CN110184324A - 一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，包括以下步骤：对照选取，以转化CaMV35S启动子的转基因拟南芥作为对照；启动子GUS活性的检测，对100mM、200mM、300mM 18％PEG 6000处理的15天转基因拟南芥小苗的叶片和根系分别进行启动子GUS活性的检测；观察染色情况，从表型上看，GUS染色中，除了CaMV35S对照植株，各片段的启动子转基因植株叶片均未染色或染色很浅，而转基因根系中，在根尖部位着色较深。本发明该结果识别了MaPIP1；1启动子的核心区域，该结果能够进一步阐明MaPIP1；1基因在抵御干旱胁迫时的作用机制。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法。
背景技术
香蕉前期植株较小，根系浅生，易受旱，其叶面积大，蒸腾量大，尤其是在高温季节，香蕉受到干旱后，叶片严重失水，导致香蕉叶片的细胞质膜透性增大，极大地伤害香蕉正常的生理代谢活动，造成香蕉减产和品质下降。香蕉栽培生产中，耗水量大，每生产500克干物质，需要吸收300千克水分。香蕉在营养生长阶段遇上干旱，会使香蕉营养器官生长发育不良，生长速度和生长量显著下降，受旱严重时，叶片下垂，枯黄凋萎，气孔关闭，光合效能降低；在花芽分化前遇旱，会使营养器官出现早衰，营养积累少，花芽分化受到影响，果实的梳数和单果数明显减少，从而造成减产。所以，香蕉是受干旱胁迫影响最重的水果之一，干旱胁迫严重制约着香蕉的生产，是香蕉产业中急需解决的关键问题。
前期的实验证明了MaPIP1；1转基因拟南芥能够响应干旱胁迫(Xu et al.2014)，然而元件分析该1362bp启动子元件中并未发现已知的干旱或者盐胁迫诱导的顺式作用元件。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法。
本发明提出的一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，包括以下步骤：
S1：对照选取，以转化CaMV35S启动子的转基因拟南芥作为对照；
S2：启动子GUS活性的检测，对100mM、200mM、300mM 18％PEG6000处理的15天转基因拟南芥小苗的叶片和根系分别进行启动子GUS活性的检测；
S3：观察染色情况，从表型上看，GUS染色中，除了CaMV35S对照植株，各片段的启动子转基因植株叶片均未染色或染色很浅，而转基因根系中，在根尖部位着色较深，其中-1274to-1区段(M-P2)的转基因拟南芥染色最深，而在-813to-1(M-P3)区段，颜色变浅，其余片段染色相仿；
S4：GUS酶活性测定，结果显示M-P2(-1274至-1)在胁迫处理下显示出更高的酶活性，当浓度为300mM时，酶活性为89，是对照的1.48倍；
S5：得出结果，结果表明，与干旱渗透胁迫相关的功能元件可能包含在M-P2和M-P3之间，在干旱胁迫处理时，CaMV35S转基因拟南芥的酶活性是稳定的。当干旱胁迫浓度为300mM时，M-P2片段的GUS活性是CaMV35S的0.77倍，高于正常条件下M-P2和CaMV35S的比例，这意味着M-P2(-1274—-1)可以实现高水平的基因表达和盐度或渗透胁迫诱导。结果表明M-P2(-1274—-1)为该启动子的核心区域，该区域包含了许多核心区域元件CAAT-box andTATA-box。
优选地，根据启动子序列作用元件，所述S5中，通过5′端缺失技术，将MaPIP1；1启动子分段成(M-P1，M-P2，M-P3，M-P4)，克隆的长度分别为1362bp，1274bp，813bp，223bp，经酶切、测序，与MaPIP1；1基因启动子各缺失片段大小相一致，将它们分别替换pcambia 1304载体上的35S启动子并转化拟南芥。
优选地，所述S5中，M-P1—M-P4的启动子在正常条件下能够启动GUS酶活性均能染出颜色，并且各片段之间也存在着一定的差异，在这些片段中进一步进行GUS酶活检测，M-P1和M-P2的GUS活性较M-P3和M-P4的GUS活性高，其中M-P2的GUS活性最高。
优选地，1362bp的启动子序列中共有72个顺式作用元件，包括了许多TATA-box和CAAT-box核心元件，包括ABA响应元件ABRE，MYB元件，MYC元件，ERE元件，MeJA响应元件，BOXII，G-box，GT1-motif，I-BOX等光响应元件，分生组织响应元件等。
本发明中的有益效果为：
1.本香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，该结果识别了MaPIP1；1启动子的核心区域，该结果能够进一步阐明MaPIP1；1基因在抵御干旱胁迫时的作用机制。
附图说明
图1为本发明提出的一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1，一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，包括以下步骤：
S1：对照选取，以转化CaMV35S启动子的转基因拟南芥作为对照；
S2：启动子GUS活性的检测，对100mM、200mM、300mM 18％PEG6000处理的15天转基因拟南芥小苗的叶片和根系分别进行启动子GUS活性的检测；
S3：观察染色情况，从表型上看，GUS染色中，除了CaMV35S对照植株，各片段的启动子转基因植株叶片均未染色或染色很浅，而转基因根系中，在根尖部位着色较深，其中-1274to-1区段(M-P2)的转基因拟南芥染色最深，而在-813to-1(M-P3)区段，颜色变浅，其余片段染色相仿；
S4：GUS酶活性测定，结果显示M-P2(-1274至-1)在胁迫处理下显示出更高的酶活性，当浓度为300mM时，酶活性为89，是对照的1.48倍；
S5：得出结果，结果表明，与干旱渗透胁迫相关的功能元件可能包含在M-P2和M-P3之间，在干旱胁迫处理时，CaMV35S转基因拟南芥的酶活性是稳定的。当干旱胁迫浓度为300mM时，M-P2片段的GUS活性是CaMV35S的0.77倍，高于正常条件下M-P2和CaMV35S的比例，这意味着M-P2(-1274—-1)可以实现高水平的基因表达和盐度或渗透胁迫诱导。结果表明M-P2(-1274—-1)为该启动子的核心区域，该区域包含了许多核心区域元件CAAT-box andTATA-box。
本发明中，根据启动子序列作用元件，S5中，通过5′端缺失技术，将MaPIP1；1启动子分段成(M-P1，M-P2，M-P3，M-P4)，克隆的长度分别为1362bp，1274bp，813bp，223bp，经酶切、测序，与MaPIP1；1基因启动子各缺失片段大小相一致，将它们分别替换pcambia 1304载体上的35S启动子并转化拟南芥，S5中，M-P1—M-P4的启动子在正常条件下能够启动GUS酶活性均能染出颜色，并且各片段之间也存在着一定的差异，在这些片段中进一步进行GUS酶活检测，M-P1和M-P2的GUS活性较M-P3和M-P4的GUS活性高，其中M-P2的GUS活性最高，1362bp的启动子序列中共有72个顺式作用元件，包括了许多TATA-box和CAAT-box核心元件，包括ABA响应元件ABRE，MYB元件，MYC元件，ERE元件，MeJA响应元件，BOX II，G-box，GT1-motif，I-BOX等光响应元件，分生组织响应元件等。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对照选取，以转化CaMV35S启动子的转基因拟南芥作为对照；
S2：启动子GUS活性的检测，对100mM、200mM、300mM18％PEG6000处理的15天转基因拟南芥小苗的叶片和根系分别进行启动子GUS活性的检测；
S3：观察染色情况，从表型上看，GUS染色中，除了CaMV35S对照植株，各片段的启动子转基因植株叶片均未染色或染色很浅，而转基因根系中，在根尖部位着色较深，其中-1274to-1区段(M-P2)的转基因拟南芥染色最深，而在-813to-1(M-P3)区段，颜色变浅，其余片段染色相仿；
S4：GUS酶活性测定，结果显示M-P2(-1274至-1)在胁迫处理下显示出更高的酶活性，当浓度为300mM时，酶活性为89，是对照的1.48倍；
S5：得出结果，结果表明，与干旱渗透胁迫相关的功能元件可能包含在M-P2和M-P3之间，在干旱胁迫处理时，CaMV35S转基因拟南芥的酶活性是稳定的。当干旱胁迫浓度为300mM时，M-P2片段的GUS活性是CaMV35S的0.77倍，高于正常条件下M-P2和CaMV35S的比例，这意味着M-P2(-1274—-1)可以实现高水平的基因表达和盐度或渗透胁迫诱导。结果表明M-P2(-1274—-1)为该启动子的核心区域，该区域包含了许多核心区域元件CAAT-box andTATA-box。
2.根据权利要求1所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，其特征在于，根据启动子序列作用元件，所述S5中，通过5′端缺失技术，将MaPIP1；1启动子分段成(M-P1，M-P2，M-P3，M-P4)，克隆的长度分别为1362bp，1274bp，813bp，223bp，经酶切、测序，与MaPIP1；1基因启动子各缺失片段大小相一致，将它们分别替换pcambia 1304载体上的35S启动子并转化拟南芥。
3.根据权利要求1所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，其特征在于，所述S5中，M-P1—M-P4的启动子在正常条件下能够启动GUS酶活性均能染出颜色，并且各片段之间也存在着一定的差异，在这些片段中进一步进行GUS酶活检测，M-P1和M-P2的GUS活性较M-P3和M-P4的GUS活性高，其中M-P2的GUS活性最高。
4.根据权利要求2所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子核心区域的筛选方法，其特征在于，1362bp的启动子序列中共有72个顺式作用元件，包括了许多TATA-box和CAAT-box核心元件，包括ABA响应元件ABRE，MYB元件，MYC元件，ERE元件，MeJA响应元件，BOX II，G-box，GT1-motif，I-BOX等光响应元件，分生组织响应元件等。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190830 |