CN110087691A - 抗-edb抗体和抗体-药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合纤连蛋白1的外结构域B剪接变体的抗体和抗体‑药物缀合物以及用于制备和使用它们的方法。

Description

抗-EDB抗体和抗体-药物缀合物
发明领域
本发明涉及抗-EDB抗体和EDB抗体-药物缀合物(ADC)。本发明进一步涉及使用这样的抗体和ADC治疗表达EDB+ FN的病症（诸如癌症）的方法。
发明背景
纤连蛋白是以可溶形式存在于血浆和其它体液中且以不溶形式存在于细胞外基质(ECM)中的高分子量黏着糖蛋白。纤连蛋白1的外结构域B剪接变体(EDB+ FN或EDB)是一种非内化ECM蛋白。EDB是每当组织重塑发生时通过在初级转录物水平的可变剪接机制插入纤连蛋白分子中的91氨基酸III型同源性结构域。已经证实EDB+ FN选择性地在肿瘤和其它病状中的新血管周围的间质中积累，但是在正常的成年血管系统中大量缺失。Zardi等人,Embo J. 6(8): 2337-42 (1987)。EDB+ FN在许多侵袭性肿瘤中表达，且根据肿瘤类型表现出主要在血管的或弥散性间质的表达模式。Carnemolla等人, J. Cell Biol. 108(3):1139-48 (1989)。
已经通过噬菌体展示技术分离出特异性地结合纤连蛋白(FN)的EDB结构域的抗体，即L19抗体。Carnemolla等人, Int. J. Cancer 68(3): 397-405 (1996)；Neri等人,Nat. Biotechnol. 15(12): 1271-5. (1997)；Pini等人, J. Biol. Chem. 273(34):21769-76 (1998)。在宽范围的实验肿瘤模型中和在人肿瘤和其它血管生成性病症的切片上，L19抗体能够将肿瘤血管染色。Carnemolla等人, J. Cell Biol. 108(3): 1139-48(1989); Kaczmarek等人, Int. J. Cancer 59(1): 11-6 (1994); Berndt等人,Histochem. Cell Biol. 109(3): 249-55 (1998)。
在癌症的治疗中使用L19抗体的不同形式已经探究了多种靶向策略。例如，scFv(L19)单克隆抗体片段，Birchler等人. Nat Biotechnol. 17: 984-8 (1999)，融合蛋白包括与scFv(L19)融合的白介素-12 (IL-12)和肿瘤坏死因子(TNF-α)，Halin C. 等人.Cancer Res. 63(12):3202-10 (2003)，以及单独的和与光敏剂缀合的L19小免疫蛋白(SIP)，Fabbrini M. 等人. Int J Cancer 118(7):1805-13 (2006)。
尽管已经公开了多种基于L19抗体的疗法，但是对于具有表达EDB+ FN的病症或疾病（诸如与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症）的那些患者而言，仍然存在对进一步改善的和优化的靶向EDB+ FN的疗法（诸如抗体-药物缀合物）的开发的重大临床需要。
发明概述
本发明提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(a)结合纤连蛋白(FN)的外结构域B(EDB)的抗体或其抗原结合片段，(b)接头和(c)药物。在某些方面，抗体-药物缀合物包含抗体或抗原结合片段，可以包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有SEQ IDNO: 3、5和7的三个CDR，所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 12、13和14的三个CDR。在某些方面，抗体-药物缀合物包含抗体或抗原结合片段，可以包含含有SEQ ID NO: 1或21的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区。
本发明也提供了一种抗体-药物缀合物，其包含抗体或抗原结合片段，可以包含含有SEQ ID NO: 1的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区；或含有SEQ ID NO: 21的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区。在某些方面，抗体-药物缀合物包含抗体或抗原结合片段，包含含有SEQ ID NO: 8、17、19、23、25、27或29的重链和含有SEQ IDNO: 15或31的轻链。
本发明也提供了一种抗体-药物缀合物，其包含含有以下链的抗体或抗原结合片段：含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 17的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 17的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 19的重链和含有SEQID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 19的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ IDNO: 23的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 23的重链和含有SEQ ID NO:31的轻链；含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；或含有SEQ ID NO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链。
本发明也提供了一种抗体-药物缀合物，其包含具有重链和/或轻链恒定区的抗体或抗原结合片段，所述重链和/或轻链恒定区包含用于位点特异性缀合的经工程改造的半胱氨酸残基。在某些方面，抗体-药物缀合物具有重链恒定区，所述重链恒定区包含在位置290处的经工程改造的半胱氨酸残基(K290C)，根据Kabat的EU索引编号。在某些方面，抗体-药物缀合物具有轻链恒定区，所述轻链恒定区包含在位置183处的经工程改造的半胱氨酸残基(κK183C)，根据Kabat的编号。在某些方面，抗体-药物缀合物具有重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含在位置290处的经工程改造的半胱氨酸残基(K290C)，根据Kabat的EU索引编号，所述轻链恒定区包含在位置183处的经工程改造的半胱氨酸残基(κK183C)，根据Kabat的编号。
本发明进一步提供了具有抗体或抗原结合片段的抗体-药物缀合物，所述抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含经工程改造的含有谷氨酰胺的标签，所述标签插入在所述抗体中或替代所述抗体中的一个或多个内源氨基酸。在某些方面，抗体-药物缀合物具有在位置E294-N297处插入所述抗体中的经工程改造的含有谷氨酰胺的标签。在某些方面，抗体-药物缀合物具有含有谷氨酰胺的标签，所述标签包含氨基酸序列LLQG (SEQ ID NO: 40)。在某些方面，具有重链恒定区的抗体-药物缀合物进一步包含在位置222处用精氨酸(R)置换赖氨酸(K)(K222R)，根据Kabat的EU索引编号。
本发明也提供了具有抗体或抗原结合片段的抗体-药物缀合物，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含在位置94处用精氨酸(R)置换赖氨酸(K)(K94R)，根据Kabat的编号。
本发明进一步提供了具有接头的抗体-药物缀合物，所述接头是可切割的接头。在某些方面，所述可切割的接头选自vc、diS、diS-C2OCO和AcLys-vc。
本发明进一步提供了具有药物的抗体-药物缀合物，所述药物是细胞毒性剂。在某些方面，所述细胞毒性剂是奥里斯他汀（auristatin）。在某些方面，所述奥里斯他汀选自0101、1569、9411和4574。在某些方面，所述细胞毒性剂是CPI二聚体。在某些方面，所述CPI二聚体是CPI-8314或CPI-0326。
本发明也提供了抗体-药物缀合物，其包含(a)含有重链可变区和轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 3、5和7的三个CDR，所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 12、13和14的三个CDR，(b) vc接头和(c) 0101药物。
本发明也提供了一种抗体-药物缀合物，其包含(a)抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO: 21的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区；(b) vc接头和(c) 0101药物。
本发明也提供了抗体-药物缀合物，其包含(a)抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；(b) vc接头和(c) 0101药物。
本发明进一步提供了药物组合物，其包含本发明的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体。本发明也提供了一种组合物，其包含多种本发明的抗体-药物缀合物和任选的药用载体，其中所述组合物具有在3-5范围内的平均DAR。本发明也提供了一种组合物，其包含多种权利要求1-25中的任一项的抗体-药物缀合物和任选的药用载体，其中所述组合物具有在1-3范围内的平均DAR。
本发明提供了核酸，其编码本发明的抗体的重链或轻链。在某些方面，所述核酸可以包含编码重链的SEQ ID NO: 9、18、20、24、26、28或30，或可以包含编码轻链的SEQ IDNO: 16或32。本发明进一步提供了一种载体，其包含本发明的任何核酸。并且，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的任何核酸。
本发明提供了一种用于生产本发明的抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括：(a)将所述接头连接至所述药物；(b)将所述接头和药物缀合至所述抗体；和(c)纯化所述抗体-药物缀合物。在某些方面，所述缀合是对所述抗体上的一个或多个经工程改造的半胱氨酸残基和/或经工程改造的谷氨酰胺残基位点特异性的。
本发明也提供了一种治疗表达EDB+ FN的病症或疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的包含本发明的抗体-药物缀合物的组合物。在某些方面，所述表达EDB+ FN的病症或疾病是癌症。在某些方面，所述癌症是实体瘤或血癌。在某些方面，所述实体瘤是甲状腺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胆囊癌、肾癌、皮肤癌、子宫癌、间皮瘤、结直肠癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、内分泌癌、胸腺癌、脑癌、肾上腺癌、眼癌、宫颈癌和肺癌。在某些方面，所述血癌是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
本发明进一步提供了本发明的抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的表达EDB+ FN的病症或疾病。在某些方面，所述表达EDB+ FN的病症或疾病是癌症。在某些方面，所述癌症是实体瘤或血癌。在某些方面，所述实体瘤是甲状腺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胆囊癌、肾癌、皮肤癌、子宫癌、间皮瘤、结直肠癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、内分泌癌、胸腺癌、脑癌、肾上腺癌、眼癌、宫颈癌和肺癌。在某些方面，所述血癌是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
附图说明
图1A和1B显示了[A] EDB-L19、EDB-PFE和EDB-(K94R)抗体以及[B] EDB-(K94R)和EDB-(κK183C-K94R-290C)抗体的结合性能。
图2显示了在人患者衍生的异种移植物(PDX)癌症模型中使用RNA-Seq分析的EDB+FN表达。
图3A和3B显示了[A] EDB-L19抗体和EDB-L19-vc-0101 ADC和EDB-(κK183C-K94R-290C)抗体和EDB-(κK183C-K94R-290C)-vc-0101 ADC以及[B] EDB-(K94R)抗体和EDB-(K94R)-vc-0101 ADC和EDB-(κK183C-K290C)抗体和EDB-(κK183C-K290C)-vc0101 ADC的ELISA结合曲线。
图4显示了通过蛋白质印迹确定的WI38-VA13和HT-29细胞中的EDB+ FN表达。
图5A-5F显示了以下在PDX-NSX-11122（高表达EDB+ FN的NSCLC患者衍生的异种移植物(PDX)人癌症模型）中的抗肿瘤效力作为每只单独荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制曲线：[A]0.3、0.75、1.5和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101；[B] 3 mg/kg和10 mg/kg的与EDB-L19-diS-DM1二硫化物连接的EDB-L19-vc-0101；[C] 1和3 mg/kg和5 mg/kg的与EDB-L19-diS-C2OCO-1569二硫化物连接的EDB-L19-vc-0101；[D]位点特异性缀合的EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101和常规地缀合的EDB-L19-vc-0101 (ADC1)，分别以0.3、1和3 mg/kg和1.5mg/kg的剂量；[E]位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101，在0.3、1和3 mg/kg的剂量；和[F]在3 mg/kg施用的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101组。
图6A-6F显示了以下在H-1975（中至高表达EDB+ FN的NSCLC细胞系异种移植物(CLX)人癌症模型）中的抗肿瘤效力：[A] 0.3、0.75、1.5和3 mg/mg的EDB-L19-vc-0101；[B]0.3、1和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-1569；[C] EDB-L19-vc-0101和EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI-8314，分别以0.5、1.5和3 mg/kg和0.1、0.3和1 mg/kg；[D]0.5、1.5和3 mg/kg的位点特异性缀合的EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101和常规地缀合的EDB-L19-vc-0101；[E] 1和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101和EDB-(K94R)-vc-0101；和[F] 1和3 mg/kg的EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101。
图7显示了3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-9411在HT29（中等表达EDB+FN的结肠CLX人癌症模型）中的抗肿瘤效力。
图8A和8B显示了0.3、1和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101在以下中的抗肿瘤效力：[A]PDX-PAX-13565，一种中至高表达EDB+ FN的胰腺PDX；和[B] PDX-PAX-12534，一种低至中表达EDB+ FN的胰腺PDX。
图9显示了1和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101在Ramos（一种中等表达EDB+ FN的淋巴瘤CLX人癌症模型）中的抗肿瘤效力。
图10A和10B显示了以下在EMT-6（小鼠同基因乳腺癌模型）中的抗肿瘤效力作为每只单独荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制曲线：[A] 4.5 mg/kg的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101；和[B]在4.5 mg/kg施用的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101组。
图11显示了与6 mg/kg的位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101(ADC4)相比，5 mg/kg的常规地缀合的EDB-L19-vc-0101的绝对嗜中性粒细胞计数。
发明详述
本发明提供了结合纤连蛋白(FN)的外结构域B (EDB)（可互换地被称作“EDB+ FN”或“EDB”）的抗体和抗体药物缀合物(ADC)。本发明还提供了使用抗-EDB抗体、接头和药物(净荷)制备ADC的方法。本发明进一步提供了使用常规和/或位点特异性缀合技术产生的ADC。本发明的抗体和ADC可用于制备和生产组合物，诸如药物，其可以用于诊断、预防和/或治疗以EDB+ FN表达为特征或与EDB+ FN表达有关的过度增殖病症，诸如癌症。本发明还提供了编码在制备EDB ADC中使用的抗-EDB抗体的核酸。
ADC包含与药物缀合的抗体组分，通常通过使用接头。通过常规缀合技术产生的ADC通过内源性地在抗体重链和/或轻链上的赖氨酸或半胱氨酸残基将药物随机地连接至抗体。因此，这样的ADC是具有不同药物:抗体比率(DAR)的物质的异质混合物。通过位点特异性缀合技术产生的ADC在抗体重链和/或轻链上的特定经工程改造的残基处将药物连接至抗体。这样，位点特异性缀合的ADC是由具有确定的药物:抗体比率(DAR)的物质构成的ADC同质混合物。因而，位点特异性缀合的ADC表现出均匀的化学计量学，从而导致改善的药代动力学、生物分布和安全性概况。
本发明的ADC包括经由接头与一种或多种药物缀合的抗-EDB抗体(即形成接头-药物部分)。本发明提供了ADC，其具有：(a)结合EDB的抗体或其抗原结合片段；(b)接头和(c)药物。本发明进一步提供了式Ab-(L-D)的ADC，其中(a) Ab是结合EDB的抗体或其抗原结合片段，且(b) L-D是接头-药物部分，其中L是接头，且D是药物。在另一个方面，本发明提供了式Ab-(L-D)p的ADC，其中(a) Ab是结合EDB的抗体或其抗原结合片段，(b) L-D是接头-药物部分，其中L是接头，且D是药物且(c) p是与抗体连接的接头-药物部分的数目。
与抗体连接的接头-药物部分的数目可以是对于ADC的开发而言优选的任何数目。在某些方面，每个抗体的接头-药物部分的数目是4。在其它方面，每个抗体的接头-药物部分的数目是3。在另一个方面，每个抗体的接头-药物部分的数目是2。在另一个方面，每个抗体的接头-药物部分的数目是1。在其它方面，每个抗体的接头-药物部分的数目大于4，诸如每个抗体5、6、7、8、9、10、11、12个或大于12个接头-药物部分。
进一步，本发明提供了ADC，其中所述接头-药物部分经由常规或位点特异性缀合技术连接至抗体。在某些方面，将抗-EDB抗体或其抗原结合片段缀合或连接至药物诸如细胞毒性剂、细胞生长抑制剂和/或治疗剂，如本文进一步描述的。例如，可以将细胞毒性剂连接或缀合至如本文中所述的抗-EDB抗体用于所述细胞毒性剂的靶向局部递送。也提供了制备和生产这样的ADC的方法以及它们在临床应用中的用途。
不同于被开发成靶向内化性的细胞表面表达的蛋白的其它ADC，本发明的ADC靶向EDB，即一种在细胞外基质(ECM)中表达的蛋白。靶向在ECM中表达的蛋白可以提供胜过靶向在肿瘤细胞上表达的蛋白的益处。所述ADC可以直接接近靶标，而不必穿透在许多难治的人癌症中常见的间质和ECM屏障。进一步，用ADC靶向ECM中的EDB会提供一种特殊机制来接近肿瘤微环境中的许多难治的靶细胞类型。这可能经由机制诸如旁观机制对肿瘤细胞和/或间质细胞的细胞死亡/细胞周期阻止而导致细胞毒性的净荷或药物的细胞外释放，从而导致多种细胞的杀死。另外，其它机制包括、但不限于失调的血管生成或细胞毒性的血管靶向/收缩、血管正常化、细胞分化的免疫调节和诱导和/或上皮间质转变的阻碍。
本文提供的实施例证实了在抗-EDB抗体和EDB ADC产生过程中得到的改善的特征，诸如同种异型优化以降低免疫原性，COOH-端赖氨酸的除去以增加产物同质性，和突变的引入以减轻潜在糖化倾向和减小异质性(参见实施例1和2)。进一步，如在实施例中所示，使用各种常规和位点特异性缀合技术(即含有半胱氨酸、赖氨酸和/或酰基供体谷氨酰胺的(“Q”)标签)和各种接头-药物部分产生的EDB ADC表现出稳健的体外和体内效力(参见实施例6-8)。本文提供的实施例也表明，与经由半胱氨酸残基使用常规缀合产生的EDB ADC相比，经由经工程改造的半胱氨酸残基使用位点特异性缀合产生的EDB ADC表现出改善的特征，诸如改善的药代动力学(PK)概况(即增加的暴露和缀合稳定性，从而导致更少的脱靶毒性效应)、有利的热稳定性和非临床安全性概况(即骨髓抑制的减轻)(分别参见实施例9、10和11)。进一步，用位点特异性缀合技术产生的EDB ADC的改善的特征可以允许在人治疗中的更高剂量，并从而提供增加的效力。在某些方面，所述EDB ADC可以包含反应性半胱氨酸(C)对在人IgG1重链恒定区中的位置290 (根据Kabat的EU索引)处的赖氨酸(K)的置换(K290C)和/或反应性半胱氨酸(C)对在人κ轻链恒定区的位置183 (根据Kabat)处的赖氨酸(K)的置换(κK183C)以实现位点特异性缀合。
纤连蛋白的外结构域B
本文中使用的“EDB+ FN”和“EDB”可互换地使用并表示含有外结构域B (EDB)的纤连蛋白(FN)。进一步，“抗-EDB抗体”和“抗-EDB+ FN抗体”可互换地使用并表示结合EDB的抗体。“抗-EDB抗体-药物缀合物”、“EDB抗体-药物缀合物”、“抗-EDB ADC”、“EDB ADC”可互换地使用并表示包含抗体或其抗原结合片段的ADC，所述抗体或其抗原结合片段结合EDB且缀合或连接至药物。FN是存在于细胞外基质(ECM)中的高分子量糖蛋白并参与细胞粘附和迁移过程，包括胚胎发生、伤口愈合、血液凝固、宿主防御和转移。FN通常作为二聚体存在，所述二聚体由在它们的C-端附近通过一对二硫键共价地连接的两个几乎相同的约250kDa亚基形成。每个单体由三种类型的重复单元组成：I型、II型和III型FN重复。单个75-kb基因编码FN，但是，在人类中观察到20种蛋白变体。FN基因的可变剪接发生在三个区域，从而导致两个III型重复（称作外结构域A (EDA)和外结构域B (EDB)）中的任一个以及连接两个其它III型重复的区段（称作III型连接区段(IIICS)）的包含或排除。EDB是在小鼠、大鼠、兔、狗、食蟹猴和人类中具有100%同一性的91氨基酸序列。一种代表性的EDB+ FN核苷酸序列在登记号NM_001306129.1下提供，且对应的氨基酸序列在登记号NP_001293058.1下提供。EDB和重组人7-EDB-8-9氨基酸序列提供在表1中。重组人7-EDB-8-9包含在EDB的氨基端侧接结构 域7且在EDB的羧基端侧接结构域8和结构域9的EDB。
抗-EDB抗体
本发明的抗体特异性地结合EDB。关于本发明的ADC的制备，抗体或其抗原结合片段可以是特异性地结合EDB的任何抗体(包括本文描述的抗体)或其抗原结合片段。可以将所述抗体或其抗原结合片段分离、纯化或衍生化用于在EDB ADC的制备中使用。
本文中使用的“抗体”或“Ab”表示这样的免疫球蛋白分子：其能够通过至少一个位于所述免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点识别和结合特定靶标或抗原，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。该术语可以包括任何类型的抗体，包括、但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，完整抗体的保留特异性地结合给定抗原(例如EDB)的能力的“抗原结合片段”(或部分)诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、Fc等，分离的互补性决定区(CDR)，双特异性抗体，异源缀合物抗体，其突变体，具有抗体或其抗原结合片段的融合蛋白，(例如，结构域抗体)，单链(ScFv)和单结构域抗体(例如，鲨鱼和骆驼科抗体)，大分子抗体，微体，细胞内抗体，双体，三体，四体，v-NAR和二-scFv (参见，例如，Holliger和Hudson, 2005, NatureBiotechnology 23(9): 1126-1136)，人源化抗体，嵌合抗体和包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任意其它修饰构型，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体，和共价地修饰的抗体。所述抗体可以是鼠、大鼠、人、或任意其它来源(包括嵌合的或人源化的抗体)。在本发明的某些方面，公开的EDB ADC的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的或重组的人抗体或其EDB-结合片段。
天然的或天然存在的抗体和天然的免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(LC)和两个相同的重链(HC)组成。每个重链具有一个可变结构域(VH)，继之以许多恒定结构域或区域(例如铰链、CH1、CH2或CH3)，被称作“CH结构域”。每个轻链具有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域，被称作“CL结构域”。术语抗体的“恒定区”或“恒定结构域”表示单独的或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。所述恒定结构域不直接参加抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能，诸如Fc受体(FcR)结合，抗体在抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)中的参与，调理素作用，补体依赖性的细胞毒性的起始，和肥大细胞去粒。EDB抗体的恒定区可以源自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM中的任一种、其任意同种型(例如，IgG的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型)、以及它们的亚类和突变形式的恒定区。
CH1结构域包括免疫球蛋白重链的第一个(最氨基端)恒定区结构域，其在例如约位置118-215延伸，根据Kabat的EU索引。CH1结构域邻近VH结构域且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基端，且不形成免疫球蛋白重链的Fc区的部分。
铰链区包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包含大约25个残基且是柔性的，因而允许2个N-端抗原结合区域独立地移动。铰链区可以细分成三个独特结构域：上、中和下铰链结构域。
CH2结构域包括在例如约位置231-340延伸的重链免疫球蛋白分子的部分，根据Kabat的EU索引。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域密切配对。相反，2个N-连接的支链碳水化合物链插入在完整天然IgG分子的2个CH2结构域之间。在某些方面，本发明的抗体(或其片段)包含从IgG分子衍生出的CH2结构域，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些方面，所述IgG是人IgG。
CH3结构域包括从CH2结构域的N-端延伸大约110个残基（例如约位置341-447，根据Kabat的EU索引）的重链免疫球蛋白分子的部分。CH3结构域通常形成抗体的C-端部分。但是，在某些免疫球蛋白中，额外的结构域可以从CH3结构域延伸以形成分子的C-端部分(例如在IgM的µ链和IgE的ε链中的CH4结构域)。在某些方面，本发明的抗体(或其片段)包含从IgG分子衍生出的CH3结构域，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些方面，所述IgG是人IgG。
CL结构域包括在例如约位置108-214延伸的免疫球蛋白轻链的恒定区结构域，根据Kabat的EU索引。CL结构域邻近VL结构域。在某些方面，本发明的抗体(或其片段)包含κ轻链恒定结构域(CLκ)。在某些方面，所述抗体(或其片段)包含λ轻链恒定结构域(CLλ)。CLκ具有已知的多形位点CLκ-V/A45和CLκ-L/V83 (使用Kabat编号)，因而允许多态性Km(1): CLκ-V45/L83; Km(1,2): CLκ-A45/L83；和Km(3): CLκ-A45/V83。本发明的多肽、抗体和ADC可以具有含有这些轻链恒定区中的任一个的抗体组分。
Fc区通常包含CH2结构域和CH3结构域。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区经常被定义为从在位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230 (根据Kabat的EU索引)延伸至其羧基端。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)。
抗体的“可变区”表示单独的或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。如本领域已知的，重链和轻链的可变区各自由通过3个互补性决定区(CDR)（也被称作高变区）连接的4个框架区(FR)组成。每个链中的CDR通过FR保持紧密靠在一起，并且与来自其它链的CDR一起，为抗体的抗原结合位点的形成做出贡献。
根据Kabat (Kabat等人, 1992, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第5版, Public Health Service, NIH, Washington D.C)、Chothia (Chothia等人, Nature 342:877-883, (1989))的定义、Kabat和Chothia的积累、AbM定义(使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(现在的Accelrys®)衍生出)、接触定义(基于观察到的抗原接触，如在MacCallum等人, J. Mol. Biol., 262:732-745, (1996)中所述)和/或构象定义(Makabe等人, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008)或本领域众所周知的任何CDR确定方法，可以鉴别可变结构域的CDR。本文中使用的CDR可以表示通过本领域已知的任何方法定义的CDR，包括方法的组合。关于本发明，使用Kabat和Chothia定义衍生出下面表2中所述的CDR。本发明的抗-EDB抗体或其抗原结合片段包括一个或多个CDR (诸如1、2、3、4、5或所有6个CDR)。
“特异性地结合”或“优先地结合”(在本文中互换使用)靶标或抗原(例如，EDB蛋白)的抗体、ADC或多肽是本领域中充分理解的术语，且确定这样的特异性或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果与替代细胞或物质相比分子更经常地、更快速地、以更大的持续时间和/或以更大的亲和力与特定细胞或物质反应或结合，就说所述分子表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体相比它结合其它物质以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大的持续时间结合，那么所述抗体“特异性地结合”或“优先地结合”靶标或抗原。例如，特异性地或优先地结合EDB表位的抗体是相比它结合其它EDB表位或非-EDB表位以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大的持续时间结合该表位的抗体。
本文中使用的术语“结合亲和力”或“KD”意图表示特定抗原-抗体相互作用的平衡解离常数。KD是解离的速率（也称为“解离速率”或“kd”）与结合的速率或“结合速率”或“ka”之比。因而，KD等于kd/ka且被表达为摩尔浓度(M)。规律是，KD越小，结合亲和力越强。因此，1μM的KD指示与1 nM的KD相比弱的结合亲和力。使用本领域中充分确立的方法可以确定抗体的KD值。一种用于确定抗体的KD的方法是使用表面等离子体共振，典型地使用生物传感器系统诸如BIAcore®系统。用于评价配体诸如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞计量术分析。
本文中使用的“分离的抗体”表示基本上不含有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，分离的特异性地结合EDB的抗体基本上不含有特异性地结合除EDB以外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可以基本上不含有其它细胞物质和/或化学物质。还理解，通过阅读该定义，例如，特异性地或优先地结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或不可以特异性地或优先地结合第二靶标。
在本发明的某些方面，EDB ADC包括这样的抗体：其与本文描述的抗体或其抗原结合片段竞争对人EDB的结合和/或结合相同的表位。
本文中关于抗体使用的术语“竞争”是指，第一抗体或其抗原结合片段与表位结合的方式充分类似于第二抗体或其抗原结合片段的结合，使得与在没有所述第二抗体存在下所述第一抗体与其相应表位的结合相比，在有所述第二抗体存在下所述第一抗体与其相应表位的结合结果可检测地降低。可选地，在有所述第一抗体存在下所述第二抗体与其表位的结合也可检测地降低，但不一定如此。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，但该第二抗体不抑制所述第一抗体与其相应表位的结合。但是，当每种抗体可检测地抑制其它抗体与其相应表位或配体的结合（不论以相同、较高或较低的程度）时，就说所述抗体彼此“交叉竞争”与其各自表位的结合。本发明包括竞争抗体和交叉竞争抗体。不论这样的竞争或交叉竞争所藉以发生的机制(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分的结合)，熟练的技术人员将明白，基于本文提供的教导，这样的竞争和/或交叉竞争抗体被包括且可以用于本文中公开的方法。
“L19”抗体在本文中也被称作“EDB-L19”抗体，是结合EDB的人抗体。L19抗体被公开和表征在PCT国际公开号WO1997/045544、WO1999/058570和WO2001/062800中，它们通过引用整体并入本文，且L19-EDB序列在本文中提供在表2 (SEQ ID NO. 1-16)中。
在本发明的某些方面，用于制备EDB ADC的抗体可以是单克隆抗体。术语“单克隆抗体”或“mAb”表示得自基本上均质抗体的群体的抗体，即，除了可能以微小量存在的可能的天然存在的突变以外，构成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆的”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。
在本发明的某些方面，用于制备本发明的ADC的抗体可以是单价的，即，每个分子(例如，IgG或Fab)具有一个抗原结合位点。在某些情况下，单价抗体可以具有超过一个抗原结合位点，但是所述结合位点来自不同的抗原。在本发明的某些方面，本发明的ADC的抗体或其抗原结合片段可以包括“二价抗体”，即，每个分子具有两个抗原结合位点(例如，IgG)。在某些情况下，所述两个结合位点具有相同的抗原特异性。可选地，二价抗体可以是双特异性的。“二特异性的”、“双特异性的”或“双功能的”抗体是具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗体。双特异性抗体的两个抗原结合位点结合两个不同的表位，它们可能存在于相同的或不同的蛋白靶标上。
术语“嵌合抗体”意图表示这样的抗体：其中可变区序列的部分或全部源自一个物种且恒定区序列源自另一个物种，诸如其中可变区序列源自小鼠抗体且恒定区序列源自人抗体的抗体。
本文中使用的“人源化的”或“CDR移植的”抗体表示非人（例如鼠）抗体的形式，其为嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有从非人免疫球蛋白衍生出的最小序列的片段（诸如Fv、Fab、Fab’、F（ab'）2或抗体的其它抗原结合子序列）。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白（接受者抗体），其中来自接受者的一个或多个CDR的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种（诸如小鼠、大鼠或兔）（供体抗体）的一个或多个CDR的残基替换。
使用本领域众所周知的技术，例如，重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这样的技术的组合或本领域容易知道的其它技术(参见，例如，Jayasena, S.D., Clin. Chem.,45: 1628-50 (1999)和Fellouse, F.A., 等人, J. MoI. Biol., 373(4):924-40(2007))，可以生产本发明抗体。另外的指导可以参见Sambrook J. 和Russell D.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel等人, Short Protocols inMolecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow和Lane UsingAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y. (1998)；和Coligan等人, Short Protocols in Protein Science,Wiley, John & Sons, Inc. (2003)。
可以将编码用于制备本发明的ADC的抗体的重链和轻链的核酸克隆进用于表达或繁殖的载体中。可以将编码目标抗体的序列在载体中维持在宿主细胞中，然后可以将宿主细胞繁殖和冷冻用于将来使用。通过用本领域已知的方式从B细胞克隆抗体基因，可以在细胞培养物中生产重组单克隆抗体。参见，例如Tiller等人, J. Immunol. Methods 329:112-124, 2008；美国专利号7,314,622。
本文中使用的术语“载体”表示构建体，其能够递送并优选地在宿主细胞中表达一个或多个目标基因或序列。载体的例子包括、但不限于病毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、被包囊在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞，诸如生产细胞。
本文中使用的术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经成为用于掺入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且所述后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原始母代细胞完全相同(在形态学上或在基因组DNA补体上)。宿主细胞包括在体内用本发明的多核苷酸转染的细胞。
如本领域已知的，“多核苷酸”、“核酸/核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换地使用，且包括任何长度的核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）的聚合形式，其类似物，或可以被DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可以具有任何三维结构，且可以执行已知的或未知的任何功能。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。
关于在本发明中讨论的所有重链恒定区氨基酸位置，编号是根据在Edelman等人,1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85中首次描述的EU索引，该文献描述了骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列，这是测序的第一种人lgG1。Edelman等人的EU索引也阐述在Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版,United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda。因而，“如Kabat所述的EU索引”或“Kabat的EU索引”表示基于Edelman等人的人lgG1 Eu抗体的残余物编号系统，如Kabat 1991年所述。
用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统是Kabat 1991年阐述的系统。
使用常规半胱氨酸技术或位点特异性缀合技术可以将本发明的EDB ADC缀合至药物/净荷。为了适应经由经工程改造的半胱氨酸的位点特异性缀合，可以修饰恒定结构域以提供在一个或多个位点经工程改造的反应性半胱氨酸残基(有时被称作“Cys”突变体)。为了适应经由以转谷氨酰胺酶为基础的缀合的位点特异性缀合，在有转谷氨酰胺酶和胺存在下通过多肽工程使含有酰基供体谷氨酰胺的(“Q”)标签或内源性谷氨酰胺成为反应性的。
本发明提供了通过非免疫原性抗体的产生对L19-EDB抗体的优化。在某些方面，包含具有在位置356处的天冬氨酸(D)和在位置358处的亮氨酸(L)的G1m(a)同种异型的L19-EDB人IgG1恒定区可以被具有在位置356处的谷氨酸(E)和在位置358处的甲硫氨酸(M)的非-G1m(a)同种异型置换(根据Kabat的EU索引编号)。
进一步，为了减小潜在的化学倾向和抗原结合假定的蛋白糖化位点，本发明的抗-EDB抗体可以具有包含在位置94 (根据Kaba的EU索引的编号)处的赖氨酸(K)至精氨酸(R)的突变(例如K94R)的重链可变区。
对于经由经工程改造的半胱氨酸的位点特异性缀合，抗-EDB抗体重链恒定结构域可以包含在位置290处的反应性的经工程改造的半胱氨酸残基(K290C)，根据Kabat的EU索引编号。可以引入另外的半胱氨酸置换。在另一个方面，抗-EDB抗体轻链恒定结构域可以包含在位置183处的反应性的经工程改造的半胱氨酸残基(κK183C)，根据Kabat的编号。可以引入另外的半胱氨酸置换。
对于经由经工程改造的谷氨酰胺残基的位点特异性缀合，抗-EDB抗体重链恒定结构域可以包含经工程改造的含有H16-谷氨酰胺的标签LLQG (SEQ ID NO: 40)。进一步，为了优化该位点特异性缀合，在重链上的位置222 (根据Kabat的EU索引)处的赖氨酸(K)氨基酸可以用精氨酸(R)置换，例如(K222R)。
氨基酸修饰可以通过本领域已知的任意方法完成，且许多这样的方法对于熟练的技术人员而言是众所周知的和常规的，例如突变、置换、缺失和/或添加。例如，但是不作为限制，使用任何众所周知的基于PCR的技术，可以完成氨基酸置换、缺失和插入。通过定位诱变可以完成氨基酸置换(参见，例如，Zoller和Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500；和Kunkel, 1985, PNAS 82:488)。
在本发明的某些方面，EDB ADC包括具有重链和/或轻链的抗体或其抗原结合片段，所述重链和/或轻链包含与本文中公开的重链或轻链中的任一个具有至少90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。已经被改变的残基可以是在抗体的可变区中或恒定区中。在某些方面，与本文中公开的任何重链或轻链相比，存在不超过1、2、3、4或5个已经被改变的残基。
术语“同一性百分比”在氨基酸序列的背景下是指，当针对最大对应进行比对时，两个序列中相同的残基的数目。存在许多本领域已知的可以用于测量氨基酸同一性百分比的不同算法（即，基础局部比对工具（Basic Local Alignment Tool）或BLAST®）。除非另外指出，否则使用特定程序或算法的默认参数。
为了用于制备EDB ADC，本文描述的抗体可以是基本上纯的，即，至少50%纯的(即，不含污染物)，更优选地，至少90%纯的，更优选地，至少95%纯的，更优选地，至少98%纯的，和最优选地，至少99%纯的。
表2和3提供了本发明的抗-EDB抗体的氨基酸(蛋白)序列和有关的核酸(DNA)序列。CDR如Kabat和Chothia所定义。带阴影的残基鉴别与抗体优化有关的氨基酸突变、置换和/或插入，且标有下划线的残基鉴别与位点特异性缀合技术有关的氨基酸突变、置换和/或插入。
在本发明的某些方面，EDB ADC包括结合纤连蛋白(FN)的外结构域B (EDB)的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的某些方面，本发明的抗体或其抗原结合片段具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH具有包含SEQ ID NO: 3、5和7的三个CDR。在本发明的某些方面，抗体或其抗原结合片段具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VL具有包含SEQID NO: 12、13和14的三个CDR。抗体或其抗原结合片段可以具有VH和VL，所述VH具有包含SEQ ID NO: 3、5和7的三个CDR，所述VL具有包含SEQ ID NO: 12、13和14的三个CDR。
在另一个方面，本发明的抗体或其抗原结合片段可以具有重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO: 3的VH CDR1、SEQ ID NO: 5的VH CDR2和SEQ ID NO: 7的VH CDR3 (根据Kabat)、或SEQ ID NO: 4的VH CDR1、SEQ ID NO: 6的VH CDR2和SEQ ID NO: 7的VH CDR3(根据Chothia)、或SEQ ID NO: 3或4的VH CDR1、SEQ ID NO: 5或6的VH CDR2和SEQ ID NO:7的VH CDR3。在另一个方面，抗体或其抗原结合片段可以具有轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO: 12的VL CDR1、SEQ ID NO: 13的VL CDR2和SEQ ID NO: 14的VL CDR3 (根据Kabat和Chothia)。在另一个方面，抗体或其抗原结合片段可以具有SEQ ID NO: 3或4的VH CDR1、SEQ ID NO: 5或6的VH CDR2和SEQ ID NO: 7的VH CDR3以及SEQ ID NO: 12的VL CDR1、SEQID NO: 13的VL CDR2和SEQ ID NO: 14的VL CDR3。
在本发明的某些方面，抗体或其抗原结合片段可以具有含有SEQ ID NO: 1或21的重链可变区和/或含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区。抗体或其抗原结合片段可以包含：其氨基酸序列与SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的重链可变区和其氨基酸序列与SEQ IDNO: 10具有至少90%同一性的轻链可变区；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 21具有至少90%同一性的重链可变区和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 10具有至少90%同一性的轻链可变区；含有SEQ ID NO: 1的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区；或含有SEQ ID NO: 21的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区。
在本发明的另一个方面，抗体或其抗原结合片段可以具有包含SEQ ID NO: 8、17、19、23、25、27和29中的任一个的重链和/或包含SEQ ID NO: 15或31的轻链。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：其氨基酸序列与SEQ ID NO: 8具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 15具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 8具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 31具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 17具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 15具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 17具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 31具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 19具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 15具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 19具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 31具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO:23具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 15具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 23具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ IDNO: 31具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 25具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 15具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ IDNO: 25具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 31具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 27具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ IDNO: 15具有至少90%同一性的轻链；其氨基酸序列与SEQ ID NO: 27具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 31具有至少90%同一性的轻链；或其氨基酸序列与SEQID NO: 29具有至少90%同一性的重链和其氨基酸序列与SEQ ID NO: 15具有至少90%同一性的轻链。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ IDNO: 17的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO:17的重链和含有SEQ ID NO:31的轻链；含有SEQ ID NO:19的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 19的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 23的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 23的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；或含有SEQ IDNO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链。
编码抗-EDB抗体重链和轻链可变区的代表性DNA分别包含SEQ ID NO: 2和22和SEQ ID NO: 11。编码抗-EDB抗体重链和轻链的代表性DNA分别包含SEQ ID NO: 9、18、20、24、26、28和30和SEQ ID NO: 16和32。
药物
可用于制备公开的EDB ADC的药物包括具有生物学或可检测活性的任何物质，例如，治疗剂、可检测标记、结合剂等，和在体内代谢成活性剂的前药。药物也可以是药物衍生物，其中药物已经被官能化以实现与本发明的抗体的缀合。
治疗剂是对癌细胞或活化的免疫细胞发挥细胞毒性的、细胞生长抑制性的和/或免疫调节性的作用的药剂。治疗剂的例子包括细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞抑制剂和免疫调节剂。细胞毒性效应表示靶细胞的剥夺、消除和/或杀死。细胞毒性剂表示对细胞具有细胞毒性的和/或细胞生长抑制性的作用的药剂。细胞生长抑制性的作用表示细胞增殖的抑制。细胞抑制剂表示对细胞具有细胞生长抑制性作用由此抑制特定细胞子集的生长和/或繁殖的药剂。化学治疗剂表示这样的药剂：其为可用于治疗癌症的化学化合物。免疫调节剂表示如下刺激免疫应答的药剂：通过细胞因子和/或抗体的产生和/或调节T细胞功能，由此直接地或间接地（通过使另一种药剂更有效）抑制或减少细胞(即，肿瘤细胞)的子集的生长。
在某些方面，所述药物是膜可渗透的药物。在这样的方面，所述净荷可以引起旁观者效应，其中不可能表达EDB+ FN或在它们的表面上具有结合的EDB+ FN的细胞（但是包围被ADC结合的细胞）被细胞可渗透的净荷杀死。这发生在当净荷从抗体释放(即，通过可切割的接头的切割)并穿过细胞膜和在扩散后诱导周围细胞的杀死时。
根据公开的方法，可以生产或制备EDB ADC，其具有(a)结合EDB的抗体或其抗原结合片段；(b)接头和(c)药物。药物与抗体之比(DAR)或药物载荷指示每个抗体缀合的药物分子的数目。可以用平均DAR表征多个ADC的组合物、批次和/或制剂。通过各种常规方式诸如紫外光谱法、质谱法、ELISA测定、放射测量方法、疏水相互作用色谱法(HIC)、电泳和HPLC，可以确定DAR和平均DAR。
在本发明的方面，EDB ADC可以具有1的DAR、2的DAR、3的DAR、4的DAR、5的DAR、6的DAR、7的DAR、8的DAR、9的DAR、10的DAR、11的DAR、12的DAR或大于12的DAR。在本发明的方面，一个EDB ADC可以具有1个药物分子、或2个药物分子、或3个药物分子、或4个药物分子、或5个药物分子、或6个药物分子、或7个药物分子、或8个药物分子、或9个药物分子、或10个药物分子、或11个药物分子、或12个药物分子或大于12个分子。
在本发明的方面，一个EDB ADC可以具有在约2至约4范围内的平均DAR，或在约3至约5范围内的平均DAR，或在约4至约6范围内的平均DAR，或在约5至约7范围内的平均DAR，或在约6至约8范围内的平均DAR，或在约7至约9范围内的平均DAR，或在约8至约10范围内的平均DAR，或在约9至约11范围内的平均DAR，或在约10至约12范围内的平均DAR，等。在某些方面，EDB ADC的组合物、批次和/或制剂可以具有约1的平均DAR、或约2的平均DAR、约3的平均DAR、或约4的平均DAR、或约5的平均DAR、或约6的平均DAR、或约7的平均DAR、或约8的平均DAR、或约9的平均DAR、或约10的平均DAR、或约11的平均DAR、或约12的平均DAR或大于12的平均DAR。如在平均DAR的前述范围中使用的，术语“约”是指±0.5%。
通过优选的平均DAR范围，例如，在约3至约5范围内的平均DAR、在约3至约4范围内的平均DAR、或在约4至约5范围内的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。进一步，通过优选的平均DAR范围，例如，在3-5范围内的平均DAR、在3-4范围内的平均DAR或在4-5范围内的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。
在本发明的某些方面，通过约1.0的平均DAR、或1.0的平均DAR、或1.1的平均DAR、或1.2的平均DAR、或1.3的平均DAR、或1.4的平均DAR、或1.5的平均DAR、或1.6的平均DAR、或1.7的平均DAR、或1.8的平均DAR、或1.9的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。在另一个方面，通过约2.0的平均DAR、或2.0的平均DAR、或2.1的平均DAR、或2.2的平均DAR、或2.3的平均DAR、或2.4的平均DAR、或2.5的平均DAR、或2.6的平均DAR、或2.7的平均DAR、或2.8的平均DAR、或2.9的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。在另一个方面，通过约3.0的平均DAR、或3.0的平均DAR、或3.1的平均DAR、或3.2的平均DAR、或3.3的平均DAR、或3.4的平均DAR、或3.5的平均DAR、或3.6的平均DAR、或3.7的平均DAR、或3.8的平均DAR、或3.9的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。在另一个方面，通过约4.0的平均DAR、或4.0的平均DAR、或4.1的平均DAR、或4.2的平均DAR、或4.3的平均DAR、或4.4的平均DAR、或4.5的平均DAR、或4.6的平均DAR、或4.7的平均DAR、或4.8的平均DAR、或4.9的平均DAR、或5.0的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。
在另一个方面，通过12或更小的平均DAR、11或更小的平均DAR、10或更小的平均DAR、9或更小的平均DAR、8或更小的平均DAR、7或更小的平均DAR、6或更小的平均DAR、5或更小的平均DAR、4或更小的平均DAR、3或更小的平均DAR、2或更小的平均DAR或1或更小的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。
在其它方面，通过11.5或更小的平均DAR、10.5或更小的平均DAR、9.5或更小的平均DAR、8.5或更小的平均DAR、7.5或更小的平均DAR、6.5或更小的平均DAR、5.5或更小的平均DAR、4.5或更小的平均DAR、3.5或更小的平均DAR、2.5或更小的平均DAR、1.5或更小的平均DAR，可以表征EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。
在本发明的某些方面，经由半胱氨酸残基的常规缀合方法和本文中公开的纯化条件会提供具有在约3-5范围内、优选约4的优化平均DAR的EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。
在本发明的某些方面，经由经工程改造的半胱氨酸残基的位点特异性缀合方法和本文中公开的纯化条件会提供具有在约3-5范围内、优选约4的优化平均DAR的EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。
在本发明的某些方面，经由基于转谷氨酰胺酶的缀合的位点特异性缀合方法和本文中公开的纯化条件会提供具有在约1-3范围内、优选约2的优化平均DAR的EDB ADC的组合物、批次和/或制剂。
细胞毒性剂的例子包括、但不限于蒽环类抗生素、奥里斯他汀、CC-1065、多拉司他汀、多卡米星（duocarmycin）、烯二炔、格尔德霉素、美坦辛、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、SN-38、微管溶素(tubulysin)、hemiasterlin及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。也可以使用植物毒素、其它生物活性的蛋白、酶(即，ADEPT)、放射性同位素、光敏剂(即，用于光动力学疗法)。
蒽环类抗生素源自细菌链霉菌属(Strepomyces)且已经被用于治疗广范围的癌症，诸如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。示例性的蒽环类抗生素包括、但不限于柔红霉素、多柔比星(即，阿霉素)、表柔比星、伊达比星、戊柔比星和米托蒽醌。
多拉司他汀和它们的肽类似物和衍生物奥里斯他汀是已经被证实具有抗癌和抗真菌活性的高度有效的抗有丝分裂剂。参见，例如，美国专利号5,663,149和Pettit等人,Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, (1998)。示例性的多拉司他汀和奥里斯他汀包括、但不限于多拉司他汀10、奥里斯他汀E、奥里斯他汀EB (AEB)、奥里斯他汀EFP(AEFP)、MMAD (单甲基奥里斯他汀D或单甲基多拉司他汀10)、MMAF (单甲基奥里斯他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-多拉脯氨酸-苯丙氨酸)、MMAE (单甲基奥里斯他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-多拉脯氨酸-去甲麻黄碱)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)。和其它新颖的形式。
在某些方面，所述药物/净荷是奥里斯他汀。奥里斯他汀通过抑制微管蛋白聚合在有丝分裂过程中抑制微管的形成而抑制细胞增殖。PCT国际公开号WO 2013/072813（其通过引用整体并入本文）公开了在本发明的EDB ADC中有用的奥里斯他汀并提供了生产奥里斯他汀的方法。例如，具有以下结构的净荷0101：
具有以下结构的净荷1569：
具有以下结构的净荷9411：
具有以下结构的净荷4574：
具有以下结构的净荷DM1：
具有以下结构的净荷西马多丁：
。
多卡米星和CC-1065是作为具有细胞毒性效能的DNA烷化剂起作用的基于CPI的单体。参见Boger和Johnson, PNAS 92:3642-3649, 1995。示例性的多拉司他汀包括、但不限于(+)-多卡米星A和(+)-多卡米星SA以及(+)-CC-1065。
在某些方面，所述药物/净荷是CPI或CBI二聚体。CPI二聚体诱导链间DNA交联和强效的细胞毒性。PCT国际公开号WO2015/110935（其通过引用整体并入本文）公开了在本发明的EDB ADC中有用的CPI和CBI二聚体并提供了生产CPI和CBI二聚体的方法。例如，具有以下结构的净荷CPI-8314二聚体：
具有以下结构的净荷CPI-0326：
。
烯二炔是以九元和十元环或具有共轭的三-双-三键的环状系统的存在为特征的一类抗肿瘤细菌产品。示例性的烯二炔包括、但不限于卡奇霉素、埃拉霉素（esperamicin）和达内霉素。卡奇霉素（也称为LL-E33288复合物，例如，β-卡奇霉素、γ-卡奇霉素或N-乙酰基-γ-卡奇霉素(γ-卡奇霉素(γ1))）是最初作为天然产物从土壤生物棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）calichensis亚种分离的烯二炔抗生素(Zein等人.Science 27;240(4856):1198-1201, 1988)；它在靶细胞中产生双链DNA断裂并随后诱导细胞凋亡(Zein等人. Science 27;240(4856):1198-1201, 1988; Nicolaou等人. Chem.Biol. Sep;1(1):57-66, 1994; Prokop等人. Oncogene 22:9107-9120, 2003)。二硫化物类似物是N-乙酰基-γ-卡奇霉素二甲基酰肼。
格尔德霉素是结合Hsp90 (热激蛋白90)且已被用作抗肿瘤药物的苯醌安沙霉素抗生素。示例性的格尔德霉素包括、但不限于17-AAG (17-N-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素)和17-DMAG (17-二甲基氨基乙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素)。
美坦辛或它们的衍生物美坦辛类通过抑制微管蛋白的聚合来抑制在有丝分裂过程中的微管形成，从而抑制细胞增殖。参见Remillard等人, Science 189:1002-1005,1975。示例性的美坦辛和美坦辛类包括、但不限于美登素(DM1)及其衍生物以及安丝菌素。
紫杉烷是作为抗-微管蛋白剂或有丝分裂的抑制剂起作用的二萜。示例性的紫杉烷包括、但不限于紫杉醇(例如，泰素®)和多西他赛(泰索帝®)。
长春花生物碱也是抗-微管蛋白剂。示例性的长春花生物碱包括、但不限于长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨。
在本发明的某些方面，所述药剂是免疫调节剂。免疫调节剂的例子包括、但不限于更昔洛韦(gancyclovier)、依那西普、他克莫司、西罗莫司、伏环孢素、环孢菌素、雷帕霉素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mycophenolgate mofetil)、甲氨蝶呤（methotrextrate）、糖皮质激素和它的类似物、细胞因子、黄嘌呤、干细胞生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子、白介素(例如，白介素-1 (IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18和IL-21)、集落刺激因子(例如，粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如，干扰素-α、-β和-γ)、命名为“S 1因子”的干细胞生长因子、促红细胞生成素和血小板生成素或它们的组合。
在本发明中有用的免疫调节剂也包括阻断激素对肿瘤的作用的抗-激素剂和抑制细胞因子产生、减量调节自体抗原表达或掩蔽MHC抗原的免疫抑制剂。代表性的抗-激素剂包括抗雌激素剂，包括、例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY 117018、onapnstone和托瑞米芬；和抗雄激素剂诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和抗-肾上腺剂。代表性的免疫抑制剂包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、溴隐亭、达那唑、氨苯砜、戊二醛、针对MHC抗原和MHC片段的抗-独特型抗体、环孢素A、类固醇诸如糖皮质类固醇、细胞因子或细胞因子受体拮抗剂(例如，抗-干扰素抗体、抗-IL10抗体、抗-TNFα抗体、抗-IL2抗体)、链激酶、TGFβ、雷帕霉素、T-细胞受体、T-细胞受体片段和T细胞受体抗体。
在本发明的某些方面，所述药物是治疗性蛋白，包括、但不限于毒素、激素、酶和生长因子。
毒素蛋白(或多肽)的例子包括、但不限于白喉(例如，白喉A链)、假单胞菌属外毒素和内毒素、蓖麻蛋白(例如，蓖麻蛋白A链)、相思豆毒蛋白(例如，相思豆毒蛋白A链)、蒴莲根毒蛋白(例如，蒴莲根毒蛋白A链)、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉菌素毒素、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、单端孢菌毒素、抑制剂胱氨酸结(ICK)肽(例如，ceratotoxins)和芋螺毒素(例如，KIIIA或SmIIIa)。
激素的例子包括、但不限于雌激素、雄激素、黄体酮和皮质类固醇。
在本发明的某些方面，所述药物是寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸。
在本发明中有用的其它药物包括抑制血管形成的抗血管生成剂，例如，法呢基转移酶抑制剂、COX-2抑制剂、VEGF抑制剂、bFGF抑制剂、类固醇硫酸酯酶抑制剂(例如，2-甲氧基甾二醇二-氨基磺酸酯(2-MeOE2bisMATE))、白介素-24、凝血酶敏感蛋白、metallospondin蛋白、I类干扰素、白介素12、鱼精蛋白、血管生成抑制因子、层粘连蛋白、内皮他丁和催乳素片段。
抗增殖试剂和促细胞凋亡剂包括PPAR-γ的活化剂(例如，环戊烯酮前列腺素(cyPGs))、维A酸类、三萜类化合物(triterpinoids) (例如，环波罗烷、羽扇豆烷、乌斯烷、齐墩果烷、木栓烷、达玛烷、葫芦素和柠檬苦素三萜类化合物)、EGF受体的抑制剂(例如，HER4)、雷帕霉素、CALCITRIOL®(1,25-二羟基胆骨化醇(维生素D))、芳香酶抑制剂(FEMARA®(Letrozone))、端粒末端转移酶抑制剂、铁螯合剂(例如，3-氨基吡啶-2-醛缩氨基硫脲(Triapine))、凋亡蛋白(来自鸡aneamia病毒的病毒蛋白3 - VP3)、Bcl-2和Bcl-X(L)的抑制剂、TNF-α、FAS配体、TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL/Apo2L)、TNF-α/FAS配体/TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL/Apo2L)信号传递的活化剂以及PI3K-Akt存活途径信号传递的抑制剂(例如，UCN-01和格尔德霉素)。
代表性的化学治疗剂包括：烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基密胺；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-EU；雄激素类诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗-肾上腺药诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2′-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(泰素®, Bristol-Myers SquibbOncology of Princeton, N.J.)和多西紫杉醇(泰索帝®, Rhone-Poulenc Rorer ofAntony, 法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；和卡培他滨。
根据本发明可以使用的另外治疗剂包括：用于光动力学疗法的光增敏剂，诸如美国公开号20020197262和美国专利号5,952,329，它们通过引用整体并入本文；用于温热疗法的磁性颗粒，诸如美国公开号20030032995，其通过引用整体并入本文；结合剂，诸如肽、配体、细胞粘附配体等，和可以转化成更有活性的细胞毒性的游离药物的前药诸如含有磷酸酯的前药、含有硫代磷酸酯的前药、含有硫酸酯的前药、含有肽的前药、含有β-内酰胺的前药、被取代的含有苯氧基乙酰胺的前药或被取代的含有苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药。
关于使用抗-EDB抗体的诊断方法，药物可以包括用于检测表达EDB+ FN的ECM或细胞在体外或在体内的存在的可检测标记。在体内可检测的放射性同位素，诸如使用闪烁描记术、磁共振成像或超声可检测的那些标记，可以用在临床诊断应用中。有用的闪烁法标记包括正电子发射体和γ-发射体。用于磁源成像的代表性造影剂是顺磁的或超顺磁的离子(例如，铁、铜、锰、铬、铒、铕、镝、钬和钆)、氧化铁颗粒和水溶性的造影剂。关于超声检测，可以将气体或液体包封在作为微泡造影剂释放的多孔无机颗粒中。关于体外检测，有用的可检测标记包括荧光团、可检测的表位或结合剂和放射性标记。
因而，在本发明的某些方面，所述药物是成像剂(例如，荧光团或PET (正电子发射断层摄影术)标记、SPECT (单光子发射计算机体层摄影术)标记)或MRI (磁共振成像)标记。
当在本文中使用时，术语“标记”表示可检测的化合物或组合物，其直接地或间接地缀合至抗体从而产生“被标记的”抗体。所述标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，可选地，在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。可以充当可检测标记的放射性核素包括，例如，I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。所述标记也可能是不可检测的实体诸如毒素。
荧光团的例子包括、但不限于异硫氰酸荧光素(FITC) (例如，5-FITC)、amidite荧光素(FAM) (例如，5-FAM)、曙红、羧基荧光素、藻红、Alexa Fluor®(例如，Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA) (例如，5-TAMRA)、四甲基罗丹明(TMR)和磺酰罗丹明(SR) (例如，SR101)。
可以将治疗性或诊断性放射性同位素或其它标记(例如，PET或SPECT标记)掺入用于缀合至如本文中所述的抗-EDB抗体的试剂中。所述同位素可以直接结合所述抗体，例如，在存在于所述抗体中的半胱氨酸残基处，或可以使用螯合剂介导所述抗体和所述放射性同位素的结合。适合用于放射疗法的放射性同位素包括、但不限于α-发射体、β-发射体和俄歇电子。关于诊断应用，有用的放射性同位素包括正电子发射体和γ-发射体。可以将本发明的抗-EDB抗体进一步碘化，例如，在抗体的酪氨酸残基上，以促进所述抗体的检测或治疗效果。
放射性同位素或其它标记的例子包括、但不限于3H、11C、13N、14C、15N、15O、35S、18F、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Se、76Br、77Br、86Y、89Zr、90Y、94Tc、95Ru、97Ru、99Tc、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、111Ag、111In、113In、121Te、122Te、123I、124I、125I、125Te、126I、131I、131In、133I、142Pr、143Pr、153Pb、153Sm、161Tb、165Tm、166Dy、166H、167Tm、168Tm、169Yb、177Lu、186Re、188Re、189Re、197Pt、198Au、199Au、201Tl、203Hg、211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、224Ac和225Ac。
接头
使用接头直接地或间接地将药物连接或缀合至抗体，可以制备本发明的EDB ADC。接头是连接药物和抗体以形成ADC的双功能化合物。这样的ADC允许经由结合特定抗原或蛋白的抗体来选择性地递送药物。合适的接头包括，例如，可切割的和不可切割的接头。可切割的接头通常对在特定细胞内和细胞外条件下药物的切割和释放是敏感的。在细胞内使缀合的药物从抗体切下的主要机制包括在溶酶体的酸性pH下的水解(腙、缩醛和顺式-乌头酸盐-样酰胺)，溶酶体酶(组织蛋白酶和其它溶酶体酶)的肽切割，和二硫键的还原。在肿瘤微环境(TME)中的蛋白酶（诸如组织蛋白酶）可以在细胞外从抗体切下缀合的药物。作为这些不同切割机制的结果，将药物连接至抗体的机制也宽泛地变化，且可以使用任何合适的接头。
合适的接头可以包括任何可切割的接头。在某些方面，合适的接头包括缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)接头、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头或马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(vc)接头，或含有连接至另外牺牲元件的二肽，诸如N~2~-乙酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基-N,N’-二甲基氨基乙基-CO-(AcLys-vc)接头，其适合用于基于转谷氨酰胺酶的缀合技术。在另一个方面，合适的接头包括二硫化物接头，诸如硫烷基吡啶(diS)接头和2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基氨甲酰基(diS-C2OCO)接头。在另一个方面，所述接头可以是不可切割的接头，诸如马来酰亚胺基己酰基(mc)、马来酰亚胺基-庚酰基(me)和马来酰亚胺基-Peg6C2 (MalPeg6C2)。在其它方面，合适的接头包括在特定pH或pH范围可水解的接头，诸如腙接头。
所述接头可以通过硫代酸酯键共价地结合至抗体，例如通过存在于接头上的马来酰亚胺或卤代乙酰胺与存在于抗体上的天然的或经工程改造的半胱氨酸残基的反应。在另一个方面，所述接头可以通过与存在于抗体上的赖氨酸残基的酰胺连接而共价地结合所述抗体，例如通过存在于接头上的N-羟基-琥珀酰亚胺活化的羧酸与赖氨酸残基的游离胺的反应。在另一个方面，所述接头可以通过与存在的谷氨酰胺残基的侧链的酰胺连接共价地结合抗体或工程改造进抗体中，例如通过转谷氨酰胺酶催化的酶反应，所述转谷氨酰胺酶从存在于接头上的伯胺与谷氨酰胺残基的侧链酰胺建立新的酰胺键。
在某些方面，本发明的接头包括：
具有以下结构的“mc-vc-PABC”或“vc-PABC”或“vc”接头：
具有以下结构的“AcLys-vc-PABC-DMAE-CO”或“AcLys-vc”接头：
具有以下结构的diS接头：
具有以下结构的diS-C2OCO接头：
。
制备EDB ADC的方法
本文提供了用于制备本发明的EDB ADC的方法。本发明进一步提供了一种用于生产或制备本文中公开的常规的和位点特异性缀合的EDB ADC的方法，且可以包括(a)将所述接头连接至所述药物；(b)将所述接头-药物部分缀合至所述抗体；和(c)纯化所述抗体药物缀合物。参见实施例3和4。
在某些方面，通过抗-EDB抗体或其抗原结合片段的一个或多个半胱氨酸残基，可以使用接头-净荷部分的常规的非特异性的缀合制备EDB ADC。
在另一个方面，通过被工程改造进抗-EDB抗体恒定结构域中的一个或多个反应性半胱氨酸残基，使用接头-净荷部分的位点特异性缀合可以制备EDB ADC。经由经工程改造的半胱氨酸残基制备用于位点特异性缀合的抗体的方法描述在PCT国际公开号WO2013/093809中，其通过引用整体并入本文。
为了缀合至药物或净荷的目的，可以用抗-EDB抗体重链的一个或多个氨基酸残基置换另一个氨基酸，诸如半胱氨酸残基。在一个方面，本发明提供了包含抗体重链恒定区的抗-EDB抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链恒定区含有在以下位置的经工程改造的半胱氨酸残基：118 (根据Kabat的114)、246、249、265、267、270、276、278、283、290、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、327、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、375、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443或444、或它们的任意组合，根据Kabat的EU索引编号)。具体地，可以使用位置118 (根据Kabat的114)、290、334、347、373、375、380、388、392、421、443或它们的任意组合。可以引入另外的半胱氨酸置换。
在另一个方面，本发明提供了包含重链恒定结构域的抗-EDB抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定结构域含有在位置290处的经工程改造的半胱氨酸残基(K290C)，根据Kabat的EU索引编号。
为了缀合至药物或净荷的目的，可以用抗-EDB抗体轻链恒定结构域的一个或多个氨基酸残基置换另一个氨基酸，诸如半胱氨酸残基。在一个方面，本发明提供了包含抗体轻链恒定区的抗-EDB抗体或其抗原结合片段，所述抗体轻链恒定区含有：(i)在位置110、111、125、149、155、158、161、183、185、188、189、191、197、205、207、208或210或它们的任意组合处的经工程改造的半胱氨酸残基，根据Kabat的编号)；(ii)当将恒定结构域与SEQ ID NO:37 (κ轻链)比对时，在与SEQ ID NO: 37的残基4、42、81、100、103或它们的任意组合对应的位置处的经工程改造的半胱氨酸残基；或(iii)当将恒定结构域与SEQ ID NO: 38 (λ轻链)比对时，在与SEQ ID NO: 38的残基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或它们的任意组合对应的位置处的经工程改造的半胱氨酸残基。可以引入另外的半胱氨酸置换。
在另一个方面，本发明提供了包含抗体κ轻链恒定区的抗-EDB抗体或其抗原结合片段，所述抗体κ轻链恒定区含有：(i)在位置111、149、188、207、210或它们的任意组合(优选地111或210)处的经工程改造的半胱氨酸残基，根据Kabat的编号；或(ii)当将恒定结构域与SEQ ID NO: 37比对时，在与SEQ ID NO: 37的残基4、42、81、100、103或它们的任意组合(优选地残基4或103)对应的位置处的经工程改造的半胱氨酸残基。
在另一个方面，本发明提供了包含抗体λ轻链恒定区的抗-EDB抗体或其抗原结合片段，所述抗体λ轻链恒定区含有：(i)在位置110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或它们的任意组合(优选地110、111、125、149或155)处的经工程改造的半胱氨酸残基，根据Kabat的编号；或(ii)当将恒定结构域与SEQ ID NO:38比对时，在与SEQ ID NO: 38的残基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或它们的任意组合(优选地残基4、5、19、43或49)对应的位置处的经工程改造的半胱氨酸残基。
在另一个方面，本发明提供了包含轻链恒定结构域的抗-EDB抗体或其抗原结合片段，所述轻链恒定结构域含有：(i)在位置183处的经工程改造的半胱氨酸残基(κK183C)，根据Kabat的编号；或(ii)当将所述恒定结构域与SEQ ID NO: 37比对时，在与SEQ ID NO: 37的残基76对应的位置处的经工程改造的半胱氨酸残基。
在另一个方面，通过在抗-EDB抗体恒定区中造成具有反应性的一个或多个经工程改造的含有酰基供体谷氨酰胺的标签或内源性谷氨酰胺残基，使用位点特异性缀合技术可以制备EDB ADC。经由含有酰基供体谷氨酰胺的标签或谷氨酰胺残基制备用于位点特异性缀合的抗体的方法描述在PCT国际公开号WO2012/059882，其通过引用整体并入本文。
在某些方面，含有酰基供体谷氨酰胺的标签包含至少一个谷氨酰胺(Q)且可以连接至重链和/或轻链的不同位置(即，在N-端、C-端或在内部)。在另一个方面，所述含有酰基供体谷氨酰胺的标签可以包含选自以下的氨基酸序列: LLQGG (SEQ ID NO: 39)、 LLQG(SEQ ID NO: 40)、 LSLSQG (SEQ ID NO: 41)、 GGGLLQGG (SEQ ID NO: 42)、 GLLQG (SEQID NO: 43)、 LLQ、 GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 44)、 GLLQGGG (SEQ ID NO: 45)、 GLLQGG(SEQ ID NO: 46)、 GLLQ (SEQ ID NO: 47)、 LLQLLQGA (SEQ ID NO: 48)、 LLQGA (SEQID NO: 49)、 LLQYQGA (SEQ ID NO: 50)、 LLQGSG (SEQ ID NO: 51)、 LLQYQG (SEQ IDNO: 52)、 LLQLLQG (SEQ ID NO: 53)、 SLLQG (SEQ ID NO: 54)、 LLQLQ (SEQ ID NO:55)、 LLQLLQ (SEQ ID NO: 56)和LLQGR (SEQ ID NO: 57)。在某些方面，含有酰基供体谷氨酰胺的标签替代在重链恒定结构域中的野生型氨基酸位置。在某些方面，抗-EDB抗体可以包含具有氨基酸序列LLQG (SEQ ID NO: 40)的含有酰基谷氨酰胺的标签，其替代在重链的位置E294- N297 (根据Kabat的EU索引)处的氨基酸。
通过改变反应变量诸如温度、pH、接头-净荷部分输入和添加剂浓度，可以经验地确定用于制备ADC的最佳反应条件。本领域技术人员无需过多实验可以确定适合用于缀合其它药物的条件。在实施例3和4中描述了用于缀合和表征EDB ADC的代表性方法。
在缀合以后，可以将缀合物与未缀合的反应物和/或缀合物的聚集形式分离、纯化，并通过常规方法表征。这包括例如、但不限于以下方法：质谱法、尺寸排阻色谱法(SEC)、超滤/渗滤、离子交换色谱法(IEC)、色谱聚焦(CF)、定位诱变、荧光标记、X-射线晶体学、高效液相色谱法(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)、Sephacryl S-200色谱法或疏水相互作用色谱法(HIC)。合适的HIC介质包括、但不限于Phenyl Sepharose 6Fast Flow色谱介质、Butyl Sepharose 4Fast Flow色谱介质、Octyl Sepharose 4Fast Flow色谱介质、Toyopearl Ether-650M色谱介质、Macro-Prep甲基HIC介质或Macro-Prep叔丁基HIC介质。
表13提供了根据本文描述的缀合和纯化方法生产并用于产生在实施例中提供的数据的EDB ADC。
在本发明的某些方面，本发明的EDB ADC包含(a)结合EDB的抗体或其抗原结合片段；(b)接头和(c)药物。
在本发明的另一个方面，本发明的EDB ADC包含(a)结合EDB的抗体或其抗原结合片段；(b)接头和(c)药物，其中所述接头是可切割的或不可切割的接头。在某些方面，所述接头是vc、diS、diS-C2OCO或AcLys-vc。
在本发明的另一个方面，本发明的EDB ADC包含(a)结合EDB的抗体或其抗原结合片段；(b)接头和(c)药物，其中所述药物是细胞毒性剂。在某些方面，所述药物是奥里斯他汀。在某些方面，所述药物是CPI或CBI二聚体。在某些方面，所述奥里斯他汀是0101、1569、9411或4574。在某些方面，所述CPI二聚体是CPI-8314或CPI-0326。
在本发明的某些方面，本发明的EDB ADC包含(a)抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 17的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQID NO:17的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO:19的重链和含有SEQ IDNO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 19的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO:23的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 23的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；含有SEQ ID NO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；或含有SEQ ID NO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；(b)接头和(c)药物。在某些方面，所述接头是可切割的或不可切割的接头。在某些方面，所述接头是vc、diS、diS-C2OCO或AcLys-vc。在某些方面，所述药物是细胞毒性剂。在某些方面，所述药物是奥里斯他汀。在某些方面，所述药物是CPI或CBI二聚体。在某些方面，所述奥里斯他汀是0101、1569、9411或4574。在某些方面，所述CPI二聚体是CPI-8314或CPI-0326。
EDB ADC的用途
本发明的抗-EDB抗体和EDB ADC可用在不同的应用中，包括、但不限于治疗性处理方法和诊断性处理方法。
本发明提供了一种用于治疗受试者中表达EDB+ FN的病症或疾病（诸如非癌症或与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症）的方法。本发明还提供了如本文中所述的EDB ADC或药物组合物，其用于用在治疗受试者中表达EDB+ FN的病症（诸如非癌症或与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症）的方法中。本发明进一步提供了如本文中所述的EDB ADC或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中表达EDB+ FN的病症，诸如非癌症或与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症。
在某些方面，本发明提供了一种抑制受试者中的肿瘤生长或进展的方法，所述受试者具有表达EDB的病症，诸如非癌症或与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB的癌症，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的含有一种或多种本文描述的EDB ADC的组合物(即，药物组合物)。在本发明的其它方面，提供了一种抑制受试者中与EDB+ FN表达有关的癌细胞和/或表达EDB+ FN的癌症的转移的方法，包括给有此需要的受试者施用有效量的含有一种或多种本文描述的EDB ADC的组合物(即，药物组合物)。在本发明的其它方面，提供了一种在受试者中诱导与EDB+ FN表达有关的肿瘤和/或表达EDB+ FN的癌症的消退的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的含有一种或多种本文描述的EDBADC的组合物(即，药物组合物)。
在某些方面，可以在邻近肿瘤细胞的细胞外基质(ECM)中检测EDB+ FN表达。EDB+FN可以由肿瘤微环境中的除了成纤维细胞以外的细胞（包括肿瘤细胞）表达。分泌的EDB+FN然后可以沉积在邻近肿瘤细胞的基质中，或沉积在肿瘤细胞的质膜上。在其它方面，本发明提供了包含一种或多种本文描述的EDB ADC的药物组合物，其用于用在如上所述的方法中。在其它方面，本发明提供了一种或多种如本文中所述的EDB ADC或包含如本文中所述的EDB ADC的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于用在上述的方法中。
与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症通常可以包括与组织重塑有关的任何癌症。进一步，与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症可以包括、但不限于实体瘤和血癌。在某些方面，实体瘤包括、但不限于甲状腺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胆囊癌、肾癌、皮肤癌、子宫癌、间皮瘤、结直肠癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、内分泌癌、胸腺癌、脑癌、肾上腺癌、眼癌、宫颈癌和肺癌。在另一个方面，血癌包括、但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
本发明的EDB ADC可用于治疗表达EDB+ FN的病症诸如与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症。本发明的EDB ADC可以用于治疗表达高水平的EDB+ FN、中水平的EDB+ FN或低水平的EDB+ FN的癌症。
因而，基于生物标志物表达可以选择要用本发明的EDB ADC治疗的患者，所述生物标志物表达包括、但不限于大量肿瘤样品的mRNA (qPCR)和升高的EDB+ FN蛋白表达，后者导致关于富集的靶标表达（而不是肿瘤起源或组织学）而选择的患者群体。可以将靶标表达测量为与细胞染色强度组合的细胞染色数目的函数。
癌症生长或异常增殖表示许多提示细胞内向更高级的癌症形式或病症状态的变化的指标中的任一种。通过本领域已知的方法，诸如延迟的肿瘤生长和转移抑制，可以测定癌细胞或非肿瘤增殖性病症的细胞的生长的抑制。用于测量癌症生长的抑制的其它指标包括癌细胞存活的减少、肿瘤体积或形态学的减小(例如，使用计算机体层摄影(CT)、超声检查或其它成像方法确定)、肿瘤血管系统的破坏、在迟发型超敏反应皮肤测试中改善的表现、细胞裂解性T-淋巴细胞的活性的增加和肿瘤特异性抗原的水平的下降。
公开的治疗方法的期望结果通常是与对照或基线测量结果相比可计量的量度。本文中使用的相对术语诸如“提高”、“增加”或“减少”指示相对于对照或对比分子的值，所述对照或对比分子是诸如在开始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量结果，或在没有本文描述的治疗存在下在一个对照个体(或多个对照个体)中的测量结果。一种代表性的对照个体是患有与正在治疗的个体相同形式的癌症的个体，其具有与正在治疗的个体大约相同的年龄（以确保在治疗的个体和对照个体中的病症的阶段是可比较的）。
响应于疗法的变化或改善通常是统计上显著的。本文中使用的术语“显著性”或“显著的”涉及在两个或更多个实体之间存在非随机关联的概率的统计分析。为了确定关联是否的“显著的”或具有“显著性”，数据的统计操作可以是“p-值”。那些低于用户定义的截止点的p值被认为是显著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001的p值可以被认为是显著的。
体内检测和诊断
在另一个方面，提供了一种检测、诊断和/或监测表达EDB+ FN的病症（诸如与EDB+ FN表达有关的癌症和/或表达EDB+ FN的癌症）的方法。例如，如本文中所述的抗-EDB抗体可以用可检测的部分诸如成像剂和酶-底物标记进行标记。如本文中所述的抗体还可以用于体 内诊断测定，诸如体内成像(例如，PET或SPECT)或染色试剂。
在将EDB ADC施用给受试者以后，其中所述药物是可检测标记，且在足够结合的时间以后，可以观察被抗体结合的EDB+ FN蛋白的生物分布。公开的诊断方法可以与治疗方法联合使用。另外，可以为了检测和治疗的双重目的施用本发明的EDB ADC。
代表性的非侵袭性的检测方法包括闪烁描记术(例如，SPECT (单光子发射计算机体层摄影术)、PET (正电子发射断层摄影术)、γ照相机成像和直线扫描)、磁共振成像(例如，常规磁共振成像、磁化传递成像(MTI)、质子磁共振光谱法(MRS)、弥散加权成像(DWI)和功能性MR成像(fMRI))和超声。
制剂
本发明进一步提供了药物组合物，其包括本文中公开的EDB ADC中的任一种和药学上可接受的载体。进一步，所述组合物可以包括超过一种本文中公开的EDB ADC。
在本发明中使用的组合物还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington: The Science and practice of Pharmacy第21版, 2005, LippincottWilliams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)，呈冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂的剂量和浓度对接受者无毒，且可以包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。本文中使用的“药学上可接受的盐”表示分子或大分子的药学上可接受的有机或无机盐。本文中进一步描述了药学上可接受的赋形剂。
EDB ADC的各种制剂可以用于施用，包括、但不限于，包含药学上可接受的赋形剂的制剂。药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，且是促进药理学上有效的物质的施用的相对惰性的物质。例如，赋形剂可以赋予形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括、但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗量（osmolarity）的盐、包囊剂、缓冲剂和皮肤穿透促进剂。赋形剂以及用于胃肠外和非胃肠外药物递送的制剂阐述在Remington, TheScience and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing, 2000。
在本发明的某些方面，可以将这些试剂配制成用于通过注射(例如，腹膜内地、静脉内地、皮下地、肌肉内地等)进行施用。因此，可以将这些试剂与药学上可接受的媒介物诸如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液等组合。特定剂量方案，即，剂量、时机和重复，将取决于特定个体和该个体的医疗史。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington, The Science and Practice of Pharmacy第21版Mack Publishing, 2005)混合，可以制备根据本发明使用的EDB ADC的治疗制剂用于贮存，呈低压冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂采用的剂量和浓度对接受者无毒，且可以包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
通常将治疗性EDB ADC组合物放在具有无菌存取口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的盖子的静脉内溶液袋或小瓶。根据本发明的组合物可以呈单位剂型诸如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒、溶液或混悬液或栓剂，用于口服、胃肠外或直肠施用或通过吸入或吹入法施用。
合适的表面活性剂具体地包括非离子试剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)和其它脱水山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。含有表面活性剂的组合物方便地包括0.05-5%表面活性剂，且可以是在0.1-2.5%之间。应当理解，如果必要的话，可以加入其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒介物。
使用商购可得的脂肪乳剂，诸如INTRALIPIDTM、LIPOSYNTM、INFONUTROLTM、LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM，可以制备合适的乳剂。可以将活性成分溶解在预混合的乳剂组合物中，或可选地可以将它溶解在油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或扁桃仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成的乳剂中。应当理解，可以加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的张度。合适的乳剂通常含有至多20%油，例如，在5-20%之间。脂肪乳剂可以包括在0.1-1.0 μm之间、特别是0.1-0.5 μm之间的脂肪微滴，且具有在5.5-8.0的范围内的pH。乳剂组合物可以是通过将EDB ADC与INTRALIPIDTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
本发明还提供了用于用在本发明的方法中的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个包含如本文中所述的EDB抗体或EDB ADC的容器和根据本文描述的本发明的任何方法的使用说明书。通常，这些说明书包括为了上述的诊断性或治疗性处理施用EDB抗体或EDBADC的描述。
与如本文中所述的EBD抗体或EDB ADC的应用有关的说明书通常包括关于剂量、给药计划和用于预期治疗的施用途径的信息。所述容器可以是单位剂量，散包装(例如，多次剂量包装)或亚-单位剂量。在本发明的试剂盒中供应的说明书通常是在标签或包装插页(例如，在试剂盒中包括的纸质片材)上的书面说明，但是机器可读的指令(例如，在磁或光存储盘上承载的指令)也是可接受的。
本发明的试剂盒是在合适的包装中。合适的包装包括、但不限于管形瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。也预见到用于与特定装置（诸如吸入器、鼻施用装置(例如，雾化器)或输注装置诸如微型泵）联合使用的包装。试剂盒可以具有无菌的访问口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的盖子的瓶)。所述容器也可以具有无菌的访问口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的盖子的瓶)。组合物内的至少一种活性剂是EDB抗体或EDB ADC。所述容器还可以包括第二种药学活性剂。
试剂盒可以任选地提供另外的组分诸如缓冲液和解释信息。通常，试剂盒包括容器和在所述容器上或伴随所述容器的标记或包装说明书。
剂量和施用
本发明提供了以有效剂量施用的EDB ADC。本文中使用的短语“有效剂量”或“有效量”表示达到任意一种或多种有益的或期望的治疗结果所必需的ADC、药物、净荷、化合物或药物组合物的量。对于预防性应用，有益的或期望的结果包括消除或减小病症的风险，减轻病症的严重程度，或延迟病症的开始，所述病症包括病症的生化、组织学和/或行为症状、它的并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理学表型。对于治疗用途，有益的或期望的结果包括临床结果诸如减小各种表达EDB+ FN的病症（诸如癌症）的发病率或改善其一种或多种症状，减小治疗病症所需的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果，和/或延迟患者的表达EDB+ FN的病症的进展。
可以在一次或多次施用中施用有效剂量。可以与或不与另一种药物、化合物或药物组合物结合地达到ADC、药物、化合物或药物组合物的有效剂量。因而，可以在施用一种或多种治疗剂的背景下考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其它药剂结合地可以达到或达到合乎需要的结果，那么可以认为以有效量施用单一药剂。
例如，当施用给携带癌症的受试者时，有效量包括足以引起抗癌活性的量，所述抗癌活性包括癌细胞细胞裂解、癌细胞增殖的抑制、癌细胞凋亡的诱导、癌细胞抗原的减少、延迟的肿瘤生长和/或转移的抑制。肿瘤收缩被充分接受为效力的临床替代标志物。另一种充分接受的效力标志物是无进展存活。
可以经由任意合适的途径将本发明的EDB ADC施用给个体。本领域技术人员应当理解，本文描述的实施例无意成为限制性的，但是是可得到的技术的示例。因此，在本发明的某些方面，根据已知方法将EDB ADC施用给个体，诸如静脉内施用，例如，作为推注或通过一段时间内的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、颅内、透皮、皮下、关节内、舌下、滑膜内，经由吹入法、鞘内、口服、吸入或局部途径。施用可以是全身性的，例如，静脉内施用，或局部的。商购可得的用于液体制剂的喷雾器（包括喷射喷雾器和超声喷雾器）可用于施用。可以将液体制剂直接喷雾，且可以将低压冻干的粉末在重构以后喷雾。可选地，EDB ADC可以使用碳氟化合物制剂和计量剂量吸入器气雾化，或作为低压冻干的和研磨的粉末吸入。
在本发明的某些方面，经由位点特异性的或靶向的局部递送技术施用EDB ADC。位点特异性的或靶向的局部递送技术的例子包括EDC ADC的各种可植入的贮库来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管或针导管、合成的移植物、外膜包裹物、旁路和支架或其它可植入的装置、位点特异性的载体、直接注射或直接应用。
就本发明的目的而言，EDB ADC的适当剂量可以取决于采用的特定EDB ADC (或其组合物)、要治疗的症状的类型和严重程度、所述药剂是否为了治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床史和对药剂的应答、患者对施用的药剂的清除率、和主治医师的考虑。临床医师可以施用EDB ADC直到达到实现期望结果和更好结果的剂量。剂量和/或频率可以在治疗过程中变化，但是也可以保持恒定。经验考虑（诸如半衰期）通常会促进剂量的确定。例如，与人免疫系统相容的抗体，诸如人源化抗体或全人抗体，可以用于延长抗体的半衰期和防止所述抗体被宿主的免疫系统攻击。可以在治疗过程中确定和调节施用频率，且通常，但不一定，基于症状的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟，例如，肿瘤生长抑制或延迟等。可选地，EDB ADC的持久连续释放制剂可以是适当的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。
就本发明的目的而言，典型日剂量可以在从3µg/kg至30µg/kg至300µg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100 mg/kg或更多的大约范围内，取决于上述因素。例如，可以使用约1 mg/kg、约2.5 mg/kg、约5 mg/kg、约10 mg/kg和约25 mg/kg的剂量。对于在几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，治疗持续直到发生期望的症状抑制或直到达到足够的治疗水平，例如，足以抑制或延迟肿瘤生长/进展或癌细胞的转移。示例性的给药方案可以包括施用递增剂量(例如，1 mg/kg的初始剂量和每周或在更长的时间段逐渐增加至一个或多个更高剂量)。其它剂量方案也可能是有用的，取决于从业人员希望达到的药代动力学衰减模式。例如，在本发明的某些方面，涵盖每周1-4次的给药。在其它方面，涵盖每个月1次或每隔1个月1次或每3个月1次的给药，以及每周、每2周和每3周。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。给药方案(包括使用的EDB ADC)可以随时间变化。
在本发明的某些方面，可以在已经施用一次或多次EDB ADC的个体中经验地确定EDB ADC的剂量。可以给个体施用递增剂量的EDB ADC。为了评估效力，可以跟踪病症的指标。
根据本发明的方法的EDB ADC的施用可以是连续的或间断的，取决于例如接受者的生理学病症、施用的目的是治疗还是预防、和熟练的从业人员已知的其它因素。EDB ADC的施用可以在预先选择的时间段中是基本上连续的，或可以是在一系列隔开的剂量中。
联合治疗
在本发明的某些方面，本文所述的方法进一步包括用另一种疗法形式治疗受试者的步骤。在某些方面，所述另一种疗法形式是另一种抗癌疗法，包括、但不限于，化学疗法、辐射、外科手术、激素疗法和/或另外的免疫疗法。
公开的EDB ADC可以作为初次治疗施用，或用于治疗对常规疗法无应答的癌症。另外，EDB ADC可以与其它疗法(例如，外科手术切除、辐射、另外的抗癌药物等)组合以由此引起累加的或增强的治疗效果和/或减小一些抗癌剂的细胞毒性。本发明的EDB ADC可以与另外的药剂一起共同施用或共配制，或配制用于与另外的药剂以任意次序连续施用。
本发明的EDB ADC可以与其它治疗剂联合使用，所述其它治疗剂包括、但不限于治疗性抗体、ADC、免疫调节剂、细胞毒性剂和细胞抑制剂。可用于联合治疗的代表性药剂也包括上文在子标题“药物”下描述为可用于制备EDB ADC的任何药物。
治疗剂包括、但不限于化学治疗剂、疫苗、基于CAR-T细胞的疗法、放射疗法、细胞因子疗法、疫苗、双特异性抗体、ADC、其它免疫抑制途径的抑制剂、血管生成的抑制剂、T细胞活化剂、代谢途径的抑制剂、mTOR抑制剂、腺苷途径的抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂（包括、但不限于inlyta、ALK抑制剂和舒尼替尼）、BRAF抑制剂、表现遗传的修饰基因、Treg细胞和/或骨髓衍生的抑制细胞的抑制剂或耗竭剂、JAK抑制剂、STAT抑制剂、细胞周期蛋白依赖性的激酶抑制剂、生物治疗剂（包括、但不限于针对VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其它生长因子受体、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS的抗体）、免疫原性药剂（例如，减弱的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞诸如用肿瘤衍生的抗原或核酸脉冲处理过的树突细胞、免疫刺激性细胞因子（例如，IL-2、IFNa2、GM- CSF）和用编码免疫刺激性细胞因子（诸如但不限于GM-CSF）的基因转染的细胞）的施用。
可以单独使用或用作ADC的其它代表性抗体包括、但不限于抗-5T4抗体(例如，A1、A2和A3)、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体(例如，RITUXAN®、ZEVALIN®、BEXXAR®)、抗-CD22抗体、抗- 抗体(例如，MYLOTARG®)、抗CD33抗体-药物缀合物、抗-刘易斯Y抗体(例如，Hu3S193、Mthu3S193、AGmthu3S193)、抗-HER-2抗体(例如，HERCEPTIN®(曲妥珠单抗)、MDX-210、OMNITARG.RTM. (培妥珠单抗、rhuMAb 2C4))、抗-CD52抗体(例如，CAMPATH®)、抗-EGFR抗体(例如，ERBITUX®(西妥昔单抗)、ABX-EGF (帕木单抗))、抗-VEGF抗体(例如，AVASTIN®(贝伐珠单抗))、抗-DNA/组蛋白复合物抗体(例如，ch-TNT-1/b)、抗-CEA抗体(例如，CEA-Cide、YMB-1003) hLM609、抗-CD47抗体(例如，6H9)、抗-VEGFR2 (或含有激酶插入结构域的受体、KDR)抗体(例如，IMC-1C11)、抗-Ep-CAM抗体(例如，ING-1)、抗-FAP抗体(例如，西罗珠单抗)、抗-DR4抗体(例如，TRAIL-R)、抗-黄体酮受体抗体(例如，2C5)、抗-CA19.9抗体(例如，GIVAREX®)和抗-纤维蛋白抗体(例如，MH-1)。
化学治疗剂的例子包括：烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基密胺；番荔枝内酯(acetogenin) (尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素; callystatin; CC-1065 (包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γl l和卡奇霉素phiM, 参见，例如，Agnew, Chem. Intl.Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、聚乙二醇化的脂质体多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺类诸如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2, 2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin) A、杆孢菌素A和蛇行菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
也包括起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括、例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY1 17018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产生，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素剂诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在某些方面，EDB ADC可以与克唑替尼、帕博西尼、吉西他滨、环磷酰胺、氟尿嘧啶、FOLFOX、亚叶酸、奥沙利铂、阿昔替尼、苹果酸舒尼替尼、托法替尼、贝伐珠单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗联合使用。
在一个方面，在用EDB ADC治疗以后，可以发生肿瘤浸润性淋巴细胞的增加、CD8/CD4比率的增加、F4/80+ 巨噬细胞的增加和/或免疫调节蛋白诸如PDL1和41BB的增加、或它们的任意组合。因而，EDB ADC和免疫检验点抑制剂或IO试剂（诸如抗-41BB激动剂和/或抗-PDL1拮抗剂单克隆抗体）的组合可以是有效的(参见实施例12)。进一步，单独的本发明的EDB ADC可以具有免疫调节剂和免疫-肿瘤学(IO)试剂促进机制，其可能用联合治疗增加。
在某些方面，EDB ADC可以与一种或多种靶向免疫检验点调节剂的其它治疗剂联合使用，所述其它治疗剂包括、但不限于靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG- 3、B7-H3、B7-H4、B7-DC (PD-L2)、B7-H5、B7-H6、B7-H8、B7-H2、B7-1、B7-2、ICOS、ICOS-L、TIGIT、CD2、CD47、CD80、CD86、CD48、CD58、CD226、CD155、CD1 12、LAIR1、2B4、BTLA、CD160、TIM1、TIM-3、TIM4、VISTA (PD-H1)、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、4-1BB、4-BBL、DR3、TL1A、CD40、CD40L、CD30、CD30L、LIGHT、HVEM、SLAM (SLAMF1、CD150)、SLAMF2 (CD48)、SLAMF3 (CD229)、SLAMF4 (2B4、CD244)、SLAMF5 (CD84)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMCF7 (CS1)、SLAMF8 (BLAME)、SLAMF9 (CD2F)、CD28、CEACAM1 (CD66a)、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM1 -3AS CEACAM3C2、CEACAM1 -15、PSG1 -1 1、CEACAM1 -4C1、CEACAM1 -4S、CEACAM1 - 4L、IDO、TDO、CCR2、CD39-CD73-腺苷途径(A2AR)、BTKs、TIKs、CXCR2、CCR4、CCR8、CCR5、VEGF途径、CSF-1或先天性免疫应答调节剂的试剂(诸如抗体)。
对于联合疗法，在适合于目标疗法的性能的任何时间范围内施用EDB ADC和/或一种或多种另外的治疗剂。因而，可以基本上同时地(即，作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以任意次序连贯地施用单一药剂。例如，单一药剂治疗可以在彼此的约1年内施用，诸如在约10、8、6、4或2个月内，或在4、3、2或1周内，或在约5、4、3、2或1天内。
公开的联合疗法可能引起协同治疗效果，即，大于它们单独的作用或治疗结果的总和的效果。例如，协同治疗效果可以是比单一药剂引起的治疗效果或给定组合的单一药剂引起的治疗效果的总和大至少约2倍的效果，或大至少约5倍、或大至少约10倍、或大至少约20倍、或大至少约50倍、或大至少约100倍。协同治疗效果也可观察为，与单一药剂引起的治疗效果或给定组合的单一药剂引起的治疗效果的总和相比，至少10%的治疗效果的增加，或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或更多。协同效果还是允许在联合使用治疗剂时减少所述治疗剂的给药的效果。
实施例
用于实现本发明的具体方面的下述实施例仅仅为了例证目的提供，且无意以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文展示和描述的那些内容之外，本领域技术人员从前述描述显而易见对本发明的各种改变，并且所述改变落入所附的权利要求的范围内。
实施例1
抗-EDB抗体的产生和缀合准备
抗-EDB抗体的产生
使用标准的分子生物学方法构建并从特异性地结合EDB的L19人单克隆抗体(下文称作“抗-EDB-L19”或“EDB-L19”抗体)衍生出编码各种结合EDB的全人抗体的cDNA。EDB-L19抗体包含人IgG1恒定区和人κ轻链恒定区，所述人IgG1恒定区含有具有在位置356处的天冬氨酸(D)和在位置358处的亮氨酸(L) (根据Kabat的EU索引)的G1m(a)同种异型。EDB-L19抗体重链和轻链可变区分别显示在SEQ ID NO. 1和10中，且重链和轻链分别显示在SEQ ID NO. 8和15中。
为了产生非免疫原性抗体，将具有在位置356处的谷氨酸(E)和在位置358处的甲硫氨酸(M) (根据Kabat的EU索引)的非-G1m(a)同种异型引入EDB-L19重链。为了产生重链，将编码EDB-L19重链可变区的核苷酸序列与具有Glmz、非-(a)、非-(x)同种异型的人IgG1恒定区cDNA融合。在某些方面，如下进一步改变抗体以减少抗体的电荷变体和增加同质性：消除EDB-L19抗体IgG1恒定区的C-端赖氨酸(K)，从而产生EDB-PFE HC (SEQ ID NO: 17)。EDB-PFE抗体重链和轻链分别显示在SEQ ID NO. 17和15中。
如在表4中所示，使用具有Prince自动采样器的iCE3执行成像的毛细管电泳(iCE)以确定用于抗体制备的电荷变体的百分比。由于在细胞培养过程中不完全的C-端赖氨酸处理，与EDB-PFE抗体相比，EDB-L19抗体具有碱性物质的实质增加和抗体的主峰的减小。
经由经工程改造的半胱氨酸残基进行位点特异性缀合的抗体
通常如在PCT国际公开号WO2013/093809（其通过引用整体并入本文）中所述执行制备抗-EDB抗体的方法，所述抗-EDB抗体用于通过反应性的经工程改造的半胱氨酸残基位点特异性地缀合至各种接头-净荷。通过定位诱变将在重链诸如位置K290 (根据Kabat的EU索引)或轻链诸如K183 (根据Kabat)上的一个或多个残基改变为半胱氨酸(C)残基。
在某些方面，用反应性半胱氨酸(C)置换在EDB-PFE抗体的人IgG1重链恒定区中的位置K290 (根据Kabat的EU索引)以实现位点特异性缀合，从而产生EDB-(K290C) HC (SEQID NO: 19)。在其它方面，将在人κ轻链恒定区中的残基K183 (根据Kabat)置换成反应性半胱氨酸(C)以实现位点特异性缀合，从而产生EDB-(κK183C) LC (SEQ ID NO: 31)。
经由经工程改造的谷氨酰胺残基进行位点特异性缀合的抗体
表达抗-EDB抗体，其具有在不同氨基酸位置用反应性谷氨酰胺残基（诸如含有谷氨酰胺(“Q”)的标签）工程改造的人IgG1亚型，用于缀合至不同接头-净荷。通常如在PCT国际公开WO2012/059882（其通过引用整体并入本文）中所述执行制备抗-EDB抗体的方法，所述抗-EDB抗体用于通过反应性谷氨酰胺残基进行位点特异性缀合。
在某些方面，在EDB-PFE抗体的人IgG1-Fc区内工程改造H16-谷氨酰胺标签LLQG(SEQ ID NO: 40)以实现DAR 2转谷氨酰胺酶介导的位点特异性缀合。例如，在EDB-PFE抗体重链中，用含有H16-谷氨酰胺的标签LLQG (SEQ ID NO: 40)替换在位置E294- N297处(根据Kabat的EU索引)的氨基酸。在其它方面，进一步改变抗体以增加与经工程改造的含有H16-谷氨酰胺的标签的缀合特异性。用精氨酸(R)置换在重链上在位置222处(根据Kabat的EU索引)的赖氨酸(K)氨基酸，从而产生EDB-(H16-K222R) HC (SEQ ID NO. 27)。K222R置换会提供同质ADC的增加、改善的抗体和接头-净荷之间的分子间交联和/或与抗体轻链的C-端上的含有H16-谷氨酰胺的标签的链间交联的显著减少。
潜在化学倾向
潜在化学倾向（特别是在CDR内）可能影响分子异质性和产生结合假定的蛋白糖化位点的抗原。蛋白糖化是在细胞培养过程中在重组抗体中可以发生的非酶促糖基化，且糖化的蛋白可以经历进一步反应以产生难以表征的异质产物，共同地称作高级糖化终产物。为了减轻潜在的糖化倾向，将EDB-L19重链可变区中邻近CDR3的位置K94 (Kabat编号)突变成精氨酸(R)以产生EDB-(K94R) VH (SEQ ID NO: 21)并然后与人IgG1恒定区融合以产生EDB-(K94R) HC (SEQ ID NO: 23)。还将K94R糖化突变引入为位点特异性缀合经工程改造的EDB-(K290C)和EDB-(H16-K222R)重链内以分别产生EDB-(K94R-K290C) HC (SEQ ID NO:25)和EDB-(K94R-H16-K222R) HC (SEQ ID NO: 29)。
实施例2
EDB抗体变体结合性能的表征
结合亲和力分析
使用表面等离子体共振(SPR)来表征抗-EDB抗体变体对重组人、食蟹猴和大鼠7-EDB-89 (分别是SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36)的结合动力学并证实具有K94R糖化突变的抗-EDB抗体的结合性能被充分保留。通过从表面折射的激光的表面SPR来检测结合。信号动力学结合速率(ka)和解离速率(kd)的分析允许在非特异性和特异性相互作用之间区分。
按照生产商的方案将抗-人IgG抗体(GE Healthcare)共价地胺偶联到CM5羧甲基化的葡聚糖包被的传感器芯片的所有4个流动池上至约10,000共振单位(RU)的密度，并然后将每种抗-EDB抗体变体捕获至大约60-90 RU的水平。使用的运行和样品缓冲液是HBS-EP+ 缓冲液(0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA,和0.05%v/v表面活性剂P20 pH7.4)。将在600 nM至11.1 nM浓度范围内的7-EDB-89的3倍连续稀释系列以50 μL/分钟的流速注射在表面上进行60秒结合和120秒解离。然后将表面用3M MgCl2的30秒脉冲、离子再生缓冲液(0.46M KSCN, 1.83 M MgCl2, 0.92 M脲,和1.83 M胍-HCl pH7.4)的30秒脉冲再生，并然后用HBS-EP+ 运行缓冲液的30秒脉冲平衡。在25℃执行所有SPR测定，使用BIAcore®T200仪器(GE Healthcare)实现1Hz的数据收集速率。使用对照表面和缓冲液注射对得到的传感图进行双参照(Myszka, D. G., J. Mol. Recognit., 12:279-284,1999)。通过用BIAcore®T200评价软件v2.0和方程式KD=kd/ka将数据拟合至1:1 Langmuir模型，确定速率常数。每个实验一式两份地进行并确定平均KD。如在表5中所示，EDB-L19和EDB-(K94R)抗体表现出与人7-EDB-89可比较的结合。t1/2= 半衰期，Rmax=最大应答，RU=共振单位。
进一步，确定了EDB-L19和EDB-(κK183C-K94R-K290C)抗体对人、食蟹猴和大鼠7-EDB-89的结合亲合力。如在表6中所示，EDB-L19和EDB-(κK183C-K94R-K290C)对抗体的结合亲合力是类似的。如在表7中所示，EDB-(κK183C-K94R-K290C)抗体对人、食蟹猴和大鼠7-EDB-89的结合亲合力是可比较的，从而证实在工程改造EDB-L19抗体以实现位点特异性缀合和除去假定的糖化位点以后保留了跨物种反应性。
通过ELISA的竞争性结合
使用与生物素化的EDB-L19的竞争ELISA进一步评价了EDB-(K94R)和EDB-(κK183C-K94R-K290C)抗体的结合性能以证实与EDB的结合被完全维持。将人7-EDB-89 (SEQ ID NO:34)固定化(100 ng/孔)在96-孔ELISA板上并加入20 ng/mL生物素化的EDB-L19抗体以与不同浓度的经修饰的抗-EDB抗体样品竞争，并使用抗-抗生蛋白链菌素-HRP抗体(SouthernBiotech, Birmingham, AL)检测结合。
如在图1A和表8中所示，EDB-L19和EDB-(K94R)抗体具有类似的半数最大抑制浓度值。图1B和表9表明，EDB-(K94R)和EDB-(κK183C-K94R-K290C)抗体也具有类似的半数最大抑制浓度值。这指示，EDB-(K94R)和EDB-(κK183C-K94R-K290C修饰的抗体保留EDB结合性能，并且重链的(K94R)修饰和/或用于位点特异性缀合的反应性的经工程改造的半胱氨酸的引入没有改变与EDB的结合。
亲合力分析
确定了EDB-L19抗体结合EDB的亲和力是在~230 nM的低结合相互作用。因此，使用SPR来研究亲合力是否影响与肿瘤微环境内的差别靶标水平的结合。将不同密度的人7-EDB-89(SEQ ID NO: 34)共价地胺偶联到CM5羧甲基化的葡聚糖包被的传感器芯片的各个流动池上。运行和样品缓冲液如上面关于结合亲和力分析所述。将在6 nM至0.074 nM浓度范围内的EDB-L19抗体的3倍连续稀释系列以50 μL/分钟的流速注射进行110秒结合和900秒解离。然后将表面用离子再生缓冲液(0.46M KSCN, 1.83 M MgCl2, 0.92 M脲,和1.83 M胍-HClpH7.4)的2个30秒脉冲再生，并然后用HBS-EP+ 运行缓冲液的30秒脉冲平衡。每个实验一式两份地进行，并确定平均ka、kd和KD。
如在表10中所示，结果表明，随着固定化的人7-EDB-89的水平增加，解离速率(kd)减慢，且随后的亲和力增加。表观KD值与人7-EDB-89的固定化水平成比例，并证实了EDB-L19抗体以大亲合力组分结合EDB。
抗-EDB抗体的多反应性
多反应性已经与体内快速清除(Hotzel等人. mAbs 4(6):753-760, 2012)和不希望的蛋白-蛋白相互作用(Xu等人. Protein Eng Des Sel 26(10): 663-670 (2013)关联。已经证实DNA和胰岛素直接结合ELISA与临床上经验证的抗体的已知药代动力学(PK)关联。针对与直接包被在ELISA板上的DNA或胰岛素的结合在低严谨性测定中一式四份地评估了在10µg/mL开始的抗体的系列稀释物。
如在表11中所示，EDB-(K94R)和EDB-(κK183C-K94R-K290C)抗体具有非常低的多反应性评分，其比具有最佳PK性能的阴性对照更好或与其相当。进一步，多反应性评分显著低于具有差PK并导致快速清除的阳性对照抗体。
FcRn色谱法
利用FcRn色谱法来研究反应性的经工程改造的半胱氨酸向野生型IgG1恒定区中的引入对FcRn依赖性的药代动力学的潜在电荷介导的影响。使用FcRn柱方法对抗体的评价已经证实，洗脱时间表现出与人和非人灵长类动物清除的正相关(Schoch A. 等人. PNAS,2015, 第112卷)。根据Schlothauer等人, MAbs 5(4): 576-586, 2013制备FcRn亲和柱。接着，注射50µg EDB-(κK183C-K94R-K290C)抗体或EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101 ADC，并然后使用20 mM MES、150 mM NaCl（pH5.5）和20mM Tris、150 mM NaCl（pH 8.8）作为洗脱液在60分钟内通过pH 5.5-8.8的线性pH梯度(30 CV)洗脱。
如在表12中所示，EDB-(κK183C-K94R-K290C)抗体和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101 ADC的FcRn柱相对洗脱时间与可接受的PK参数一致。这些数据证实，反应性的经工程改造的半胱氨酸残基K290向IgG1恒定区中的掺入没有影响FcRn结合。
实施例3
EDB ADC的生物缀合
将本发明的抗-EDB抗体经由接头缀合至药物/净荷以产生EDB ADC。使用的缀合方法是常规缀合(即经由随机的半胱氨酸残基)或位点特异性缀合(即，经由经工程改造的半胱氨酸残基或经工程改造的谷氨酰胺残基)。表13显示了用于各种EDB ADC的缀合方法。
方法A: 经由半胱氨酸残基的常规缀合
将在PBS（pH7.2）中的27 mg/ml的抗-EDB抗体在37℃用2.3-2.6倍(m/m)的TCEP还原2小时，并然后缀合。摩尔比通常是在2.5倍，但是根据抗体缀合物的量优化以达到约4.0的最佳最终平均DAR。在含有10%DMA的PBS中在25℃将部分地还原的抗体与6-7倍(m/m)的接头-净荷缀合1小时。在25℃将多余的接头-净荷用L-半胱氨酸淬灭15分钟。将粗制的ADC在4-6℃在PBS中透析过夜。
将粗制的ADC通过Superdex 200上的尺寸排阻色谱法(SEC)在PBS中纯化，并将收集的单体峰在4-6℃保存或在20mM组氨酸、8.5%蔗糖（pH 5.8）中透析；无菌过滤，并在-70℃冷冻。通过相同方法缀合阴性对照huNeg-8.8抗体。
方法B: 经由经工程改造的半胱氨酸残基的位点特异性缀合
将2克抗-EDB抗体（用反应性的经工程改造的半胱氨酸残基产生，在pH7.2的PBS中27.2mg/ml）用15倍(m/m)的TCEP在37℃还原7小时并在Sephadex®G-25上在PBS中脱盐以除去多余的TCEP。将链间半胱氨酸用30倍DHA (m/m)在4-6℃氧化过夜。通过在Sephadex®G-25上在PBS中脱盐，除去DHA。对于具有较高程度的谷胱甘肽帽化的ADC（而不是位点特异性的半胱氨酸的优选半胱氨酸帽化），将100倍TCEP (m/m)用于还原。
在含有10%DMA的PBS中在25℃将还原的和氧化的抗体与9倍(m/m)的接头-净荷缀合2小时。将多余的接头-净荷用9倍(m/m)的L-半胱氨酸在25℃淬灭15分钟。将粗制的ADC在PBS中在4-6℃透析过夜。
将粗制的ADC在PBS中通过在Superdex 200上的SEC纯化，并将收集的单体峰在20mM组氨酸、8.5%蔗糖（pH 5.8）中透析；无菌过滤并在-70℃冷冻。通过相同方法缀合阴性对照huNeg-8.8抗体。
方法C: 经由经工程改造的谷氨酰胺残基的位点特异性缀合
将用反应性的经工程改造的谷氨酰胺残基制备的抗-EDB抗体在反应缓冲液（100mM磷酸盐, 200mM NaCl, pH 7.0）中透析。每mg抗体使用1单位的市售的经纯化的转谷氨酰胺酶(TG)，在混合下，在100mM磷酸钾、200mM NaCl、10%DMSO中，将20mg/ml抗体与接头-净荷(10倍，m/m)在室温缀合15小时。将粗制的ADC离心并将上清液通过SEC纯化。
将粗制的ADC在PBS中通过在Superdex 200上的SEC纯化，将收集的单体峰在20mM组氨酸、8.5%蔗糖（pH 5.8）中透析；无菌过滤并在-70℃冷冻。通过相同方法缀合阴性对照huNeg-8.8抗体。
方法D：使用二硫化物接头经由半胱氨酸残基的常规缀合
将在PBS（pH7.2）中的27 mg/ml的抗-EDB抗体使用5倍(m/m)的TCEP在37℃部分地还原2小时，并使用Sephadex®G-25 SEC脱盐。
在含有0.7mM DTPA和7%DMA的67mM HEPES（pH7.0）中在25℃将部分地还原的抗体与12-15倍(m/m)的还原的接头-净荷缀合15分钟。将多余的接头-净荷用20倍NEM (m/m)在25℃淬灭15分钟。
将粗制的ADC在含有50mM DHA和50mM DTPA的PBS中通过在Superdex 200上的SEC纯化，并将收集的单体峰在4-6℃保存。通过相同方法缀合阴性对照。
实施例4
EDB ADC的表征
使用尺寸排阻色谱法(SEC)、LC-MS和疏水相互作用色谱法(HIC)的组合表征了本发明的EDB ADC。通过质谱法(MS)确定平均药物:抗体比率(DAR)。表14提供了各种EDB ADC的分析特征。
LC-MS: 柱= Waters BEH300-C4, 2.1 x 100 mm (P/N = 186004496)；仪器= 具有SQD2质谱检测器的Acquity UPLC；流速= 0.7 mL/min；温度= 80℃；缓冲液A = 水+ 0.1%甲酸；缓冲液B = 乙腈+ 0.1%甲酸。梯度在2分钟内从3%B运行至95%B，在95%B保持0.75min，然后在3%B重新平衡。在即将注射之前用TCEP或DTT还原样品。通过LCMS (400-2000道尔顿)监测洗脱液，并使用MaxEnt1将蛋白峰解卷积。将DAR报告为以前已经描述的重量平均负载。
SEC: 柱: Superdex200 (5/150 GL)；流动相: 含有2%乙腈的磷酸盐缓冲盐水,pH 7.4；流速= 0.25 mL/min；温度= 环境温度；仪器: Agilent 1100 HPLC。
HIC: 柱: TSKGel Butyl NPR, 4.6mm x 3.5 cm (P/N = S0557-835)；缓冲液A =含有10 mM磷酸盐的1.5 M硫酸铵, pH 7；缓冲液B = 10 mM磷酸盐, pH 7 + 20%异丙醇；流速= 0.8 mL/min；温度= 环境温度；梯度= 在12分钟内从0%B至100%B，在100%B保持2分钟，然后在100%A重新平衡；仪器: Agilent 1100 HPLC。
实施例5
EDB+ FN表达
为了进行基于EDB ADC的疗法的癌症适应症的广泛研究，在人肿瘤和PDX模型中在蛋白和mRNA水平分析了EDB+ FN表达。
EDB+ FN表达的RNA-Seq分析
从10660个单个肿瘤样品分析RNA-Seq数据，所述样品被收集为扩展31个肿瘤类型的The Cancer Genome Atlas (TCGA)项目(National Cancer Institute，位于HIH,Bethesda, MD)的部分。从OmicSoft软件(Cary, NC)得到异形体水平表达数据。将EDB+ FN表达计算为携带EDB的纤连蛋白(FN1)的异形体的表达水平的总和。通过片段/千碱基转录物/百万读出(FPKM)来测量表达水平，并将每个肿瘤类型的EDB+ FN表达水平的总结性统计显示在表15中。通常，如果FPKM是约1或更高，认为该基因被表达。
表15显示了在人肿瘤中的EDB+ FN的RNA-Seq分析。在宽范围的人肿瘤适应症中证实了EDB+ FN表达，包括、但不限于，甲状腺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺腺癌、胶质母细胞瘤、胆管上皮癌、肺腺癌、肾癌、黑素瘤、子宫癌肉瘤、间皮瘤、肺鳞状细胞癌、直肠和结肠腺癌、肝细胞癌、结肠癌、卵巢浆液囊腺癌和膀胱癌。
表15. 在TCGA样品中的EDB+ FN的RNA-Seq分析.
肿瘤类型/疾病 中间值(FPKM) 上分位数 下分位数 最大值
甲状腺癌 216.69 628.03 14.20 3541.43
肉瘤 96.86 226.41 22.20 1450.21
侵袭性乳腺癌 36.92 77.75 14.77 1062.56
胰腺腺癌 35.08 67.03 14.02 549.68
多形性胶质母细胞瘤 28.74 56.74 11.76 1171.19
胆管上皮癌 27.77 55.99 10.34 458.05
肺腺癌 23.31 49.16 10.85 1105.41
肾透明细胞癌 22.91 39.34 11.49 346.83
皮肤黑素瘤 22.13 54.48 7.89 2131.95
子宫癌肉瘤 21.08 56.70 7.28 185.43
间皮瘤 20.13 52.36 3.64 205.08
肺鳞状细胞癌 19.13 42.86 8.75 1004.73
直肠腺癌 15.69 33.20 6.02 221.89
肝细胞癌 13.29 37.22 4.32 472.23
结肠腺癌 12.24 27.77 3.87 275.90
头和颈鳞状细胞癌 11.37 32.52 3.47 1111.18
卵巢浆液囊腺癌 11.25 27.51 5.00 425.09
膀胱泌尿道上皮癌 10.03 29.64 2.28 467.12
睾丸生殖细胞肿瘤 8.68 72.28 2.94 1395.34
前列腺腺癌 5.92 11.03 2.74 648.96
肾嫌色细胞（Chromophobe） 5.21 8.07 1.71 1788.92
嗜铬细胞瘤和副神经节瘤 4.95 12.24 2.06 118.84
胸腺瘤 3.58 27.15 0.30 1173.35
脑低级神经胶质瘤 3.19 6.94 1.53 163.17
肾上腺皮质癌 2.40 4.87 0.52 112.69
子宫体子宫内膜癌 2.20 7.36 0.49 172.08
眼色素层黑素瘤 1.81 3.72 0.89 16.59
宫颈鳞状细胞癌和子宫颈内腺癌 1.79 6.34 0.56 258.49
肾肾乳头状细胞癌 1.76 6.80 0.64 2291.27
淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞性淋巴瘤 0.34 1.11 0.12 51.63
急性髓性白血病 0.00 0.13 0.00 5.84
使用RSEM程序对来自乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、结直肠癌、黑素瘤、胰腺、非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌的160个Pfizer内部患者衍生的异种移植物(PDX)模型的RNA-Seq数据进行基因表达定量。参见Li等人, BMC Bioinformatics, 12:323, 2011。将EDB+FN表达计算为携带EDB的纤连蛋白(FN1)的异形体的表达水平的总和。如在图2中所示，在分析的所有肿瘤类型中在不同水平(所有样品具有>1的水平)表达EDB+ FN。将数据表示为片段/千碱基转录物/百万读出(FPKM)。
EDB+ FN表达的免疫组织化学(IHC)检测
在冷冻切片中使用EDB-L19抗体通过IHC验证了人癌症中的EDB+ FN蛋白表达。将包埋在Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek)中的8微米新鲜冷冻组织切片在丙酮:100%乙醇的3:1混合物中固定4分钟，并然后在10%中性缓冲的福尔马林中浸泡20秒。将载玻片在TBS中冲洗。将内源性过氧化物酶活性用Peroxidazed 1 (Biocare Medical)灭活10分钟。将非特异性的蛋白相互作用用Background Punisher (Biocare Medical)阻断10分钟。将EDB-L19抗体或同种型阴性对照huNeg-8.8抗体分别以3µg/ml和0.5µg/ml的终浓度与兔抗-人IgG (Jackson ImmunoResearch)在室温预络合1小时。将预络合的混合物与多余的全人IgG (Jackson ImmunoResearch)一起在室温温育15分钟，并加入载玻片保持1小时。将切片在TBS中洗涤，并与SignalStain Boost Rabbit HRP (CellSignaling Technologies)一起温育30分钟。用DAB+ (Dako)使产色信号显色5分钟，并随后用蒸馏水淬灭。将载玻片用CAT苏木精(Biocare Medical)短暂地复染色，在水中洗涤，在分级醇中脱水，在二甲苯中清洁，并用Permount Mounting Medium (FisherChemicals)盖上。执行表达的分析并确认。
如在表16中所示，在测试的所有人癌症适应症中在中至高水平表达EDB+ FN蛋白，包括头和颈癌(数据未显示)、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌和乳腺癌。在所有肿瘤中的表达主要是间质的(包括成纤维细胞的和与血管系统有关的)，尽管也观察到肿瘤细胞的一些染色。
实施例6
EDB ADC的体外结合
为了评估抗-EDB抗体和EDB ADC对EDB的相对结合，将MaxiSorp 96-孔平板用在PBS中的0.5或1µg/ml的人7-EDB-89 (SEQ ID NO: 34)包被并在轻轻摇动下在4℃温育过夜。然后将平板排空，用200µl PBS洗涤并用100µl封闭缓冲液(ThermoScientific)在室温封闭3小时。除去封闭缓冲液，将孔用PBS洗涤并与100µl在ELISA测定缓冲液(EAB; 0.5%BSA/0.02%Tween-20/PBS)中系列稀释(4倍)的抗-EDB抗体或EDB ADC一起温育。将平板的第一列留空，并将平板的最后一列用EAB填充作为空白对照。将平板在室温温育3小时。除去试剂，并将平板用200µl在PBS中的0.03%Tween-20 (PBST)洗涤。将100µl在EAB中1:5000稀释的抗-人IgG-Fc-HRP (Thermo/Pierce)加入孔中并在室温温育15分钟。将平板用200µl PBST洗涤，然后加入100µl BioFX TMB (Fisher)，并允许在室温显色4分钟。用100µl 0.2 N硫酸停止反应，并在Victor平板读数器(Perkin Elmer, Waltham, MA)上读出在450 nm的吸光度。
表17提供了抗-EDB抗体和EDB ADC以ELISA形式与结合至96-孔板的人7-EDB-89蛋白片段的相对结合。所有靶向EDB的抗体和ADC以在19 pM至58 pM范围内的类似亲和力结合靶蛋白。相反，非-EDB靶向的抗体和ADC具有>10,000 pM的高EC50值。在图3A和3B中显示了代表性ELISA结合曲线。
实施例7
EDB ADC的体外细胞毒性
细胞培养
WI38-VA13是得自ATCC并维持在MEM Eagles培养基(Cell-Gro)中的SV40-转化的人肺成纤维细胞，所述培养基补充了10%FBS、1%MEM非必需氨基酸、1%丙酮酸钠、100单位/ml青霉素-链霉素和2 mM GlutaMax。HT29源自人结肠直肠癌(ATCC)并维持在补充了10%FBS和1%谷氨酰胺的DMEM培养基中。
EDB+ FN转录物检测
对于EDB+ FN的基因表达和转录物分析，将附着的繁殖的WI38-VA13和HT29细胞用TrypLE Express (Gibco)从细胞培养瓶解离。使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)从收集的细胞沉淀物纯化总RNA。将残余的DNA在RNA纯化过程中用RNase-Free DNase Set (Qiagen)除去。将High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems)用于总RNA向cDNA的反转录。使用TaqMan Universal Master Mix II, with UNG (Applied Biosystems)通过定量实时PCR分析cDNA。通过TaqMan引物Hs01565271_m1检测EDB+ FN信号，并用来自ACTB(TaqMan引物Hs99999903_m1)和GAPDH (TaqMan引物Hs99999905_m1)的两个信号的平均值归一化。所有引物都来自ThermoFisher Scientific。显示了来自代表性实验的数据。
通过蛋白质印迹法的EDB+FN蛋白检测
为了通过蛋白质印迹法检测EDB+ FN，将附着的繁殖的WI38-VA13和HT29细胞通过细胞刮削进行收获。在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解缓冲液(Cell SignalingTechnology)中制备细胞裂解物。在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液或2X细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology)中制备肿瘤裂解物。通过SDS-PAGE、随后通过蛋白质印迹法分析蛋白裂解物。将蛋白转移至硝酸纤维素膜，并然后用5%奶/TBS封闭，随后与EDB-L19抗体和抗-GAPDH抗体(Cell Signaling Technology)一起在4℃温育过夜。洗涤以后，将抗-EDB印迹与ECL HRP-连接的抗-人IgG第二抗体(GE Healthcare)一起在室温温育1小时。洗涤以后，将EDB+ FN信号用Pierce ECL 2 Western Blotting Substrate(Thermo Scientific)显色并通过X-射线胶片检测。将抗-GAPDH印迹与Alexa Fluor 680缀合的抗-兔IgG第二抗体(Invitrogen)一起在封闭缓冲液中在室温温育1小时。洗涤以后，通过LI-COR Odyssey Imaging System检测GAPDH信号。使用Bio-Rad GS-800校准的成像光密度计进行EDB+ FN蛋白质印迹的密度计分析，并使用Quantity One 4.6.9版软件定量。显示了来自代表性实验的数据。
图4显示了通过蛋白质印迹确定的在WI38-VA13和HT29细胞中的EDB+ FN表达。EDB+ FN在WI38-VA13细胞系中表达，且当在体外培养时，HT29结肠癌细胞系是阴性的。
通过流式细胞计量术进行EDB+ FN蛋白检测
使用EDB-L19抗体通过流式细胞计量术测量在WI38-VA13或HT29细胞的细胞表面上的EDB+ FN表达。将细胞用非酶促的细胞解离缓冲液(Gibco)解离，并在冰上与冷流缓冲液(FB, 3%BSA/PBS+Ca+Mg)一起温育进行封闭。然后将细胞在FB中在冰上与第一抗体一起温育。温育以后，将细胞用冷的PBS -Ca-Mg洗涤，并然后根据生产商手册与生存力染料(Biosciences)一起温育以区分活的和死的细胞。在BD Fortessa流式细胞计上分析信号，并使用BD FACS DIVA软件分析数据。显示了来自代表性实验的数据。
表18总结了来自蛋白质印迹、qRT-PCR和流式细胞计量术的结果。数据证实，WI38-VA13是EDB+ FN阳性的，且HT29是EDB+ FN阴性的。
体外细胞毒性测定
将繁殖的WI38-VA13或HT29细胞用非酶促的细胞解离缓冲液从培养瓶收获，并在控湿室(37ºC, 5%CO2)中以1000个细胞/孔在96-孔平板(Corning)中培养过夜。次日，通过在10个浓度一式两份地加入50µl 3x储备物，将细胞用EDB ADC或同种型对照非-EDB-结合的ADC处理。在一些实验中，将细胞以1500个细胞/孔铺板并处理相同天。然后将细胞与EDB ADC或同种型对照非-EDB-结合的ADC一起温育4天。在收获天，将50µl Cell Titer Glo(Promega)加给细胞并在室温温育0.5小时。在Victor平板读数器(Perkin Elmer,Waltham, MA)上测量发光。将相对细胞生存力确定为未经处理的对照孔的百分比。用XLfitv4.2 (IDBS)使用4-参数逻辑模型#203计算IC50值。
表19显示了在细胞毒性测定中的EDB ADC处理的IC50 (ng/ml抗体)，所述细胞毒性测定在WI38-VA13 (EDB+ FN阳性的肿瘤细胞系)和HT29结肠癌细胞(EDB+ FN阴性的肿瘤细胞系)上执行。EDB ADC在表达EDB+ FN的细胞系中诱导了细胞死亡。所有具有vc-0101接头-净荷的EDB ADC的IC50值是类似的，在大约184 ng/ml至216 ng/ml的范围内(EDB-L19-vc-0101、EDB-(κK183C-K290C)-vc-0101、EDB-(K94R)-vc-0101、EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101)。阴性对照vc-0101 ADC具有实质上更低的效力，具有为EDB-vc-0101 ADC的大约70-200倍的IC50值。所有vc-0101 ADC在EDB+ FN阴性的肿瘤细胞系HT29中具有高46-83倍的IC50值。因此，关于它们的体外细胞毒性，EDB ADC依赖于EDB+ FN表达。
其它具有“vc”蛋白酶-可切割的接头的基于奥里斯他汀的EDB ADC（EDB-L19-vc-9411和EDB-L19-vc-1569）也在WA38-VA13细胞中表现出有效的细胞毒性，具有与对应的阴性对照ADC相比约50-180倍的高选择性和与非表达细胞系相比约25-140倍的选择性。EDB-L19-diS-DM1 ADC具有与vc-0101 ADC类似的效能，但是与阴性对照ADC (约3倍)相比和与HT29细胞(约0.9倍)相比具有低得多的选择性。
如在表20中所示，未缀合的净荷在两种细胞系中具有独立于EDB+ FN表达的高效力，从而指示这些细胞对用作ADC净荷的细胞毒性剂是敏感的。
实施例8
EDB ADC的体内效力
在细胞系异种移植物(CLX)、患者衍生的异种移植物(PDX)和同基因肿瘤模型中评价了EDB ADC。如本文前面描述的，使用免疫组织化学(IHC)测定检测EDB+ FN的表达。
为了产生CLX模型，将8x106至10x106个H-1975、HT29或Ramos肿瘤系的细胞皮下地植入雌性无胸腺裸鼠中。将用于接种的Ramos和H-1975细胞分别悬浮于50%和100%Matrigel(BD Biosciences)中。对于Ramos模型，动物在细胞接种之前接受全身辐照(4 Gy)以促进肿瘤的建立。当平均肿瘤体积达到大约160-320 mm3时，将动物随机分入治疗组，每组8-10只小鼠。在第0天静脉内地施用ADC或媒介物(PBS)，并然后每4天1次地向动物给药共4-8剂。每周1次或2次地测量肿瘤，并将肿瘤体积计算为体积(mm3) = (宽度x宽度x长度)/2。监测动物的体重4-9周，在任何治疗组中没有观察到动物重量减轻。
为了产生PDX模型，从供体动物收集肿瘤，并将大约3x3 mm的肿瘤片段使用10号套针皮下地植入雌性无胸腺裸鼠(对于PDX-NSX-11122模型)或NOD SCID小鼠(对于PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534模型)的胁腹中。当平均肿瘤体积达到大约160-260 mm3时，将动物随机分入治疗组，每组7-10只小鼠。ADC或媒介物(PBS)给药方案和施用途径以及肿瘤测量操作与上面关于CLX模型所述相同。监测动物的体重5-14周，在任何治疗组中没有观察到动物重量减轻。将肿瘤生长抑制绘制为肿瘤大小平均值±SEM。
EDB+ FN的表达
如在表21中所示，通过EDB-L19抗体的结合和随后在IHC测定中的检测，在H-1975、HT29和Ramos CLX模型、PDX-NSX-11122、PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534 PDX模型以及EMT-6同基因的同基因肿瘤模型中测量EDB+ FN的表达。CLX HT-29是中表达CLX，但是当在体外检查时是阴性的，这是由于源自肿瘤间质的CLX中的蛋白表达的优势。
表21. EDB+ FN的表达
效力模型 肿瘤类型 EDB+ FN总表达
PDX-NSX-11122 NSCLC PDX 高
EMT-6 同基因的小鼠乳腺癌(乳房) 高
PDX-PAX-13565 胰腺腺癌PDX 中等/高
H-1975 NSCLC CLX 中等/高
HT29 结直肠癌CLX 中等
Ramos 伯基特淋巴瘤CLX 中等
PDX-PAX-12534 胰腺腺癌PDX 低/中等
PDX-NSX-11122 NSCLC PDX
在PDX-NSX-11122（一种表达高水平的EDB+ FN的NSCLC PDX人癌症模型）中评价了各种ADC的作用。图5A显示了0.3、0.75、1.5和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101的抗肿瘤活性。数据证实，3 mg/kg和1.5 mg/kg的EDB-L19-vc-0101以剂量依赖性的方式表现出肿瘤消退。
将vc-连接的ADC的抗肿瘤效力与二硫化物连接的ADC进行了对比。图5B和5C分别显示了与10 mg/kg二硫化物连接的EDB-L19-diS-DM1相比3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101的抗肿瘤活性，和与5 mg/kg二硫化物连接的EDB-L19-diS-C2OCO-1569相比1和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101。如在图5B和5C中所示，EDB-L19-vc-0101表现出与同种型阴性对照ADC和使用二硫化物接头产生的ADC（EDB-L19-diS-DM1和EDB-L19-dis-C2OCO-1569）相比更大的效力。进一步，用EDB-L19-vc-0101治疗的带有肿瘤的动物具有在1 mg/kg时延迟的肿瘤生长和在3 mg/kg时完全的消退。数据证实，EDB-L19-vc-0101 (ADC1)以剂量依赖性的方式抑制PDX-NSX-11122 NSCLC异种移植物的生长。
评价了位点特异性地和常规地缀合的ADC的活性。图5D显示了分别以0.3、1和3mg/kg和1.5 mg/kg的剂量，与常规地缀合的EDB-L19-vc-0101相比位点特异性缀合的EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101的抗肿瘤效力。基于剂量-水平的效力是可比较的，且EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101以剂量依赖性的方式导致肿瘤消退。
评估了具有不同突变的vc-0101 EDB ADC的活性。图5E显示了在0.3、1和3 mg/kg的剂量位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101的抗肿瘤效力。1和3 mg/kg的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101诱导了肿瘤消退。图5F显示了图5E中的以3 mg/kg施用的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101组中的10只单独荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制曲线。在研究(95天)结束时在10只小鼠中的8只(80%)中在3 mg/kg组中的肿瘤消退是完全的且持久的。
H-1975 NSCLC CLX
在H-1975（一种中至高表达EDB+ FN的NSCLC CLX人癌症模型）中评价了各种vc-连接的奥里斯他汀和CPI ADC的作用。图6A显示了在0.3、0.75、1.5和3 mg/mg评估的EDB-L19-vc-0101的抗肿瘤活性。数据证实，EDB-L19-vc-0101在3 mg/kg和在低至1.5 mg/kg以剂量依赖性的方式表现出肿瘤消退。图6B显示了在0.3、1和3 mg/kg评价的EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-1569的抗肿瘤活性。数据证实，EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-1569以剂量依赖性的方式表现出肿瘤消退。
将vc-连接的奥里斯他汀ADC的抗肿瘤活性与CPI ADC进行了对比。如在图6C中所示，分别以0.5、1.5和3 mg/kg以及0.1、0.3和1 mg/kg评估了EDB-L19-vc-0101和EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI-8314。EDB-L19-vc-0101和EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI-8314都在评价的最高剂量表现出肿瘤消退。
评价了位点特异性地和常规地缀合的EDB ADC的活性。图6D显示了在0.5、1.5和3mg/kg的剂量与常规地缀合的EDB-L19-vc-0101相比位点特异性缀合的EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101的抗肿瘤效力。基于剂量-水平的效力是可比较的，且EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101以剂量依赖性的方式导致肿瘤消退。
评估了具有不同突变的vc-0101 EDB ADC的活性。图6E显示了1和3 mg/kg的EDB-L19-vc-0101和EDB-(K94R)-vc-0101的抗肿瘤效力。图6F显示了1和3 mg/kg的位点特异性的EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101的抗肿瘤效力。4种ADC在H-1975模型中表现出类似的效力，不论它们是否含有κK183C-K290C和/或K94R突变。另外，在3 mg/kg测试的所有ADC产生了稳健的抗肿瘤效力，包括肿瘤消退。这些数据证实，κK183C-K290C和/或K94R突变的引入没有不利地影响ADC的效力。
HT29结肠CLX
在HT29（一种中等表达EDB+ FN的结肠CLX人癌症模型）中评价了各种vc-连接的奥里斯他汀ADC的作用。如在图7中所示，在3 mg/kg测试了EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-9411的抗肿瘤活性。EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-9411都在3 mg/kg剂量随时间表现出肿瘤消退。
PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534胰腺PDX
在人胰腺PDX模型中评价了EDB-L19-vc-0101的抗肿瘤效力。如在图8A中所示，在PDX-PAX-13565（一种中至高表达EDB+ FN的胰腺PDX）中在0.3、1和3 mg/kg评估了EDB-L19-vc-0101。如在图8B中所示，在PDX-PAX-12534（一种低至中表达EDB+ FN的胰腺PDX）中在0.3、1和3 mg/kg评估了EDB-L19-vc-0101。EDB-L19-vc-0101在评价的两种胰腺PDX模型中以剂量依赖性的方式表现出肿瘤消退。
Ramos淋巴瘤CLX
在Ramos（一种中等表达EDB+ FN的淋巴瘤CLX模型）中评价了EDB-L19-vc-0101的抗肿瘤效力。在1和3 mg/kg评估了EDB-L19-vc-0101的抗肿瘤活性。如在图9中所示，EDB-L19-vc-0101以剂量依赖性的方式在3 mg/kg剂量表现出肿瘤消退。
EMT-6乳房同基因模型
在免疫活性背景下在EMT-6（一种小鼠同基因乳腺癌模型）中评价了EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101的抗肿瘤效力。如在图10A中所示，EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101在4.5 mg/kg表现出肿瘤生长抑制。将肿瘤生长抑制绘图为11只荷瘤动物中的肿瘤大小的平均值±SEM。图10B显示了在以4.5 mg/kg给药的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101组中的11只单独荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制曲线。在研究(34天)结束时在11只小鼠中的9只(82%)中在4.5 mg/kg组中的肿瘤消退是完全的且持久的
卵巢
在表达EDB+ FN的卵巢和乳腺癌人PDX模型中检查了EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101的活性。已经在3 mg/kg和10 mg/kg剂量水平观察到活性(数据未显示)。
实施例9
药代动力学(PK)
分别在食蟹猴中以5或6 mg/kg的静脉内(IV)单次剂量(bolus dose)施用以后，确定了常规地缀合的EDB-L19-vc-0101和位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101缀合的抗体药物缀合物的暴露。使用配体结合测定(LBA)测量了总抗体(总Ab；缀合的mAb和未缀合的mAb的测量)、ADC (缀合至至少一种药物分子的mAb)的浓度，并使用质谱法测量了释放的净荷0101的浓度。使用具有荧光检测的Gyrolab®工作站，通过配体结合测定(LBA)实现了总Ab和ADC浓度的定量。使用的生物素化的捕获蛋白是绵羊抗-hIgG，且检测抗体是Alexa Fluor 647山羊抗-hIgG（对于总抗体）或Alexa Fluor 647抗-0101 mAb（对于ADC）(用Watson v 7.4 LIMS系统处理数据)。使用蛋白沉淀制备用于未缀合的净荷分析的体内样品，并使用正Turbo IonSpray电喷射电离(ESI)和多重反应监测(MRM)模式注射到ABSciex API5500 (QTRAP)质谱仪上。将743.6→188.0和751.6→188.0的跃迁分别用于分析物和氘化的内部标准品。用Analyst软件1.5.2版(Applied Biosystems/MDS Sciex,Canada)进行数据采集和处理。
来自EDB-L19-vc-0101 ADC (在5 mg/kg)和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101ADC (6 mg/kg)给药的食蟹猴的总Ab、ADC和释放的净荷的药代动力学显示在表22中。位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101 ADC的暴露表明与常规缀合物相比增加的暴露(约2.3倍增加，如通过剂量归一化的AUC所测得的)和增加的缀合稳定性。通过位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101 ADC相对于常规EDB-L19-vc-0101 ADC的分别更高的ADC/Ab比率(84%相对于75%)和更低的释放的净荷暴露(剂量归一化的AUC;0.0058相对于0.0082µg*h/mL)，评估了缀合稳定性。NA= 不适用。
实施例10
EDB ADC的热稳定性评估
使用示差扫描量热法(DCS)确定抗-EDB抗体变体和对应的常规和位点特异性缀合的EDB ADC的热稳定性。将在PBS-CMF（pH 7.2）中配制的样品分配进具有自动采样器的MicroCal VP-Capillary DSC(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ)的样品托盘中，在10℃平衡5分钟，并然后以100℃/小时的速度扫描直到110℃。选择16秒的过滤阶段。对原始数据进行基线校正，并将蛋白浓度归一化。使用Origin软件7.0 (OriginLabCorporation, Northampton, MA)将数据拟合至MN2-State Model，具有适当数目的转换。
如在表23中所示，评价了使用位点特异性的和常规的缀合技术的各种抗-EDB抗体和EDB ADC，并表现出有利的热稳定性，如>65℃的第一次解链转变(Tm1)所确定的。这些结果证实，包含经工程改造的半胱氨酸残基的EDB-(κK183C-K94R-K290C抗体和κK183C-K94R-K290C-vc-0101 ADC是热稳定的。
实施例11
毒性研究
在Wistar-Han大鼠和食蟹猴中在探究重复剂量(Q3Wx3)研究中表征了常规缀合的EDB-L19-vc-0101和位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101的非临床安全性概况。由于与人EDB的100%蛋白序列同源性以及抗体EDB-L19和EDB-(κK183C-K94R-K290C)与大鼠、人和猴的类似结合亲和力（通过Biacore测定，如在实施例2中证实的），大鼠和食蟹猴被视作用于毒性评价的药理学上有关的非临床物种。
分别在Wistar Han大鼠和食蟹猴中评价了直到10和5 mg/kg/剂的EDB-L19-vc-0101，并在食蟹猴中评价了直到12 mg/kg/剂的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101。每3周1次地(在第1、22和43天)静脉内地施用给大鼠或猴，并在第46天(第3剂以后3天)安乐死。评价动物的临床征象、体重变化、食物消耗、临床病理学参数、器官重量以及宏观和微观观察。在这些研究中没有注意到死亡或动物的临床情况的显著变化。
在大鼠和猴中不存在在表达EDB+ FN的组织/器官中的靶标依赖性毒性的迹象。在两个物种中，主要的毒性是与血液学变化有关的可逆骨髓抑制。在猴中，用5 mg/kg/剂的常规地缀合的EDB-L19-vc-0101观察到显著的短暂嗜中性粒细胞减少症，而用6 mg/kg/剂的位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101仅观察到对嗜中性粒细胞计数的微小影响，如在表24和图11中所示。点代表平均值，且误差棒代表平均值±1个标准差(SD)。
数据证实了位点特异性缀合对骨髓抑制的显著减轻。EDB-L19-vc-0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101的毒性谱与这些缀合物的靶标依赖性效应相一致，且EDB-L19-vc-0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101的最高非严重毒性剂量(HNSTD)分别被确定为≥5 mg/kg/剂和≥12 mg/kg/剂。
实施例12
IO组合
随着癌细胞死亡，它们释放出被树突细胞(DC)吸收和呈递的抗原。因为在这些肿瘤细胞中的突变，这些抗原中的一些包括癌症新表位，它们具有被成熟的DC呈递给T细胞、由此活化它们和诱导抗肿瘤靶向的潜力。但是，负调节机制在癌症患者中被上调。例如，通过检验点诸如PD-1/PD-L1途径的信号传递可能限制新表位的识别和T细胞的活化。
以ADC形式缀合至抗体的净荷可能参与连接树突细胞成熟途径，从而导致增加的肿瘤抗原交叉呈递，这允许T细胞激发和增加的肿瘤T细胞靶向。利用本发明的EDB ADC（包含各种净荷诸如净荷-0101）通过建立免疫原性的肿瘤环境来改善肿瘤新抗原的免疫识别。当联合施用EDB ADC和免疫-肿瘤学试剂时，这些环境变得对阻断负调节途径的免疫-肿瘤学试剂有应答。
来自用EDB-L19-vc-0101治疗的EMT6同基因肿瘤的效力研究的数据提示，诱导了对净荷-0101的效应物应答。与媒介物对照相比在EDB-L19-vc-0101治疗的肿瘤中观察到增加的CD3+ T细胞浸润。另外，观察到在治疗的肿瘤中增加的PDL1表达，从而提示由增加的效应T细胞应答引起的IFNγ释放。
将EDB ADC与靶向免疫调节途径的试剂（诸如抗-PDL1拮抗剂抗体或抗-41BB激动剂抗体）组合可能提高抗肿瘤效力和提供更持久的应答。
实施例13
生物标志物/作用机理
如前面所述在裸鼠中开发了NSCLC PDX模型PDX-NSX-11122。通过尾静脉注射施用3mg/kg (每组每个时间点4只动物)的EDB-(K94R)-vc-0101、EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101和Neg-vc-0101 ADC。在单次施用后96小时，将动物麻醉并灌注盐水。在盐水灌注以后，将肿瘤取出并准备用于经由配体结合测定(LBA)测量抗体和ADC，或准备用于免疫组织化学(IHC)。
配体结合测定(LBA)
对于LBA测定，将5倍缓冲液加入肿瘤样品。组织提取试剂(Invitrogen)含有1%蛋白酶抑制剂(Sigma)(v/w)，最终的稀释度为6倍(µg/mL匀浆物→µg/g组织)。加入不锈钢珠子并使用Mini-Beadbeater- 96 (BioSpec)将组织匀浆化。将匀浆物(~100- 300µL，取决于样品大小)转移至适当的瓶(Marsh试管)并在14000 rpm离心10分钟(4ºC)。将离心的匀浆物用Super Block™稀释(MRD)用于根据分析方案进行分析。
如在表25中所示，使用配体结合测定来确定EDB ADC的单剂量施用以后的平均总抗体和ADC血浆浓度(µg/mL)肿瘤浓度(µg/g)。数据证实，在肿瘤部位处以增加的水平检测到EDB-(K94R)-vc-0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101，如通过总抗体和ADC相对于Neg-vc-0101测得的。此外，与Neg-vc-0101相比，对于EDB-(K94R)-vc-0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101观察到ADC和总抗体的减小的血浆与肿瘤比率，从而指示靶向EDB的ADC的增加的肿瘤特异性靶向效率。
免疫组织化学(IHC)
对于ADC分布和应答的下游生物标志物的免疫组织化学检测，将样品在10%中性缓冲的福尔马林中固定48小时。固定以后，将样品包埋在石蜡中并在5µM切片。将切的石蜡切片在二甲苯替代物中脱石蜡并用分级醇至蒸馏水再水合。在加压蒸煮器(Electron MicroscopySciences)中将抗原恢复在10 mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0 (Invitrogen)（对于磷酸-组蛋白H3和切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3检测）或Borg Decloaker缓冲液pH 9.5(Biocare Medical)（对于抗-人IgG检测和抗-0101检测）并冷却至室温。将内源性过氧化物酶用3%过氧化氢封闭10分钟。将非特异性的蛋白相互作用用蛋白封闭剂(DAKO)封闭20分钟。将组织切片与第一抗体一起在室温温育1小时。第一抗体是: 0.3µg/mL抗-人Pan IgG抗体(Epitomics)；10µg/mL抗-0101 Ab; 0.13µg/mL抗-磷酸组蛋白H3 (pHH3, CellSignaling Technology)；1.3µg/mL抗-切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3 (CellSignaling Technology)。为了避免在小鼠检测上的小鼠，使用Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒(Life Technologies)用AlexaFluor 488标记抗-0101同种型抗体。将未标记的第一抗体用Signalstain Boost试剂(Cell Signaling Technology)在室温检测30分钟。将AlexaFluor 488标记的第一抗体用1µg/ml兔抗-AlexaFluor488 (Life Technologies)在室温检测45分钟，随后与Signalstain Boost试剂(Cell Signaling Technology)一起在室温温育30分钟。使用DAB+ (3’,3’-二氨基联苯胺; Dako)显色5分钟。将切片在苏木精中短暂地复染色，用水洗涤，在分级醇中脱水，在二甲苯替代物中清洁，并盖上PermountMounting Medium。
在单剂量以后96小时，在PDX-NSX-11122 PDX模型中用抗-人IgG IHC类似地检测到常规的EDB-(K94R)-vc-0101和位点特异性缀合的EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101。在用EDB-(K94R)-vc-0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101治疗的肿瘤中观察到与用阴性对照ADC (Neg-vc-0101)治疗的那些肿瘤相比pHH3阳性细胞（有丝分裂停止标志物）的增加。大多数携带pHH3有丝分裂停止标志物的细胞是赘生性细胞，从而提示旁效应。切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3染色指示与用阴性对照ADC (Neg-vc-0101)治疗的肿瘤相比，在用EDB-(K94R)-vc-0101 (和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101治疗的那些肿瘤中增加的细胞凋亡。

Claims (44)

1.一种抗体-药物缀合物，其包含(a)结合纤连蛋白的外结构域B的抗体或其抗原结合片段，(b)接头和(c)药物。
2.权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 3、5和7的三个CDR，所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 12、13和14的三个CDR。
3.权利要求1或2的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ IDNO: 1或21的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区。
4.权利要求1-3中的任一项的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含
含有SEQ ID NO: 1的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区；或者
含有SEQ ID NO: 21的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区。
5.权利要求1-4中的任一项的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO: 8、17、19、23、25、27或29的重链和含有SEQ ID NO: 15或31的轻链。
6.权利要求1-5中的任一项的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含
含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；
含有SEQ ID NO: 8的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；
含有SEQ ID NO: 17的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；
含有SEQ ID NO: 17的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；
含有SEQ ID NO: 19的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；
含有SEQ ID NO: 19的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；
含有SEQ ID NO: 23的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；
含有SEQ ID NO: 23的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；
含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；
含有SEQ ID NO: 25的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；
含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；
含有SEQ ID NO: 27的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；
含有SEQ ID NO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 15的轻链；或者
含有SEQ ID NO: 29的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链。
7.权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链和/或轻链恒定区，所述重链和/或轻链恒定区包含用于位点特异性缀合的经工程改造的半胱氨酸残基。
8.权利要求7的抗体-药物缀合物，其中所述重链恒定区包含在位置290处的经工程改造的半胱氨酸残基(K290C)，根据Kabat的EU索引编号。
9.权利要求7的抗体-药物缀合物，其中所述轻链恒定区包含在位置183处的经工程改造的半胱氨酸残基(κK183C)，根据Kabat的编号。
10.权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述重链恒定区包含在位置290处的经工程改造的半胱氨酸残基(K290C)，根据Kabat的EU索引编号，且其中所述轻链恒定区包含在位置183处的经工程改造的半胱氨酸残基(κK183C)，根据Kabat的编号。
11.权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含经工程改造的含有谷氨酰胺的标签，所述标签插入在所述抗体中或替代所述抗体中的一个或多个内源氨基酸。
12.权利要求11的抗体-药物缀合物，其中所述经工程改造的含有谷氨酰胺的标签在位置E294-N297处插入所述抗体中。
13.权利要求12的抗体-药物缀合物，其中所述含有谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列LLQG (SEQ ID NO: 40)。
14.权利要求11的抗体-药物缀合物，其中所述重链恒定区进一步包含在位置222处用精氨酸(R)置换赖氨酸(K)(K222R)，根据Kabat的EU索引编号。
15.权利要求1的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含在位置94处用精氨酸(R)置换赖氨酸(K)(K94R)，根据Kabat的编号。
16.权利要求1-15中的任一项的抗体-药物缀合物，其中所述接头是可切割的接头。
17.权利要求16的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的接头选自vc、diS、diS-C2OCO和AcLys-vc。
18.权利要求1-17中的任一项的抗体-药物缀合物，其中所述药物是细胞毒性剂。
19.权利要求18的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是奥里斯他汀。
20.权利要求19的抗体-药物缀合物，其中所述奥里斯他汀选自0101、1569、9411和4574。
21.权利要求1-18中的任一项的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是CPI二聚体。
22.权利要求21的抗体-药物缀合物，其中所述CPI二聚体是CPI-8314或CPI-0326。
23.一种抗体-药物缀合物，其包含(a)含有重链可变区和轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区包含含有SEQ ID NO: 3、5和7的三个CDR，所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO: 12、13和14的三个CDR，(b) vc接头和(c) 0101药物。
24.一种抗体-药物缀合物，其包含(a)抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:21的重链可变区和含有SEQ ID NO: 10的轻链可变区；(b) vc接头和(c) 0101药物。
25.一种抗体-药物缀合物，其包含(a)抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:25的重链和含有SEQ ID NO: 31的轻链；(b) vc接头和(c) 0101药物。
26.一种药物组合物，其包含权利要求1-25中的任一项的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体。
27.一种组合物，其包含多种权利要求1-25中的任一项的抗体-药物缀合物和任选的药用载体，其中所述组合物具有在3-5范围内的平均DAR。
28.一种组合物，其包含多种权利要求1-25中的任一项的抗体-药物缀合物和任选的药用载体，其中所述组合物具有在1-3范围内的平均DAR。
29.一种核酸，其编码权利要求1-25中的任一项的抗体的重链或轻链。
30.一种核酸，其为编码重链的SEQ ID NO: 9、18、20、24、26、28或30中的任一个或编码轻链的SEQ ID NO: 16或32中的任一个。
31.一种载体，其包含权利要求29或30的核酸。
32.一种宿主细胞，其包含权利要求29或30的核酸。
33.一种用于生产权利要求1-25中的任一项的抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括：
(a)将所述接头连接至所述药物；
(b)将所述接头和药物缀合至所述抗体；和
(c)纯化所述抗体-药物缀合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述缀合是位点特异性的在抗体的一个或多个经工程改造的半胱氨酸残基上和/或经工程改造的谷氨酰胺残基上。
35.一种治疗表达EDB+ FN的病症或疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的包含权利要求1-25中的任一项的抗体-药物缀合物的组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中表达EDB+ FN的病症或疾病是癌症。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或血癌。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述实体瘤是甲状腺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胆囊癌、肾癌、皮肤癌、子宫癌、间皮瘤、结直肠癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、内分泌癌、胸腺癌、脑癌、肾上腺癌、眼癌、宫颈癌和肺癌。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述血癌是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
40.权利要求1-25中的任一项的抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中表达EDB+ FN的病症或疾病。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述表达EDB+ FN的病症或疾病是癌症。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述癌症是实体瘤或血癌。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述实体瘤是甲状腺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、胆囊癌、肾癌、皮肤癌、子宫癌、间皮瘤、结直肠癌、头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、内分泌癌、胸腺癌、脑癌、肾上腺癌、眼癌、宫颈癌和肺癌。
44.根据权利要求43所述的用途，其中所述血癌是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
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