CN110129213A - 一株铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents

一株铜绿假单胞菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110129213A
CN110129213A CN201910461130.8A CN201910461130A CN110129213A CN 110129213 A CN110129213 A CN 110129213A CN 201910461130 A CN201910461130 A CN 201910461130A CN 110129213 A CN110129213 A CN 110129213A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudomonas aeruginosa
carbon source
application
conditions
soya
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910461130.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110129213B (zh
Inventor
韩雪容
李庆辉
杨家鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changchun University of Science and Technology
Original Assignee
Changchun University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changchun University of Science and Technology filed Critical Changchun University of Science and Technology
Priority to CN201910461130.8A priority Critical patent/CN110129213B/zh
Publication of CN110129213A publication Critical patent/CN110129213A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110129213B publication Critical patent/CN110129213B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一株铜绿假单胞菌及其应用，本发明涉及一种假单胞菌及其应用。本发明解决了现有PHA生产菌株的生产能力差、生产成本高的问题。本发明的铜绿假单胞菌，其为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93‑3‑1，本发明铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用；本发明铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93‑3‑1以豆油或者废弃食用油为碳源，制备得到聚羟基脂肪酸酯，其含有3‑羟基辛酸、3‑羟基癸酸和3‑羟基十二烷酸中长链脂肪酸三种单体结构，本发明的菌Pseudomonas aeruginosa 93‑3‑1具有优异的生产能力，生产成本低。

Description

一株铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种假单胞菌及其应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)是许多种微生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和能源贮存物质而在体内合成的一类直链脂肪族热塑性聚酯。PHA的结构由含有羟基的多样的脂肪酸单体组成，根据脂肪酸侧链的长短和结构，PHA可以分为3种：含有3-5个碳原子的短链short-chain-length PHA(scl-PHA)；含有6-14个碳原子的中链medium-chain-length PHA(mcl-PHA)和含有多于14个碳原子的长链long-chain-lengthPHA(lcl-PHA)。基于单体的多样性，PHA具有从脆性到弹性的广泛材料性质。
PHA具有类似于石油基塑料的良好的热塑性，还兼具生物可降解性、气体相隔性，作为不能自然分解的塑料的替代品已被广泛研究。除此之外，PHA还具有生物相容性、光学活性、压电性等诸多优秀性能，在生物医用材料和制药领域拥有潜在的应用前景。目前因为PHA生产菌株的生产能力、获得的PHA的材料性质以及生产成本的限制，导致PHA在高附加值领域的应用开发相对滞后。因此，具有高生产能力和可控材料性质菌株的筛选、利用廉价碳源的发酵降低合成成本等研究势在必行。
发明内容
本发明为了解决现有PHA生产菌株的生产能力差、生产成本高的问题，而提供了一株铜绿假单胞菌及其应用。
本发明菌株为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018927。Pseudomonas aeruginosa 93-3-1的培养条件为：培养基是含有1％～4％碳源的MS培养基，培养温度为37℃、pH值为7；其中碳源为豆油或废弃食用油。
本发明的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用。利用该菌合成聚羟基脂肪酸酯的具体方法按照以下步骤进行：
一、将上述的Pseudomonas aeruginosa 93-3-1活化得到菌液，然后将菌液按照5％的体积比接种到含有质量百分数为1％～4％碳源的MS培养基中，在35～38℃、160～200rpm条件下振荡培养70～75h，得到发酵液；其中碳源为豆油或废弃食用油；
二、步骤一中的发酵液在5000rpm/min条件下离心20min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行干燥；
三、按照重量百分比为1～3％的比例向步骤三中的干燥物中加入氯仿，超声波破碎8～12min后，于28～32℃摇床上震荡提取45～50h，抽滤、旋转蒸发去除氯仿；
四、向步骤三中的剩余物中加入甲醇溶液进行沉淀，摇匀混合液静置析出白色絮状固体，冻干后即得到聚羟基脂肪酸酯；其中甲醇与剩余物的重量比为4～6:1。
用上述的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1得到的聚羟基脂肪酸酯制备GC-MS样品的方法按照以下步骤进行：
一、50mg上述合成的聚羟基脂肪酸酯和2mL到浓度为15％(v/v)硫酸甲醇溶液中混合均匀，再加入2mL氯仿溶液混合，在100℃条件下加热3h，然后冷却至室温，即得到第一次混合液；
二、第一次混合液与1mL去离子水混合，振荡混匀后静置分层，然后取下层氯仿相，过滤后与无水硫酸镁混合充分除水后静置得到第二次混合液；
三、向第二次混合液中加入500μL的0.1％氯仿标准品溶液混合均匀，即得到GC-MS样品；其中标准品为正辛酸乙酯。
本发明的菌株Pseudomonas aeruginosa 93-3-1为铜绿假单胞菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2018年12月27日，保藏号为CCTCC NO：M2018927。
本发明铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1以豆油或者废弃食用油为碳源制备包括3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十二烷酸三种单体结构的聚羟基脂肪酸酯，且具有优异的生产能力。目前我国废弃食用油来源广泛，价格低廉，但其再加工利用却很困难。本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1可以有效的利用废弃食用油进行PHA的发酵生产，降低了PHA的制备成本，又实现了废弃食用油的再利用。另外，本发明的得到的聚羟基脂肪酸酯GC-MS样品，制备过程简单，有效的缩短检测时间。
附图说明
图1是铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1的系统进化树；
图2是铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1的菌落形态；
图3是实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物的GC结果图；
图4是实施例1中以豆油为碳源时GC-MS检测以正辛酸乙酯作为内标的结果图；
图5是实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物中3HO的结果图；
图6是实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物中3HD的结果图；
图7是实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物中3HDD的结果图；
图8是实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物中GC的结果图；
图9是实施例1中以废弃食用油为碳源时GC-MS检测以正辛酸乙酯作为内标的结果图；
图10是实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物中的3HO结果图；
图11是实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物中的3HD结果图；
图12是实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物的核磁氢谱结果图；
图13是实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物核磁氢谱结果图；
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式铜绿假单胞菌，其为铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa 93-3-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018927。
本实施方式铜绿假单胞菌的分离与纯化方法：
一、2016年7月取30g长春经济开发区兴隆镇93豆油分公司生产线周边的油污，用30mL去离子水清洗3次，弃上清液留沉淀；其中，清洗的具体方法为：油污与去离子水震荡混合后在转速为150rmp、时间30min的条件下离心，弃上清液留沉淀；
二、向步骤一中的沉淀加入25mL的含有1％豆油的MS培养基，在30℃条件下培养48h，得到含有混合菌株的待分离液；
三、将步骤二中的待分离液用去离子水以100倍梯度稀释，稀释为10-6、10-8、10-10分别涂布到含1％豆油的MS筛选培养基平板上，在30℃条件下培养48h；
四、选取步骤四培养后的单菌落接种到LB培养基，在37℃条件下培养12h，通过镜检，观察菌体是否有PHA粒子聚集，并在MS筛选培养基平板上划线以纯化后得到菌株，保存于甘油管中；
五、步骤四得到的菌株进行菌属鉴定；通过上海生工公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(Cat：DP302-02)提取其基因组DNA，然后使用通用引物27F(5＇-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3＇)和1492R(5＇-GGTTAC CTTGTT ACGACT T-3＇)对其基因组的16SrRNA基因进行扩增；扩增体系是：27F 1ul,1492R 1ul,模板DNA 1ul，2×Taq PCR Master Mix 12.5ul,无菌去离子水9.5ul；扩增条件是：94℃5min,94℃45s,55℃45s，72℃1min,72℃10min,30个循环；PCR产物经1％凝胶电泳，纯化并回收后送吉林省库美生物科技有限公司测序，根据测序结果制作系统进化树说明书图1所示。步骤四所获得的菌株与Pseudomonas aeruginosa(CP029605)同源性达100％，确定步骤四所获得的菌株为Pseudomonas属，并命名为Pseudomonas aeruginosa 93-3-1。
本实施方式的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1的形态学观察
一、本实施方式的Pseudomonas aeruginosa 93-3-1接种在LB液体培养基中，在37℃条件下培养12h，其所获得的菌液呈翠绿色；
二、本实施方式的Pseudomonas aeruginosa 93-3-1接种在MS固体培养基中，在30℃条件下培养48h，菌落形态如图2所示，菌落较小，呈白色圆球状，边缘规则，较粘稠，与培养基接触紧密，革兰氏染色为阴性。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：Pseudomonasaeruginosa 93-3-1的培养条件为：培养基是含有1％～4％碳源的MS培养基，培养温度为37℃、pH值为7；其中碳源为豆油或废弃食用油。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：如具体实施方式一所述的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1合成聚羟基脂肪酸酯的方法为：
一、将具体实施方式一所述的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1活化得到菌液，然后将菌液按照5％的体积比接种到含有质量百分数为1％～4％碳源的MS培养基中，在35～38℃、160～200rpm条件下振荡培养70～75h，得到发酵液；其中碳源为豆油或废弃食用油；
二、步骤一中的发酵液在5000rpm条件下离心20min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行干燥；
三、按照重量百分比为1～3％的比例向步骤三中的干燥物中加入氯仿，超声波破碎8～12min后，于28～32℃摇床上震荡提取45～50h，抽滤、旋转蒸发去除氯仿；
四、向步骤三中的剩余物中加入甲醇溶液进行沉淀，摇匀混合液静置析出白色絮状固体，冻干后即得到聚羟基脂肪酸酯；其中甲醇与剩余物的重量比为4～6:1。其他与具体实施方式三相同。
本实施方式步骤一中豆油是93号豆油。
本实施方式步骤三中对氯仿的作用是其作为提取液，然后进行抽滤并弃去细胞碎片，再利用旋转蒸发仪去除多余溶剂。
本实施方式步骤四中冻干条件为在-60℃冻干4-5小时至恒重。
本实施方式步骤四中甲醇采用的是预冷后的甲醇。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中活化的方法为：Pseudomonas aeruginosa 93-3-1接种到5mL LB液体培养基中，在35～38℃、160～200rpm条件下振荡培养12～16h，即完成了活化。其他与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五不同的是：步骤一中在37℃、180rpm条件下振荡培养72h。其他与具体实施方式四或五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤三中于30℃摇床上震荡提取48h。其他与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四、五或七不同的是：步骤四中甲醇与剩余物的重量比为5:1。其他与具体实施方式四、五或七相同。
具体实施方式九：用具体实施方式一所述的Pseudomonas aeruginosa 93-3-1得到的聚羟基脂肪酸酯制备GC-MS样品的方法，其特征在于制备GC-MS样品方法按照以下步骤进行：
一、50mg具体实施方式三得到的聚羟基脂肪酸酯和2mL到浓度为15％(v/v)硫酸甲醇溶液中混合均匀，再加入2mL氯仿溶液混合，在100℃条件下加热3h，然后冷却至室温，即得到第一次混合液；
二、第一次混合液与1mL去离子水混合，振荡混匀后静置分层，然后取下层氯仿相，过滤后与无水硫酸镁混合充分除水后静置得到第二次混合液；
三、向第二次混合液中加入500μL的0.1％氯仿标准品溶液混合均匀，即得到GC-MS样品；其中标准品为正辛酸乙酯。
本实施方式步骤二所使用的去离子水为milli-Q超纯水。
本实施方式步骤三中氯仿标准品溶液中氯仿与标准品的体积比为9:1。
实施例1采用不同的碳源，然后利用本发明铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa 93-3-1制备聚羟基脂肪酸酯，其中碳源为豆油或废弃食用油。
铜绿假单胞菌制备聚羟基脂肪酸酯的方法为：
一、将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1活化得到菌液，然后将菌液按照5％的接重量接种到含有质量百分数为2％豆油或者3％废弃食用油(碳源)的MS培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养72h，得到发酵液；
二、步骤一中的发酵液在5000rpm/min条件下离心20min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行干燥；
三、按照重量百分比为2％的比例向步骤三中的干燥物中加入氯仿，超声波破碎10min后，于30℃摇床上震荡提取48h，抽滤、旋转蒸发去除氯仿；
四、向步骤三中的剩余物中加入甲醇溶液进行沉淀，摇匀混合液静置析出白色絮状固体，过滤、冻干后即得到提取物；其中甲醇与剩余物的重量比为5:1；其中步骤中豆油是93号豆油；步骤三中对氯仿的作用是其作为提取液，然后进行抽滤并弃去细胞碎片，再利用旋转蒸发仪去除多余溶剂；步骤四中冻干条件为在-60℃条件下冻干4-5小时至恒重；步骤四中甲醇采用的是预冷后的甲醇。
实施例2实施例1所得到的提取物进行GC-MS结构分析
一、制备GC-MS样品：
1、取50mg实施例1得到的提取物和2mL到浓度为15％(v/v)硫酸甲醇溶液中混合均匀，再加入2mL氯仿溶液混合，在100℃条件下加热3h，然后冷却至室温，即得到第一次混合液；
2、第一次混合液与1mL去离子水混合(milli-Q超纯水)，振荡混匀后静置分层，然后取下层氯仿相，过滤后与无水硫酸镁混合充分除水后静置得到第二次混合液；
3、向第三次混合液中加入500μL的0.1％氯仿标准品溶液混合均匀，即得到GC-MS样品；其中标准品为正辛酸乙酯。
二、采用气质联用的方法检测GC-MS样品(PHA单体结构)。
其中，实施例1步骤一中利用豆油为碳源的MS培养基所制备得到的提取物的检测结果如图3、图4、图5、图6、图7所示。图3为实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物的GC结果图(PHA)、图4为实施例1中以豆油为碳源GC-MS检测以正辛酸乙酯作为内标的结果图、图5为实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物中3HO(3-羟基辛酸)的单体结构、图6为实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物中3HD(3-羟基癸酸)的单体结构、图7为实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物中3HDD(3-羟基十二烷酸)的单体结构，从图3～图7确定实施例1以豆油为碳源所得到的提取物为聚羟基脂肪酸酯(PHA)，其单体结构组成分别为3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十二烷酸。由此可见本发明菌株Pseudomonas aeruginosa 93-3-1可以以豆油为唯一碳源合成3-羟基辛酸(3HO)、3-羟基癸酸(3HD)及3-羟基十二烷酸(3HDD)的中长链聚羟基脂肪酸酯。
实施例1步骤一中利用废弃食用油为碳源的MS培养基所制备得到的提取物的检测结果如图8、图9、图10、图11所示。图8为实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物的GC结果、图9为实施例1中以豆油为碳源GC-MS检测以正辛酸乙酯作为内标的结果、图10为实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物中3HO(3-羟基辛酸)的单体结构、图11为实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物中3HD(3-羟基癸酸)的单体结构。从图8～图11确定实施例1以废弃食用油为碳源所得到的提取物为聚羟基脂肪酸酯(PHA)，其单体结构分别为3-羟基辛酸(3HO)、3-羟基癸酸(3HD)。由此可知，本发明的菌株Pseudomonasaeruginosa 93-3-1可以以废弃食用油为碳源合成3-羟基辛酸(3HO)、3-羟基癸酸(3HD)的中长链聚羟基脂肪酸酯。
实施例3实施例1所得到的提取物进行核磁分析
通过实施例2的方法可以确定出实施例1所制备得到的提取物中含有PHA；将实施例1步骤四所得到的提取物研磨成细小颗粒，加入到干燥的100mL锥形瓶中，按照2％(w/v)的比例加入氯仿并密封防止氯仿挥发；超声破碎10分钟后，在30℃摇床中振荡提取48h；提取结束后，用溶剂抽滤装置抽提氯仿提取液，弃去细胞碎片，通过旋转蒸发仪除去多余溶剂；然后向提取液中加入5倍氯仿体积的预冷甲醇溶液，进行沉淀，摇匀混合液4℃过夜静置，析出白色絮状固体PHA；用溶剂抽滤装置再次抽滤，分离出纯品PHA；用分析天平称取5mgPHA纯品，充分溶解于适量氘代氯仿试剂中，放入一干净的核磁管内，到达管高4cm处，进行核磁检测。
结果如图12、13所示，图12是实施例1中以豆油为碳源所得到的提取物的核磁氢谱图；图13实施例1中以废弃食用油为碳源所得到的提取物的核磁氢谱图；从图12～图13结果，与文献(Pooja Basnett,Barbara Lukasiewicz,Elena Marcello,et al.Productionof a novel medium chain length poly(3-hydroxyalkanoate)usingunprocessedbiodiesel waste and its evaluation as a tissue engineeringscaffold[J].Microbial Biotechnology,2017,1384-1399；Amtiga Muangwong,ThanawatBoontip,et al.Medium chain length polyhydroxyalkanoates consisting primarilyof unsaturated 3-hydroxy-5-cis-dodecanoate synthesized by newly isolatedbacteria using crude glycerol[J].Microb Cell Fact,2016,15:55)比对后确定氢的位置及比例，符合GC-MS结果，再次确认本发明的菌株Pseudomonas aeruginosa 93-3-1可以豆油为碳源合成3-羟基辛酸、3-羟基癸酸及3-羟基十二烷酸的中长链混合聚酯，以废弃食用油为碳源合成3-羟基辛酸、3-羟基癸酸的中长链聚羟基脂肪酸酯。
实施例4实施1步骤一中采用不同的碳源，然后用实施例1的方法制备得到聚羟基脂肪酸酯，对所得到聚羟基脂肪酸酯的含量进行比较
所使用的碳源包括：质量百分数为1％葡萄糖、1％果糖、1％果糖、1％月桂酸钠、1％辛酸钠、2％豆油(93豆油)、2％废弃食用油。
利用不同碳源合成聚羟基脂肪酸酯含量如表1所示。
表1聚羟基脂肪酸酯含量
从表1可以看出，本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1以豆油为碳源制备得到含有3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十二烷酸中长链脂肪酸的聚羟基脂肪酸酯，以废弃食用油制备得到含有3-羟基辛酸和3-羟基癸酸的中长链脂肪酸的聚羟基脂肪酸酯，无论以豆油为碳源还是以废弃食用油为碳源，所得到的聚羟基脂肪酸酯的含量均较高，本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1对于合成PHA的生产能力高；以葡萄糖、月桂酸钠为碳源也能制备出3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十二烷酸中长链脂肪酸的聚羟基脂肪酸酯，但其成本高于本申请所使用的碳源，以果糖为碳源仅能能到一种单体结构3-羟基癸酸，产能有限。
本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1利用豆油和废弃食用油制备得到聚羟基脂肪酸酯(PHA)，且含量较高。目前我国废弃食用油来源广泛，价格低廉，但其再加工利用困难。本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1可以有效的利用废弃食用油进行PHA的发酵生产，降低了PHA的制备成本，又实现了废弃食用油的再利用。

Claims (8)

1.一株铜绿假单胞菌，其为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018927。
2.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用。
3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用，其特征在于铜绿假单胞菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法为：
一、将上述的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1活化得到菌液，然后将菌液按照5％的体积比接种到含有质量百分数为1％～4％碳源的MS培养基中，在35～38℃、160～200rpm条件下振荡培养70～75h，得到发酵液；其中碳源为豆油或废弃食用油；
二、步骤一中的发酵液在5000rpm/min条件下离心20min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行干燥；
三、按照重量百分比为1～3％的比例向步骤三中的干燥物中加入氯仿，超声波破碎8～12min后，于28～32℃摇床上震荡提取45～50h，抽滤、旋转蒸发去除氯仿；
四、向步骤三中的剩余物中加入甲醇溶液，摇匀混合液静置析出白色絮状固体，过滤、冻干后即得到聚羟基脂肪酸酯；其中甲醇与剩余物的重量比为4～6:1。
4.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用，其特征在于步骤一中活化的方法为：将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 93-3-1接种到5mL LB液体培养基中，在35～38℃、160～200rpm条件下振荡培养12～16h，即完成了活化。
5.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用，其特征在于步骤一中在37℃、180rpm条件下振荡培养72h。
6.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用，其特征在于步骤三中于30℃摇床上震荡提取48h。
7.根据权利要求3所述的铜绿假单胞菌在合成聚羟基脂肪酸酯上的应用，其特征在于步骤四中甲醇与剩余物的重量比为5:1。
8.用权利要求1所述的铜绿假单胞菌合成的聚羟基脂肪酸酯制备GC-MS样品的方法，其特征在于制备GC-MS样品的方法按照以下步骤进行：
一、50mg权利要求2得到的聚羟基脂肪酸酯和2mL到浓度为15％硫酸甲醇溶液中混合均匀，再加入2mL氯仿溶液混合，在100℃条件下加热3h，然后冷却至室温，即得到第一次混合液；
二、第一次混合液与1mL去离子水混合，振荡混匀后静置分层，然后取下层氯仿相，过滤后与无水硫酸镁混合充分除水后静置得到第二次混合液；
三、向第二次混合液中加入500μL的0.1％氯仿标准品溶液混合均匀，即得到GC-MS样品；其中标准品为正辛酸乙酯。
CN201910461130.8A 2019-05-30 2019-05-30 一株铜绿假单胞菌及其应用 Active CN110129213B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910461130.8A CN110129213B (zh) 2019-05-30 2019-05-30 一株铜绿假单胞菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910461130.8A CN110129213B (zh) 2019-05-30 2019-05-30 一株铜绿假单胞菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110129213A true CN110129213A (zh) 2019-08-16
CN110129213B CN110129213B (zh) 2020-12-01

Family

ID=67582871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910461130.8A Active CN110129213B (zh) 2019-05-30 2019-05-30 一株铜绿假单胞菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110129213B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1275378A2 (en) * 2001-07-10 2003-01-15 Canon Kabushiki Kaisha Particulate construct comprising polyhydroxyalkanoate and method for producing it
CN102154387A (zh) * 2010-12-27 2011-08-17 山东大学 利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1275378A2 (en) * 2001-07-10 2003-01-15 Canon Kabushiki Kaisha Particulate construct comprising polyhydroxyalkanoate and method for producing it
CN102154387A (zh) * 2010-12-27 2011-08-17 山东大学 利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOFFMAN N等: "Nitrogen-dependent regulation of medium-chain length polyhydroxyalkanoate biosynthesis genes in pseudomonas", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *
徐操等: "细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控", 《微生物学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110129213B (zh) 2020-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gao et al. Comparison of bacterial nanocellulose produced by different strains under static and agitated culture conditions
CN106635924B (zh) 一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备及用途
CN102154395A (zh) 一种无机盐、有机溶剂共沉作用提取γ-聚谷氨酸的方法
CN103493969B (zh) 一种生产大鲵多肽粉的方法
Du et al. Characterization of exopolysaccharide produced by Levilactobacillus brevis HDE-9 and evaluation of its potential use in dairy products
CN113073121B (zh) 一种含高聚合度多聚磷酸盐的纳米碳材料及高聚合度多聚磷酸盐的制备方法
CN102174614B (zh) 一种能提高机体免疫力的南极适冷微生物胞外多糖
CN106282264A (zh) 一种具有生发作用的槐糖脂的生产方法
CN104744609B (zh) 采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法
CN1926239A (zh) 聚羟基链烷酸酯的制造方法
Getachew et al. Production of sterilized medium chain length polyhydroxyalkanoates (Smcl-PHA) as a biofilm to tissue engineering application
Simon-Colin et al. A novel mcl-PHA produced on coprah oil by Pseudomonas guezennei biovar. tikehau, isolated from a “kopara” mat of French Polynesia
CN110184311A (zh) 一种使用微生物发酵生产特种油脂opo的方法
CN110129213A (zh) 一株铜绿假单胞菌及其应用
Pandit et al. Alginates production, characterization and modification
CN116574645A (zh) 一株蜡样芽孢杆菌mg1及应用
CN103667153B (zh) 一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌
CN104055702B (zh) 一种皮肤抗敏保湿剂
CN108823266A (zh) 一种采用发酵的方法制备几丁质的方法
Ye et al. Bacterial cellulose production by a strain of Komagataeibacter rhaeticus isolated from residual loquat
CN103103225A (zh) 一种制备高纯度β-聚苹果酸的方法
CN112778430A (zh) 一种硫酸化修饰青钱柳多糖及其制备方法和应用
CN106036852A (zh) 一种牛蒡益生菌发酵功能保健食品的制备方法
Gnaim et al. Avocado seed waste bioconversion into poly (3-hydroxybutyrate) by using Cobetia amphilecti and ethyl levulinate as a green extractant
CN105031720A (zh) 一种纳米羟基磷灰石-聚酰胺医用复合材料及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant