CN110151749A - 冬凌草甲素在制备预防或治疗nlrp3炎症小体相关疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冬凌草甲素在制备用于预防或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。冬凌草甲素药理作用强，且安全无毒，预示着良好的药用前景。冬凌草甲素能在体外抑制NLRP3炎症小体的活化，在体内可以治疗NLRP3炎症小体相关疾病模型的病理状况。冬凌草甲素可通过共价键直接与NLRP3结合，进而抑制NLRP3、NEK7的相互作用，从而抑制炎症小体的组装，达到抑制炎症小体活化的目的。

Description

冬凌草甲素在制备预防或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药 物中的应用

技术领域

本发明涉及冬凌草甲素的用途，尤其涉及其在制备预防或治疗NLRP3 炎症小体相关疾病药物中的应用。

背景技术

炎症小体是由固有免疫相关感受器蛋白组成的一种大的蛋白复合物，主要包括NLRP1、NLRP3、IPAF以及AIM2、IFI16炎症小体(Martinon et al.，2009；Davis et al.，2011；Jo et al.，2016)。在激动剂的作用下，感受器蛋白能够通过接头蛋白ASC，招募pro-caspasel，形成大的多聚蛋白复合物，即炎症小体。活化的炎症小体可以导致pro-caspasel自剪切，形成有活性的caspasel，而活化的caspasel，可以介导细胞的凋亡，以及IL-1β、IL-18 的成熟和分泌。不同于其他的炎症小体，NLRP3炎症小体既能识别外源的病因相关分子模式，又能识别内源的危险相关分子模式。NLRP3炎症小体的过度活化跟很多疾病相关，如肠炎(Siegmund et al.，2001，Proc Natl AcadSci USA.)、肝炎(Negash et al.，2013，PLoSPathog)、硅肺(Dostert et al.， 2008，Science)、石棉肺和矽肺(Dostert C，et al，2008，science)、白塞病(Liang L，et al，2013，Invest Ophthalmol Vis Sci.)、类风湿关节炎(Rosengren S，et al， 2005，Ann Rheum Dis)、紫外线所诱导的皮肤晒伤(Watanabeet al.，2007，J Investig D ermatol.；Feldmeyer et al.，2007，CurrBiol)和接触性超敏反应 (Watanabe et al.，2007，J InvestigDermatol；Sutterwala et al.，2006，Immunity)、脓毒血症(Mao et al.，2013，Cell Res)、肿瘤(Ghiringhelli et al.， 2009，Nat Med；Allen et al.，2010，J Exp Med)、阿尔茨海默病(Halle et al.， 2008，NatImmunol)，帕金森病(Yan et al，2015，Cell)、抑郁症(Zhang et al， Int JNeuropsychopharmacol，2015)、II型糖尿病(Zhou et al.，2010，Nat Immunol；Yan etal.，2013，Immunity)、动脉粥样硬化(Duewell et a1.，2010，Nature)、痛风(MartinonF，etal，2006，nature)、非酒精性脂肪肝炎以及非酒精性脂肪肝病(Csak T et al，2011，Hepatology；Wree A，2014， Hepatology)、酒精性肝病(Cui K，2015，Hepatology)、肾病(Norihiko Sakai， 2016，kidney international)、家族性冷自发炎综合征(FCAS)，Muckle-Wells 综合征(MWS)，慢性婴儿神经皮肤和关节(CINCA)综合征和新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)(Kastner，D.L.et al，2010，Cell)、多发性硬化症(Gris，D et al，2010J.Immunol)、肌萎缩侧索硬化(Zhao et al，2015，J. Expneurol)，哮喘(M.J.Primiano，etal，2016，J.Immunol)、急性呼吸窘迫综合征(D.Shah et al，2014，Am.J.Physiol.LungCell.Mol.Physiol)等。这也提示可以通过抑制NLRP3炎症小体的活化来抑制相关的疾病。

目前临床治疗NLRP3炎症小体过度活化的疾病是通过抑制IL-1β的功能来实现的，主要包括IL-1β受体拮抗剂、IL-1β单克隆抗体以及IL-1β受体阻断剂(Dinarello et al.，2012)。在治疗相关疾病的NLRP3炎症小体相关疾病过程中起到了一定的作用，但是也存在一定的缺陷。首先，NLRP3 炎症小体活化时，不只导致IL-1β的成熟和分泌，其他的炎性细胞因子 IL-18、HMGB1以及细胞凋亡都有发生，而这些也参与到了NLRP3炎症小体相关疾病的发生发展过程中去。另外，IL-1β不止NLRP3炎症小体活化会产生，其他炎症小体活化过程也有产生，而通过抑制IL-1β，可能对机体的其他正常生理功能造成影响，从而产生一系列副作用。这也提示靶向NLRP3炎症小体，能更好的起到治疗相关疾病的目的。

目前已经有很多相关的NLRP3炎症小体的抑制剂，其中包括一些外源的小分子化合物如：MCC950、BAY 11-7082(Youm et al.，2015，Nat Med；Juliana et al，2010，J BiolChem)；等，天然提取物：雷公藤、胡萝卜硫素及异甘草素(Yu X，et al.，2017.Oncotarget，2017；Yang，G，et al.，2016， Sci Rep；Honda，H.，et al.，2014，J LeukocBiol)，内源的代谢产物：β羟基丁酸、前列腺素E2(Youm Y H，2015，Nature medicine；Mortimer L et al，2016，Nature immunology)等。以上抑制剂虽然对NLRP3炎症小体相关的疾病都有一定的缓解作用，但是其作用机制并不够直接，而是通过其他一些信号通路起作用，副作用未知，其应用前景不明。而除了通过抑制 NLRP3炎症小体相关上游信号来抑制炎症小体的活化之外，还可以直接靶向NLRP3炎症小体的组分来影响NLRP3炎症小体的组装，但是ASC以及caspasel不仅在NLRP3炎症小体中起作用，在其他炎症小体活化过程中也起着至关重要的作用。所以特异性靶向NLRP3是抑制NLRP3炎症小体相关疾病的最佳选择。已经有文献报道CY-09可以直接与NLRP3结合，通过抑制NLRP3的ATP酶活性进而抑制NLRP3炎症小体的组装，从而达到干预一些NLRP3相关的疾病(Hua Jiang et al，J Exp Med，2017)。

综上所述，本领域对于特异性靶向NLRP3而抑制炎症小体活化的药物存在需求。

发明内容

本发明的目的是开发更特异性靶向NLRP3而抑制炎症小体活化的化合物或药物。

本发明人在研究中发现冬凌草甲素也能够直接与NLRP3特异性结合从而达到抑制炎症小体活化的目的。冬凌草甲素是一种传统的中药成分，安全无毒，药理作用强，而CY-09作为一种人工合成的小分子，其应用较少，副作用未知，其前景还需要进一步确定。在目前所用的动物模型上看，冬凌草甲素能够明显的缓解由高脂食物引起的II型糖尿病，并且对MSU 诱导的痛风以及腹膜炎也有明显的治疗效果，提示其在治疗NLRP3炎症小体相关的疾病中有良好的应用前景。

冬凌草甲素是中药冬凌草的成分之一，目前关于冬凌草甲素的研究主要集中在其抗癌效果，而关于其抗炎方面少有研究，有文献报道，冬凌草甲素在脓毒血症、阿尔兹海默综合症中有一定的治疗效果(Zhao et a1.， 2016，.Kaohsiung J Med Sci；Wang et al.，2014，PLoS One)，但是其起作用的具体机制还不清楚。

在本发明中，本发明人发现冬凌草甲素可能通过抑制NLRP3炎症小体来抑制炎症相关的疾病。

冬凌草甲素的结构式如图1A所示。目前已有成熟的冬凌草甲素提取技术，可以通过商业渠道购买到药用级别的冬凌草甲素。例如，用于本发明的冬凌草甲素(缩写为Ori)购自Selleck公司(货号：s2335)。并且，冬凌草甲素的结构式也已经分辨出来，也可以利用化学合成技术人工合成。

本发明人经过进一步研究发现冬凌草甲素可以直接NLRP3共价键结合，从而抑制NLRP3炎症小体的活化，进而预防和治疗NLRP3炎症小体相关的疾病，特别是对腹膜炎、痛风以及II型糖尿病的预防和治疗具有良好效果。基于此，本发明人提供了冬凌草甲素的新用途，冬凌草甲素可以抑制NLRP3炎症小体活化，干预NLRP3炎症小体相关疾病的发生发展过程。

为了充分验证冬凌草甲素的这种用途，本发明人首先进行了冬凌草甲素对NLRP3炎症小体抑制以及作用机制研究，然后建立了急性以及慢性 NLRP3炎症小体相关疾病动物模型，再用冬凌草甲素进行预防和治疗，以观察冬凌草甲素在动物水平的抗炎症小体的作用。

在第一方面，本发明人进行了冬凌草甲素对NLRP3炎症小体抑制作用的体外研究，研究发现冬凌草甲素在体外可以特异性抑制NLRP3炎症小体的活化。

在第二方面，本发明人进行了冬凌草甲素抑制NLRP3炎症小体的机制探究。在冬凌草甲素能够特异性抑制NLRP3炎症小体活化的体外研究的基础上，本发明人试图找寻冬凌草甲素是如何特异性抑制NLRP3炎症小体活化的。结果显示，冬凌草甲素能够抑制NLRP3炎症小体活化过程中炎症小体的组装，进一步探究发现其能够在外源过表达体系中直接抑制NLRP3与NEK7的相互作用，再进一步探究发现冬凌草甲素能够直接与 NLRP3结合，从而抑制NLRP3与NEK7的相互作用。

在第三方面，本发明人进行了冬凌草甲素与NLRP3结合方式以及结合位点的研究。结果显示，冬凌草甲素与NLRP3是通过共价键的方式结合的，并且是通过冬凌草甲素的碳碳双键与NLRP3的NACHT结构域上 279位半胱氨酸结合的。

在第四方面，本发明人进行了冬凌草甲素抑制NLRP3炎症小体作用的体内探究。本发明人选用了MSU诱导的腹膜炎以及关节炎的急性病模型，以及高脂食物诱导的肥胖及II型糖尿病模型，结果显示，冬凌草甲素对与MSU诱导的腹膜炎中炎性细胞浸润以及炎性细胞因子分泌都有显著的抑制，对于MSU诱导的关节肿胀以及关节中炎性因子的产生都有显著的抑制，对于高脂食物诱导的肥胖、胰岛素抵抗以及肝脏脂肪变性都有良好的缓解作用，并且以上效果都是依赖NLRP3的。同时，本发明人发现，在相同剂量下，冬凌草甲素对于正常对照鼠无影响。

基于上面的详细研究，本发明提供冬凌草甲素在制备用于预防或治疗 NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

其中，包含冬凌草甲素的药物可以配制成注射剂，通过注射的方式施用给需要的受试者。注射的方式可以是腹腔注射或关节内注射，但不限于此。

其中所述NLRP3炎症小体相关疾病包括急性NLRP3炎症小体相关疾病或慢性NLRP3炎症小体相关疾病。所述急性NLRP3炎症小体相关疾病可以选自腹膜炎或痛风等，但不限于此。所述慢性NLRP3炎症小体相关疾病可以选自II型糖尿病或高脂食物诱导的肥胖等，但不限于此。例如，所述NLRP3炎症小体相关疾病可以选自肠炎、肝炎、硅肺、石棉肺和矽肺、白塞病、类风湿关节炎、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触性超敏反应、帕金森病、抑郁症、II型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、非酒精性脂肪肝病、酒精性肝病、肾病、家族性冷自发炎综合征、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤和关节综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、哮喘或急性呼吸窘迫综合征等。

包含冬凌草甲素的药物可以用于施用给患有NLRP3炎症小体相关疾病的哺乳动物，用于治疗目的，或者用于施用给具有发展NLRP3炎症小体相关疾病的倾向的哺乳动物，用于预防目的。优选地，所述包含冬凌草甲素的药物用于人。

在一个实施方案中，所述药物由冬凌草甲素和药用赋形剂组成。本领域技术人员能够选择合适的药用赋形剂与冬凌草甲素一起配制。

本发明人还研究了可以与冬凌草甲素配伍的药物成分。这些药物成分可以与冬凌草甲素复配在一起，具有更好的预防或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的效果。

在本发明充分研究了冬凌草甲素作用于NLRP3炎症小体途径的机制的基础上，本领域技术人员能够选择可以与冬凌草甲素配伍的药物成分，这些药物成分不抵消冬凌草甲素的活性，而是具有协同作用，提高其疗效，或者，添加这些药物成分可以使其适用于复杂病情，或者，添加这些药物成分，使包含冬凌草甲素的药物获得更好的特性，例如，提高其稳定性，提高其生物利用度等等。例如，可以与冬凌草甲素配伍的药物成分包括，但不限于，抗炎药物成分、促进药物吸收的成分或减少药理损伤的成分等。例如，半枝莲、重楼、石上柏、白花蛇舌草、白毛藤等中药的主要成分可以与冬凌草甲素配伍成药物制剂。

基于上述研究，本发明提供下述技术方案：

1.冬凌草甲素在制备用于预防或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

2.根据第1项所述的应用，其中所述NLRP3炎症小体相关疾病选自急性NLRP3炎症小体相关疾病或慢性NLRP3炎症小体相关疾病。

3.根据第2项所述的应用，其中所述急性NLRP3炎症小体相关疾病选自腹膜炎或痛风。

4.根据第2项所述的应用，其中所述慢性NLRP3炎症小体相关疾病选自II型糖尿病或高脂食物诱导的肥胖。

5.根据第1项所述的应用，其中所述NLRP3炎症小体相关疾病选自肠炎、肝炎、硅肺、石棉肺和矽肺、白塞病、类风湿关节炎、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触性超敏反应、帕金森病、抑郁症、II型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、非酒精性脂肪肝病、酒精性肝病、肾病、家族性冷自发炎综合征、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤和关节综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、哮喘或急性呼吸窘迫综合征。

6.根据第5项所述的应用，其中所述NLRP3炎症小体相关疾病为非酒精性脂肪肝炎。

7.根据第1项所述的应用，其中包含冬凌草甲素的药物的剂型为注射剂。

8.根据第1项所述的应用，其中包含冬凌草甲素的药物的给药方式为腹腔注射或关节内注射。

9.根据第1项所述的应用，其中所述药物用于哺乳动物。

10.根据第9项所述的应用，其中所述药物用于人。

11.根据第1项所述的应用，其中所述药物还包括能够与冬凌草甲素配伍的其他药物成分。

12.根据第11项所述的应用，其中所述其他药物成分是抗炎药物成分、促进药物吸收的成分或减少药理损伤的成分等。

本发明的优点表现在：

第一，本发明对冬凌草甲素发掘了新的医疗作用，开辟了新的应用领域。

第二，冬凌草甲素安全无毒，药理作用强，预示着很强的药用前景。

第三，冬凌草甲素在体外可以特异性的抑制NLRP3炎症小体的活化。

第四，冬凌草甲素抑制NLRP3炎症小体的组装，并且能够在过表达体系中抑制NLRP3与NEK7的相互作用。

第五，冬凌草甲素通过本身的碳碳双键与NLRP3的半胱氨酸279位点共价键结合。

第六，通过建立急性以及慢性NLRP3炎症小体相关疾病模型，发现冬凌草甲素在体内也有很好的抑制NLRP3炎症小体活化的效果。并且本发明人发现在相同剂量下，对于正常鼠没有影响。因而，冬凌草甲素是一种相对安全的治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，

其中：

图1：(A)冬凌草甲素的结构式，Ori为冬凌草甲素的缩写；

(B)免疫印迹(WB)检测冬凌草甲素可以浓度依赖性的抑制尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的caspase1的活化以及IL-1β的分泌。

(C)ELISA检测冬凌草甲素可以浓度依赖性的抑制尼日利亚菌素 (Nigericin)诱导的IL-1β的分泌。

(D)ELISA检测冬凌草甲素对LPS诱导的TNFα的分泌没有影响。

(E)WB检测冬凌草甲素可以抑制各种NLRP3炎症小体刺激剂诱导的 caspasel的活化以及IL-1β的分泌。

(F)ELISA检测冬凌草甲素可以抑制各种NLRP3炎症小体刺激剂诱导的IL-1β的分泌。

(G)WB检测冬凌草甲素对AIM2炎症小体刺激剂诱导的caspasel的活化以及IL-1β的分泌无影响。

(H)ELISA检测冬凌草甲素对AIM2炎症小体刺激剂诱导的IL-1β的分泌无影响。

(I)WB检测冬凌草甲素对IPAF炎症小体刺激剂诱导的caspasel的活化以及IL-1β的分泌无影响。

(J)ELISA检测冬凌草甲素对IPAF炎症小体刺激剂诱导的IL-1β的分泌无影响。

图2：(A)冬凌草甲素影响NLRP3炎症小体活化过程中ASC(凋亡相关斑点样蛋白)的聚合。

(B)冬凌草甲素影响NLRP3炎症小体活化过程中NEK7与NLRP3的相互作用。

(C)冬凌草甲素影响NLRP3炎症小体活化过程中ASC与NLRP3的相互作用。

(D)冬凌草甲素影响外源的NLRP3与NEK7的相互作用。

(E)冬凌草甲素影响纯化的NLRP3与NEK7的直接的相互作用。

(F)冬凌草甲素影响外源的NLRP3与ASC的相互作用。

(G)冬凌草甲素影响外源的NLRP3与NLRP3的相互作用。

图3：(A)生物素标记的冬凌草甲素(Bio-Ori)能与NLRP3结合，不能与 NEK7结合。

(B)生物素标记的冬凌草甲素与NLRP3的结合可以被正常的冬凌草甲素竞争性抑制。

(C)生物素标记的冬凌草甲素可以与纯化的NLRP3结合。

(D)MST检测冬凌草甲素能与纯化的GFP-NLRP3结合。

(E)WB显示生物素标记的冬凌草甲素特异性的与NLRP3结合。

(F)WB显示生物素标记的冬凌草甲素与NLRP3的NACHT结构域结合。

图4：(A)洗脱冬凌草甲素之后对尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的IL-1β的分泌依然抑制。

(B)先加生物素标记的冬凌草甲素，冬凌草甲素不能够竞争性的与 NLRP3结合，先加冬凌草甲素能够竞争性的抑制生物素标记的冬凌草甲素与NLRP3结合。

(C)加入DTT(二硫苏糖醇)以及BME(β-巯基乙醇)竞争性的与冬凌草甲素结合，进而抑制其与NLRP3结合。

(D)WB显示NLRP3半胱氨酸279位点突变之后不能与生物素标记的冬凌草甲素结合。

(E)WB显示NLRP3半胱氨酸279位点突变之后依然与NEK7有相互作用，但这种相互作用不能被冬凌草甲素抑制。

图5：(A)碳碳双键破坏的冬凌草甲素R-Ori结构式。

(B)WB显示生物素标记的R-Ori不能与NLRP3结合。

(C)WB显示R-Ori不能抑制尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的caspasel 的活化以及IL-1β的分泌。

(D)ELISA显示R-Ori不能抑制尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的IL-1β的分泌。

图6：(A)ELISA显示冬凌草甲素能够抑制MSU诱导的腹膜炎中血清中 IL-1β的产生。

(B)ELISA显示冬凌草甲素能够抑制MSU诱导的腹膜炎中腹腔灌洗液中IL-1β的产生，该作用是NLRP3依赖性的。

(C)ELISA显示冬凌草甲素能够抑制MSU诱导的腹膜炎中腹腔灌洗液中中性粒细胞的聚集，该作用是NLRP3依赖性的。

(D)冬凌草甲素能够抑制MSU诱导的关节炎中关节的肿胀，该作用是NLRP3依赖的。

(E)冬凌草甲素能抑制MSU诱导的关节炎中关节中炎性因子IL-1β的产生，该作用是NLRP3依赖性的。

图7：(A)冬凌草甲素能够减少小鼠的食物摄入。

(B)冬凌草甲素能够抑制高脂食物喂养的野生型小鼠的体重增加，对 NLRP3缺陷鼠无影响。

(C)冬凌草甲素能够显著降低高脂食物喂养的野生型小鼠的禁食血糖，对NLRP3缺陷鼠无影响。

(D)冬凌草甲素能够显著降低高脂食物喂养的野生型小鼠的随机血糖，对NLRP3缺陷鼠无影响。

(E)冬凌草甲素能够显著改善高脂食物喂养的野生型小鼠的胰岛素敏感性。

(F)冬凌草甲素能够显著改善高脂食物喂养的野生型小鼠的葡萄糖耐量。

(G)冬凌草甲素对高脂食物喂养的NLRP3缺陷鼠的胰岛素敏感性无影响。

(H)冬凌草甲素对高脂食物喂养的NLRP3缺陷鼠的葡萄糖耐量无影响。

图8：(A)冬凌草甲素能够显著降低高脂食物喂养的野生型小鼠血清中的炎性因子IL-1β的产生，对NLRP3缺陷鼠无影响。

(B)冬凌草甲素能够显著降低高脂食物喂养的野生型小鼠肝脏培养上清中的炎性因子IL-1β的产生，对NLRP3缺陷鼠无影响。

(C)冬凌草甲素能够显著降低高脂食物喂养的野生型小鼠脂肪组织培养上清中的炎性因子IL-1β的产生，对NLRP3缺陷鼠无影响。

(D)冬凌草甲素能够显著降低高脂食物喂养的野生型小鼠脂肪组织中活化的caspasel产生，对NLRP3缺陷鼠无影响。

(E)冬凌草甲素能够显著改善高脂食物喂养的野生型小鼠的肝脏脂肪变性，对NLRP3缺陷鼠无影响。

图9：(A)冬凌草甲素对于正常鼠的体重无影响。

(B)冬凌草甲素对于正常鼠的食物摄取无影响。

(C)冬凌草甲素对于正常鼠的随机血糖无影响

(D)冬凌草甲素对于正常鼠的禁食血糖无影响。

(E)冬凌草甲素对于正常鼠的代谢无影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

抗鼠IL-1β抗体：R&D，AF-401-NA。

抗鼠caspase-1抗体：Adipogen，AG-20B-0042。

抗NLRP3抗体：Adipogen，AG-20B-0014。

抗β-actin抗体：Abmart，P30002。

抗ASC抗体：Santa Cruz，SC-22514。

抗NEK7抗体：Santa Cruz，SC-50756。

抗Flag抗体：Sigma，F2555。

抗VSV抗体：Sigma，V4888。

抗GFP抗体：Abmart，P30010。

辣根过氧化物酶标记抗兔抗体：Jackson IR，111-035-144。

辣根过氧化物酶标记抗鼠抗体：Jackson IR，115-035-146。

辣根过氧化物酶标记抗山羊抗体：Santa Cruz，SC-2020。

IL-1β、TNF-α、MCP-1ELISA试剂盒：R&D

CD11b和Ly6G：BD

Ori(冬凌草甲素)：Selleck，s2335。

Ultrapure LPS：Invivogen。

Nigericin(尼日利亚菌素)：Sigma，N7143。

MSU(尿酸结晶)：Sigma，U0881。

ATP：Sigma，A1852。

Protein G珠子：Millipore。

亲和素珠子：Pierce Biochemicals。

高脂食物：Research Diet Company，D12492。

葡糖糖：Sigma。

胰岛素：Nova Nordisk。

C57BL/6J：购自南京模式动物研究所。

HEK293T细胞，L-929细胞：购自ATCC

实施例1冬凌草甲素对NLRP3炎症小体抑制作用的体外研究

一、实验方法

1、L-929细胞培养上清的收取

将L-929细胞在15cm的处理培养皿(购自Fisher)中培养，待细胞铺满后收取培养上清，离心去除死细胞，然后过滤去掉其中的杂质，-20℃冰箱保存备用。

2、BMDM细胞(骨髓来源的巨噬细胞)的获取

(1)取六周龄左右野生型C57BL/6J小鼠，颈椎脱臼处死小鼠，取后肢腿骨。

(2)在超净台内，将后肢腿骨中骨髓吹出，离心。

(3)弃上清，裂解红细胞，然后用DMEM培养基(购自HyClone)中和，离心。

(4)弃上清，加入含有10％L-929培养上清的DMEM培养基(购自HyClone) 重悬细胞，分入未处理细胞培养皿(购自Corning)中培养，4天后可以使用。

3、样品缓冲液配制

体系：500ml

Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液，购自生工)(pH＝7.4)93.75ml；

SDS(十二烷基硫酸钠，购自生工)30g；

Bromphenol Blue(溴酚蓝，购自生工)150mg；

Glycenol(甘油，购自生工)172.5ml；

加H₂O至500ml

1M的DTT(二硫苏糖醇，购自Biosharp)50ml。

4、炎症小体刺激

将分化好的BMDM细胞以5×10⁵/ml分入12孔板，第二天换成含有50 ng/ml LPS的opti-MEM(购自Gibco)，刺激3小时。然后加入冬凌草甲素 (终浓度如图1B、C、D所示，如未标注则为2μM)0.5小时，再加入以下刺激剂中的一种进行刺激，尿酸结晶(MSU，150μg/ml)或者S. typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)(感染复数(MOI)为10)，4小时收样； ATP(2.5mM)、尼日利亚菌素(Nigericin，10μM)，0.5小时收样；转染 poly A：T(0.5μg/ml)，4小时收样。细胞裂解以及上清中的蛋白收集用于免疫印迹(WB)。

5、免疫印迹(WB)

(1)样品收集，101℃金属浴煮10分钟，上样，或者-20℃保存备用。

(2)聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，根据目的蛋白质分子量大小选用合适的凝胶浓度(8％-15％)，常规电泳条件(80v，30分钟， 120v，1小时)。

(3)用湿转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。

(4)用5％的脱脂牛奶封闭1小时。

(5)加入抗检测蛋白的一抗(详见下表1)，4℃摇床过夜。

(6)PBST洗三次，每次10分钟，加入上步一抗相对应的二抗(详见下表1)，室温摇床1小时。

(7)PBST洗三次，每次10分钟，用含有辣根过氧化物酶底物的显色液进行显色，用化学发光凝胶成像仪进行成像。

表1.免疫印迹(WB)中所用的一抗和二抗

6、ELISA

使用R&D公司的ELISA试剂盒，实验步骤按照R&D公司说明书进行，简述如下：

(1)按比例稀释捕获抗体，然后包板过夜。

(2)用PBST洗三次，然后用10％血清的PBS封闭，室温1h。

(3)用PBST洗三次，加入标准品及样品，室温2h。

(4)用PBST洗三次，按比例稀释并加入检测抗体，室温2h。

(5)用PBST洗三次，按比例稀释并加入HRP，室温20分钟。

(6)用PBST洗三次，加入TMB进行显色。

(7)待变色适度后加入1M硫酸进行终止，然后450nm进行读数。

(8)做标准曲线，并带入求值。

二、结果分析

结果显示，冬凌草甲素能够抑制尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的 caspasel的活化以及IL-1β分泌(图1B、C)，但是对LPS信号通路活化产生的TNF-α无影响，也就是说，冬凌草甲素特异性的影响炎症小体活化的过程(图1D)。

NLRP3炎症小体的活化剂多种多样，本发明人采用经典的炎症小体刺激剂MSU、ATP、Nigericin来活化NLRP3炎症小体，结果显示，冬凌草甲素对它们活化的NLRP3炎症小体依然有很好抑制效果，也就是说，冬凌草甲素能够抑制各种经典的NLRP3炎症小体刺激剂活化的炎症小体(图 1E、F)。

炎症小体除了NLRP3炎症小体之外，还有其他的炎症小体，于是本发明人又对冬凌草甲素的专一性进行了探究，结果显示，其对AIM2以及 IPAF炎症小体的活化没有影响，只对NLRP3炎症小体的活化有抑制效果 (图1G、H、I、J)。

总结以上结果可以得到结论：冬凌草甲素能够特异性的抑制NLRP3 炎症小体的活化，而对AIM2、IPAF炎症小体无影响。其具体的抑制机制还需要进一步探究。

实施例2冬凌草甲素抑制NLRP3炎症小体活化的机制

一、实验方法

1、ASC(凋亡相关斑点样蛋白)聚合实验

(1)将分化好的细胞分至6孔板，进行正常的炎症小体刺激，收取上清蛋白进行WB，然后将细胞用预冷的PBS洗三次，加入300ul预冷的NP40(购自碧云天)，4℃摇床裂解0.5小时。

(2)4℃330g离心10分钟，弃上清，然后用预冷的PBS洗三次，用500 μl PBS重悬。

(3)加入DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺，购自生工)，终浓度为2mM，然后室温转盘30分钟。

(4)330g离心10分钟，弃上清，加入样品缓冲液，101℃金属浴，10分钟，上样或者-20℃保存备用。

2、内源的免疫共沉淀

(1)将分化好的BMDM细胞分至6孔板，进行正常炎症小体刺激。

(2)弃上清，然后加入300μl预冷的NP40，4℃摇床30分钟。

(3)8000rpm，4℃，10分钟，将上清转移至新的1.5ml EP管。取50μl 进行WB，剩下的进行免疫共沉淀。

(4)Protein G珠子(购自millipore)用NP40进行平衡，8000rpm，1 分钟，重复三次。

(5)将珠子以及抗体和对照IgG加入步骤(3)的剩余上清中，4℃转盘， 2小时。

(6)用NP40对珠子进行洗脱，8000rpm，1分钟，重复三次，加入样品缓冲液，101℃金属浴，10分钟，然后上样或者-20℃保存备用。

3、外源的免疫共沉淀

(1)293T细胞分至六孔板，第二天进行质粒转染。

(2)转染8小时后加入冬凌草甲素(用量见图2D、F、G示，如未标明则为2.5μM)。

(3)转染24小时后，用预冷的300μl NP40裂解，4℃摇床30分钟。

(4)8000rpm，4℃，10分钟，将上清转移至新的1.5ml EP管。取50μl 进行WB，剩下的进行免疫共沉淀。

(5)Flag珠子(购自Sigma)用NP40进行平衡，8000rpm，1分钟，重复三次。

(6)将Flag珠子加入步骤(4)的剩余上清中，4℃转盘，2小时。

(7)用NP40对珠子进行洗脱，8000rpm，1分钟，重复三次，加入样品缓冲液，101℃金属浴，10分钟，然后上样或者-20℃保存备用。

4、生物素Pull Down(蛋白质体外结合实验)

(1)BMDM细胞分至六孔板，加入LPS刺激3小时，然后加入300μl 预冷的NP40进行裂解，4℃摇床30分钟。

(2)8000rpm，4℃，10分钟，将上清转移至新的1.5ml EP管。取50μl 进行WB，剩下的进行生物素pull down实验。

(3)先将亲和素珠子与裂解液共孵育2小时，以去掉非特异性蛋白。然后离心，取上清转移到新的1.5ml EP管中

(4)加入生物素标记的冬凌草甲素以及亲和素珠子共同孵育，4℃转盘2 小时。

(5)然后离心去上清，用NP40洗5次，每次1分钟，加入样品缓冲液， 101℃金属浴，10分钟，然后上样或者-20℃保存备用。

(6)如果为过表达的体系，分293T细胞至六孔板，然后进行质粒转染， 24小时后，用NP40裂解，余下步骤全部相同。

5、纯化蛋白

(1)构建His-GFP-NLRP3以及His-Flag-NEK7质粒(方法可参见：Hua Jiang et al，J Exp Med，2017)。

(2)将质粒转染至293T细胞中，48小时后，用NP40裂解，4℃，30分钟。

(3)然后14000rpm，4℃离心15分钟。

(4)然后过镍柱纯化。然后将洗脱液用10kD的分离柱进行浓缩，浓缩到5ml时过分子筛，然后根据分子量收集蛋白。

(5)蛋白用银染进行染色鉴定。

6、MST(微量热泳动)实验

(1)将冬凌草甲素用DMSO进行3倍倍比稀释。

(2)然后将上步样品再用蛋白溶液(50mM Hepes，10mM MgCl₂，100 mM NaCl和0.05％Tween 20(试剂均购自国药集团)，调节pH至7.5) 稀释100倍。

(3)将上步样品与200nM纯化蛋白进行孵育，40分钟。

(4)样品被装载进入NanoTemper玻璃毛细管，并使用100％LED功率和 80％MST功率进行MST。

二、结果分析

NLRP3炎症小体不仅能识别外源的病原相关分子模式，而且能识别内源的危险相关分子模式。由于NLRP3炎症小体的活化剂多种多样，所以目前NLRP3炎症小体活化的具体机制还不是很清楚。一般来说，在激动剂的作用下，会导致细胞内钾离子外流、溶酶体破碎以及线粒体活性氧增加，进而通过一系列级联信号，导致NEK7与NLRP3结合，从而促进NLRP3与ASC的相互作用，介导炎症小体的组装。本发明人为了探究冬凌草甲素抑制NLRP3炎症小体活化的具体机制，首先检测了炎症小体活化过程中ASC的聚合情况，结果显示，冬凌草甲素能够浓度依赖性的抑制炎症小体活化过程中的ASC聚合(图2A)。随后本发明人对其是否影响上游的NEK7与NLRP3以及NLRP3与ASC的相互作用进行了探究，结果显示冬凌草甲素抑制了炎症小体活化过程中NEK7与NLRP3以及NLRP3与 ASC的相互作用(图2B、C)。随后本发明人用外源过表达体系探究冬凌草甲素对于NEK7与NLRP3的相互作用的影响，结果显示，冬凌草甲素影响外源的NEK7与NLRP3的相互作用(图2D)。为了进一步确定这一结果，本发明人用纯化的NEK7、NLRP3蛋白进行了验证，结果显示，冬凌草甲素能够直接抑制NEK7与NLRP3的相互作用(图2E)。但是冬凌草甲素对于外源的NLRP3与ASC以及NLRP3与NLRP3的相互作用没有影响(图2F、G)。

以上结果提示，冬凌草甲素可能通过与NLRP3或者NEK7结合，从而起到抑制效果。为了对这假设进行验证，本发明人用生物素标记的冬凌草甲素去与BMDM全细胞裂解液进行蛋白质体外结合实验，结果显示生物素标记的冬凌草甲素能与NLRP3结合，不能与NEK7结合(图3A)，并且这种结合作用能够被冬凌草甲素竞争性抑制(图3B)。为了进一步验证这一结果，本发明人用纯化的GFP-NLRP3蛋白进行了体外的Pull down，结果显示，生物素标记的冬凌草甲素能够直接与GFP-NLRP3直接结合(图 3C)，随后的MST实验得到了同样的结论(图3D)。随后对其特异性进行分析，结果显示，冬凌草甲素特异性与NLRP3结合，与AIM2、IPAF、以及NLRP1无结合(图3E)。随后对其与NLRP3结合的具体结构域进行确定，结果显示，与NLRP3的NACHT结构域结合。

综合以上结果，本发明人发现冬凌草甲素能够与NLRP3结合，进而抑制NLRP3与NEK7的相互作用，从而抑制了炎症小体的组装起到了抑制炎症小体活化的作用。进一步研究发现，冬凌草甲素是与NLRP3的 NACHT结构域起相互作用，但是，与NLRP3结合的具体位点，以及冬凌草甲素是怎样与NLRP3结合的还需要进一步探究。

实施例3冬凌草甲素与NLRP3结合方式以及结合位点的研究

一、实验方法

1、洗脱实验

分BMDM细胞至12孔板，第二天加入LPS刺激3小时，然后加入冬凌草甲素，洗脱组在加入冬凌草甲素15分钟后，用不含冬凌草甲素的培养基进行替代，5分钟后再重复一次，共洗脱3次，然后正常炎症小体刺激收样，进行ELISA。

2、炎症小体刺激，同实施例1。

3、生物素Pull Down(蛋白质体外结合实验)，同实施例2。

4、外源的免疫共沉淀，同实施例2。

二、结果分析

蛋白与小分子之间的结合有共价键结合和非共价键结合，为了探究冬凌草甲素与NLRP3结合的方式，本发明人进行了洗脱实验，结果显示，当本发明人对冬凌草甲素进行洗脱之后，其依然能起到抑制炎症小体活化的效果(图4A)，这也提示其结合方式可能是共价键结合。随后本发明人做了一个竞争性实验，结果显示，当先加入生物素标记的冬凌草甲素之后再加入空白的冬凌草甲素，不能竞争性的抑制其与NLRP3的结合(图4B)。这提示这种结合方式是共价键进行结合的，是不可逆的，所以洗脱之后依然有抑制炎症小体活化的效果，先加入的把位点占了之后导致后加的不能与NLRP3结合。已经有文献报道(Zhen T，et al，2012，Science translational medicine)冬凌草甲素能够通过碳碳双键与硫醇基团进行共价键结合，本发明人推测冬凌草甲素与NLRP3的结合，可能也是通过碳碳双键与硫醇基团共价键结合的。于是，本发明人用富含硫醇基团的DTT(二硫苏糖醇) 以及BME(β-巯基乙醇)竞争性的与冬凌草甲素结合，结果显示，加入 DTT或者BME之后能够抑制冬凌草甲素与NLRP3的结合(图4C)。在蛋白中富有硫醇基团的是半胱氨酸，之前报道冬凌草甲素也是通过半胱氨酸与蛋白发生相互作用的，本发明人推测冬凌草甲素与NLRP3结合是通过半胱氨酸起作用的，于是本发明人把NLRP3的NACHT结构域中的半胱氨酸进行了突变，结果显示，当本发明人把279位的半胱氨酸突变之后， NLRP3就不能与冬凌草甲素结合(图4D)，虽然突变之后NLRP3依然与 NEK7有相互作用，但这种相互作用不能被冬凌草甲素所抑制，提示冬凌草甲素是通过NLRP3上的279半胱氨酸起作用的(图4E)。

既然NLRP3是通过279位半胱氨酸起作用的，那么冬凌草甲素是否通过碳碳双键起作用呢？本发明人构建了碳碳双键突变的冬凌草甲素 (R-Ori)(图5A)以及生物素标记的R-Ori，发现其不能与NLRP3结合 (5B)，并且不能抑制炎症小体的活化(5C、D)，也就是说冬凌草甲素是通过碳碳双键起作用的。

综上，本发明人发现冬凌草甲素在体外能够特异性的抑制NLRP3炎症小体的活化，并且这种抑制作用是通过冬凌草甲素的碳碳双键与NLRP3 的279位半胱氨酸结合，进而抑制NLRP3与NEK7的相互作用，从而抑制炎症小体组装。其在体内是否同样起到抑制炎症小体活化的作用还需要进一步探究。

实施例4冬凌草甲素抑制NLRP3炎症小体作用的体内探究

1、MSU诱导的关节炎模型

(1)取NLRP3^-/-以及WT小鼠(NLRP3^-/-小鼠由Jurg Tschopp惠赠，WT 小鼠购自南京模式动物研究所)，进行称重，并测量关节宽度。

(2)然后左脚膝关节注入冬凌草甲素(20mg/Kg)，右脚膝关节注入等体积的DMSO。

(3)0.5h后在膝关节处注入MSU，随后在1，6，12，24h测量关节宽度。

(4)随后杀死小鼠，并将关节取出，放入加有100μl培养基的12孔板中培养0.5h，随后检测IL-1。

2、MSU诱导的腹膜炎模型

(1)取NLRP3^-/-以及WT小鼠，称重，并进行编号。然后腹腔注射冬凌草甲素，20mg/kg，对照组注射含有10％DMSO的PBS，0.5小时后注射 MSU，50mg/kg。

(2)6小时后，摘除眼球放血，并收集血清，放血完毕后颈椎脱臼处死小鼠。

(3)用1ml PBS冲洗腹腔，吸出的PBS，3000rpm离心5分钟，上清用来检测细胞因子，沉淀细胞用来分析炎性细胞浸润。第1ml后，再用相同的方法冲洗腹腔，以收集腹腔内的细胞，用量大概为10ml，可每次用2-4ml冲洗。

(4)将后10ml冲洗液连带第1ml沉淀的细胞，离心，2000rpm，10分钟。

(5)弃上清，加入1ml红细胞裂解液，2-3分钟。9ml DMEM中合， 2000rpm，离心10分钟。

(6)弃上清，1ml DMEM重悬，过滤至1.5ml EP管，3000rpm，1分钟。

(7)弃上清，80μl大鼠血清冰上封闭30分钟。

(8)混匀，取5μl/管到100μl PBS+Ab(ly6g pp5.5)，冰上30分钟。

(9)加入1ml PBS，3000rpm，5分钟，再用300μl PBS重悬，过滤至流式管上样。

3、高脂食物诱导的肥胖模型

取6-8周的体重相近以及血糖相近的NLRP3^-/-小鼠(NLRP3^-/-小鼠惠赠于JurgTschopp)以及野生型C57BL/6J小鼠(购自南京模式动物研究所) 进行随机分组。然后喂养高脂食物(购自Research Diet Company， D12492i)，12周，随后腹腔注射冬凌草甲素(注射量为3mg/kg，冬凌草甲素溶于含有10％DMSO的PBS)，并记录体重，饮食，6周后进行后续实验，在后续实验过程中继续注射冬凌草甲素及饲喂高脂食物。

4、血糖检测

尾静脉放血，然后用血糖测试系统套件(购自强生公司)进行检测。

5、胰岛素敏感性实验

小鼠禁食4小时，然后检测0分钟时血糖，随后注射胰岛素0.75U/kg，然后在15分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟检测血糖。

6、葡萄糖耐量实验

小鼠禁食14小时后，检测0分钟时血糖，随后注射葡萄糖1.5g/kg，然后在15分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟检测血糖。

7、组织培养及炎性因子检测

取0.5g肝脏或者脂肪组织置于含有2ml培养基的六孔板中，在细胞培养箱中培养24小时，随后离心取上清，进行ELISA检测。

8、HE(苏木精-伊红)染色

小鼠组织用PBS洗涤3次，然后固定在4％PFA中，并在石蜡包埋后切片。使用标准程序制备切片并用H&E染色。在Nikon ECLIPSE Ci生物显微镜下检查载玻片，并用Nikon DS-U3彩色数码相机拍摄图像。

结果分析

为了探究冬凌草甲素在体内的抗炎症小体的效果，本发明人首先使用了急性NLRP3炎症小体相关疾病模型：MSU诱导的关节炎和腹膜炎。结果显示，冬凌草甲素能够显著抑制MSU诱导的腹膜炎中血清以及腹腔灌洗液里的炎性因子IL-1β，以及中性粒细胞的募集，并且是NLRP3依赖性的(图6A、B、C)。冬凌草甲素能够抑制MSU诱导的关节炎中关节肿胀以及关节中IL-1β的产生，并且是NLRP3依赖性的(图6D、E)。综上，冬凌草甲素对于急性关节炎和腹膜炎都有良好的效果。

随后本发明人用高脂食物诱导的肥胖鼠，这是一种长期慢性NLRP3 炎症小体相关疾病模型。结果显示，给药组相对于对照组，食物摄取以及体重都有明显的降低，而对NLRP3缺陷鼠无效果(图7A、B)。长期肥胖会导致II型糖尿病，II型糖尿病是胰岛素相对不足引起的血糖升高的一种代谢性疾病。结果显示，相对于对照组，实验组的随机血糖以及禁食血糖有显著的降低，但对NLRP3缺陷鼠无影响(图7C、D)，并且其胰岛素敏感性以及葡萄糖耐量有明显的改善(图7E、F)，但是对于NLRP3缺陷鼠无影响(图7G、H)。并且发现，冬凌草甲素能够明显改善由高脂食物引起的肝脏脂肪变性，但是对NLRP3缺陷鼠没有影响(8E)。

在II型糖尿病的发生发展过程中，脂肪组织以及肝脏组织中NLRP3 依赖的慢性炎症起了非常重要的作用。本发明人检测了冬凌草甲素治疗之后的炎性状态，结果显示，实验组相对于对照组，血清以及肝脏、脂肪组织培养上清中的炎性因子的分泌有明显的降低，并且发现脂肪组织中 caspasel也有显著降低(图8A、B、C、D)。

随后本发明人探究了冬凌草甲素对于正常鼠的影响，本发明人对正常鼠腹腔给药42天，并监测其体重以及摄食情况，发现对于正常鼠，冬凌草甲素不影响体重和食物摄取(图9A、B)，然后检测了随机血糖和禁食血糖，发现也无明显变化(图9C、D)，随后对一些代谢指征进行了检测，发现也无影响(图9E)。这些结果充分说明冬凌草甲素相对安全。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (10)

1.冬凌草甲素在制备用于预防或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述NLRP3炎症小体相关疾病选自急性NLRP3炎症小体相关疾病或慢性NLRP3炎症小体相关疾病。

3.根据权利要求2所述的应用，其中所述急性NLRP3炎症小体相关疾病选自腹膜炎或痛风。

4.根据权利要求2所述的应用，其中所述慢性NLRP3炎症小体相关疾病选自II型糖尿病或高脂食物诱导的肥胖。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述NLRP3炎症小体相关疾病选自肠炎、肝炎、硅肺、石棉肺和矽肺、白塞病、类风湿关节炎、紫外线所诱导的皮肤晒伤、接触性超敏反应、帕金森病、抑郁症、II型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、非酒精性脂肪肝病、酒精性肝病、肾病、家族性冷自发炎综合征、Muckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤和关节综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化、哮喘或急性呼吸窘迫综合征。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述NLRP3炎症小体相关疾病为非酒精性脂肪肝炎。

7.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物用于哺乳动物。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述药物用于人。

9.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物还包括能够与冬凌草甲素配伍的其他药物成分。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述其他药物成分是抗炎药物成分、促进药物吸收的成分或减少药理损伤的成分等。