CN110101849B - 一种酶催化解酒作用的组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶催化解酒作用的组合物及其制备方法与应用，所述的组合物包括1～10份乙醇脱氢酶、1～10份乙醛脱氢酶、1～10份乙醇脱氢酶激动剂、1～10份乙醛脱氢酶激动剂、0～10份乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的共同辅基，组方全面，可显著提升酶的活性，并提升解酒效果，所述的激动剂同时还具有护肝作用。本发明的组合物可应用于酶催化解酒剂的制备，可有效、迅速缓解醉酒。同时，本发明还对所述组合物的剂型和给药方式进行了有益改进，例如，通过雾化吸入使药物能够通过呼吸道作用于患者，达到迅速缓解醉酒的效果，使用场景更广、更方便。本发明的产品生物利用度高、质量稳定、生产工艺简单，并且适用面广、使用方便、易于推广。

Description

一种酶催化解酒作用的组合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物制剂研发的技术领域，特别涉及一种酶催化解酒作用的组合物及其制备方法与应用。
背景技术
我国酒文化源远流长，酒桌文化也异常丰富，酒市场巨大，我国是8千亿级市场世界饮酒大国。来自最新数据显示，中国已经赶超英美，成为全球酒类消费最大国家。饮酒市场有多大，醒酒市场就有多大。
酒精在人体内的代谢主要靠两种酶：乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶。乙醇脱氢酶能把酒精分子中的两个氢原子脱掉，使乙醇分解变成乙醛；而乙醛脱氢酶则能把乙醛中的两个氢原子脱掉，使乙醛转化为乙酸。
人体中这两种酶的多少和活力，决定了酒量的大小。如果这两种酶量不够，或者活力不强，这类人喝酒后会产生恶心欲吐、昏迷不适等醉酒症状。酒精及其代谢产物乙醛对肝脏的伤害是最直接，它能使肝细胞发生变性和坏死，引起转氨酶急剧升高；如果长期饮酒，还容易导致酒精性脂肪肝、酒精性肝炎，甚至酒精性肝硬化。
因此，长期饮酒会对身体造成一定的危害。过量饮酒会影响肝肾功能。然而，我国酒文化源远流长，可以说饮酒是人们生活中无法避免的一部分。那么，有没有什么办法让我们在享受酒精带来的快感的同时，防止酒精对我们的身体造成伤害？我国现阶段对解酒药物的研究主要集中于中药或植物制剂。但这些制剂通常只具有保肝功能，难以分解酒精。另外，有些药物甚至声称能减少血液中的酒精浓度，但是还缺少相关证据。目前，真正具有直接分解酒精作用的制剂则未见报道。
此外，在饮酒的同时，人们常常饮茶，而茶叶中富含茶多酚，例如儿茶素(EC)、没食子儿茶素(EGC)、儿茶素没食子酸酯(ECG)和没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。发明人团队在本发明的研究过程中，发现这些成分会抑制人体内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，是抑制剂。因此，寻找激动剂，增强乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，对于解酒非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，针对我国解酒药市场的痛点，提供一种具有解酒作用的组合物；该组合物含有酒精代谢过程中的两种酶，并且含有乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的激动剂，功能全面；两种酶直接分解酒精，极大地减少酒精的吸收并进入血液循环，含有的激动剂可显著提升解酒活性。
本发明的另一目的在于提供所述的具有解酒作用的组合物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种酶制剂。
本发明的再一目的在于提供所述的具有解酒作用的组合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有解酒作用的组合物，包含如下重量份数的原料组分：
所述的乙醇脱氢酶激动剂优选为二硫苏糖醇、巯基乙醇、咪唑、2-巯基咪唑中的一种或至少两种。
所述的乙醛脱氢酶激动剂优选为硫辛酸、牛磺酸、蛋氨酸或γ-氨基丁酸中的一种或至少两种。
所述的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的共同辅基优选为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。
所述的乙醇脱氢酶优选为乙醇脱氢酶ADH1B2；所述的乙醛脱氢酶优选为乙醛脱氢酶ALDH2。
所述的乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶可通过基因重组的方法制备得到；具体操作步骤优选为：构建含有所述的乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶基因片段的重组表达载体，将所述的重组表达载体转入表达系统中进行表达，最后纯化得到所述的乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶。
所述的表达系统优选为酵母；进一步优选为毕赤酵母GS115。
所述的表达载体优选为pPIC3.5k。
所述的纯化优选为通过亲和层析进行纯化；进一步优选为通过镍柱层析进行纯化。
所述的镍柱层析中的洗脱目的蛋白的洗脱液优选为200mM咪唑缓冲液；所述的200mM咪唑缓冲液的配方优选为200mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠。
所述的具有解酒作用的组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)混合：按配方将乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶激动剂、乙醛脱氢酶激动剂以及乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的共同辅基混匀，得到解酒剂原料；
(2)溶解：将步骤(1)得到的解酒剂原料溶解于水，得到水溶液；
(3)灭菌：将步骤(2)所述的水溶液灭菌，即得所述的具有解酒作用的组合物。
所述的制备方法还可以包括将所述的具有解酒作用的组合物灌装于洁净干燥灭菌的容器中并密封的步骤，从而得到更适于保存的具有解酒作用的组合物成品。
步骤(2)中所述的水溶液优选为浓度为5～10mg/mL的水溶液。
步骤(2)中所述的水优选为去离子水、蒸馏水或超纯水；进一步优选为经过灭菌的去离子水、蒸馏水或超纯水。
步骤(3)中所述的灭菌优选用微孔滤膜过滤灭菌；所述的微孔滤膜优选为孔径为0.22μm的微孔滤膜。
一种酶制剂，含有所述的具有解酒作用的组合物和药学上可接受的载体或辅料。
所述的酶制剂优选为雾化剂或注射剂，所述的雾化剂包括气雾剂、喷雾剂等。
所述的酶制剂的给药方式优选为吸入给药；进一步优选为雾化吸入。
所述的雾化吸入是用雾化装置将药物溶液分散成微小的雾滴或微粒，通过自然呼吸，进入呼吸道及肺内，达到局部治疗。
所述的具有解酒作用的组合物在制备解酒药物或保健食品中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)在组方方面，本发明提供酶催化解酒组合物的组方全面、科学、合理，含有酒精代谢过程中的两种关键酶——高表达的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶及其共同辅基；两种酶可直接分解酒精，极大地减少酒精的吸收或血液中的酒精含量。
(2)在效果方面，本发明的组合物可有效、迅速缓解醉酒，组合物中含有的两种关键酶的激动剂，可显著提升两种酶的活性，并提升解酒效果，而且这些激动剂还具有很强的护肝活性。
(3)在制剂形式上，本发明可通过雾化吸入或注射的方式给药。雾化吸入使药物能够通过呼吸道作用于患者，特别是酒后深睡和酒后昏迷的病人，达到迅速缓解醉酒的效果。注射的方式起效快，但需要在医院进行。因此，在制剂形式上，本发明进行了完全不同于现有技术中的口服的中药制剂的创新，给药方式灵活多样，方便快捷。
(4)本发明提供了与现有技术不同的全新有效成分组合，不同于现有技术中提供口服中药制剂，本发明的产品生物利用度高、质量稳定、生产工艺简单，并且适用面广、使用方便、易于推广。
附图说明
图1是实施例10中醒酒作用的结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1乙醇脱氢酶的克隆(酵母)、表达、纯化
1.构建质粒.将商品质粒ADH1B2-pPIC9k(购买于江苏泓讯生物科技有限公司，含人源ADH1B2基因以及N端-His×6标签)上的ADH1B2基因(对应的NCBI登录号CN20036-1)通过PCR技术扩增(上游引物ADH1B2-pPIC3.5k-F：aattattcgaaggatccATGGCCACCATGCACCACCACCATCACCA，下游引物ADH1B2-pPIC3.5k-R：ccgccctagggaattcTCAAAACGTCAGGACGGTACG)，得到目的片段(包括ADH1B2和His×6标签)后，使用同源重组酶ⅡOne StepCloning Kit，将人源乙醇脱氢酶ADH1B2基因及His×6标签，构建到pPIC3.5k质粒的BamHI，EcoR I酶切位点之间，得到表达载体ADH1B2-pPIC3.5k。
2.构建酵母表达体系.将步骤1得到的质粒ADH1B2-pPIC3.5k使用Sac I快切酶酶切，转化至酵母Pichia pastoris GS115中。对转化后的酵母进行筛选，将PCR验证为阳性的菌株在YPD培养基(酵母培养基)中培养，温度为30℃，转速为200r/min，24h后按1％接种至50mL BMGY培养基中，在30℃，转速为200r/min的摇床中培养18h左右，离心收集菌体。然后，将上一步离心收集得到的菌体接种于50mL BMMY培养基中。诱导表达条件为温度28℃，pH＝7.0，初始OD600＝15，诱导72h，每24h补加甲醇1.2％。
3.离心分离.将发酵液于4℃，4000r/min离心收集菌体，置于冰上，使用PBS(pH＝7.4)重悬菌体。每1mL样品，加入100μL裂解缓冲液(1mM EDTA，5％甘油，50mM磷酸钠，1mMPMSF，购买于阿拉丁试剂公司)，加入等体积的酸洗玻璃珠(0.5mm，购买于上海迈瑞尔化学技术有限公司)，涡旋30s，冰上孵育1分钟，12000r/min离心收集上清，将上清转移至干净的里离心管中，保存于-20℃。
4.纯化.由于目的蛋白有His6标签，能与亲和色谱上的Ni紧密结合，而被分离出来。将步骤3的上清2mL上载于镍柱上，用5倍柱体积的清洗缓冲液(40mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠)去除杂质，再用10倍柱体积的200mM咪唑缓冲液洗(200mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠)脱出目的蛋白。将洗脱下来的蛋白用30kDa超滤管浓缩蛋白，并加入PBS(pH＝7.4)缓冲液透析2次以除盐，于-80℃保存，即得到人源乙醇脱氢酶。
实施例2
乙醛脱氢酶的克隆(酵母)、表达、纯化，与上述方法相似。
1.构建质粒.将商品质粒ALDH2-pPIC9k(购买于江苏泓讯生物科技有限公司，含人源ALDH2基因以及N端-His×6标签)上的ALDH2基因(对应的NCBI登陆号CNCN19443-1)通过PCR技术扩增(上游引物ALDH2-pPIC3.5k-F：attattcgaaggatccATGGCCACCATGCACCACCACCATCACCA，下游引物ALDH2-pPIC3.5k-R：ccgccctagggaattcTTAGGAGTTCTTTTGTGGGACCTT)，得到目的片段(包括ALDH2基因和His×6标签)后，使用同源重组酶ⅡOneStep Cloning Kit，将人源乙醛脱氢酶ALDH2基因及His×6标签，构建到pPIC3.5k质粒的BamH I，EcoR I酶切位点之间，得到表达载体ALDH2-pPIC3.5k。
2.构建酵母表达体系.将步骤1得到的质粒ALDH2-pPIC3.5k使用Sac I快切酶酶切，转化至酵母Pichia pastoris GS115中。对转化后的酵母进行筛选，将PCR验证为阳性的菌株在YPD培养基(酵母培养基，购自北京绿百草科技发展有限公司)中培养，温度为30℃，转速为200r/min，24h后按1％接种至50mL BMGY培养基(为酵母培养基，购自北京绿百草科技发展有限公司)中，在30℃，转速为200r/min的摇床中培养18h左右，离心收集菌体。然后，将上一步离心收集得到的菌体接种于50mL BMMY培养基中。诱导表达条件为温度28℃，pH＝7.0，初始OD600＝15，诱导72h，每24h补加甲醇1.2％。
3.离心分离.将发酵液于4℃，4000r/min离心收集菌体，置于冰上，使用PBS(pH＝7.4)重悬菌体。每1mL样品，加入100μL裂解缓冲液(1mM EDTA，5％甘油，50mM磷酸钠，1mMPMSF，购买于阿拉丁试剂公司)，加入等体积的酸洗玻璃珠(0.5mm，购买于上海迈瑞尔化学技术有限公司)，涡旋30s，冰上孵育1分钟，12000r/min离心收集上清，将上清转移至干净的离心管中，保存于-20℃。
4.纯化.由于目的蛋白有His6标签，能与亲和色谱上的Ni紧密结合，而被分离出来。将步骤3的上清2mL上载于镍柱上，用5倍柱体积的清洗缓冲液(40mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠)去除杂质，再用10倍柱体积的200mM咪唑缓冲液洗(200mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠)脱出目的蛋白。将洗脱下来的蛋白用30kDa超滤管浓缩蛋白，并加入PBS(pH＝7.4)缓冲液透析2次以除盐，于-80℃保存，即得到人源乙醛脱氢酶。
实施例3酶催化解酒组合物的制备I
(1)将乙醇脱氢酶1g、乙醛脱氢酶1g、乙醇脱氢酶激动剂二硫苏糖醇1g、乙醛脱氢酶激动剂蛋氨酸1g，及两种脱氢酶的共同辅基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1g均匀混合，即得酶催化解酒组合物I。
(2)定容：将步骤(1)得到的解酒剂组合物I原料溶解于蒸馏水，配成5mg/mL的水溶液。
(3)将步骤(2)的水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，并灌装于洁净干燥灭菌的容器中，加盖密封，即得到有解酒作用的组合物。
实施例4酶催化解酒组合物的制备II
(1)将乙醇脱氢酶0.1g、乙醛脱氢酶1g、乙醇脱氢酶1g激动剂二硫苏糖醇1g、乙醛脱氢酶激动剂蛋氨酸1g，及两种脱氢酶的共同辅基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1g均匀混合，即得酶催化解酒组合物II。
(2)定容：将步骤(1)得到的解酒剂组合物II原料溶解于蒸馏水，配成5mg/mL的水溶液。
(3)将步骤(2)的水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，并灌装于洁净干燥灭菌的容器中，加盖密封，即得到有解酒作用的组合物。
实施例5酶催化组合物的制备III
(1)将乙醇脱氢酶1g、乙醛脱氢酶0.1g、乙醇脱氢酶激动剂咪唑1g、乙醛脱氢酶激动剂硫辛酸1g，及两种脱氢酶的共同辅基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.5g均匀混合，即得酶催化解酒组合物III。
(2)定容：将步骤(1)得到的解酒剂组合物III原料溶解于蒸馏水，配成6mg/mL的水溶液。
(3)将步骤(2)水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，并灌装于洁净干燥灭菌的容器中，加盖密封，即得到有解酒作用的组合物。
实施例6酶催化组合物的制备IV
(1)将乙醇脱氢酶1g、乙醛脱氢酶1g、乙醇脱氢酶激动剂巯基乙醇0.1g、乙醛脱氢酶激动剂牛磺酸1g，及两种脱氢酶的共同辅基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.7g均匀混合，即得酶催化解酒组合物IV。
(2)定容：将步骤(1)得到的解酒剂组合物原料IV溶解于蒸馏水，配成7mg/mL的水溶液。
(3)将步骤(2)水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，并灌装于洁净干燥灭菌的容器中，加盖密封，即得到有解酒作用的组合物。
实施例7酶催化组合物的制备V
(1)将乙醇脱氢酶1g、乙醛脱氢酶1g、乙醇脱氢酶激动剂2-巯基咪唑0.1g、乙醛脱氢酶激动剂γ-氨基丁酸1g，及两种脱氢酶的共同辅基烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.8g均匀混合，即得酶催化解酒组合物V。
(2)定容：将步骤(1)得到的解酒剂组合物V原料溶解于蒸馏水，配成7mg/mL的水溶液。
(3)将步骤(2)水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，并灌装于洁净干燥灭菌的容器中，加盖密封，即得到有解酒作用的组合物。
实施例8乙醇脱氢酶激动剂的筛选实施例
将缓冲液(磷酸缓冲液，pH：7.0，终浓度为0.2mol/L)，乙醇、KCl、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和实施例1制得的乙醇脱氢酶加入混匀后(乙醇、KCl、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和乙醇脱氢酶加入量见表1)，于37℃孵育10min，然后加入待测试化合物二硫苏糖醇、巯基乙醇、咪唑、2-巯基咪唑、硫辛酸、牛磺酸、蛋氨酸或γ-氨基丁酸、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯(各待检测化合物加入量见表1)，3min之内进行检测；紫外分光光度计温度槽温度为37℃，波长设定为340nm，测定吸光值，以第15分钟的吸光值为指标，判断各化合物对乙醇脱氢酶活力的影响，吸光值越高，说明乙醇脱氢酶的活力越强。
表1乙醇脱氢酶活性测试体系组方表
组分 加入量
1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0) 20μL
20mmol/Lβ-NAD 20μL
100mmol/L乙醛 13.3μL
3mol/L KCl 6.7μL
1mol/L待测化合物 2μL
乙醇脱氢酶 10μL
H2O 128μL
表2各待检测化合物及经乙醇脱氢酶作用后对应的吸光值
从表2可知，化合物二硫苏糖醇、巯基乙醇、咪唑、2-巯基咪唑的吸光值显著高于对照组，具有促进乙醇脱氢酶的活性，为激动剂；相比较而言，茶叶中儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯显著降低吸光度，为乙醇脱氢酶的抑制剂，这说明，饮酒时，喝茶会降低乙醇脱氢酶的活性。橙汁中的山奈酚和槲皮素也会轻微降低乙醇脱氢酶的活性，说明，饮酒的同时，喝果汁也是不科学的。
实施例9乙醛脱氢酶激动剂的筛选实施例
将缓冲液(磷酸缓冲液，pH：7.0，终浓度为0.2mol/L)，乙醛、KCl、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和实施例2制得的乙醛脱氢酶加入混匀后(乙醇、KCl、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和乙醛脱氢酶加入量见表3)，于37℃孵育10min，然后加入待测试化合物二硫苏糖醇、巯基乙醇、咪唑、2-巯基咪唑、硫辛酸、牛磺酸、蛋氨酸或γ-氨基丁酸、儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯(各待检测化合物加入量见表3)，3min之内进行检测；紫外分光光度计温度槽温度为37℃，波长设定为340nm，测定吸光值，以第15分钟的吸光值为指标，判断各化合物对乙醛脱氢酶活力的影响，吸光值越高，说明乙醛脱氢酶的活力越强。
表3乙醛脱氢酶活性测试体系组方表
组分 加入量
1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0) 20μL
20mmol/Lβ-NAD 20μL
100mmol/L乙醛 13.3μL
3mol/L KCl 6.7μL
1mol/L待测化合物 2μL
乙醛脱氢酶 10μL
H2O 128μL
表4各待检测化合物及经乙醇脱氢酶作用后对应的吸光值
化合物 吸光值(mAU)
二硫苏糖醇 466
巯基乙醇 457
咪唑 452
2-巯基咪唑 456
硫辛酸 832
牛磺酸 827
蛋氨酸 785
γ-氨基丁酸 776
儿茶素 255
没食子儿茶素 244
儿茶素没食子酸酯 236
没食子儿茶素没食子酸酯 228
山奈酚 418
槲皮素 406
水(对照) 445
从表4可知，化合物硫辛酸、牛磺酸、蛋氨酸或γ-氨基丁酸的吸光值显著高于对照组，具有促进乙醛脱氢酶的活性，为激动剂；相比较而言，儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯和没食子儿茶素没食子酸酯显著降低吸光度，为乙醛脱氢酶的抑制剂，这说明，饮酒时，喝茶会降低乙醛脱氢酶的活性。橙汁中的山奈酚和槲皮素也会轻微降低乙醇脱氢酶的活性，说明，饮酒的同时，喝果汁也是不科学的。
实施例10解酒效果实施例
1.动物分组，每组10只小白鼠(昆明种小鼠，每只约20g)，雌雄对半。
A组：给小白鼠灌蒸馏水(阴性对照)。
B组：给小白鼠灌15mL/kg(52度)白酒(阳性对照)。
C组：给小白鼠灌15mL/kg(52度)白酒，白酒灌胃15分钟后，使用酶催化组合物I(实施例3)灌胃给药(200mg/kg)。
D组：给小白鼠灌15mL/kg(52度)白酒，白酒灌胃15分钟后，使用酶催化组合物I，用医用空气压缩雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)雾化给药(200mg/kg)。
E组：给小白鼠灌15mL/kg(52度)白酒，使用酶催化组合物腹腔注射给药(200mg/kg)。
2.检测指标
(1)醒酒时间：通过检测酶催化组合物I对醉酒小白鼠的活动情况以及翻正反射消失和翻正反射恢复时间；
(2)保肝作用：白酒灌胃5小时后，统一眼眶取血，测定小鼠血液中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)与谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的水平；
(3)护肾作用：白酒灌胃5小时后，统一眼眶取血，测定血液中尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)的含量；
AST、ALT、AKP和LDH酶活力及BUN、Cr含量均采用南京建成生物工程所的试剂盒，根据试剂盒的使用说明并采用本发明团队报道的方法(Toxicology and AppliedPharmacology 2012,265,190–199.)进行检测。
3实验结果
(1)醒酒作用
A、B、C、D、E各组测得的入睡数(只)、醉酒潜伏时间(分)、睡眠时间(分)、和醒酒时间(分)如表5所示。
表5酶催化组合物对醉酒小鼠的醒酒作用
小结:
饮酒会使小鼠翻正反射消失(醉酒)，翻正反射恢复时间(醒酒)延长。
本发明的酶催化组合物有醒酒作用，并且将给药形式由口服改为雾化，醉酒潜伏时间延长，睡眠时间缩短，醒酒时间缩短，醒酒作用明显增强；注射给药，醒酒作用略强于雾化给药(图1)。
(2)保肝作用
A、B、C、D、E各组测得的谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)与谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的含量如表6所示。
表6酶催化组合物对醉酒小鼠肝脏功能的保护作用
*与阴性对照(A)相比，有显著性差异p≤0.05；
小结：
饮酒使得小鼠血液中的谷丙转氨酶(ALT)与谷草转氨酶(AST)，碱性磷酸酶(AKP)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平显著上升；本酶催化组合物有保肝作用，并且将给药形式由口服改为雾化，AST、ALT、AKP、LDH指标下降，说明保肝作用明显增强；注射给药，保肝作用略强于雾化给药。
(3)护肾作用
A、B、C、D、E各组测得的尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的含量如表7所示。
表7酶催化组合物对醉酒小鼠肾脏功能的保护作用
*与阴性对照(A)相比，有显著性差异p≤0.05；
小结：
本酶催化组合物有肾脏保护作用，并且将给药形式由口服改为雾化，尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的含量下降，说明肾脏保护作用明显增强；注射给药，护肾作用略强于雾化给药。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种酶催化解酒作用的组合物及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ADH1B2-pPIC3.5k-F核苷酸序列
<400> 1
aattattcga aggatccatg gccaccatgc accaccacca tcacca 46
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ADH1B2-pPIC3.5k-R核苷酸序列
<400> 2
ccgccctagg gaattctcaa aacgtcagga cggtacg 37
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ALDH2-pPIC3.5k-F核苷酸序列
<400> 3
attattcgaa ggatccatgg ccaccatgca ccaccaccat cacca 45
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物ALDH2-pPIC3.5k-R核苷酸序列
<400> 4
ccgccctagg gaattcttag gagttctttt gtgggacctt 40

Claims (3)

1.一种具有解酒作用的组合物，其特征在于，包含如下重量份数的原料组分：
乙醇脱氢酶 1份； 乙醛脱氢酶 1份； 乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的共同辅基 1份； 乙醇脱氢酶激动剂 1份； 乙醛脱氢酶激动剂 1份；
所述的乙醇脱氢酶激动剂为二硫苏糖醇；
所述的乙醛脱氢酶激动剂为蛋氨酸；
所述的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的共同辅基为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述的乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶通过基因重组的方法制备得到；
所述的具有解酒作用的组合物为雾化剂，给药方式为雾化吸入；
所述的乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶通过基因重组的方法制备得到的具体操作步骤为：构建含有所述的乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶基因片段的重组表达载体，将所述的重组表达载体转入表达系统中进行表达，最后纯化得到所述的乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶；
所述的乙醇脱氢酶为乙醇脱氢酶ADH1B2；所述的乙醛脱氢酶为乙醛脱氢酶ALDH2；
所述的表达系统为酵母；
所述的表达载体为pPIC3.5k；
所述的纯化为通过亲和层析进行纯化；
所述的表达系统为毕赤酵母GS115；
所述的纯化为通过镍柱层析进行纯化；
所述的镍柱层析中的洗脱目的蛋白的洗脱液为200 mM咪唑缓冲液；
所述的具有解酒作用的组合物的制备方法包括如下步骤：
（1）混合：按配方将乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶激动剂、乙醛脱氢酶激动剂以及乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的共同辅基混匀，得到解酒剂原料；
（2）溶解：将步骤（1）得到的解酒剂原料溶解于水，得到水溶液；
（3）灭菌：将步骤（2）所述的水溶液灭菌，即得所述的具有解酒作用的组合物。
2.根据权利要求1所述的具有解酒作用的组合物，其特征在于：
所述的制备方法还包括将所述的具有解酒作用的组合物灌装于洁净干燥灭菌的容器中并密封的步骤，从而得到更适于保存的具有解酒作用的组合物成品；
步骤（2）中所述的水溶液为浓度为5～10 mg/mL的水溶液；
步骤（2）中所述的水为经过灭菌的去离子水、蒸馏水或超纯水；
步骤（3）中所述的灭菌为用微孔滤膜过滤灭菌；
所述的微孔滤膜为孔径为0.22 μm的微孔滤膜。
3.权利要求1或2所述的具有解酒作用的组合物在制备解酒药物中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5759539A (en) * 1995-06-06 1998-06-02 Georgia Research Foundation, Inc. Method for rapid enzymatic alcohol removal
CN102038806A (zh) * 2010-12-31 2011-05-04 北京迪诺基因科技有限公司 一种保肝组合物及其制备方法
CN104520311A (zh) * 2011-11-22 2015-04-15 约翰霍普金斯大学 用于降低酒精毒性的方法和组合物
CN105535945A (zh) * 2016-01-22 2016-05-04 刘洋 一种由生物制剂组成的解酒配方

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5759539A (en) * 1995-06-06 1998-06-02 Georgia Research Foundation, Inc. Method for rapid enzymatic alcohol removal
CN102038806A (zh) * 2010-12-31 2011-05-04 北京迪诺基因科技有限公司 一种保肝组合物及其制备方法
CN104520311A (zh) * 2011-11-22 2015-04-15 约翰霍普金斯大学 用于降低酒精毒性的方法和组合物
CN105535945A (zh) * 2016-01-22 2016-05-04 刘洋 一种由生物制剂组成的解酒配方

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
中药水提取物对乙醇脱氢酶活性影响的初步研究;芦洁等;《同济大学学报(医学版)》;20020228;第23卷(第01期);23-24,30 *

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