CN110129278A

CN110129278A - 杂交瘤细胞株cmomp-5d7及其分泌的单克隆抗体与应用

Info

Publication number: CN110129278A
Application number: CN201910469550.0A
Authority: CN
Inventors: 刘威; 周丹娜; 袁芳艳; 田永祥; 刘泽文; 郭锐; 杨克礼; 段正赢; 高婷; 梁婉; 吴修竹
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110129278B

Abstract

本发明提供一种杂交瘤细胞株CMOMP‑5D7及其分泌的单克隆抗体，该杂交瘤细胞株CMOMP‑5D7的保藏号为CCTCC NO：C2012141；该单克隆抗体免疫活性好，效价高达1×10⁵，具有很强的特异性；本发明利用单克隆抗体建立的阻断ELISA检测试剂盒与方法的试验结果表明，所获得的单克隆抗体能针对羊流产嗜性衣原体MOMP外膜蛋白进行检测，具有很强的特异性，批内、批间重复性好，稳定性高，该方法与普通ELISA方法相比，减低了对重组蛋白纯化的要求，提高了检测的特异性；与间接血凝IHA方法相比，提高了检测的敏感性，结果判定更加客观，可用于大批量样品的检测。

Description

杂交瘤细胞株CMOMP-5D7及其分泌的单克隆抗体与应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株CMOMP-5D7及其分泌的单克隆抗体与应用。

背景技术

羊流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus，C.abortus)是一种大小0.2-1.0μm的革兰氏阴性菌，属于衣原体科嗜性衣原体属，能引起怀孕母羊流产、死胎、产弱仔等慢性接触性传染病(Siarkou V，Lambropoulos AF，Chrisafi S.Subspecies variation inGreek strains of Chlamydophila abortus.Vet Microbiol.2002.85:145-157)。该病广泛分布于世界各地，对畜牧业造成巨大的经济损失，孕妇也可感染而发生流产，从而影响公共卫生。衣原体主要外膜蛋白(Major outer membrane protein，MOMP)在外膜中约占60％，是一种相对保守的功能蛋白，在维持衣原体结构完整性中起重要作用，并且MOMP具有种、属和血清型特异性抗原决定簇，可作为衣原体的诊断靶标。

在衣原体诊断方面，病原分离培养一直是嗜性衣原体检测的金标准，但由于衣原体培养较为困难，分离时间较长且工作量大，在临床检测应用中具有很大的限制。目前临床上常用的病原学检测方法有根据脂多糖LPS建立的衣原体直接免疫荧光检测试剂盒(英国OXOID公司)和放大酶联免疫吸附实验(PCE-ELISA)。在抗体检测方面，以色列研发了以LPS作为包被抗原的间接荧光试剂盒Savyon Diagnostics(Brade H，Brade L，NanoF.Chemical and serological investigations on the genus-specificlipopolysaccharide epitope of Chlamydia.Proc Natl Acad Sci.1987.84(8):2508-12)，英国以POMP90-3为包被抗原建立了MVD-Enfer酶联免疫吸附抗体检测试剂盒(Longbottom D，Fairley S，Chapman S，et al.Serological diagnosis of ovineenzootic abortion by enzyme-linked immunosorbent assay with a recombinantprotein fragment of the polymorphic outer membrane protein POMP90ofChlamydophila abortus.J Clin Microbiol.2002.40(11):4235-43)。湖北省农科院畜牧兽医研究所和中国农科院兰州兽医研究所联合研制了IHA商业化的试剂盒，IHA方法对设备要求不高，简便易行，但灵敏度不高，结果判断易受主观因素影响。进口免疫荧光检测试剂盒和酶联免疫吸附实验试剂盒虽然可信度较高，但价格昂贵、也不利于临床普及。基于此，研制敏感、特异、符合我国国情的新型衣原体检测方法将成为防制该病的重要方向。

发明内容

本发明的目的在于提供了杂交瘤细胞株CMOMP-5D7及其分泌的单克隆抗体与应用，本发明利用单克隆抗体建立的羊流产嗜性衣原体阻断ELISA检测试剂盒，能针对羊流产嗜性衣原体MOMP外膜蛋白进行检测，具有很强的特异性，批内、批间重复性好，稳定性高。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供杂交瘤细胞株CMOMP-5D7，其保藏号为CCTCC NO：C2012141。

本发明的目的之二在于提供一种杂交瘤细胞株CMOMP-5D7的制备方法，所述杂交瘤细胞株通过以下步骤制备：

步骤1、扩增羊流产嗜性衣原体MOMP基因编码区序列，插入原核表达载体pET28a，得到重组表达质粒pET28a-MOMP；

步骤2、将重组表达质粒pET28a-MOMP转化至大肠杆菌，加入诱导剂诱导MOMP重组蛋白的表达；

步骤3、纯化MOMP重组蛋白，再通过免疫实验动物、免疫后动物脾脏细胞与骨髓瘤融合，得到杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株通过筛选得到只分泌针对重组MOMP蛋白抗体的阳性细胞株，即得到该杂交瘤细胞株CMOMP-5D7。

本发明的目的之三在于提供一种羊流产嗜性衣原体重组MOMP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列添加标签序列衍生的蛋白质也在本发明的保护范围之内。标签的添加使蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连上常用标签(Poly-Arg，序列为5-6个R；Poly-His，序列为2-10个H；FLAG，序列为DYKDDDDK)。

本发明的目的之四在于提供所述的羊流产嗜性衣原体重组MOMP蛋白在制备羊流产嗜性衣原体检测试剂及试剂盒中的应用。

本发明的目的之五在于提供一种羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体，所述MOMP单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株CMOMP-5D7或其传代细胞株分泌产生。

本发明的目的之六在于提供所述的羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体在制备羊流产嗜性衣原体检测试剂及试剂盒中的应用。

本发明的目的之七在于提供一种羊流产嗜性衣原体阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：

(A)包被有所述的羊流产嗜性衣原体重组MOMP蛋白的ELISA酶标板；

(B)标准阴性血清；

(C)标准阳性血清；

(D)酶标单抗，所述单抗为所述的羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

本发明的目的之八在于提供一种羊流产嗜性衣原体阻断ELISA抗体检测方法，所述方法包括如下步骤：

S1、在酶标板中包被抗原，所述抗原为所述的羊流产嗜性衣原体重组MOMP蛋白；

S2、加入待测血清与所述包被的抗原孵育；

S3、洗板后，加入酶标单抗再次孵育，所述酶标单抗为所述的羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体；

S4、加入底物显色，测OD值。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明构建了重组表达MOMP蛋白的质粒pET28a-MOMP；获得了去除信号肽区域的MOMP重组蛋白，信号肽的去除增加了MOMP的表达水平和蛋白纯化效率。

2、本发明筛选获得了抗MOMP的单克隆抗体，并从杂交瘤细胞染色体数目、腹水纯化，以及单克隆抗体的亚型、效价、单抗酶标等方面，对所获得的单克隆抗体生物学特性进行了系统鉴定，其中，

(1)亚型是IgG1；

(2)该单克隆抗体免疫活性好，效价高达1×10⁵，并且具有很强的特异性；结果均表明所获得的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的能力强，酶标后稳定，单克隆抗体效价高。

3、本发明利用单克隆抗体建立的阻断ELISA检测试剂盒与方法的试验结果表明，所获得的单克隆抗体能针对MOMP外膜蛋白进行检测，具有很强的特异性，批内、批间重复性好，稳定性高，与现行标准检测方法(NY/T 562-2015)IHA的整体符合率为89.9％，阳性符合率为81.3％，阴性符合率为90.8％。该方法与普通ELISA方法相比，减低了对重组蛋白纯化的要求，提高了检测的特异性；与间接血凝IHA方法相比，提高了检测的敏感性，结果判定更加客观，可用于大批量样品的检测。

其中，本发明的杂交瘤细胞株CMOMP-5D7的保藏日期为2012年9月25日，保藏编号为CCTCC NO：C2012141。保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

图1为本发明中重组质粒pET28a-MOMP的原核表达的胶图。图中M：蛋白分子量；1：pET28a-MOMP(BL21)未诱导；2：pET28a-MOMP(BL21)22℃IPTG诱导16h；3：pET28a-MOMP(BL21)37℃IPTG诱导4h；4：pET-30a(+)(BL21)未诱导；5：pET-30a(+)(BL21)22℃IPTG诱导16h；6：pET-30a(+)(BL21)37℃IPTG诱导4h；

图2为本发明中重组蛋白pET28a-MOMP的免疫学活性分析的Western blot结果。图中M：蛋白分子量；P：MOMP与阳性血清反应；N：MOMP与阴性血清反应；

图3为重组蛋白pET28a-MOMP纯化后的SDS-PAGE图；M：蛋白marker；1-6：50mmol/L咪唑；7-9：150mmol/L咪唑；

图4为血清最佳工作浓度的筛选；

图5为血清最佳反应时间的筛选；

图6为酶标单抗最佳反应时间的筛选。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 MOMP基因的克隆

1、引物的设计(见表1所示)

表1-PCR引物

表1引物序列中下划线部分是对应的酶切位点，表1的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2、MOMP基因的扩增

以流产衣原体HB1043株基因组DNA为模板，对MOMP基因(GenBank登录号JN411078.1)进行扩增。PCR扩增的体系见表2所述：

表2-PCR扩增体系

MOMP基因序列的扩增条件为：94.0℃2min变性后进入循环，循环参数为：94.0℃15s，58.0℃30s，72.0℃1min，35个循环后72.0℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增得到长906bp的DNA片段(MOMP)(见序列表SEQ ID NO：1所示)。

3、重组质粒pET28a-MOMP的构建

利用引物MOMP-F、MOMP-R对MOMP基因进行PCR扩增，获得缺失MOMP N端信号肽的截短MOMP基因，回收该基因片段并用BamH I和Sal I双酶切后，插入到pET-28a(+)(Novagen，德国)的BamH I和Sal I位点之间，获得重组质粒pET28a-MOMP。经酶切鉴定证实重组质粒构建正确，测序鉴定证实无碱基误配。

实施例2重组质粒pET28a-MOMP的原核表达

1、质粒的转化

将含有羊流产衣原体MOMP基因的表达质粒pET28a-MOMP(卡那抗性)转化大肠杆菌BL21感受态细胞。

具体操作如下：

(1)取100μL大肠杆菌BL21感受态细胞悬液转移到无菌的1.5ml EP管中，加入3μL连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。

(2)将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒。

(3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

(4)每管加400μL LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌复苏。为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/分。

(5)取100μL转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。

(6)将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12～16h可出现菌落。

2、原核表达

挑取单菌落扩大培养，使用质粒小量提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取其质粒进行酶切鉴定并保存菌液。鉴定正确后，将保存的菌液按照1：1000的体积比进行复苏。次日，按照1：100的体积比进行诱导。在终浓度为0.8mM IPTG、37℃和180r/min的条件下进行诱导。分别在诱导前和诱导后取样1mL，并以转化pET-28a载体的E.coli BL21(DE3)的细菌诱导产物作为空白对照。12000r/min离心1min后，加入100μL ddH₂O重悬菌液后，加入25μL 5×Loading Buffer，在100℃的沸水中煮沸10min，冰浴10min后，通过12％SDS-PAGE进行样品分析，确定重组的原核蛋白是否表达(图1)。

在进行SDS-PAGE检测时，上样前，将所有的样品10000r/min离心1min，抽取位于样品液面上层的样品上样。另外，以羊流产衣原体的阳性血清作为抗体进行WesternBlotting分析，验证重组蛋白是否具有免疫学活性(图2)。

在确定原核重组蛋白可以稳定表达后，再次诱导100mL重组菌，通过高压破碎仪破碎后，12000r/min离心10min，将上清和沉淀分别煮样，进行12％SDS-PAGE检测，确定重组蛋白的表达形式，结果显示pET28a-MOMP重组蛋白主要以包涵体形式存在。

实施例3 pET28a-MOMP融合蛋白的纯化

实施例2得到的pET28a-MOMP重组蛋白主要以包涵体形式存在，采用NiSepharose6Fast Flow(GE)进行纯化，纯化步骤如下：

将诱导4h后的菌液200mL，12000r/min离心1min，弃掉上清，将沉淀用Buffer A(1/10)重悬，置于-80℃冰箱，反复冻融三次后，用超高压波破碎仪将其破碎，12000r/min离心30min，上清留存，沉淀用Buffer A(1/10)洗涤两次后重悬，加入20mL镍柱用平衡缓冲液(含8mol/L尿素)，置于冰上备用。

使用GE公司NiSepharose 6Fast Flow亲和层析柱进行蛋白纯化。具体操作步骤按使用说明书进行。最后洗脱时采用咪唑浓度梯度洗脱，咪唑浓度分别为25、50、75、100、150、250、500mmol/L的洗脱液洗脱目的蛋白，通过SDS-PAGE检测其纯度(图3)；洗脱完成后，将纯度高的蛋白集中后加复性剂使蛋白复性；最后使用蔗糖透析袋浓缩法对蛋白进行浓缩；收集蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，1.5mL离心管分装，-80℃保存。

实施例4 MOMP单克隆抗体制备

1、动物免疫

衣原体接种后致死的鸡胚卵黄囊液经甲酸灭活后离心取上清与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等量混合，乳化完全后作为免疫原。免疫方案如下：初免小鼠颈背部皮下多点注射(免疫原+弗氏完全佐剂)；二免和三免腹腔注射(免疫原+弗氏不完全佐剂)，间隔均为两周。二免后7d和三免后7d断尾釆血测效价。融合前3d采用不加佐剂的卵黄囊膜研磨液离心后上清腹腔注射加强免疫。

2、细胞融合

融合前3天，复苏SP2/0骨髓瘤细胞。在无菌条件下取小鼠上述免疫后的脾脏，制备脾细胞，并分别吸取1×10⁸个脾细胞和2×10⁷个骨髓瘤细胞的悬液，在融合剂PEG4000作用下，进行融合。将融合细胞用HAT选择培养悬浮均匀并加入铺有饲养细胞的96孔细胞板中，每孔100μL，置于5％CO₂培养箱内培养。每天观察记录细胞生长情况。

3、杂交瘤细胞的筛选和克隆

待融合后的细胞克隆生长到覆盖细胞孔底部1/4～1/3后，经间接ELISA检测呈阳性的细胞孔采用有限稀释法进行克隆。具体步骤如下：制备饲养细胞，于克隆的前一天晚上铺板，每孔一滴；用断头的200μL的枪头吹匀细胞，根据细胞量的多少进行计数；在96孔细胞培养板中，按照10个/孔，5个/孔，1个/孔，每个浓度4列；用含HT的完全培养基稀释至适当浓度后接种于一块培养板上。以后克隆均使用不含HT的完全培养基。置于培养箱中培养。一般4天后即可见到小的细胞集落，7天后补液，10天后检测抗体。一般需克隆2-4次，直至出现集落的孔阳性率为100％。

4、杂交瘤细胞染色体计数

将杂交瘤细胞传代后36-48h处于生长对数期时加秋水仙素，终浓度为0.04μg/mL，继续培养5h；吹匀细胞后于10mL离心管中，1000r/min，10min，弃去上清液；加入37℃预温的0.075mol/L的KCL低渗溶液5mL，吹打细胞使其悬浮混匀，37℃水浴15-20min；加入固定液5mL，1000r/min，10min，弃上清；加固定液5mL，轻轻混勾，静置30min，1000r/min，10min，弃上清；再次固定，同上步；加固定液5mL，混匀，封管口，4℃过夜；1000r/min，10min，弃上清，留下0.5mL上清，混匀，用滴管吸取细胞悬液，自10-20cm高处滴在4℃预冷的载玻片上，立即吹散，使细胞平铺其上，自然干燥；10％Giemsa染色10min，用自来水洗去染液，自然干燥；选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察计数。每个细胞株计10个细胞的染色体数，计算平均值，平均值为89.5条/个细胞。

5、腹水纯化

辛酸硫酸铵法：5mL腹水加适量二氧化硅，混匀，加等体积巴比妥缓冲液，室温振荡1h；静置30min；4℃，12000r/min，15min；弃沉淀，上清中加两倍上清体积的醋酸缓冲液，调pH至4.5；边搅拌边加正辛酸33μL/mL(原腹水体积)，室温搅拌30min；4℃，静置2h，使其充分沉淀；4℃，12000r/min，30min；取上清，0.45μm滤器过滤后加体积的1/10的10×PBS，调pH7.4；边搅拌边加入同体积的饱和硫酸铵溶液(用前氨水调pH 7.4)；4℃，静置1h；4℃，12000r/min，30min，弃上清；沉淀用pH 7.4的PBS重悬溶解；透析除盐。对纯化后的单抗釆用蔗糖浓缩，SDS-PAGE检测纯化效果，结果显示纯化后杂蛋白基本被除去。

6、单克隆抗体酶标

取适量单抗，用生理盐水将浓缩后单抗浓度调整为1mg/mL，利用GalaxyBio公司Fastlink A型酶标试剂盒对单抗进行HRP标记。标记完成后，用重组的MOMP作为包被抗原，间接ELISA方法检测酶标单抗的效价。

表3-纯化抗体特性表

实施例5阻断ELISA检测方法的建立

1、最佳抗原包被浓度及酶标单抗工作浓度的选择

将抗原蛋白MOMP按从4μg/mL开始横向倍比稀释6个梯度至0.125μg/mL，包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤板子5遍，加入1％的BSA封闭2h；用PBST洗涤ELISA板5遍，加2倍稀释的标准阴性血清和阳性血清37℃反应1h；用PBST洗涤ELISA板5次，加入酶标单抗按照1:8000-1:64000横向倍比稀释，进行阻断ELISA方阵实验。

表4-抗原包被浓度与酶标单抗工作浓度方阵滴定结果

选择阴性OD_630nm值在1.0左右，阴性值与阳性值比值较高的稀释度作为最佳工作浓度。分析表中数据可知，蛋白选择2μg/mL的浓度，酶标单抗选择32000倍稀释为最佳的工作浓度。

2、待检血清稀释倍数的选择

根据方阵实验选取的最佳蛋白包被浓度和酶标单抗工作浓度，将阴、阳性参考血清以及PBS对照按0、2、4、8、16、32倍稀释，不改变其他条件，选取最佳的血清稀释倍数。

结果如图4所示，随着血清稀释度增加，阳性结果逐渐升高；未加稀释的血清阴性值则偏低，因此选择2倍稀释为最佳稀释浓度。

3、待检血清反应时间的选择

用已确立的抗原包被浓度、酶标单抗工作浓度以及待检血清稀释度进行阻断ELISA试验，试验中加入阴、阳性血清以及PBS对照，血清和PBS反应时间设置为60、90、120、150min四个时间梯度，选取最佳的血清反应时间。

结果如图5所示，反应时间在小于90min的时候，阳性羊血清抗体不能完全反应；与此同时在90-120min范围内也没有明显的变化。为了保证阻断反应的灵敏性和快速性，选择120min为血清的最佳反应时间。

4、酶标单抗反应时间的选择

用已确立的抗原包被浓度、酶标单抗工作浓度、待检血清稀释度以及血清反应时间进行阻断ELISA试验，加入酶标单抗后的反应时间分别设置为10、20、40、60min四个时间梯度，选取酶标单抗最佳反应时间。

结果如图6所示，阴、阳性血清及PBS对照的OD_630nm值随反应时间延长而逐渐升高。选择OD_630nm值在1.0左右的反应条件即20min为酶标单抗的最佳反应时间。

5、临界值的确定

选择70份羊衣原体抗体阴性的羊血清，采用已确定的抗原包被浓度、酶标单抗工作浓度、待检血清稀释度和反应时间以及酶标单抗反应时间进行阻断ELISA试验，同时设置参考的阴、阳性和PBS各三次重复。阻断率(PI)根据公式计算：PI＝(阴性对照OD_630nm值平均值N-测试样本OD_630nm值S)/阴性对照OD_630nm值平均值N×100％。

表5-阴阳性临界值选择

计算70份阴性血清样品阻断率平均值(X)＝3.86％和标准差(SD)＝14.67％。样品阻断率PI≥(X)+3(SD)，则样品判定为阳性；当样品阻断率PI<(X)+3(SD)，则样品判定为阴性。结果判定标准为：血清样品PI值≥50％判定为阳性，血清样品PI值<50％判定为阴性。

6、工艺条件

将抗原蛋白包被ELISA板，利用HRP标记的MOMP单克隆抗体为一抗，通过探索最佳抗原包被及酶标单抗工作浓度、待检血清稀释倍数、待检血清反应时间、酶标单抗反应时间、临界值等的最优条件，初步建立了阻断ELISA方法，所建立阻断ELISA方法的工艺条件和判定标准如下表6所示。

表6-阻断ELISA方法的工艺条件和判定标准

实施例6 MOMP单克隆抗体在临床样品检测中应用

1、符合性试验

利用HRP标记的MOMP单克隆抗体检测临床样品，与IHA试剂盒检测结果的阳性符合率为81.3％，与IHA试剂盒检测结果的阴性符合率为90.8％，总体符合率为89.9％(表7)。综上所述，MOMP单克隆抗体可用于快速诊断羊流产嗜性衣原体病。

表7-MOMP单克隆抗体阻断ELISA法与IHA商业化试剂盒检测结果比较

2、特异性试验

用已经确立的阻断ELISA最适条件分别检测JEV、CSFV、PRV、PRRSV、PCV、FMDV、M.hyopneumoniae、M.capricolum，并以羊流产嗜性衣原体阴、阳性血清做对照，计算阻断率。特异性试验结果如表8所示，8种血清检测结果均为阴性，表明所建立的阻断ELISA检测方法在检测这几种病原时不存在交叉反应，特异性良好。

表8-交叉反应实验结果

3、重复性试验

重复性试验结果如表9A和表9B所示。从表中的数据可知，批内和批间的变异系数CV值均小于10％，表明本检测方法重复性良好。

表9A-批内重复性试验

表9B-批间重复性实验

4、稳定性试验

稳定性试验结果如表10A和表10B所示。从表中的数据可知，ELISA板在4℃和-20℃保存4个月后，检测结果没有明显的变化，表明包被的ELISA板在4个月内具有良好的稳定性。

表10A-4℃保存ELISA板稳定性试验结果

表10B-20℃保存ELISA板稳定性试验结果

综上所述，本发明所获得的单克隆抗体能针对MOMP外膜蛋白进行检测，具有很强的特异性，仅和流产嗜性衣原体C.abortus有反应，和其他8种病原无反。本发明建立阻断ELISA方法，该方法降低了对重组蛋白的纯化要求，提高了特异性，与间接血凝IHA方法比较，提高了检测的敏感性，读数更客观，所建立的ELISA方法批间、批内变异系数小于10％，4度和20度保存4月后测定结果仍然稳定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 杂交瘤细胞株CMOMP-5D7及其分泌的单克隆抗体与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> 衣原体(chlamydia)

<400> 1

ggatcctctc caaatgactt taaaaatgct gaagatagac ccaacgtcgc ttatggcaga 60

catttgcaag actccgaatg gtttacaaat gcagctttct tagcgttaaa tatctgggat 120

cgttttgata ttttctgcac attaggcgct tctaatgggt acttcaaagc tagttctgcg 180

gcattcaatc tcgttggttt gattggtgtt aaaggaaact ccttaacaaa tgaccaactt 240

cccaacgtag ccatcactca aggcgttgtt gagttttaca cagatacaac gttctcttgg 300

agcgtaggtg cacgtggagc tctatgggaa tgtggttgcg caactttagg agctgaattc 360

caatacgctc aatctaatcc taaaattgaa atgttgaatg taatctccag cccagcacaa 420

tttgtggttc acaagcctag aggatacaag ggaacgtccg ccaactttcc tttacctgca 480

aatgcaggca cagaggctgc tacggatact aaatctgcaa cactcaaata tcatgaatgg 540

caagttggtc tagcactctc ttacagattg aacatgttag ttccttacat tggcgtaaac 600

tggtcacgag caacttttga tgccgacact atccgcatcg ctcaacctaa attggcctct 660

gctgttatga acttgaccac atggaaccca acccttttag gggaagccac aatccttgat 720

acttccaata aattcagtga cttcttacaa atcgcttcga ttcagatcaa caaaatgaag 780

tctagaaaag cttgcggttt agctattggt gcaacgttaa tcgacgccga caaatggtca 840

atcactggtg aagcacgctt aatcaatgaa agagctgctc acatgaacgc tcaattcaga 900

ttctaa 906

<210> 2

<211> 301

<212> PRT

<213> 衣原体(chlamydia)

<400> 2

Gly Ser Ser Pro Asn Asp Phe Lys Asn Ala Glu Asp Arg Pro Asn Val

1 5 10 15

Ala Tyr Gly Arg His Leu Gln Asp Ser Glu Trp Phe Thr Asn Ala Ala

20 25 30

Phe Leu Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Ile Phe Cys Thr Leu

35 40 45

Gly Ala Ser Asn Gly Tyr Phe Lys Ala Ser Ser Ala Ala Phe Asn Leu

50 55 60

Val Gly Leu Ile Gly Val Lys Gly Asn Ser Leu Thr Asn Asp Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Val Ala Ile Thr Gln Gly Val Val Glu Phe Tyr Thr Asp Thr

85 90 95

Thr Phe Ser Trp Ser Val Gly Ala Arg Gly Ala Leu Trp Glu Cys Gly

100 105 110

Cys Ala Thr Leu Gly Ala Glu Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Asn Pro Lys

115 120 125

Ile Glu Met Leu Asn Val Ile Ser Ser Pro Ala Gln Phe Val Val His

130 135 140

Lys Pro Arg Gly Tyr Lys Gly Thr Ser Ala Asn Phe Pro Leu Pro Ala

145 150 155 160

Asn Ala Gly Thr Glu Ala Ala Thr Asp Thr Lys Ser Ala Thr Leu Lys

165 170 175

Tyr His Glu Trp Gln Val Gly Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met

180 185 190

Leu Val Pro Tyr Ile Gly Val Asn Trp Ser Arg Ala Thr Phe Asp Ala

195 200 205

Asp Thr Ile Arg Ile Ala Gln Pro Lys Leu Ala Ser Ala Val Met Asn

210 215 220

Leu Thr Thr Trp Asn Pro Thr Leu Leu Gly Glu Ala Thr Ile Leu Asp

225 230 235 240

Thr Ser Asn Lys Phe Ser Asp Phe Leu Gln Ile Ala Ser Ile Gln Ile

245 250 255

Asn Lys Met Lys Ser Arg Lys Ala Cys Gly Leu Ala Ile Gly Ala Thr

260 265 270

Leu Ile Asp Ala Asp Lys Trp Ser Ile Thr Gly Glu Ala Arg Leu Ile

275 280 285

Asn Glu Arg Ala Ala His Met Asn Ala Gln Phe Arg Phe

290 295 300

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaggatcca tgaaaaaact cttgaaatcg 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggtcgact tagaatctga attgagc 27

Claims

1.杂交瘤细胞株CMOMP-5D7，其特征在于，其保藏号为CCTCC NO：C2012141。

2.一种杂交瘤细胞株CMOMP-5D7的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞株通过以下步骤制备：

步骤3、纯化MOMP重组蛋白，再通过免疫实验动物、免疫后动物脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株通过筛选得到只分泌针对重组MOMP蛋白抗体的阳性细胞株，即得到该杂交瘤细胞株CMOMP-5D7。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中用于扩增羊流产嗜性衣原体MOMP基因编码区序列的上引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述步骤3中用于制备羊流产嗜性衣原体杂交瘤细胞株的免疫原为由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或添加标签序列衍生的蛋白质。

4.一种羊流产嗜性衣原体重组MOMP蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体，其特征在于，所述MOMP单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株CMOMP-5D7或其传代细胞株分泌产生。

6.权利要求5所述的羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体在制备羊流产嗜性衣原体检测试剂及试剂盒中的应用。

7.一种羊流产嗜性衣原体阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

(A)包被有权利要求4所述的羊流产嗜性衣原体重组MOMP蛋白的ELISA酶标板；

(B)标准阴性血清；

(C)标准阳性血清；

(D)酶标单抗，所述单抗为权利要求5所述的羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体；

8.一种羊流产嗜性衣原体阻断ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、在酶标板中包被抗原，所述抗原为权利要求4所述的羊流产嗜性衣原体重组MOMP蛋白；

S2、加入待测血清与所述包被的抗原孵育；

S3、洗板后，加入酶标单抗再次孵育，所述酶标单抗为权利要求5所述的羊流产嗜性衣原体MOMP单克隆抗体；

S4、加入底物显色，测OD值。