CN110117543B - 高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法 - Google Patents

高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于藻培养技术领域，公开了高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法，其包括如下步骤：将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有培养基的培养容器中，培养9‑12d，收集藻液；将藻液置于碟片离心机中离心,收集沉淀，然后置于‑20℃的低温条件下，冷冻处理30‑60min，然后置于50‑60℃的真空干燥箱中，干燥至恒重，收集干燥后的藻体，最后置于万能粉碎机进行粉碎，过200目筛，收集筛下物，即得。本发明通过高密度培养获得球等鞭金藻，然后通过冷冻、干燥以及粉碎等步骤，制备了藻粉，工艺简单可行，脱水彻底，可作为水产养殖中的饲料添加剂。

Description

高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法
技术领域
本发明属于藻类培养技术领域，具体涉及高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法。
背景技术
球等鞭金藻是单细胞生活的个体，细胞裸露，形状多变，但大多数呈椭圆形，幼细胞有一略扁平的背腹面，故侧面观为长椭圆形或长方形。细胞前端生出两条等长的尾鞭型鞭毛，鞭毛平滑无附着物和膨胀体，其长度为细胞的1-2倍。鞭毛基部有液泡。细胞内具有2个大而伸长的侧生色素体，其形状和位置往往随体形而改变。一个暗红色、卵圆形的眼点位于细胞中央，偶有靠近细胞前端。细胞核一个，通常位于细胞中间。贮藏物是油滴和白糖素，小油滴分布在细胞质中，白糖素位于细胞后端，一般为2-5个小块。一般活动细胞长4.4-7.1微米，宽2.7-4.4微米，厚2.4-3微米。球等鞭金藻主要进行无性二分裂繁殖。
球等鞭金藻由于个体小，无细胞壁，易消化，富含多糖，胡萝卜素及高能量的脂类物质，是世界各地水产养殖中重要的饵料微藻，广泛用于饲喂贻贝、牡蛎、泥蚶等，被认为是海产双壳类动物幼虫的理想饵料。球等鞭金藻含有较多的蛋白质、多种维生素、色素、微量元素和生长素等，还含有多种具有生物活性物质，用作饲料产品，具有其它高蛋白质饲料无法比拟的特殊价值。
与小球藻(Chlorella vulgaris)和螺旋藻(Spirulinaplatensis)相比，球等鞭缺乏独特性的培养条件和强的抗污染能力，加之生长速度和培养密度也相对低，目前国内外对球等鞭金藻尚未有大规模工业化生产。微藻高密度培养是微藻产业化开发的前提，同时也是节约后续生产成本的重要手段。微藻的营养方式一般主要以二氧化碳为碳源进行光合自养，充足的二氧化碳供应是保障微藻快速生长的必要条件。在现有技术的基础上，申请人对球等鞭金藻培养基进行了改进，提高了球等鞭金藻的生长速率，该成果已经申报发明专利“用于培养球等鞭金藻的培养基”，该培养基包括以下组分：KNO3 100-120mg/L，植酸15-20mg/L，KH2PO4 10-12mg/L，肌醇10-12mg/L，Co(NH2)2 6-8mg/L，柠檬酸铁铵3-4mg/L，Na2EDTA 10-12mg/L，氯化镝0.4-0.6mg/L，胺鲜酯 1-2mg/L，乙烯利0.4-0.6mg/L，维生素B60.05-0.1mg/L，维生素12 0.04-0.06mg/L，维生素1 0.006-0.008mg/L，ZnSO4·7H2O 20-25μg/L，MnCl2·4H2O 150-200μg/L，CuSO4·5H2O 8-12μg/L，Na2MoO4·2H2O 7-8μg/L，CoCl2·6H2O 10-15μg/L。在上述研究的基础上，申请人继续对球等鞭金藻进行收集，并且制备了藻粉，用作水产养殖。
发明内容
本发明的目的在于提供高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有培养基的培养容器中，光照强度3000-5000lux，24℃培养，光暗比为18:6，培养9-12d，收集藻液；
步骤2）将藻液置于碟片离心机中离心,收集沉淀，然后置于-20℃的低温条件下，冷冻处理30-60min，然后置于50-60℃的真空干燥箱中，干燥至恒重，收集干燥后的藻体，最后置于万能粉碎机进行粉碎，过200目筛，收集筛下物，即得。
优选地，所述碟片离心机的离心速度为4000-5000rpm，离心时间为5-10min。
优选地，所述球等鞭金藻的接种初始密度为20-30万个/ml。
进一步地，所述培养基包括以下组分：植酸、肌醇、乙烯利和维生素B6。
进一步地，所述培养基包括以下组分：植酸15-20mg/L、肌醇10-12mg/L、乙烯利0.4-0.6mg/L和维生素B60.05-0.1mg/L。
进一步地，所述培养基包括以下组分：KNO3 100-120mg/L，植酸15-20mg/L，KH2PO410-12mg/L，肌醇10-12mg/L，Co(NH2)2 6-8mg/L，柠檬酸铁铵3-4mg/L，Na2EDTA 10-12mg/L，氯化镝0.4-0.6mg/L，胺鲜酯 1-2mg/L，乙烯利0.4-0.6mg/L，维生素B6 0.05-0.1mg/L，维生素12 0.04-0.06mg/L，维生素1 0.006-0.008mg/L，ZnSO4·7H2O 20-25μg/L，MnCl2·4H2O150-200μg/L，CuSO4·5H2O 8-12μg/L，Na2MoO4·2H2O 7-8μg/L，CoCl2·6H2O 10-15μg/L。
进一步地，所述培养基包括以下组分：KNO3 100mg/L，植酸20mg/L，KH2PO4 12mg/L，肌醇10mg/L，Co(NH2)2 6mg/L，柠檬酸铁铵3.5mg/L，Na2EDTA 12mg/L，氯化镝0.5mg/L，胺鲜酯1mg/L，乙烯利0.5mg/L，维生素B6 0.1mg/L，维生素12 0.05mg/L，维生素1 0.006mg/L，ZnSO4·7H2O 23μg/L，MnCl2·4H2O 178μg/L，CuSO4·5H2O 10μg/L，Na2MoO4·2H2O 7.3μg/L，CoCl2·6H2O 12μg/L。
按照上述任其一所述的方法制备的球等鞭金藻藻粉。
优选地，所述藻粉在水产养殖中的应用。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
为了提高球等鞭金藻的生长速率，本发明在现有的在专利培养基的基础上进行改进。
生长抑制物的胁迫使球等鞭金藻细胞体内积累了过量的活性氧，通过添加一定浓度的植酸，可作为抗氧化剂，通过清除藻细胞体内积累的活性氧，减轻了膜脂过氧化伤害，从而抵制了生长抑制物对球等鞭金藻细胞的抑制效应；植酸还具备一定的螯合能力，能够在球等鞭金藻养殖过程中作为重金属解毒剂和络合剂。
肌醇有助于活性物质的发挥，提高维生素B1的效果，促进球等鞭金藻生长，提高二氧化碳固定反应能力。
乙烯利能够促进球等鞭金藻细胞分裂，避免球等鞭金藻处于休眠状态。
通过添加一定浓度的维生素B6作为生物催化剂，能够参与细胞蛋白、糖类的代谢，促进球等鞭金藻增殖。
本发明通过高密度培养获得球等鞭金藻，然后通过冷冻、干燥以及粉碎等步骤，制备了藻粉，工艺简单可行，脱水彻底，水分含量控制在5％以内；可作为水产养殖中的饲料添加剂。
附图说明
图1：不同培养基对球等鞭金藻生长速率的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法，将培养至对数生长期的球等鞭金藻（以球等鞭金藻8071品种为例）接种到含有培养基的培养容器中，接种初始密度为30万个/ml，光照强度4000lux，24℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养10d，收集藻液；
将藻液置于碟片离心机中以4000r/min离心10min,收集沉淀，然后置于-20℃的低温条件下，冷冻处理30min，然后置于50℃的真空干燥箱中，干燥至恒重，收集干燥后的藻体，最后置于万能粉碎机进行粉碎，过200目筛，收集筛下物，即得。
所述用于培养球等鞭金藻的培养基，其包括如下组分：KNO3 100mg/L，植酸20mg/L，KH2PO4 12mg/L，肌醇10mg/L，Co(NH2)2 6mg/L，柠檬酸铁铵3.5mg/L，Na2EDTA 12mg/L，氯化镝0.5mg/L，胺鲜酯1mg/L，乙烯利0.5mg/L，维生素B6 0.1mg/L，维生素12 0.05mg/L，维生素10.006mg/L，ZnSO4·7H2O 23μg/L，MnCl2·4H2O 178μg/L，CuSO4·5H2O 10μg/L，Na2MoO4·2H2O 7.3μg/L，CoCl2·6H2O 12μg/L。
实施例2
高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法，将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有培养基的培养容器中，接种初始密度为20万个/ml，光照强度4000lux，25℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养12d，收集藻液；
将藻液置于碟片离心机中以4500r/min离心8min,收集沉淀，然后置于-20℃的低温条件下，冷冻处理30min，然后置于50℃的真空干燥箱中，干燥至恒重，收集干燥后的藻体，最后置于万能粉碎机进行粉碎，过200目筛，收集筛下物，即得。
所述用于培养球等鞭金藻的培养基，包括如下组分：KNO3 110mg/L，植酸15mg/L，KH2PO4 10mg/L，肌醇10mg/L，Co(NH2)2 6mg/L，柠檬酸铁铵4mg/L，Na2EDTA 10mg/L，氯化镝0.6mg/L，胺鲜酯2mg/L，乙烯利0.4mg/L，维生素B6 0.05 mg/L，维生素12 0.04 mg/L，维生素1 0.006 mg/L，ZnSO4·7H2O 20μg/L，MnCl2·4H2O 200μg/L，CuSO4·5H2O 82μg/L，Na2MoO4·2H2O 7μg/L，CoCl2·6H2O 10μg/L。
实施例3
高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法，将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有培养基的培养容器中，接种初始密度为30万个/ml，光照强度4000lux，24℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养9d，收集藻液；
将藻液置于碟片离心机中以4000r/min离心8min,收集沉淀，然后置于-20℃的低温条件下，冷冻处理50min，然后置于55℃的真空干燥箱中，干燥至恒重，收集干燥后的藻体，最后置于万能粉碎机进行粉碎，过200目筛，收集筛下物，即得。
所述用于培养球等鞭金藻的培养基，包括如下组分：KNO3 110mg/L，植酸17mg/L，KH2PO4 11mg/L，肌醇11mg/L，Co(NH2)2 7mg/L，柠檬酸铁铵3mg/L，Na2EDTA 11mg/L，氯化镝0.5mg/L，胺鲜酯1mg/L，乙烯利0.5mg/L，维生素B6 0.07mg/L，维生素12 0.05mg/L，维生素10.007mg/L，ZnSO4·7H2O 23μg/L，MnCl2·4H2O 165μg/L，CuSO4·5H2O 9μg/L，Na2MoO4·2H2O7.5μg/L，CoCl2·6H2O 12μg/L。
对比例1
对照培养基（CN105002092A）：一种球等鞭金藻培养基，包括如下组分：KNO3120mg/L，Co(NH2)2 6mg/L，KH2PO4 12mg/L，柠檬酸铁铵3.5mg/L，Na2EDTA 12mg/L，氯化镝0.5mg/L，胺鲜酯 1mg/L，VB1 0.006mg/L，VB12 0.05mg/L，ZnSO4·4H2O 23μg/L，MnCl2·4H2O178μg/L，CuSO4·5H2O 10μg/L，Na2MoO4·2H2O 7.3μg/L，CoCl2·6H2O 12μg/L。
对比例2
f/2海水培养基。
对比例3
在实施例1的基础上进行去除植酸组分。
对比例4
在实施例1的基础上进行去除肌醇组分。
对比例5
在实施例1的基础上进行去除乙烯利组分。
对比例6
在实施例1的基础上进行去除维生素B6组分。
实施例4
球等鞭金藻培养方法参照实施例1。
检测实施例和对比例中的培养基对球等鞭金藻的培养效果。
培养期间隔日定时取藻液计数藻细胞密度。藻细胞密度的测定采用计数板计数法。
如图1所示，经过对现有技术的培养基组分进行改进，本发明的培养基培养效果更好，培养8天的藻细胞密度为630万个/ml，接近峰值，继续培养，细胞密度增殖并不太明显。其他组别也存在类似的趋势，鉴于成本和培养时间的考虑，选择在第8天进行各组别的比较，对比例1组为438万个/ml，对比例2组为416万个/ml，本发明分别较对比例1和对比例2组提高了43％和48％，增幅较为明显；与对比例3-6比较，本发明培养基在现有技术培养基的基础上进行优化，添加了植酸、肌醇、乙烯利以及维生素B6，各组分之间相互协同，共同提升了藻细胞的密度。
实施例5
本发明制备的球等鞭金藻粉（实施例1）的性能测试。
南美对虾养殖中，在普通对虾饲料（鱼粉30％＋大豆粕25％＋玉米20％＋麦麸15％＋酵母粉5％＋矿物质3％＋氨基酸2％）中添加本发明藻粉，按照常规方式养殖20d。养殖状况见表1。
表1
藻粉添加量％ 始重 末重 成活率%
0 2.82±0.41 4.89±0.82 83
0.5 2.75±0.38 6.02±0.94 91
1 2.78±0.43 6.57±0.77 97
2 2.74±0.36 6.71±1.03 96
由上表1可见，本发明藻粉添加到南美白对虾基础饲料中，能够提高生长速度和成活率，改善南美白对虾的生长性能，各添加组均明显优于不添加组，综合成本和养殖效果，以添加量为1％为最佳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.高密度培养球等鞭金藻制备藻粉的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有培养基的培养容器中，光照强度3000-5000lux，24℃培养，光暗比为18:6，培养9-12d，收集藻液；所述培养基由以下组分组成：KNO3 100-120mg/L，植酸15-20mg/L，KH2PO4 10-12mg/L，肌醇10-12mg/L，Co(NH2)2 6-8mg/L，柠檬酸铁铵3-4mg/L，Na2EDTA 10-12mg/L，氯化镝0.4-0.6mg/L，胺鲜酯 1-2mg/L，乙烯利0.4-0.6mg/L，维生素B6 0.05-0.1mg/L，维生素12 0.04-0.06mg/L，维生素1 0.006-0.008mg/L，ZnSO4·7H2O 20-25μg/L，MnCl2·4H2O 150-200μg/L，CuSO4·5H2O 8-12μg/L，Na2MoO4·2H2O 7-8μg/L，CoCl2·6H2O 10-15μg/L；
步骤2）将藻液置于碟片离心机中离心，收集沉淀，然后置于-20℃的低温条件下，冷冻处理30-60min，再置于50-60℃的真空干燥箱中，干燥至恒重，收集干燥后的藻体，最后置于万能粉碎机进行粉碎，过200目筛，收集筛下物，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碟片离心机的离心速度为4000-5000rpm，离心时间为5-10min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述球等鞭金藻的接种初始密度为20-30万个/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基由以下组分组成：KNO3 100mg/L，植酸20mg/L，KH2PO4 12mg/L，肌醇10mg/L，Co(NH2)2 6mg/L，柠檬酸铁铵3.5mg/L，Na2EDTA12mg/L，氯化镝0.5mg/L，胺鲜酯1mg/L，乙烯利0.5mg/L，维生素B6 0.1mg/L，维生素120.05mg/L，维生素1 0.006mg/L，ZnSO4·7H2O 23μg/L，MnCl2·4H2O 178μg/L，CuSO4·5H2O10μg/L，Na2MoO4·2H2O 7.3μg/L，CoCl2·6H2O 12μg/L。
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