CN110184375A - 一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法 - Google Patents

一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，属于转基因检测技术领域，包括总DNA的提取；以Bar‑F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC，Bar‑R：GTAGGACGACTCAGTGTA，EF1α‑F:TGTTGCAAAGACGACCGAC，EF1α‑R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT作为引物，进行PCR反应；电泳；回收PCR产物；地高辛标记探针；基因组DNA酶切；转膜、固定；杂交；洗膜、信号检测。本发明从DNA提取，PCR反应条件、基因组DNA酶切、固定、杂交、洗膜条件进行优化，提供一种快速、方便、价格较低、高效的检测转基因杜鹃的阳性基因的Southern杂交方法。

Description

一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法
技术领域
本发明属于转基因检测技术领域，具体涉及一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法。
背景技术
杜鹃花是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)植物的总称，杜鹃花以绮丽多姿，高雅脱俗赢得了“花中西施”的美誉，杜鹃花不仅是世界园林最为著名的观赏植物，也是我国传统十大名花之一。杜鹃花种类繁多、色彩艳丽，形态各异，花期亦长，它不仅可以种植在林缘、溪边、池畔及岩石旁成丛、成片种植，也可以植于庭院中作为盆景。目前，国际上无论在宏观领域还是微观领域对杜鹃花都有比较深入的研究，在新品种的选育上成效显著，比利时、美国、英国、日本、德国等培育了大量极具商品性的品种。近年来在中国，杜鹃花的育种工作也日渐引起重视。
Southern杂交技术由英国科学家埃德温·迈勒·萨瑟恩于1975年创立，此技术现已成为检测特定DNA片段的经典方法。该方法利用硝酸纤维膜或尼龙膜等可以吸附DNA的功能，将DNA电泳后的DNA区带吸附到膜上，随后在膜上进行同位素标记探针与被测DNA之间的杂交，最后通过放射自显影对杂交结果进行检测，以此探测DNA样品中含有的特定DNA信息。Southern杂交技术特异性强，灵敏性高，可应用于检测样品中DNA及其含量，了解基因的状态，如是否存在点突变、扩增重排等，在遗传病诊断、外源基因检测、DNA图谱分析、PCR产物分析等方面均有广泛应用。目前地高辛标记的Southern杂交技术已成功运用到棉花、烟草、水稻、玉米、油菜、小麦等农作物中并取得了良好的杂交效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，该检测方法固定效果好，价格低；能够避免探针与尼龙膜及非特异性核酸的结合，从而使杂交效果较好。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，包括：
总DNA的提取；
采用紫外分光光度计对DNA溶液进行质量测定和浓度定量；
PCR反应：以EF1α基因作为内参基因，Bar基因为目的基因，引物序列为Bar-F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC，Bar-R：GTAGGACGACTCAGTGTA，EF1α-F:TGTTGCAAAGACGACCGAC，EF1α-R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT；
琼脂糖凝胶电泳；
Southern杂交：回收PCR产物；地高辛标记探针；转基因杜鹃基因组DNA酶切；转膜；固定；杂交；洗膜；信号检测。内参基因在各组织和细胞中的表达较为恒定，在检测基因的表达水平变化时常用来做参照物，可以校正上样量及上样过程中存在的实验误差，提高实验结果的准确度，在转基因植物及其加工产品的定性、定量PCR检测和转基因植物生产过程中外源基因拷贝数的测定方面发挥着及其重要的作用。内参基因要求具有中间特异性、种内非特异性、低拷贝数的特点。EF1α作为杜鹃的内参基因，通过BLAST比对显示与其他物种有较高的同源性，达到90％，扩增率达到101％，发育过程中稳定性较高，GenBank的基因登录号为JQ412743。引物的长度一般为18-27bp，引物设计不合理会导致PCR出现假阴性和假阳性，本发明提供的引物长度适宜，且引物序列在模板内没有相似性较高的序列，不易导致错配，PCR效果好。
作为优选，总DNA的提取在研磨材料时加入0.2-0.4mL质量体积分数1-2％的聚乙烯吡咯烷酮。聚乙烯吡咯烷酮作为一种高分子化合物，可以去除酚类，能够明显提高提取的DNA纯度以及扩增质量，同时可以减少研磨过程中对DNA的机械损伤。
作为优选，PCR反应以1.0-1.5μL浓度为18-23ng/μL的DNA为模板。PCR中模板DNA浓度过高会导致电泳会有条带弥散，甚至没有条带，原因有：非特异性扩增的上升，蛋白质含量也会上升从而影响PCR反应体系；DNA是具有高级结构，浓度过高影响引物结合，在退火时模板会和引物竞争，模板与模板互相结合；模板浓度过高时，在PCR反应的前几个循环中，引物只是不断反复和模板结合，和产物结合较少。
作为优选，PCR反应体系中分别加入EF1α基因引物和Bar基因引物0.4-0.45μL。引物可以使游离的碱基结合DNA单链，在一定范围内，引物浓度越大DNA复制越快，超过一定浓度时，比较容易出现非特异性扩增反应，并且可能导致引物之间形成二聚体。
作为优选，PCR反应条件为：94-95℃预变性3-5min，94-95℃变性30-40S，58-59℃退火30-35S，72-74℃延伸30-35S；共30-35个循环；72℃延伸5-6min，2-4℃冷藏10-12min。变性温度低，解链不完全会导致PCR失败，但温度过高对酶的活性有影响。退火温度会影响PCR的特异性，引物的长度、碱基组成及其浓度决定了退火温度与时间，还有靶基因序列的长度。在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合，PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。PCR循环次数主要取决于DNA模板的浓度，随着循环次数增多，非特异性产物的量也会增多。
作为优选，转基因杜鹃基因组DNA酶切体系为：在360-380μL体系中加入30-35μLDNA，6-8μL限制性内切酶HindⅢ，酶切12-14h。酶切是做好Southern杂交的前提，基因组DNA酶切量依据植物基因组特性不同，使用基因组DNA量也不同，一般植物用于Southern杂交的DNA量在5-15μL左右便可取得良好的杂交效果。本发明提供的转基因杜鹃DNA量在30-35μL，DNA量较低时杂交效果不理想，条带较弱，无法分辨植株的拷贝数。一般用于杂交的杜鹃基因组时间较长，为了节约时间，加快进度，本发明提供了酶切时间为12-14h的400μL的大酶切体系。
作为优选，转基因杜鹃基因组DNA酶切中酶切后的DNA置于2-4℃冷藏，加样前56-58℃水浴2-3min。能够破坏突出黏性末端可能形成的任何碱基对。
作为优选，固定是采用紫外交联法将DNA固定到尼龙膜上，并添加一定量阳离子聚丙烯酰胺。紫外交联固定膜上DNA方便，效率高。进行紫外交联时，照射的目的是使DNA的一小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团形成交联，过量的照射将导致大部分胸腺嘧啶共价结合，继而降低了胸腺嘧啶残基与氨基基团的交联。阳离子聚丙烯酰胺是一种高分子化合物，加入一定量的阳离子聚丙烯酰胺能够与尼龙粘合，阳离子聚丙酰胺具有吸附架桥的功能，能够帮助DNA固定到尼龙膜上，同时带有正电荷，有助于DNA以共价结合方式结合在尼龙膜上，从而竞争性抑制大部分胸腺嘧啶的共价结合，有助于更好的将DNA固定到尼龙膜上。
作为优选，杂交的步骤包括：将浸湿的DNA滤膜放入杂交瓶中，加入杂交液；向杂交管中加入羧甲基纤维素后，放入42-44℃的杂交炉中预杂交45-75min；；探针在95-100℃变性8-10min，立即放置在冰上4-7min；除去预杂交液，加入新的的杂交液5-7mL，再加入变性好的探针5-6μL，64-66℃杂交16-18h。杂交过程中杂交温度过高或过低都不利于探针与目的片段的结合。在满足温度条件的情况下，杂交的成败取决于杂交时间，时间过短则杂交不充分；时间过长则可能导致非特异结合增多。预杂交时，羧甲基纤维素能够封闭尼龙膜上的非特异性位点，避免探针与尼龙膜及非特异性核酸的结合，从而使杂交效果较好。
作为优选，洗膜的步骤包括：取28-30ml含有0.08-0.1％十二烷基硫酸钠的0.04-0.5×柠檬酸钠缓冲液，常温洗膜2-3次，每次6-8min；取28-30ml含有0.08-0.1％十二烷基硫酸钠的0.04-0.5×柠檬酸钠缓冲液，63-64℃洗膜2-3次，每次15-18min。利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，背景高，杂交信号差。为了降低背景，可以适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度，从而获得较好的杂交信号。
本发明的有益效果为：
1)本发明提供一种以EF1α作为杜鹃的内参基因对定性PCR进行校正，得出的实验结果准确可靠；
2)本发明从基因组DNA提取，PCR反应条件进行优化，获得的PCR扩增产物质量好，PCR特异性明显提高；
3)本发明从转基因杜鹃基因组DNA酶切、尼龙膜上DNA固定、杂交过程、洗膜条件对转基因杜鹃的Southern杂交方法进行优化，在紫外交联固定膜上DNA时加入阳离子聚丙烯酰胺，能够与尼龙粘合，阳离子聚丙烯酰胺具有吸附架桥的功能，能够帮助DNA固定到尼龙膜上，同时带有正电荷，有助于DNA以共价结合方式结合在尼龙膜上，从而竞争性抑制大部分胸腺嘧啶的共价结合，有助于更好的将DNA固定到尼龙膜上。预杂交时，羧甲基纤维素能够封闭尼龙膜上的非特异性位点，避免探针与尼龙膜及非特异性核酸的结合，从而使杂交效果较好。提供一种快速、方便、价格较低、高效的检测转基因杜鹃的阳性基因的Southern杂交方法。
附图说明
图1为本发明的实施例2转基因杜鹃基因组DNA酶切后的电泳图；
图2为本发明的实施例3转基因杜鹃基因组DNA酶切后的电泳图；
图3为本发明的实施例1的PCR电泳图；
图4为本发明的实施例2的PCR电泳图；
图5为本发明的实施例2的Southern杂交结果示意图；
图6为本发明的对比例3的Southern杂交结果示意图；
图7为本发明的对比例4的Southern杂交结果示意图。
附图标记说明：图3-图7中的M为DL5000DNA Marker。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，包括以下步骤：
1)总DNA的提取，对4个待测样品分别称取0.2-0.3g转基因杜鹃的新鲜叶片，加入0.4mL质量体积分数2％的聚乙烯吡咯烷酮，加入液氮，迅速研磨成粉；将粉末转入1.5mL离心管，加入0.8mL预热的CTAB提取缓冲液，CTAB提取缓冲液的配方如表1，68℃水浴条件下涡旋振荡25min；加入与提取液等体积的体积比25:1的氯仿和异戊醇的混合液抽提2次，涡旋振荡混匀后9000r/min，离心12min；取上清转入新的1.5mL离心管，加入0.8mL的异丙醇，混匀后置于冰箱冷冻30min；取出后9000r/min，离心12min，收集沉淀，加入0.6mL体积分数70％的乙醇洗涤2次；待乙醇挥发后加入0.06mL的无菌水溶解。
表1：CTAB提取缓冲液配方
2)采用NanoDrop ND1000对DNA溶液进行质量测定和浓度定量，记录DNA溶液在260nm和280nm处的最大吸收峰，根据OD260/280及测得的DNA浓度判定DNA提取质量。
3)以纯度符合A260nm/A280nm＝1.7的DNA为模板，将浓度稀释至18ng/μL后作为PCR扩增的模板，以EF1α基因作为内参基因，Bar基因为目的基因。引物序列为Bar-F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC；Bar-R：GTAGGACGACTCAGTGTA；EF1α-F:TGTTGCAAAGACGACCGAC；EF1α-R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT。PCR扩增反应体系如表2。
表2：实验例1中PCR扩增反应体系
组分 添加量(μL)
模板DNA 1.0
2×Multiplex PCR buffer 22.5
Multiplex PCR Enzyme Mix 0.3
引物Bar-F 0.45
引物Bar-R 0.45
引物EF1α-F 0.45
引物EF1α-R 0.45
ddH<sub>2</sub>O 24.4
PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性40S，59℃退火35S，72℃延伸30S；共35个循环；72℃延伸6min，4℃冷藏10min。
4)琼脂糖凝胶电泳，吸取8μL PCR产物在含有2％琼脂糖的凝胶上进行电泳。
5)Southern杂交：回收PCR产物，定量后，取200ng模板DNA，加ddH2O定容至16uL；以定容后的DNA为模板，Bar-F和Bar-R为引物，PCR扩增Southern杂交的探针，PCR扩增体系如表3。
表3：扩增Southern杂交探针的PCR反应体系
PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性40S，59℃退火35S，72-74℃延伸30S；共35个循环；72℃延伸6min，4℃冷藏10min。
对转基因杜鹃基因组DNA酶切，酶切体系为：在380μL体系中加入6μL 10×buffer、30μL DNA、8μL限制性内切酶HindⅢ，37℃酶切12h，将酶切后的DNA置于4℃冷藏，加样前56℃水浴3min。酶切后的DNA在琼脂糖凝胶上电泳。
转膜：将胶裁成4.7×8.6cm大小，用蒸馏水冲洗1次；加入80mL 0.25mol/L的盐酸脱嘌呤，室温振荡25min；加入1.5mol/L Na Cl和0.5mol/L NaOH混合的变性液室温振荡25min后，蒸馏水冲洗2次；加入1.5mol/L NaCl和1.0mol/L Tris-Cl组成的pH＝7.4的中和液，室温振荡10min，振荡3次；再用蒸馏水冲洗2次后加入尼龙膜，转膜2h。
固定：转膜后，用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗去盐，加入阳离子聚丙烯酰胺后在UV交联仪上照射固定DNA。
杂交：将浸湿的DNA滤膜卷成圆柱状放入杂交瓶中，加入Hyb高效杂交液7mL，拧紧瓶盖；向杂交管中加入羧甲基纤维素后，放入42℃的杂交炉中预杂交75min；探针在100℃变性8min，立即放置在冰上7min；除去预杂交液，加入新的的Hyb高效杂交液7mL，再加入变性好的探针6μL，混匀，66℃杂交18h。
洗膜：杂交后，取28ml含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.5×柠檬酸钠缓冲液，常温洗膜2次，每次6min；取28ml含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.5×柠檬酸钠缓冲液，63℃洗膜2次，每次15min。
信号检测：将膜置于20mL由0.1mol/L马来酸、0.15mol/L Nacl和体积分数0.3％吐温制得的pH＝7.5的洗涤缓冲液中平衡4min；再将膜在10mL封闭液中封闭30min；结合有碱性磷酸酶的抗地高辛半抗原的抗体(Anti-Dig-AP)在10000rpm下离心5min，取3.5μl稀释后的Anti-Dig-AP，加入10ml封闭液混匀；去除封闭液，加入稀释好的10ml抗体溶液，浸膜35min；去除抗体溶液，用25ml洗涤缓冲液缓慢洗膜3次，每次10min；去除洗涤缓冲液，在15ml检测液中平衡膜2次，每次3min；用检测缓冲液稀释180μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)化学显色底物，在8.5ml新鲜制备的显色液中反应显色；用TE缓冲液洗涤5min终止反应，照相记录结果。
实施例2：
一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，包括以下步骤：
1)总DNA的提取，对4个待测样品分别称取0.2-0.3g转基因杜鹃的新鲜叶片，加入0.4mL质量体积分数2％的聚乙烯吡咯烷酮，加入液氮，迅速研磨成粉；将粉末转入1.5mL离心管，加入0.8mL预热的CTAB提取缓冲液，CTAB提取缓冲液的配方如表1，68℃水浴条件下涡旋振荡25min；加入与提取液等体积的体积比25:1的氯仿和异戊醇的混合液抽提2次，涡旋振荡混匀后9000r/min，离心12min；取上清转入新的1.5mL离心管，加入0.8mL的异丙醇，混匀后置于冰箱冷冻30min；取出后9000r/min，离心12min，收集沉淀，加入0.6mL体积分数70％的乙醇洗涤2次；待乙醇挥发后加入0.06mL的无菌水溶解。
2)采用NanoDrop ND1000对DNA溶液进行质量测定和浓度定量，记录DNA溶液在260nm和280nm处的最大吸收峰，根据OD260/280及测得的DNA浓度判定DNA提取质量。
3)以纯度符合A260nm/A280nm＝1.7的DNA为模板，将浓度稀释至23ng/μL后作为PCR扩增的模板，以EF1α基因作为内参基因，Bar基因为目的基因。引物序列为Bar-F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC；Bar-R：GTAGGACGACTCAGTGTA；EF1α-F:TGTTGCAAAGACGACCGAC；EF1α-R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT。PCR扩增反应体系如表4。
表4：实验例2中PCR扩增反应体系
PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性40S，59℃退火35S，72℃延伸35S；共30个循环；72℃延伸5-6min，4℃冷藏10min。
4)琼脂糖凝胶电泳，吸取8μL PCR产物在含有2％琼脂糖的凝胶上进行电泳。
5)Southern杂交：回收PCR产物，定量后，取200ng模板DNA，加ddH2O定容至16uL；以定容后的DNA为模板，Bar-F和Bar-R为引物，PCR扩增Southern杂交的探针，PCR扩增体系如表3。
PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性40S，59℃退火35S，72℃延伸35S；共30个循环；72℃延伸5-6min，4℃冷藏10min。
对转基因杜鹃基因组DNA酶切，酶切体系为：在380μL体系中加入6μL 10×buffer、30μL DNA、8μL限制性内切酶HindⅢ，37℃酶切12h，将酶切后的DNA置于4℃冷藏，加样前56℃水浴3min。酶切后的DNA在琼脂糖凝胶上电泳。
转膜：将胶裁成4.7×8.6cm大小，用蒸馏水冲洗1次；加入80mL 0.25mol/L的盐酸脱嘌呤，室温振荡25min；加入1.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH混合的变性液室温振荡25min后，蒸馏水冲洗2次；加入1.5mol/L NaCl和1.0mol/L Tris-Cl组成的pH＝7.4的中和液，室温振荡10min，振荡3次；再用蒸馏水冲洗2次后加入尼龙膜，转膜2h。
固定：转膜后，用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗去盐，加入阳离子聚丙烯酰胺后在UV交联仪上照射固定DNA。
杂交：将浸湿的DNA滤膜卷成圆柱状放入杂交瓶中，加入Hyb高效杂交液7mL，拧紧瓶盖；向杂交管中加入羧甲基纤维素后，放入42℃的杂交炉中预杂交75min；探针在100℃变性8min，立即放置在冰上7min；除去预杂交液，加入新的的Hyb高效杂交液7mL，再加入变性好的探针6μL，混匀，66℃杂交18h。
洗膜：杂交后，取28ml含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.5×柠檬酸钠缓冲液，常温洗膜2次，每次6min；取28ml含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.5×柠檬酸钠缓冲液，63℃洗膜2次，每次15min。
信号检测：将膜置于20mL由0.1mol/L马来酸、0.15mol/L Nacl和体积分数0.3％吐温制得的pH＝7.5的洗涤缓冲液中平衡4min；再将膜在10mL封闭液中封闭30min；Anti-Dig-AP在10000rpm下离心5min，取3.5μl稀释后的Anti-Dig-AP，加入10ml封闭液混匀；去除封闭液，加入稀释好的10ml抗体溶液，浸膜35min；去除抗体溶液，用25ml洗涤缓冲液缓慢洗膜3次，每次10min；去除洗涤缓冲液，在15ml检测液中平衡膜2次，每次3min；用检测缓冲液稀释180μl NBT/BCIP化学显色底物，在8.5ml新鲜制备的显色液中反应显色；用TE缓冲液洗涤5min终止反应，照相记录结果。
实施例3：
对转基因杜鹃基因组DNA酶切，酶切体系为：在360μL体系中加入6μL 10×buffer、35μL DNA、6μL限制性内切酶HindⅢ，37℃酶切14h，将酶切后的DNA置于4℃冷藏，加样前56℃水浴3min。酶切后的DNA在琼脂糖凝胶上电泳。
其余部分与实施例2完全一致。
对比例1：
以不含Bar基因的野生型杜鹃作实验材料设为阴性对照，其余部分和实施例2完全一致。
对比例2：
以含有Bar基因的pCAMBIA3301重组质粒作实验材料设为阳性对照，其余部分和实施例2完全一致。
对比例3：
预杂交时未加入向杂交管中加入羧甲基纤维素，其余部分和实施例2完全一致。
对比例4：
在UV交联仪上照射固定DNA前未加入阳离子聚丙烯酰胺，其余部分和实施例2完全一致。
由图1和图2可知，实施例2和实施例3在的酶切条件下，酶切效果好，差异不明显，泳道亮度明显，自上而下成均匀弥散状，且在实施例3的条件下，酶切效果更佳。
实施例1和实施例2利用不同的PCR条件扩增了4了待测转基因杜鹃样本中的内参基因EF1α和目的基因Bar，对比例1以不含有Bar基因的野生型杜鹃作为阴性对照，对比例2以含有Bar基因的pCAMBIA3301重组质粒作为阳性对照。由图3和图4可以看出，阴性对照和4个样本在Maker 400-500bp间都有清晰的条带，说明所有样本DNA抽提质量较好，PCR条件较佳，阳性对照和样本1、样本2、样本4在Maker 300-400bp间都有清晰的条带，且在实施例2的PCR条件下，电泳效果更好，条带更亮更均一。
如图5、图6和图7分别为实施例2、对比例3和对比例4的Southern杂交结果，对比例4在UV交联仪上照射固定DNA前未加入阳离子聚丙烯酰胺，过量的照射将导致大部分胸腺嘧啶共价结合，继而降低了胸腺嘧啶残基与尼龙膜上的氨基基团的交联，从而导致探针杂交结果很不理想，几乎无目的条带；由图5和图6可以明显看出，由于对比例3未加入羧甲基纤维素，存在探针与尼龙膜本身及非特异性核酸的结合，出现非特异性条带，呈涂抹性，杂交效果不理想。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 元成环境股份有限公司
<120> 一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌WCFS1(Lactobacillus plantarum WCFS1)
<400> 1
atgagcgtat cattacgaac tgcaaccatg tcagatttac ccattattgt agatatttac 60
aatcaaacga ttcccagtca tcaagtgacg gctgatctta aaccagttac ggttgagcaa 120
cgtcgaaatt ggtttttgag tcatacccct gaacactatc cgctgtgggt tgttgtaaag 180
gacgactcag tggtcggttg ggttagtctg tcaccatttt atggacgggc agcgtatgca 240
aagacgactg aaatttcagt ttatttggat cgcagtgttc aaggacaggg aatcggtagc 300
caggttttga cattagttcc taaacaatta cctgtgttgg gattaacaac gattatcgct 360
tatatttttt caagtaatat tccaagcatt aagctgttca aaaagtttgg gtacgaacag 420
tgggggtttc tgccagaagt cgctgaatta ggtggccgac cgaatgactt agtgattctg 480
ggacaacatt tcaagtaa 498
<210> 2
<211> 373
<212> RNA
<213> 杜鹃(Rhododendron)
<400> 2
agaccaccaa gacacgcacg cacgagcccg gacacggacc acaagaacag acacggcacc 60
ccaggcgacg gccacccaag acccaccacc gggggaagcg gaacaaagga ggcagacccg 120
agagcagcgc gccaccggga ggcaaagagc gcgcaacaag aggagccaca acccaaaacc 180
aaggcaagga gagaaacgaa aggaagccca ccgaagaagg ggaacaaccc gagaagaccc 240
agccccaccg ggaaggagac aacagagaga ggcacaaacc cgacggacaa gggcccaacc 300
cccggaggcc cgacagaagg aacccaagag gccccagaca agccgcccgc ccccaccagg 360
aggacaagag ggg 373

Claims (10)

1.一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)总DNA的提取；
2)采用紫外分光光度计法对DNA溶液进行质量测定和浓度定量；
3)PCR反应：以EF1α基因作为内参基因，Bar基因为目的基因，引物序列为Bar-F：CCACTCGTAACCAGTAAGCC，Bar-R：GTAGGACGACTCAGTGTA，EF1α-F:TGTTGCAAAGACGACCGAC，EF1α-R：CGGCCATCTGTAGCGATCTT；
4)琼脂糖凝胶电泳；
5)Southern杂交：回收PCR产物；地高辛标记探针；转基因杜鹃基因组DNA酶切；转膜；固定；杂交；洗膜；信号检测。
2.根据权利要求1所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述总DNA的提取在研磨材料时加入0.2-0.4mL质量体积分数1-2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
3.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述PCR反应以1.0-1.5μL浓度为18-23ng/μL的DNA为模板。
4.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述PCR反应体系中分别加入EF1α基因引物和Bar基因引物0.4-0.45μL。
5.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：94-95℃预变性3-5min，94-95℃变性30-40S，58-59℃退火30-35S，72-74℃延伸30-35S；共30-35个循环；72℃延伸5-6min，2-4℃冷藏10-12min。
6.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述转基因杜鹃基因组DNA酶切体系为：在360-380μL体系中加入30-35μL DNA，6-8μL限制性内切酶HindⅢ，酶切12-14h。
7.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述转基因杜鹃基因组DNA酶切中酶切后的DNA置于2-4℃冷藏，加样前56-58℃水浴2-3min。
8.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于：所述固定是采用紫外交联法将DNA固定到尼龙膜上，并添加一定量阳离子聚丙烯酰胺。
9.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，所述杂交的步骤包括：
1)将浸湿的DNA滤膜放入杂交瓶中，加入杂交液；
2)向杂交管中加入羧甲基纤维素后，放入42-44℃的杂交炉中预杂交45-75min；
3)探针在95-100℃变性8-10min，立即放置在冰上4-7min；
4)除去预杂交液，加入新的杂交液5-7mL，再加入变性好的探针5-6μL，64-66℃杂交16-18h。
10.根据权利要求1或2所述的一种适用于转基因杜鹃的阳性基因检测方法，其特征在于，所述洗膜的步骤包括：
1)取28-30ml含有0.08-0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.04-0.5×柠檬酸钠缓冲液(SSC)，常温洗膜2-3次，每次6-8min；
2)取28-30ml含有0.08-0.1％十二烷基硫酸钠的0.04-0.5×柠檬酸钠缓冲液，63-64℃洗膜2-3次，每次15-18min。
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