤维细胞(IMF)、人类肠上皮细胞(hIEC)组成，人类肠肌成纤维细胞(IMF)支持包含人类肠上皮细胞(hIEC)的上皮层。将3D生物打印的肠组织以层状结构制备在transwell插入物上(图22A)以能够接近顶端表面和基底外侧表面二者用于直接化合物测试，并且在17天培养时间段中进行组织学分析。在第17天，组织表现出极化的柱状上皮形态学和二级结构形成(图22B)。上皮和间质组织区室保持不同，上皮细胞特异性标志物CK19的正确表达局限于上皮层，并且肌成纤维细胞标志物波形蛋白局限于间质(图22C)。紧密连接标志物E-钙黏蛋白(参与屏障功能的关键蛋白)在hIEC层的上皮细胞之间均匀地表达(图22D)。通过针对在顶端表面处的刷状缘蛋白绒毛蛋白的阳性染色观察到hIEC的正确的极化和刷状缘形成(图22E)。过碘酸希夫(PAS)/阿尔新蓝染色确认了顶端刷状缘并且表明了杯状细胞的亚群的存在以及黏液的排泄(图22F)。针对黏蛋白-2的免疫组织化学确认了杯状细胞和黏液分泌的存在，杯状细胞和黏液分泌的存在是指示正常肠功能的特征。培养物中黏液截留的细胞在正常细胞更新期间从上皮脱落，引起组织学上观察到的细胞碎片(图22G)。除杯状细胞外，在3D生物打印的肠组织模型的上皮层中存在对多种生物学刺激物的许多响应关键的肠上皮的其它特化的细胞类型，包括溶菌酶阳性潘氏细胞和表达嗜铬粒蛋白的肠内分泌细胞(图22H-22I)。组织结构和关键细胞标志物的表达在培养物中维持大于两周，在分析的第10天和第17天时间点具有一致的表达模式，表明该模型可以适于扩展的化合物研究。
与Caco-2单层培养物相比，3D生物打印的肠组织更厚，并且在上皮中包含在单层中不存在的二级结构形成。尽管Caco-2细胞表现得柱比3D生物打印的肠组织的上皮细胞更少，但它们表达E-钙黏蛋白和绒毛蛋白，确认了紧密连接形成和极化的上皮表型。然而，与3D生物打印的肠组织相比，在Caco-2单层中不存在特化的细胞的亚群和黏液产生的证据(图29)。
实施例4的3D生物打印的人类肠组织的基因表达的表征。
基因表达分析被用于进一步评价在17天培养时间段中在3D生物打印的肠组织中关键肠上皮组织标志物、代谢酶和转运蛋白的表达，并且与天然供体肠组织和标准Caco-2单层二者进行比较(图23)。为了具体地研究在上皮中的差异表达和去除在总细胞数目中的任何变化，相对于上皮特异性标志物CK19的表达分析基因。紧密连接标志物E-钙黏蛋白(CDH1)在所有样品中高度表达。尽管在3D肠组织和天然组织中水平是相当的，但在Caco-2单层中的E-钙黏蛋白表达是不自然地高的。在组织学发现的支持中，特化的细胞亚群(包括潘氏细胞(LYZ)和肠内分泌细胞(CHGA))的标志物存在于3D生物打印的肠组织中，并且与天然供体组织是相当的，而Caco-2单层缺乏它们的表达。尽管通过免疫组织化学方法在3D生物打印的肠组织中鉴定出黏蛋白-2细胞(图22G)，但是与天然肠相比基因表达被减少。在生物打印的组织中的大多数基因表达值是在供体肠组织的2倍内。参与药物代谢和处置的关键异生物质活化的核受体，包括VDR、PXR(NR1I2)和CXR(NR1I3)也在3D生物打印的肠组织中表达，并且在与天然肠相当的水平。相比之下，Caco-2表现出异常高的VDR表达和低的NR1I2表达(图23A)。
在3D生物打印的肠组织中检测到主要肠I相P450代谢酶包括CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP2J2。临床上重要的CYP3A4在3D生物打印的肠模型中以类似于天然组织的水平高度表达，而在Caco-2单层中不存在该表达。CES2(参与水解的主要生物转化酶)在天然肠和3D肠组织二者中也高度表达，但在Caco-2单层中水平低得多。关键肠II相代谢酶GSTP1和UGT1A1以及脂肪酸代谢的转录物，包括DGAT1、MOGAT2和MTTP被3D生物打印的肠组织表达(图23B)。肠流出和摄取转运蛋白可以是药物-药物相互作用的两个位点和药物吸收的限制因素。主要流出转运蛋白P-gp(ABCB1、MDR1)和BCRP(ABCG 2)和关键摄取转运蛋白PEPT1(SLC15A1)和OAP2B1(SLCO2B1)在3D生物打印的肠组织中以与天然肠相当的水平表达(图23C)。肠胆汁酸相关的转运蛋白ASBT(SLC10A2)、OSTa(SLC51A)和OSTb(SLC51B)也被检测到。有趣地，在Caco-2单层中，所分析的许多重要的代谢酶和转运蛋白被降低、过表达或不存在，表明生物打印的模型比Caco-2单层更接近于正常组织功能。
实施例4的3D生物打印的人类肠组织的屏障功能的表征。
实施例4的3D生物打印的肠组织发育出生理学屏障功能，并且正确地区分了高渗透率化合物和低渗透率化合物。肠是选择性可渗透屏障，调控营养物和异生物质二者的吸收。跨上皮电阻(TEER)被用于在21天培养时间段中测量在3D生物打印的肠组织中的屏障功能。测量证明了，在培养的第10天和第21天之间，组织发育出并且维持屏障功能，表现出在与正常人类肠功能相当的生理学范围(50-100Ω*cm2)内的值[20](图24A)。相比之下，Caco-2单层显示出大得多的TEER测量(785±56Ω*cm2)，该值显著地比正常人类组织功能更高。
具有高渗透率和低渗透率的代表性化合物被用于进一步验证3D生物打印的肠组织屏障功能(图24B)。细胞旁转运(paracellular transport)标志物萤光黄正确地显示出低渗透率，表明用于药物转运的完整的物理屏障的存在。3D生物打印的肠组织正确地区分了低渗透率米托蒽醌(ABCG2(BCRP)流出转运蛋白的原型底物)和更高渗透率普萘洛尔(被动跨细胞转运参考化合物)。
实施例4的3D生物打印的肠组织模型中的转运蛋白定位和功能。
免疫组织化学染色被用于确认在顶端表面处的关键流出转运蛋白P-gp(ABCB1、MDR1)和BCRP(ABCG2)的正确极化的表达模式。染色证明了，类似于天然组织，表达跨顶端表面是连续的，而在Caco-2细胞中的顶端表达出现在跨单层的斑块中(图25A-25B)。组织学染色还确认了类似于天然肠的3D生物打印的肠组织中正确的顶端MRP2和基底外侧MRP3表达模式。相比之下，Caco-2单层表现出过表达MRP2和MRP3转运蛋白，与基因表达数据一致(图31)。
评价双向转运使得能够预测化合物是否经历主动流出。在3D生物打印的肠组织模型中通过在具有和不具有抑制的情况下测量双向转运来测试P-gp和BCRP功能(图25C)。在对照条件下，观察到P-gp底物地高辛的不对称渗透率，其中流出比大于2。Zosuquidar对P-gp的抑制减少了B至A转运的速率，将流出比降低至1.2，并且确认了3D生物打印的肠组织中的P-gp的活性。BCRP功能通过拓扑替康(图25D)和米托蒽醌(图30)的流出来确认。BCRP/P-gp底物拓扑替康和BCRP底物米托蒽醌优先地在B至A方向上转运，流出比分别为8.8和129。此外，随后BCRP抑制剂Ko143对拓扑替康转运的抑制将流出比降低至3.6，并且用Ko143和Zosuquidar的双重抑制将流出比进一步减少至1.4。总之，这些结果证明3D生物打印的肠组织模型表达具有适当定位和功能的临床上相关的P-gp和BCRP转运蛋白。
实施例4的3D生物打印的肠组织模型中细胞色素P450代谢功能的证明。
基因表达分析鉴定了3D生物打印的肠组织中关键肠细胞色素P450酶CYP3A4和CYP2C9的表达(图23B)。对CYP3A4和CYP2C9进行功能的测定，以确认它们的活性和特异性(图26)。CYP2C9活性容易地通过发光P450底物转化在3D生物打印的肠组织中被检测到，并且可以被磺胺苯吡唑显著地抑制(图26A)。CYP3A4活性和被酮康唑的特异性抑制通过发光P450底物转化(图26B)和通过咪达唑仑代谢物形成(图26C)二者来确认。利福平处理与在处理的组织中咪达唑仑的显著更高的更新和PXR诱导型基因(包括CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5、P-gp和UGT1A1)的基因表达的显著上调相关，而上皮标志物基因CK19和ECAD保持稳定(图26D-26E)。对由三个单独的供体制备的三组单独的3D生物打印的肠组织的CYP3A4活性的比较，显示出尽管有预期的在基础CYP3A4活性中的个体间差异，但存在在供体之间酮康唑抑制和利福平诱导的一致性(图32)。
3D生物打印的肠组织(实施例4)作为用于胃肠毒性的模型的表征。
3D生物打印的肠模型用于化合物毒性应用的效用通过NSAID吲哚美辛被评价，NSAID吲哚美辛是通过肠细胞凋亡和坏死引起肠上皮屏障功能降低的前列腺素E2(PGE2)氧合酶抑制剂和已知的GI毒物。如通过响应于24小时处理的TEER测量的，3D生物打印的肠组织显示出屏障功能的剂量依赖性减少(图27A)。通过LDH释放检测到肠细胞损伤，并且在高于0.25mM的吲哚美辛剂量存在下，损伤被显著地增加(图27B)。在吲哚美辛存在下显示出的对前列腺素E2合成的抑制支持了已知的活性机制(图27C)。使用组织学分析(3D生物打印的肠组织模型的优点)确认了上皮层的破坏增加和E-钙黏蛋白的表达减少与增加的吲哚美辛给药相关并且与在屏障功能的损失一致(图27D)。
为了表征3D生物打印的肠模型对炎症的响应(通常与GI毒性以及慢性疾病状况相关)，将组织用高剂量的促炎细胞因子TNFα处理24小时并且评价形态学、LDH释放和基因表达的改变(图28)。用TNFα的处理改变了上皮形态学并且引起细胞从间质层解离。这伴随着在来自3D生物打印的肠组织的LDH释放的显著增加，表明细胞毒性响应和肠细胞死亡。COX-2、IL-8和TNFα的基因表达也被上调，证明炎症途径的活化。数据共同证明，3D生物打印的肠组织可以被用于体外检测和定量GI毒性的组织学和生物化学方面，包括屏障破坏和炎症。
3D生物打印的肠组织模型的优点
目前的临床前模型在其捕获人类肠组织的复杂性和功能的能力方面是有限的[1-5]。细胞单层缺乏细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用的天然环境，并且在表型上受限，而动物模型的遗传差异可能不提供与人类结果的高度相关性[16]。完全人类生物打印的人类3D肠组织模型是使用人类原代细胞工程化的并且能够重现肠生物学和功能的多个方面，以便弥合差距并解决与药物开发中的不良可预测性相关的转化挑战。生物打印平台允许这样自动化的方法，该自动化的方法可以通过空间上受控的细胞沉积可重复地产生多细胞3D生物打印的组织，以与传统的2D模型相比更好地模拟天然组织结构和功能[18,19]。3D复杂性允许通过标准生物化学方法以及组织学终点二者询问组织。3D生物打印的肠组织是具有层状结构的高度细胞结构，允许接近顶端区室和基底区室。
3D微环境促进在人类原代肌成纤维细胞和人类原代上皮细胞之间的通讯，以支持极化的上皮在17天培养时间段中发育和维持。组织学分析确认了上皮的正确极化，具有柱状上皮形态学、紧密连接和顶端刷状缘形成。组织学和基因表达分析还证明了在3D生物打印的肠组织中特化的细胞亚群的存在和黏液产生的证据，特化的细胞亚群和黏液产生在标准Caco-2单层中明显不存在。黏蛋白-2阳性杯状细胞的鉴定和黏蛋白染色连同潘氏细胞的存在表明，这些组织可以被用于表征肠生物学的另外的方面，包括黏膜屏障功能和抗微生物或微生物组功能。尽管黏蛋白-2基因表达与天然肠相比是减少的，但这可能是部分由于在转录水平的时间调控或可以通过改变培养条件调节的表型的差异[11]。嗜铬粒蛋白阳性细胞表明3D肠组织也可以被用于研究在肠中的肠内分泌功能，包括GLP-1信号传导。该数据指示，当在分离物中的干细胞群在类似于通过类器官细胞培养物实现的组合物的培养物中成熟时，它们可以在3D肠组织中分化[9,10,21]，并且可以能够通过修改培养条件经历定向分化[11]。尽管在该研究中使用成人原代细胞制备组织，但iPSC也可以被认为是促进实现更特化的表型的潜在替代细胞来源。然而，iPS来源的肠上皮细胞的成熟更接近于胎儿期表型[14]。
3D生物打印的组织的层状结构优于类器官系统的优点是与使用标准方法的屏障功能和定向转运评价的相容性。尽管类器官研究人员已经使用暴露类器官腔的方法，但是这些努力需要复杂的生物反应器设置[22]，并且可以产生具有非生理学TEER的单层[23,24]。在第10天在3D肠组织中通过TEER成功证实了生理学屏障功能，生理学屏障功能在整个21天培养时间段中被维持。3D肠组织具有与报道的成人肠上皮细胞的单层培养物一致的TEER值[25]，然而与天然肠相比人原代肠上皮单层可能遭受低CYP表达[26]。这可能是部分由于支持上皮和维持功能的其它相关的细胞类型如肠肌成纤维细胞的不存在。3D生物打印的肠组织在培养物中维持屏障功能超过两周。此外，组织可以成功区分低渗透率底物和高渗透率底物，诸如细胞旁标志物萤光黄和跨细胞标志物普萘洛尔。在培养物中在延长的时间中的功能性和区分化合物的能力可以使具有临床上相关的终点的急性研究和慢性研究二者实现。需要三周成熟时间段的Caco-2单层方案，表现出不自然地高的TEER值，这可能是部分由于观察到的升高的E-钙黏蛋白表达[20]。利用生理学TEER值的优点，具有人类肠上皮细胞的模型可以产生比Caco-2单层更好的与体内渗透率的相关性[25]。
肠流出和流入转运蛋白是吸收的关键介质(mediators)。基因表达分析和免疫组织化学确认在3D生物打印肠组织中肠转运蛋白的存在并且证明类似于天然供体组织的那些肠转运蛋白的表达水平。临床上相关的P-gp和BCRP(P-gp和BCRP是可以显著影响吸收的化合物的净级分(net fraction)的流出转运体[2,6])，分别响应于已知底物地高辛和拓扑替康在顶端上皮中正确表达并起作用。有功能的转运蛋白的表达表明，该系统可以被应用于评价流出转运蛋白对药物处置的相对贡献，或被用作用于通过靶向摄取转运蛋白(诸如PEPT1和OATP2B1)增加吸收的潜在模型。
使用广泛的基因的组(panel)比较3D生物打印的肠组织与天然肠和Caco-2细胞的表达。3D生物打印的肠组织与天然肠的酶和转运蛋白表达密切匹配，而与Caco-2单层是差异较大的，与先前的报道一致[7,26]。该差异可能是部分由于Caco-2细胞的癌症起源或所比较的组的起源的组织区域。已知关键代谢酶和转运蛋白的表达依据在胃肠道中的定位而不同[2,27]。天然肠组织和3D生物打印的肠模型二者来源于回肠而Caco-2细胞来源于结肠。3D生物打印的肠组织证明了基因(包括关键异生物质核受体VDR、PXR(NR1I2)和CAR(NR1I3))的表达以及在肠中的代谢所需要的细胞色素P450和II相酶的表达。CYP2C9和CYP3A4的活性测定确认酶是有功能的。3D生物打印的肠组织对利福平处理有响应，具有增加的CYP3A4的基因表达和活性二者，与PXR活化一致。重要的是注意到，CYP3A4和PXR二者在Caco-2单层中是无功能的或不存在的[8]。此外，3D模型的稳健性通过在由多个供体制备的组织中的咪达唑仑代谢来证明。供体比较显示出如预期的个体间差异[27]，其值类似于肠切片显示出的值[28]并且比2D系统报道的那些值高得多[8,26]。这些数据表明该模型用于药物诱导的代谢和转运蛋白研究的合适性，这是不能够通过先前的成人、胎儿或Caco-2单层实现的[8,26]。在3D生物打印的肠组织模型中转运蛋白和酶的双重存在表明3D生物打印的肠组织模型可以被用于阐明复杂的相互作用，诸如用重叠的P-gp/CYP3A4底物观察到的那些相互作用[29]。
胃肠毒性是药物开发中常见的临床不良事件，通常与腹泻的高发病率相关，是不能够用目前的体外模型或体内模型精确地预测或表征的结果[4,5,30]。NSAID吲哚美辛被用于成功验证3D生物打印的肠组织的毒性响应。组织以剂量依赖的方式响应，具有减少的TEER和增加的细胞破坏，与在屏障功能中的减少相关，类似于在体外结果[31]和体内结果[4]中报道的那些。3D生物打印的肠组织也对毒性炎性刺激物TNFα(一种临床靶[30])有响应，具有减少的屏障功能和上调的炎性基因，与先前的2D模型一致[32]。这些数据表明3D生物打印的肠模型可以被应用于筛选其它已知类别的化合物，诸如化学治疗剂[5]，其在肠中具有脱靶毒性并且合并长期存活力，指示该模型适于给药和恢复研究。此外，炎症标志物的上调表明，未来的应用可以包括模拟慢性疾病诸如炎性肠病(IBD)、克罗恩病和结肠炎[4,5,30]。另外的复杂性可以通过掺入免疫细胞和/或使用由患病供体分离的肠细胞来实现[13,24]。
总之，公开了新的体外3D生物打印的肠组织模型，与标准模型相比具有增加的复杂性和功能。完全人类3D生物打印的肠模型重现肠黏膜，具有生理学屏障功能和关键的有功能的转运蛋白和代谢酶的表达。3D生物打印的肠组织提供了与用于屏障功能、渗透率、代谢、转运和毒性的测定相容的灵活的平台。
3D生物打印的肠组织模型的另外的应用包括用作疾病模型以表征用于多种应用(包括炎症、传染病和内分泌生物学)的治疗靶。在3D生物打印的肠组织中参与脂肪酸代谢的酶的高表达指示用于评价靶向这些酶的化合物对抗肥胖的潜在应用[33]。此外，3D生物打印的肠模型的间质提供了用于表征纤维化发生(fibrogenesis)(包括损伤和再生诸如伤口愈合)的平台，纤维化发生是在2D中不能充分地被模拟的疾病表型。为了更好地模拟天然微环境，另外的应用可以使用来自GI道的不同区段的细胞用于与回肠诸如十二指肠、结肠和直肠比较，并且可以与层流成一体。3D生物打印的肠模型可以通过添加多种细胞输入来特化以通过以下增加复杂性：例如，掺入内皮细胞以模拟血管系统、掺入平滑肌细胞以更精确地模拟黏膜下层和胃肠动力、以及掺入免疫细胞以模拟疾病状态。还可以添加癌细胞以在3D环境中模拟肿瘤行为。由于天然组织样多细胞性和结构，生物打印的3D肠组织提供了在受控系统中跨多个应用研究复杂的多方面过程(包括分泌、转运、细胞-细胞相互作用和致病过程)的独特机会。
虽然本文已经显示出和描述本发明的优选的实施方案，但是对于本领域技术人员将明显的是，此类实施方案仅以实例的方式被提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解，在实践本发明时可以采用本文描述的本发明的实施方案的多种替代选择。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物通过引用完全并入本文。
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Claims (92)

1.一种三维工程化生物打印的生物肠组织模型，包含：
(i)包含肌成纤维细胞的肠间质组织层；和
(ii)在所述肠间质组织层上的肠上皮细胞层，以形成所述三维工程化生物肠组织模型。
2.根据权利要求1所述的肠组织模型，其中所述肠间质组织层的至少一层包含肌成纤维细胞，并且肠上皮细胞层还包含至少一种类型的免疫细胞。
3.根据权利要求2所述的肠组织模型，其中所述免疫细胞是髓样细胞。
4.根据权利要求3所述的肠组织模型，其中所述髓样细胞是单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞或巨核细胞。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的肠组织模型，其中所述免疫细胞存在于以下的至少一种中：(a)间质层、(b)上皮细胞层、(c)在所述间质层和所述上皮细胞层之间、(d)在所述上皮细胞层上面和(e)在所述间质细胞层下面。
6.根据权利要求1或2所述的肠组织模型，其中所述肠上皮细胞层包含来自健康供体的原代上皮细胞。
7.根据权利要求1或2所述的肠组织模型，其中所述肠上皮细胞层包含来自患病供体的原代上皮细胞。
8.根据权利要求7所述的肠组织模型，其中所述患病供体具有乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、痔、憩室炎、炎性肠病、显微镜下结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、内分泌障碍、代谢障碍、肥胖、糖尿病、血脂异常、肠癌或结肠直肠癌。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的肠组织模型，其中所述肠上皮细胞层还包含至少一种干细胞群。
10.根据权利要求9所述的肠组织模型，其中所述至少一种干细胞群能够分化。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型还包含肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞是结肠直肠的肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞存在于所述肠组织模型中的层或区室中。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述肠上皮细胞层和所述间质组织层包含来自健康供体的原代上皮细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的肠组织模型，所述肠组织模型表现出以下的至少一种：
(a)绒毛蛋白的顶端染色；
(b)紧密连接；
(c)顶端刷状缘；
(d)在上皮表面上的绒毛样结构；
(e)在所述间质组织层和所述上皮细胞层之间的基底层；
(f)分泌黏液；
(g)表达CYP3A4；
(h)表达p-糖蛋白；
(i)表达胰高血糖素样肽-1；
(j)表达BCRP；
(k)包含肠内分泌细胞；和
(l)包含杯状细胞。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的肠组织模型，其中所述组织模型不包含完全成熟、可灌注的血管系统。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的肠组织模型，其中所述组织模型不包含红细胞。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组织模型，其中所述组织模型不受中枢神经系统支配。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的肠组织模型，其中所述包含肌成纤维细胞的肠间质组织层和/或所述肠上皮细胞层基本上是单层。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的肠组织模型，其中所述肠组织模型还包含与所述肠组织层接触的生物相容性膜。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的肠组织模型，其中所述模型是至少2个细胞层厚。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的肠组织模型，其中多于一个所述肠组织模型被配置形成阵列。
23.根据权利要求22所述的肠组织模型，其中所述阵列存在于微量滴定板的孔中。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的肠组织模型，其中所述肠模型在培养物中经受静态培养条件。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的肠组织模型，其中所述肠模型在培养物中经受非静态培养条件。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的肠组织模型，所述肠组织模型包含至少一个包含正常的肠间质组织和肠上皮细胞的层的第一区域和至少一个包含肠间质组织和肠上皮细胞的层的第二区域，其中所述第二区域的所述层的至少一层包含来自患病供体的细胞。
27.一种肠障碍或损伤的非人类动物模型，所述非人类动物模型包括在其中植入根据权利要求1-26中任一项所述的肠组织模型的非人类动物。
28.根据权利要求27所述的非人类动物模型，其中所述非人类动物是免疫缺陷啮齿动物。
29.一种评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力的方法，所述方法包括：
(a)使根据权利要求1-28中任一项所述的肠组织模型或非人类动物模型与所述候选治疗剂接触，其中所述肠组织模型具有肠障碍或损伤的表型；
(b)确定所述肠组织细胞的存活力或功能性；和
(c)基于与未与所述候选治疗剂接触的对照肠组织模型相比的确定的所述肠组织细胞的存活力或功能性，评价所述候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肠障碍或损伤的表型通过使所述肠组织模型与引起所述表型的治疗、化合物、或传染原接触来诱导。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述肠障碍或损伤的表型是在所述肠组织模型中肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞的存在。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力是降低的肿瘤、肿瘤碎片、肿瘤细胞或永生化细胞侵袭或转移。
33.一种评价候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力的方法，所述方法包括：
(a)使根据权利要求1-28中任一项所述的肠组织模型或非人类动物模型与所述候选治疗剂接触；
(b)确定所述肠组织细胞的存活力或功能性；和
(c)基于与未与所述候选治疗剂接触的对照肠组织模型相比的确定的所述肠组织细胞的存活力或功能性，评价所述候选治疗剂逆转、降低、诱导或预防肠障碍或损伤的能力。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型的所述上皮细胞和/或所述肌成纤维细胞从患病供体获得。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述患病供体具有乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、痔、憩室炎、炎性肠病、显微镜下结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、内分泌障碍、代谢障碍、肥胖、糖尿病、血脂异常、肠癌或结肠直肠癌。
36.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述肠障碍或损伤是炎症。
37.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述肠障碍或损伤是物理损伤，并且所述肠组织模型在与所述候选治疗剂接触前经受物理破坏。
38.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述肠障碍或损伤是纤维化障碍。
39.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述肠障碍或损伤是传染病。
40.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述肠障碍或损伤是癌症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。
42.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型在与所述候选治疗剂接触前与潜在毒性剂接触。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述潜在毒性剂是毒素、治疗剂、抗微生物剂、金属、微生物(例如，细菌、病毒、寄生虫、真菌)、或环境因素。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述潜在毒性剂是抗病毒剂、镇痛剂、抗抑郁剂、利尿剂、或质子泵抑制剂。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述潜在毒性剂是细胞因子、趋化因子、小分子药物、大分子药物、蛋白或肽。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述潜在毒性剂是化学治疗剂。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述潜在毒性剂是布洛芬、对乙酰氨基苯酚、锂、阿昔洛韦、两性霉素B和氨基糖苷类、β内酰胺类、膦甲酸钠、更昔洛韦、喷他脒、喹诺酮、磺酰胺、万古霉素、利福平、阿德福韦、茚地那韦、didofovir、替诺福韦、甲氨蝶呤、兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑、别嘌呤醇、苯妥英、异环磷酰胺、庆大霉素或唑来膦酸。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述潜在毒性剂是辐射。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述潜在毒性剂是免疫活化剂或免疫调节剂。
50.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过测量代谢活性的指示物来确定。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述代谢活性的指示物是与对照相比的在所述肠组织模型中的刃天青还原、四氮唑盐还原、胱天蛋白酶水平或ATP水平。
52.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的屏障功能。
53.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的药物流出。
54.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的细胞色素P450 3A4(CYP3A4)活性。
55.根据权利要求29-49中任一项的方法，其中所述肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的RNA表达或蛋白表达。
56.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型的存活力或功能性是与对照相比的肽分泌。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述肽是细胞因子。
58.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型的存活力或功能性通过与对照相比的组织学来确定。
59.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过鉴定与对照相比的所述肠组织细胞的再生来确定。
60.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的黏液分泌来确定。
61.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的转运蛋白活性来确定。
62.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的酶活性来确定。
63.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的甘油三酯合成来确定。
64.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的乳糜微粒分泌活性来确定。
65.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织细胞的存活力或功能性通过测量与对照相比的胶原蛋白产生来确定。
66.根据权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述肠组织上皮细胞的存活力或功能性随时间来测量。
67.根据权利要求29-66中任一项所述的方法，所述方法是逆转或降低毒性剂所致的损伤的方法，并且所述肠组织模型首先与所述毒性剂接触，并且然后与所述候选治疗剂接触。
68.根据权利要求29-66中任一项所述的方法，所述方法是降低或预防毒性剂所致的损伤的方法，并且所述肠组织模型首先与所述候选治疗剂接触，并且然后与所述毒性剂接触。
69.根据权利要求29-68中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型在与所述候选治疗剂和所述毒性剂接触前已经在细胞培养基中培养。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述肠组织模型已经在所述细胞培养基中培养至少3天。
71.一种评价潜在毒性剂对肠功能的影响的方法，所述方法包括：
(a)使所述剂与根据权利要求1-28中任一项所述的三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量所述剂对所述肠组织模型细胞的存活力或功能性的影响。
72.根据权利要求71所述的方法，所述方法是逆转或降低毒性剂所致的损伤的方法，并且使所述肠组织模型首先与所述毒性剂接触，并且然后去除所述潜在毒性剂。
73.一种评价剂的肠吸收的动力学的方法，所述方法包括：
(a)使所述剂与根据权利要求1-28中任一项所述的三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量所述肠组织模型的吸收的动力学。
74.一种预测候选治疗剂的有效给药浓度和给药方案的方法，所述方法包括：
(a)使不同浓度或量的所述剂与根据权利要求1-28中任一项所述的三维工程化生物打印的生物肠组织模型接触；和
(b)测量所述剂对所述肠组织模型细胞的存活力或功能性随时间的影响；和
(c)测量所述肠组织模型细胞随时间的恢复，以确定提供效力的剂量之间的最小定时。
75.根据权利要求74所述的方法，所述方法还包括：
(d)去除所述剂；和
(e)评价所述剂的不存在是否引起所述肠组织模型的改善的存活力或功能性。
76.一种制备根据权利要求1-28中任一项所述的肠组织模型的方法，所述方法包括：
(a)使包含肠肌成纤维细胞的层沉积到生物相容性表面上；和
(b)使肠上皮细胞层沉积到所述肠肌成纤维细胞层上。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述肠肌成纤维细胞和所述肠上皮细胞的至少一种通过生物打印被沉积。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述肠肌成纤维细胞和所述肠上皮细胞的至少一种通过喷墨打印被沉积。
79.根据权利要求76所述的方法，其中所述肠肌成纤维细胞和所述肠上皮细胞的至少一种通过挤出被沉积。
80.根据权利要求76所述的方法，其中所述肠肌成纤维细胞和所述肠上皮细胞的至少一种通过微阀或微电磁阀打印(MSV)被沉积。
81.根据权利要求76-80中任一项所述的方法，其中所述肠肌成纤维细胞和所述肠上皮细胞的至少一种作为生物墨的一部分被沉积。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述生物墨包含水凝胶。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述水凝胶是胶原蛋白。
84.根据权利要求76-83中任一项所述的方法，所述方法还包括使免疫细胞沉积。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞。
86.根据权利要求84或85所述的方法，其中所述免疫细胞作为所述肠组织层的至少一层的部分被沉积。
87.根据权利要求84-86中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在以下的至少一种中被沉积：(a)间质层、(b)所述上皮细胞层、(c)在所述间质层和所述上皮细胞层之间、(d)在所述上皮细胞层上面、和(e)在所述间质细胞层下面。
88.根据权利要求84-87中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞作为在所述肠组织模型中的层或区室被沉积。
89.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述肠组织模型被沉积到微量滴定板的孔中。
90.根据权利要求84-89中任一项所述的方法，所述方法还包括在细胞培养基中培养所述肠组织模型。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述肠组织模型在所述细胞培养基中培养至少3天。
92.根据权利要求84-91中任一项所述的方法，其中所述生物相容性表面位于所述微量滴定板的孔中。
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